CN102002485A

CN102002485A - 沙冬青的焦磷酸酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102002485A
Application number: CN 201010519920
Authority: CN
Inventors: 蒯本科; 魏强; 郭玉娟; 梁宁菁
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-10-26
Filing date: 2010-10-26
Publication date: 2011-04-06

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种沙冬青的焦磷酸酶及其编码基因与应用。本发明所提供的焦磷酸酶基因，来源于沙冬青，名称为AmVP1,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。沙冬青焦磷酸酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一：SEQIDNO.1；SEQIDNO.2氨基酸序列的多核苷酸。本发明的基因可用于沙冬青抗盐耐旱分子机制研究，用于改良植物抗盐耐旱性状。

Description

沙冬青的焦磷酸酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种液泡膜焦磷酸酶及其编码基因与应用，特别是涉及沙冬青的焦磷酸酶及其编码基因与应用。

背景技术

盐害和干旱是限制农作物生长的两大限制因子。中国的干旱区面积占全国总面积的1/3，盐碱土广泛分布于其中，干旱与盐渍并存严重限制了我国农作物产量的提高和农业发展。因此，了解和研究植物耐盐碱抗干旱胁迫的机制；从我国特有的资源生物中克隆抗盐耐干旱基因，获得宝贵的基因资源；培育耐干旱耐盐碱农作物具有重要的现实和战略意义。

植物在长期进化过程中，形成了一系列抵抗干旱和盐渍胁迫的适应机制。如在细胞中积累无害的可溶性小分子物质；通过Na⁺外排途径将Na⁺排出细胞以及提高下游抵抗氧化伤害的抗氧化酶的活性等等。其中通过Na⁺/H⁺反向转运蛋白在液泡中积累Na⁺一方面可以降低Na⁺在细胞质的含量，降低Na⁺的毒害性；另一方面还可以降低细胞水势，能够让植物在高盐溶液中获得和保持更多的水分[Cixin He等(2005)，Plant Cell Physiol. 46(11): 1848–1854]。

NHX基因家族是植物中Na⁺区隔化至液泡的关键基因，而液泡膜焦磷酸酶则为Na⁺区隔化过程提供质子电化向学梯度[Gao F等， Cloning of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance. Journal of Experimental Botany 57:3259-3270(2006)]。迄今为止，人们已经从拟南芥、小麦、盐芥等植物中分离得到了液泡膜焦磷酸酶基因[Gaxiola RA 等 (2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVP1 H+-pump. P Natl Acad Sci USA 98:11444-11449; Brini F等 (2007) Overexpression of wheat Na⁺/H⁺ antiporter TNHX1 and H⁺-pyrophosphatase TVP1 improve salt- and drought-stress tolerance in Arabidopsis thaliana plants. Journal of Experimental Botany 58:301-308；Gao F等(2006), Cloning of an H⁺-PPase gene from Thellungiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance. Journal of Experimental Botany 57:3259-3270]。人们已经对焦磷酸酶基因的结构功能已研究得较为详细。目前，研究人员已经对焦磷酸酶基因进行了酶学性质、分子结构、表达调控、酵母突变体的功能互补以及过量表达等多方面的研究。焦磷酸酶基因对于植物的耐盐性、体内离子动态平衡以及整个的植物发育过程，都起到非常重要的作用。

焦磷酸酶基因是迄今为之，单个基因改良植物耐盐抗旱性状最有效的基因之一。在拟南芥，番茄，苜蓿，翦股颖，棉花等植物中过量表达焦磷酸酶基因均能够有效提高植物耐盐性甚至抗旱性（Gaxiola RA 等 (2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVP1 H⁺-pump. P Natl Acad Sci USA 98:11444-11449; Park S等(2005) Up-regulation of a H+-pyrophosphatase (H+-PPase) as a strategy to engineer drought-resistant crop plants. P Natl Acad Sci USA 102:18830-18835；Bao AK等 (2009) Overexpression of the Arabidopsis H+-PPase enhanced resistance to salt and drought stress in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Sci 176:232-240；Li ZG等 (2010) Heterologous expression of Arabidopsis H plus -pyrophosphatase enhances salt tolerance in transgenic creeping bentgrass (Agrostis stolonifera L.). Plant Cell Environ 33:272-289；Lv S等 (2008) Overexpression of an H⁺-PPase gene from Thellungiella halophila in cotton enhances salt tolerance and improves growth and photosynthetic performance. Plant Cell Physiol 49:1150-1164；Lv SL等(2009) Overexpression of Thellungiella halophila H+-PPase (TsVP) in cotton enhances drought stress resistance of plants. Planta 229:899-910）。

