CN106480038B

CN106480038B - 一种受盐诱导的特异性诱导型启动子dna序列及应用

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Publication number: CN106480038B
Application number: CN201611234639.1A
Authority: CN
Inventors: 肖国增; 韩烈保
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: CN106480038A

Abstract

本发明提供了一种受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，所述的启动子DNA序列为：匍匐翦股颖AsNHX2基因的启动子序列，且含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。所述特异性引物的核苷酸序列为：正向引物Promoter‑F:5'‑ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAG‑3'；反向引物Promoter‑R：5'‑AGAGGTTGATGGAGACCACGGACGC‑3'。所述的启动子序列在调控植物基因表达中的应用。还提供了匍匐翦股颖AsNHX2基因的启动子序列，构建了转基因植物表达载体，通过转基因技术对其功能进行了鉴定；本发明为进一步研究和应用于调控匍匐翦股颖NHX等相关耐盐基因的表达，提高和改良匍匐翦股颖及其他植物的耐盐性，以植物作为生物反应器表达药用蛋白提供了理论基础。

Description

一种受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列及应用

技术领域

本发明涉及到生物工程领域，特别涉及到一种受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列及应用。

背景技术

就目前来说，盐胁迫对植物而言是一个及其复杂的机制，它几乎影响着植物每个生理生化途径。盐胁迫能引起植物的膜破裂、产生代谢毒害、抑制光合作用、产生ROS和减少营养物质进入细胞，甚至是植物体死亡。植物体可以通过离子平衡、离子区隔和离子排除的策略减轻盐分对植物的毒害作用，其中与Na⁺交换相关的Na⁺/H⁺逆转运（NHX）基因在离子区隔和离子排除中发挥着重要作用。在盐胁迫下，大多数植物的NHX活性会增强，转运Na⁺的功能也会增加，同时H⁺-ATPase的活性也相应增加，提供质子梯度将Na⁺隔离到液泡中，从而降低细胞质中的Na⁺浓度，减轻对各类酶和膜系统的损害。启动子是位于基因结构5’端上游区的一段核苷酸序列，其作用是活化RNA聚合酶并使其与DNA模板准确结合。它控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，决定基因的活动。启动子根据其功能和作用方式大致分为组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子三种类型。组成型启动子调控基因表达不受外界环境条件影响，几乎在所有植物不同组织中都能表达，典型的有花椰菜花叶病毒35S启动子、玉米泛素Ubiquitin启动子和水稻肌动蛋白（Actin）启动子。该类启动子活性高，但是由于其导致外源基因在转基因植物整个生长时期的不同部位表达，影响了植物的生长发育和正常生理代谢，有些可能会产生毒害作用，不利于品质和产量提高，甚至会导致植物死亡。

组织特异型启动子是调控目的基因只在特定器官或组织中表达。在根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因Pyk10启动子能调控目的基因在转基因拟南芥根部高水平特异表达（参见Nitz等，2001，Plant Science 161，337-346）。玉米叶片特异性PPCA1启动子（参见Gowik等，2004，Plant Cell 16，1077-1090）和草莓果实特异性GalUR启动子（参见Agius等，2005，J Exp Bot 56，37-46）等。对该类启动子的深入研究有助于阐明植物生长发育和生理代谢的基础理论，具有广泛的应用价值。诱导型启动子是指正常状态下不表达或低表达，受到某些物理或化学信号刺激，可以大幅度提高基因表达水平的一类启动子。根据诱导因素可以分为光诱导型启动子、温度诱导性型启动子、激素诱导型和干旱诱导型启动子等。它的特点是：含有多种功能元件，协同增强或降低启动子的活性；部分诱导型启动子同时具有组织特异型启动子的特点。Kasuga等利用诱导型rd29A启动子代替35S启动子转化拟南芥，提高了拟南芥抗旱性，同时减少了组成型启动子过表达造成的植株生长停滞或矮化现象的发生（参见Kasuga等，2004，Plant and Cell Physiology 45，346-350）。水稻质膜CaATPase启动子受干旱、寒冷、脱落酸的诱导（参见Huda等，2013，PLoS One 8）。拟南芥RBCS-1A启动子受光诱导同时具有组织特异性的启动子（参见习雨琳等，2012，作物学报38，1561-1569）。诱导型启动子目的基因只有在接受诱导信号后才会表达，不仅能减少对转基因植物生长发育及其代谢途径的影响，还能增强转基因植物对外界的抗逆性。因此，研究和利用诱导型启动子，对于研究植物响应各种逆境胁迫的生理机制以及研究农作物的抗逆基因工程具有重要意义，在基础研究和植物生物技术方面也有广阔的应用前景。然而到目前为止，能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少，而对匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera L.）AsNHX基因启动子的研究还未见报道。