沙冬青( Ammopiptanthus mongolicus (Maxim1)Cheng F1) 又名蒙古沙冬青、蒙古黄花木,是古老的第三纪残遗种,也是迄今为止我国温带荒漠的惟一珍贵常绿灌木,是阿拉善荒漠区所特有的建群植物（郭生祥，甘肃林业科技，第30 卷第4 期， 2005年12月）。沙冬青不仅具有极强的抗干旱性，抗高温，耐低温以及抗风蚀沙埋还具有很强的抗盐性，种子能够在含有200mm NaCl的MS培养平板上正常生长。目前对沙冬青的耐逆性研究仅停留在生理生化阶段，从遗传上阐述沙冬青的抗逆性机制是一片空白。因此借助拟南芥模式生物，挖掘沙冬青重要的抗逆性基因资源，并应用到农作物抗逆性状改良上具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙冬青焦磷酸酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的沙冬青焦磷酸酶，是具有SEQ ID NO.2 氨基酸残基序列的蛋白质或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。

沙冬青焦磷酸酶的编码基因，是下列核苷酸之一

1）SEQ ID NO.1 所示的DNA序列。

2）编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸。

SEQ ID NO.1由2875个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第353位至第2668位碱基；SEQ ID NO.2由771个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围。本发明的基因将在沙冬青耐盐耐旱分子机制研究，植物耐盐耐旱性状改良中发挥重要作用。

附图说明

图1为RACE-PCR电泳图谱。

图2为AmVP1同几种重要物种焦磷酸酶的多重序列比对。

图3为RT-PCR鉴定转基因植株AmVP1表达水平电泳图。

图4为AmVP1转基因植株的抗旱性。

图5为 AmVP1转基因植株的抗盐性。

具体实施方式

实施例1、沙冬青焦磷酸酶基因的获得。

1.1 沙冬青盐胁迫处理

沙冬青种子用0.01% HgCl₂ 表面灭菌15 min，无菌水冲洗5次, 37℃无菌水浸泡过夜后移至1/2 MS＋1.5％蔗糖＋1.0％琼脂+200mmNaCl盐胁迫培养基上。在16h L/8h D光照, 24℃条件下培养一周。

1.2 RNA提取

取经过盐胁迫处理的沙冬青幼根材料约0.1g。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加1ml

( invitrogen公司 )，混匀后，室温放置15 min，加0.2ml氯仿:异戊醇（24:1），剧烈摇动15 s后室温放置5 min，13000rpm, 4℃离心15 min。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15 min，13000rpm，4℃离心15 min。70％乙醇洗涤沉淀，室温干燥15 min。溶解于适量的经0.1% DEPC处理过的ddH₂O水中，贮存于-80℃备用。

1.3 cDNA第一链合成和反转录PCR

采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为：2μg制备的总RNA，0.5μl Rnase inhibitor，加DEPC处理过的去离子水至8.5μl, 2μl的Oligo(dT)18 primer. 65℃,5min,室温放置10min， 13000rpm 简短离心5s。再依次加入4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase Inhibitor，2μl 100mM DTT, 2μl dNTP, 1μl MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37℃反转录1小时，90℃5分钟；冰上冷却；13000rpm 短暂离心5秒钟，存放于-20℃待用。

1.4 RT-PCR扩增AmVP1基因中间片断

根据以往在其他植物中克隆到的Na⁺/H⁺ 转运蛋白基因的保守序列，设计了两条同源兼并引物AmNHX1CF（5'GCCTATAATATTCAATGCAGGGTTTCA 3'）和AmNHX1CR：（5'GTCCAGGGCATCCATACCAACATA 3'）（SEQ ID NO.3）作为PCR反应的引物。PCR 反应体系为50μl，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离获得一段约900bp的片断。回收并且通过TA克隆至TAKARA pMD-19-T载体后，由上海英骏公司测序，获得AmVP1的中间序列。

1.5 RACE法扩增AmVP1基因的3’末端序列

AmVP1基因的3’末端序列扩增使用Clontech公司的BD-SMARTTMRACE试剂盒。根据已经获得的保守序列设计了两个特异性引物进行巢式PCR反应。

AmVP13’RACEF：5' CTGGGCTGGACTTATTATTGGGTTTGTG 3'