匍匐翦股颖别名本特草、四季青，属于禾本科翦股颖属，冷季型草坪草，它具有良好的叶片质地、高致密性、优良的耐低修剪和抗冻性，是被世界上城市绿地、高尔夫球场、保龄球场等高质量草坪中应用最广泛的草种，缺点是耗水量大、耐盐性不够理想，限制了它更大的应用范围。

因此，利用现代分子生物技术方法克隆AsNHX2基因启动子序列，通过构建该序列的植物表达载体转化拟南芥研究其功能，对我们了解匍匐翦股颖AsNHX2基因参与盐胁迫响应以及在这过程中发挥的功能作用奠定良好的基础，对进一步应用于提高匍匐翦股颖及其他植物的耐盐性遗传改良，以及以植物作为生物反应器表达疫苗、抗体和其他药用蛋白等医学领域具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列及应用。从而为研究和应用调控NHX等耐盐基因的表达、植物的耐盐性遗传改良以及表达药用蛋白等提供有效手段。

为了完成上述目的，本发明的技术方案为：

一种受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，所述的启动子DNA序列为：匍匐翦股颖AsNHX2基因的启动子序列，且含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。从匍匐翦股颖中克隆出了匍匐翦股颖AsNHX2基因的启动子序列。

可选的，所述启动子序列为：1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；2）在严格条件下与SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列；3）与SEQ ID No.1限定的核苷酸至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

本发明提供了克隆所述启动子序列的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：

正向引物Promoter-F:（ SEQ ID No.2所示序列）

5'-ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAG-3'

反向引物Promoter-R：（SEQ ID No.2所示序列）

5'-AGAGGTTGATGGAGACCACGGACGC-3'

进一步，含有所述的启动子DNA序列的植物表达载体。

进一步，本发明还提供了对pBI121载体进行双酶切切除35S启动子后，连接AsNHX2基因的启动子和GUS标签序列的转基因植物表达载体。

进一步，本发明还提供了含有AsNHX2基因的启动子和GUS标签序列的转基因pBI121植物表达载体，在转基因植物中的基因表达应用。

所述应用包括含有AsNHX2基因的启动子和GUS标签序列的转基因pBI121植物表达载体转化植物。

所述的植物表达载体在调控植物基因表达中的应用。

所述的启动子在盐胁迫诱导时启动目的基因在植物中的表达。

所述植物为拟南芥、烟草和/或匍匐翦股颖类植物。

本发明的积极效果为：

1、本发明提供了匍匐翦股颖AsNHX2基因的启动子序列，并构建了转基因植物表达载体，通过转基因技术对它的功能进行了鉴定；

2、本发明的研究结果表明：AsNHX2基因的启动子能被盐胁迫诱导，在转基因植物的嫩叶和花蕾中呈现深蓝色；

3、本发明为进一步研究和应用于调控匍匐翦股颖NHX等相关耐盐基因的表达，提高和改良匍匐翦股颖及其他植物的耐盐性，以植物作为生物反应器表达药用蛋白提供了理论基础。

附图说明

图1、匍匐翦股颖总DNA电泳图；

图2、染色体步移扩增启动子第2轮和第3轮PCR电泳图；

图3、启动子PCR扩增电泳图；

图4、启动子pBI121植物表达载体结构示意图；

图5、启动子pBI121植物表达转化农杆菌阳性单菌落鉴定电泳图；

图6、转启动子拟南芥阳性植株筛选；

图7、转启动子拟南芥阳性鉴定PCR电泳图；

图8、对生长10天的转启动子拟南芥盐诱导下的GUS基因组织化学染色；

图9、对生长10天的转启动子拟南芥盐诱导下的GUS基因组织化学染色；

图10、对生长20天的转启动子拟南芥盐诱导下的GUS基因组织化学染色；

图11、对生长20天的转启动子拟南芥盐诱导下的GUS基因组织化学染色。

在图8-11中：a、b为：生长10天的转基因拟南芥GUS染色；a-1、b-1为:拟南芥嫩叶GUS染色；c、d为:生长20天的拟南芥GUS染色；c-1、d-1为:拟南芥嫩叶和花蕾GUS染色。