AmVP13’RACENF：5' GATGTTGCTGATTCCTGCCG 3'

(SEQ ID NO.4)

反应条件分别为：

第一轮PCR反应：94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃复性40s，72℃延伸90s，循环35次。72℃充分延伸10min。

第二轮PCR反应：94℃预变性5min，94℃变性40s，56℃复性40s，72℃延伸90s，循环35次。72℃充分延伸10min。

第二轮PCR反应结束后，1％电泳检测，获得约1200bp的片段，割胶回收并克隆至克隆载体进行测序，获得3’末端序列。

1.6 5’RACE 法扩增AmVP1基因的末端序列

按照Takara5’ FULL-RACE（Code：D6122）方法，依次经过 cDNA第一链的合成，Hybrid RNA的分解，连接反应（单链cDNA环化或形成首尾连接物），以及两轮PCR 反应，再经琼脂糖凝胶电泳分离获得约600bp的PCR片断。最后经割胶回收，克隆至克隆载体，测序，最终获得AmVP1基因的5’末端序列。

AmVP15’末端P标记反转录引物：5' ACAGACAAGAATGCC 3'(SEQ ID NO.5)

1st PCR A1: 5' TGGGGTCTGATCTTTTTGGT 3'

1st PCR S1: 5' CAGATCAGCACCGACATCAG 3' (SEQ ID NO.6)

2nd PCR A2: 5' TCAACCATGATTTCACTGCC 3'

2nd PCR S2: 5' GATACCACCACCGACTCTCC 3' (SEQ ID NO.7)。

第一轮PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃复性40s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min。

第二轮PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，57℃复性40s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min。

1.7 AmVP1全长基因的克隆

根据已经获得的AmVP13’末端序列和5’末端序列以及中间序列拼接获得了AmVP1的全长序列，并设计了如下一对引物扩增AmVP1 编码区。

AmVP1ELF： 5' TTTTTTTCTGGCGAGGATGG 3'

AmVP1ELR： 5' CAGATCAGCACCGACATCAG 3' (SEQ ID NO.8)

PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性40s，52℃复性40s，72℃延伸150s，循环35次。72℃充分延伸10min。

1%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，获得了约2.2kb的片段，并克隆测序。

实施例2：沙冬青焦磷酸酶基因功能分析。

2.1序列比较分析

多序列比对使用Genedoc软件，ORF（Opening Reading Frame）查找使用分子分析软件Lasergene6.0进行。ORF翻译使用Primer5软件。多重序列比对表明, AmVP1与拟南芥，烟草，水稻，玉米，大麦，高粱等不同植物来源的焦磷酸酶蛋白序列具有很高的同源性，如附图2所示。各蛋白基因登录号如下：AtVP1,拟南芥液泡膜焦磷酸酶(NP_173021)； NtVP1，烟草液泡膜焦磷酸酶(CAA58701)；OsVP1，水稻液泡膜焦磷酸酶(BAA31523)；ZmVP1，玉米液泡膜焦磷酸酶(CAG29370 )； HvVP1，大麦液泡膜焦磷酸酶(Q06572 )；TaVP1，高粱液泡膜焦磷酸酶(ABX10014)。

2.2 拟南芥转基因分析。

2.2.1植物表达载体构建

利用引物AmVP1P（forward:5'TTTTTTTCTGGCGAGGATGG3', reverse:5'CAGAT CAGCACCGACATCAG3'）(SEQ ID NO.9)扩增出AmVP1全长编码区，并克隆至pMD19-T Vector (Takara)，测序无误之后。分别使用BamH1，Sal1双酶切,回收纯化目的片断，并连接到经过同样两个酶酶切，纯化的pPZPY122载体上。

2.2.2农杆菌转化。

2.2.2.1 LBA4404农杆菌感受态细胞制备

1) 在含利福霉素40μg/ml, 链霉素100μg/ml 的YEB固体培养基上划线， 28℃培养48h-72h；

2) 挑单菌落到含利福霉素40μg/ml, 链霉素100μg/ml 的YEB液体培养基中28℃培养至OD₆₀₀0.5；

3) 冰上冷却菌液，5000rpm, 4℃ 10分钟收集菌体；

4) 1mM Hepes pH 7.0洗涤3次，再用10％甘油洗涤一次；

5) 悬浮菌体于3ml 10％甘油中，分装到1.5ml离心管中，每管40ul。

2.2.2农杆菌转化

1）200ng质粒DNA，加40ul农杆菌感受态细胞混匀后按以下条件进行电转化：

U 1.8 KV

R 200 W

C 25 μF ；

2）电击后添加800μl SOC液体培养基，28℃ 培养1h；

3) 4000rpm， 10分钟收集菌体，悬浮于200μl SOC中，涂在含12μg/ml氯霉素，利福平40μg/ml, 链霉素100μg/ml YEB固体培养基上，28℃倒置培养48h-72h。