具体实施方式

下面结合实施例和附图1-11进一步对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。

实施例

1材料与方法

1.1植物材料

采用实验室保存的匍匐翦股颖Penncross种子，播种于直径15cm的塑料花盆中，栽培基质的体积比为：草炭：沙：蛭石（V：V：V）=3:3:1。在温室内生长3个月，每周喷施0.5强度的Hogland营养液。

1.2匍匐翦股颖基因组DNA提取

称取健康生长的匍匐翦股颖叶片0.1g，放入研钵中加入液氮研磨至粉末，采用CTAB法提取基因组DNA。

1.3匍匐翦股颖AsNHX2基因启动子克隆

根据AsNHX2基因序列，采用Primer 5.0软件设计了3条特异性引物,分别为：

NHX2 pro -1：5’-CATCCCGCCAACCCGGTCCA-3’ ；

NHX2pro-2：5’-CACGAAATCAATCTGACCCGA-3’ ；

NHX2 pro -3：5’-TCTTCTTGCCCCCTCCTCTGT-3’。

以匍匐翦股颖基因组DNA为模板，用NHX2 pro -1、NHX2pro-2、NHX2 pro -3对应染色体步移的第1、2、3轮随机引物进行染色体步移克隆启动子序列。三轮PCR结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，挑选明亮的单一条带PCR产物送公司测序。测序结果用DNAMAN8.0和NCBI数据库进行序列比对分析，确定启动子的核苷酸序列。按照获得的启动子序列设计一对特异性引物：

Promoter-F：5'-ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAG-3'；

Promoter-R：5'-AGAGGTTGATGGAGACCACGGACGC-3'。

以匍匐翦股颖基因组DNA为模板，PCR克隆启动子。对PCR产物纯化回收后连接T载体，转化DH10b大肠杆菌，挑取阳性单菌落送公司测序。对测序正确的菌液提取质粒，-20℃保存备用。

1.4启动子序列分析

用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/对启动子序列进行分析，预测可能存在的TATA-box，CAAT-box及其他可能存在的顺式作用元件。

1.5转基因pBI121植物表达载体构建

采用Xba I和HindⅢ两个限制性内切酶切除pBI121载体中的35S启动子，然后以：

NHX2propBI-F 5'-CTATGACCATGATTACGCCAATTACGCCAGCTTGCATGC-3'；

NHX2propBI-R

5'-TACAGGACGTAACATCCCGCCAACCCGGTCCAAGGAG-3'；

为引物，用含有启动子序列的质粒为模板进行PCR扩增，对PCR获得的片段和双酶切后的pBI121载体产物纯化后，采用中美太和生物技术有限公司的SeamlessAssemblyCloning Kit 试剂盒进行无缝连接，获得AsNHX2pro::GUS植物表达载体。构建好的质粒采用冻融法转入GV3101农杆菌中，加50%甘油放-80℃保存备用。

1.6转基因拟南芥

以Clombia 野生型拟南芥作为转基因材料，采用花序侵染的方法，将构建好的AsNHX2pro::GUS植物表达载体通过GV3101农杆菌介导转化拟南芥。将所获得的拟南芥转基因T3 代种子放于含有50ug/mL 卡那霉素的MS 培养基上进行筛选。

1.7启动子的活性鉴定分析

分别取生长10天和20天的转基因拟南芥T3 代植株，置于0.2mol/L NaCl溶液中处理3天，采用组织化学法进行检测。以X-Gluc 为反应底物，做GUS 染色，用95%的乙醇退色48小时后利用LEICA DM2500 体式显微镜拍照。

2结果与分析

2.1启动子序列克隆与分析

以匍匐翦股颖基因组DNA为模板（如图1所示），进行染色体步移（如图2所示），获得一个长度为1653bp的片段（如图3所示）。启动子序列经过在线网站预测有11个CAAT-box，23个TATA-box，2个ABRE顺式作用元件。