2.2.3农杆菌介导的拟南芥转化。

2.2.3.1 拟南芥基质培养:

基质组分：蛭石：黑土：珍珠岩 9 : 3 : 0.5

营养液组分：

。

基质浸透营养液后，将种子播于钵子中，用保鲜膜覆盖，置于4℃黑暗条件下，2天后转入（16h L/8h D）光照, 23℃条件下进行培养。拟南芥生长到抽苔开花即可供转化。

2.2.3.2农杆菌准备

1) 接种携带目的表达载体的农杆菌到含适量抗生素的YEB培养基中，28℃，220rpm摇菌培养至OD₆₀₀1.2；

2) 5000rpm, 4℃ 10分钟离心收集菌体；

3) 菌体重新悬浮于5％的蔗糖溶液中，并调至OD₆₀₀0.8；

4）加入Silwet L-77至终浓度为0.03%。

2.2.3.3拟南芥转化

取拟南芥材料，倒置浸泡地上部分于预备好的农杆菌溶液中，晃动约3s，取出，放置到荫蔽条件下，保湿24h，转入正常条件培养。

2.2.3.4拟南芥转化子筛选

收集转化后拟南芥的种子。种子用0.01% HgCl₂ 表面灭菌8 min，无菌水冲洗4次，悬浮在0.1 %的琼脂糖中，然后按每平板（直径15cm）2000粒种子（约40mg），铺在庆大霉素90mg/L, 1/2MS培养基上。将平板置于4℃黑暗冰箱中2天，转移到（16h L/8h D）光照, 23℃条件下进行培养。约10天左右可筛选出具庆大霉素抗性的转基因植株。将具抗性的植株转移到基质培养，并收获T₂代种子。

2.2.3.5半定量PCR检测转基因植株AmVP1表达量

1）取T₃代转基因植株叶片和野生型植株叶片按1.2部分提取总RNA，cDNA

第一链合成参照1.3部分；

2）PCR扩增AmVP1，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，54℃复性40s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min；

3）PCR扩增AtActin2，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性40s，54℃复性40s，72℃延伸60s，循环35次。72℃充分延伸10min；

将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离检测，拍照；

4）引物序列：

AmVP1RT (forward: 5' ATGGAGGTTTGTCAGTGATAGCC 3', reverse: 5'AATGCTGGAT GGACGAGGAA3') (SEQ ID NO.10), AtACT2 (forward: 5'ACTGTGCCAATCTACGAGGGT 3', reverse: 5'AGCGATACCTGAGAACATAGTGG3') (SEQ ID NO.11)。

2.2.4 转基因植株耐旱性鉴定

收获的T₃代转基因植株种子经表面灭菌后铺在含90mg/L庆大霉素的MS培养基上，4℃黑暗冰箱中2天，转移到（16h L/8h D）光照, 23℃条件下培养。7天之后移出根生长良好的转基因苗至基质，覆膜3天，正常培养。正常培养时每隔4天浇水一次，第20天浇水之后，进行干旱胁迫处理15天。

2.2.5 转基因植株耐盐性鉴定

1）将野生型和T₄代转基因拟南芥种子播于含有基质的钵子中，用保鲜膜覆盖，置于4℃黑暗条件下，2天后转入（10h Light/14h Dark）光照, 23℃条件下进行培养，每隔5天浇水一次,每次2个小时；

2）第25天开始灌溉含200mm/L NaCl的盐水，每隔5天处理一次，每次处理2个小时，直至处理24天，对照组则正常浇水。

<110> 复旦大学

<120> 沙冬青的焦磷酸酶及其编码基因与应用

<130> 001

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2875

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 1

ttaatcaaat ctatgagagg tacctgcaat ttcatgtcat tcaactcctc ccctaaacag 60

aatgcctaca ccacgggggt cataaagtca atgaggcatt aagagaacac acggaagtgc 120

aagtaaacta caactagtgt tggaggtaac tgactctatg ctaccaatac agaatgatga 180

acaatagttg acagcagcca caacaccaat cactgaagta ttcctctgac cgagttgata 240

gtagaggcat cccattaagt gtacgtatgg accttaccgc aacactcagt ctcttggttt 300

cgcttgccgg agcgggaaga tcgcatttgt tttgattttt tttctggcga ggatgggtga 360

ggcgttgctg tcggagcttg cgacggagat agtggtgccg gtgtgtgctg tggtggggat 420

tgtgttctcg ttggtgcagt ggttgctggt gtcgcgggtg aagctgacgc cggagcggta 480

cggtccctcg tcgtcaccgg gaaacaacaa caacagcaag aatggttacg gggactacct 540

tattgaggag gaagatggaa tcgatgacca caacgttgtc atcaaatgcg ctgagataca 600

gaacgccatt tctgaaggtg caacatcctt tctttttact gaatatcaat atgtggggat 660

cttcatggct gcttttgcag ttctgatctt ccttttcctg ggctccgtgg agagcttcag 720

taccaagagt cagccctgca catatgataa aacaaagcta tgcaaaccag cccttgcagc 780

tgcactcttt agcaccgtat cgttcttgct tggtgcttta acttcagtcc tatctggtta 840

ccttgggatg aaagttgcca cctatgccaa tgcaaggaca accttggagg caagaaaggg 900

agttggaaag gctttcatta ctgcatttag gtctggtgca gtaatgggtt tccttcttgc 960

agcaaatggt cttctggtgc tctacattgc catcaatctg ttcaagctat attatggcga 1020

tgattgggaa ggcctttttg aggccataac tggttatggt ttgggtggat cttccatggc 1080

tctttttggg agagtcggtg gtggtatcta taccaaggct gctgatgtcg gtgctgatct 1140

ggttggaaaa gttgaaagaa atatccctga ggatgatcca agaaacccag ctgtgattgc 1200

tgacaatgtt ggtgataatg ttggggacat tgctgggatg gggtctgatc tttttggttc 1260

atatgctgaa tcatcttgtg ccgccctagt tgttgcttca atttcttctt ttggaatcaa 1320

ccatgatttc actgccatgt tatatcctct gcttgtcagt tctataggca ttcttgtctg 1380

tttgattact actctctttg caactgattt cttcgagatc aaggctgtca aggaaattga 1440

accagcattg aaaaaacagc ttatcatctc tacagttctc atgaccgttg ggattgcaat 1500

tattagttgg attgctcttc catcatcctt cacaattttc aactttgggg ttcagaagga 1560

agtgaagagc tggcagctgt tcctatgtgt atgtgttggt ctctgggctg gacttattat 1620

tgggtttgtg actgaatatt acacaagcaa tgcttacagc cctgtacaag atgttgctga 1680

ttcctgccga actggagctg caaccaatgt catctttggc cttgctctgg gatacaagtc 1740

tgtcattatt cctatttttg ccattgcaat cagcattttt gtgagtttta gttttgcatc 1800

aatgtatggt attgctgtcg cagcccttgg gatgctgagc accattgcta ctggtttggc 1860

tattgatgcc tatggtccca tcagtgacaa tgcagggggt attgctgaga tggcaggtat 1920

gagccatcgt atccgtgaga gaactgatgc ccttgatgct gctggcaaca ctactgctgc 1980

cattggcaag ggatttgcta ttggatctgc cgcactagtg tctttggccc tgtttggtgc 2040

ctttgtgagc cgggcaggaa tttcaactgt ggatgtctta actcccaagg tcttcattgg 2100

actcattgtg ggtgccatgc ttccttactg gttttctgcc atgaccatga agagtgtagg 2160

aagtgcagca ttgaagatgg ttgaggaggt tcgtaggcag ttcaacacta ttccaggact 2220

catggagggt catgccaagc ctgattatgc tacctgtgtc aagatttcta ctgatgcatc 2280

aatcaaggag atgattcctc caggtgccct tgtcatgctc acaccactca tcataggtac 2340

cttctttggt gtagaaactc tttcaggtgt tcttgctggc tctctagttt ctggtgtgca 2400

gatcgcaata tcagcatcca acaccggtgg tgcctgggat aatgctaaga agtacattga 2460

ggctggtgct tctgagcatg cccggtcatt gggcccaaag ggatctgaac cacacaaagc 2520

agctgttatt ggtgacacca ttggagatcc tcttaaggac acttcagggc cttcgctcaa 2580

cattcttatt aagctcatgg cagtcgagtc acttgttttt gctccatttt tcgccactca 2640

tggtggccta cttttcaaaa tcttttgaga agtggtttcg gttattccta tatttttgtt 2700

ggagcggaat aggtttgcaa ttcacagcta aggcattttt tactcctttt ctttgtatca 2760

aatagcctct ccacctatag gtagctcttc aattatgaga acgtgtaact tgttacaaaa 2820

agttaatttt gccaaaatga atttccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2875