2.2 GUS植物表达载体构建及转化拟南芥

采用Xba I 和Hind Ⅲ为内切酶切除pBI121 所含的35S 启动子，然后连接AsNHX2基因启动子，构建成AsNHX2基因启动子驱动GUS 报告基因的双元表达载体( 如图4 所示)。将构建好的启动子植物表达载体采用冻融法转化农杆菌GV3101，在12个单菌落的阳性鉴定中有两个菌落有明亮的单一条带（如图5所示）。将鉴定的启动子阳性GV3101菌落培养后，采用花序侵染法转化拟南芥。对转基因拟南芥收获的种子，播种在含有卡那霉素的MS培养基中筛选得到转基因拟南芥（如图6所示）。对筛选培养基筛选出的19株拟南芥转移到营养土中进行培养，采用CTAB法提取转基因拟南芥的基因组DNA，用pBI121载体通用引物进行阳性鉴定，有10株转基因拟南芥有明亮的单一条带（如图7所示），把PCR产物送公司测序表明是AsNHX2基因启动子序列，说明AsNHX2基因启动子成功转入到了拟南芥DNA基因组中。

2.3启动子活性鉴定分析

分别取生长10天和20天的启动子转基因拟南芥T3 代植株，置于0.2mol/L NaCl溶液中处理3天后进行GUS 染色。在生长10天的启动子转基因拟南芥的GUS基因染色中，在转基因拟南芥的嫩叶和叶缘能观察到蓝色（如图8a、9b所示），并且在嫩叶中出现了深蓝色（如图8a-1、9b-1所示）。在生长20天的启动子转基因拟南芥的GUS基因染色中，在转基因拟南芥的嫩叶、花蕾和叶缘能观察到蓝色（如图10c、11d所示），并且在嫩叶和花蕾中出现了深蓝色（如图10c-1、11d-1所示）。

以上的结果说明匍匐翦股颖AsNHX2基因启动子是一个受盐胁迫诱导，能在植物嫩叶和花蕾组织中高效表达的组织特异性诱导型启动子。

以上实施例用于说明本发明的技术方案，但不用来限制本发明的范围。实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售。

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书（包括权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

以上所述仅是本发明的非限定实施方式，还可以衍生出大量的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进的实施例，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

长江大学园艺园林学院

启动子核苷酸序列SEQ ID No.1：

ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTACTATAGGGCACGCGTGGTGTCGAGTTTCGTGTTCAACTATTGAGTACGTGAAAGTAGCTAGATAATCATAAGGGGAAGCCAAGAACACCATGCATGAAAATGAAACAAGAGGCGAAAGGGAAGAAATGTTCTTTTTCTTGCCGGAAACGCCATCAACTACTCCCAACTTTCTTGTGATTTGCAGCTAGTATCCCTGTCATCATTGATTAATTGGGTCATAGATAGATCACGAGCTAGCTAGCGAGTGGCAACACGGAAAAGTTTCGCAACGCCCGGAACTCAAGCGTACGGGATACTTCTTAACCGTGCGCAGACAGAGTTACATGCATGCATGTCATGCATTTAGAACCATCTAGGAGTAGCTAGTGGCAGCGCTCCTTTTTGGCATACAACTATACAAGTGTATAGATGGTTCTTTTTATATATGATGACATGTGACGACCTAAAAAGGCAAGAGGCCTAAACTTAGTGGGAACTAGACGCATGTGTTTATTAAGCACTTTGCATTTCACACGATCGAGGTGAAAAATAAATACTACTCCCTCCCTTTTAAAATATAAGCCTTTATAGCATTTTAAATTGTACCGCCAAAAAAGGCTTACATTCCGGAACGGAAGTAATCTAAGGACTCATGTCTCGTTTTCCTAATTAATATTTTGCACCGGAAAAAAAAATCTATTGTTCGAGGTGTGACTCTGTTTCCTTCTGTTAAAAAAATGGTGCTAGTCATCTCATCTAATCTTGACTTTCTAGTTCCTTTAATATGCAGATCTATAATGCTAAAACATTCAATGGCCCTAGCATGTCAACCTAGACCCGTATGAAAAACCTTAACCAACTTAGATATTGGGAAAAAGCATATCAAGTTATCACCTGTTGAAAGGAACTTGAAGTGAACCACAAGCACTAGCTCCACGAGGACAGGGATACCACACCAAAAGTTACCACCGTGTCACTACGAAGCACGGGTGGGCACAGGGGACCCACCTGGACGCTCCAGTTCGGACCAGAGCCCCCGGACACGTCACCAACCGCATTCCCCCATCCTATTCTCTCCCCCAAACACCATTCACCGCCGCCACCCGCTCCCCATCCGCCACGCGTCCCCCCTTTCGCCCGAACGATCCAACCCCAAGAACGCCCGAGCCACCTTCCTTTCCCTTCCCTTTCTCGCGCTCCTCTTTAAATACGAGCCGGGCCAGCCAAAATTATCCCGATACCGCTCGCGCGAAGCCAAACCAAAACCAGGAGCAAGAATCCCGACCTCCTCGTCGCGGATTCCTCGCTCGCGCCGCGCGGCTGCGCCAACGAACCTTTGTTCATCTCCATCCTCTATTTATCCCGAATCCTCCGTGCTTTTCTCTTTCCCCCACCGTCCCTTCCCTCCCCGGCGGCCTGGGGACGGAGCGGCACAGAGGAGGGGGCAAGAAGAACAGGGGAGGAAGAAGAAGCAGCTTGGTTCTTCTCCCCGCCGATTCGTTTCCGGATTAGCCAGAGGATTTCCGTCCCCACCACCCATTTCTCCCCAGGGGCTCGGGTCAGATTGATTTCGTGTAAAGCTCCGCGGAATCTGTACGGCCGCTCGCCGGAGCAATCTCCTTGGACCGGGTTGGCGGGATGGGGACGGGCGCTGTGGCGGCGCAGCTGGCGCGGCTGGGCGGCGCGCTCTCGACCTCGGACCACGCGTCCGTGGTCTCCATCAACCTCT

启动子扩增特异性引物序列SEQ ID No.2(5'-3')

NHX2 pro-1: CATCCCGCCAACCCGGTCCA

NHX2 pro-2: CACGAAATCAATCTGACCCGA

NHX2 pro-3: TCTTCTTGCCCCCTCCTCTGT

Promoter-F: ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAG

Promoter-R: AGAGGTTGATGGAGACCACGGACGC

NHX2propBI-F: CTATGACCATGATTACGCCAATTACGCCAGCTTGCATGC

NHX2propBI-R: TACAGGACGTAACATCCCGCCAACCCGGTCCAAGGAG

序列表

SEQUENCE LISTING

长江大学园艺园林学院

启动子核苷酸序列SEQ ID No.1：

启动子扩增特异性引物序列SEQ ID No.2(5'-3')

NHX2 pro-1: CATCCCGCCAACCCGGTCCA

NHX2 pro-2: CACGAAATCAATCTGACCCGA

NHX2 pro-3: TCTTCTTGCCCCCTCCTCTGT

Promoter-F: ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAG

Promoter-R: AGAGGTTGATGGAGACCACGGACGC

NHX2propBI-F: CTATGACCATGATTACGCCAATTACGCCAGCTTGCATGC

NHX2propBI-R: TACAGGACGTAACATCCCGCCAACCCGGTCCAAGGAG

Claims

1.一种受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，其特征在于：所述的启动子DNA序列为：匍匐翦股颖AsNHX2基因的启动子序列，且含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，其特征在于：所述的启动子DNA序列引物的核苷酸序列为：

Promoter-F:5'-ATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAG-3'

Promoter-R：5'-AGAGGTTGATGGAGACCACGGACGC-3'。

3.根据权利要求1所述的受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，其特征在于：将所述的启动子DNA序列构建在植物表达载体上。

4.根据权利要求3所述的受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，其特征在于：包含所述启动子DNA序列的植物表达载体为双酶切切除35S启动子后连接AsNHX2基因的启动子序列的pBI121载体。

5.根据权利要求1或3或4中的任意一项所述的受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，其特征在于：所述的启动子DNA序列在调控植物基因表达中的应用。

6.根据权利要求5所述的受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，其特征在于：所述的启动子在盐胁迫诱导时启动目的基因在植物中的表达。

7.根据权利要求5所述的受盐诱导的特异性诱导型启动子DNA序列，其特征在于：所述的植物为拟南芥、烟草和/或匍匐翦股颖类植物。