<210> 2

<211> 771

<212> PRT

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 2

Met Gly Glu Ala Leu Leu Ser Glu Leu Ala Thr Glu Ile Val Val Pro

1 5 10 15

Val Cys Ala Val Val Gly Ile Val Phe Ser Leu Val Gln Trp Leu Leu

20 25 30

Val Ser Arg Val Lys Leu Thr Pro Glu Arg Tyr Gly Pro Ser Ser Ser

35 40 45

Pro Gly Asn Asn Asn Asn Ser Lys Asn Gly Tyr Gly Asp Tyr Leu Ile

50 55 60

Glu Glu Glu Asp Gly Ile Asp Asp His Asn Val Val Ile Lys Cys Ala

65 70 75 80

Glu Ile Gln Asn Ala Ile Ser Glu Gly Ala Thr Ser Phe Leu Phe Thr

85 90 95

Glu Tyr Gln Tyr Val Gly Ile Phe Met Ala Ala Phe Ala Val Leu Ile

100 105 110

Phe Leu Phe Leu Gly Ser Val Glu Ser Phe Ser Thr Lys Ser Gln Pro

115 120 125

Cys Thr Tyr Asp Lys Thr Lys Leu Cys Lys Pro Ala Leu Ala Ala Ala

130 135 140

Leu Phe Ser Thr Val Ser Phe Leu Leu Gly Ala Leu Thr Ser Val Leu

145 150 155 160

Ser Gly Tyr Leu Gly Met Lys Val Ala Thr Tyr Ala Asn Ala Arg Thr

165 170 175

Thr Leu Glu Ala Arg Lys Gly Val Gly Lys Ala Phe Ile Thr Ala Phe

180 185 190

Arg Ser Gly Ala Val Met Gly Phe Leu Leu Ala Ala Asn Gly Leu Leu

195 200 205

Val Leu Tyr Ile Ala Ile Asn Leu Phe Lys Leu Tyr Tyr Gly Asp Asp

210 215 220

Trp Glu Gly Leu Phe Glu Ala Ile Thr Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Ser

225 230 235 240

Ser Met Ala Leu Phe Gly Arg Val Gly Gly Gly Ile Tyr Thr Lys Ala

245 250 255

Ala Asp Val Gly Ala Asp Leu Val Gly Lys Val Glu Arg Asn Ile Pro

260 265 270

Glu Asp Asp Pro Arg Asn Pro Ala Val Ile Ala Asp Asn Val Gly Asp

275 280 285

Asn Val Gly Asp Ile Ala Gly Met Gly Ser Asp Leu Phe Gly Ser Tyr

290 295 300

Ala Glu Ser Ser Cys Ala Ala Leu Val Val Ala Ser Ile Ser Ser Phe

305 310 315 320

Gly Ile Asn His Asp Phe Thr Ala Met Leu Tyr Pro Leu Leu Val Ser

325 330 335

Ser Ile Gly Ile Leu Val Cys Leu Ile Thr Thr Leu Phe Ala Thr Asp

340 345 350

Phe Phe Glu Ile Lys Ala Val Lys Glu Ile Glu Pro Ala Leu Lys Lys

355 360 365

Gln Leu Ile Ile Ser Thr Val Leu Met Thr Val Gly Ile Ala Ile Ile

370 375 380

Ser Trp Ile Ala Leu Pro Ser Ser Phe Thr Ile Phe Asn Phe Gly Val

385 390 395 400

Gln Lys Glu Val Lys Ser Trp Gln Leu Phe Leu Cys Val Cys Val Gly

405 410 415

Leu Trp Ala Gly Leu Ile Ile Gly Phe Val Thr Glu Tyr Tyr Thr Ser

420 425 430

Asn Ala Tyr Ser Pro Val Gln Asp Val Ala Asp Ser Cys Arg Thr Gly

435 440 445

Ala Ala Thr Asn Val Ile Phe Gly Leu Ala Leu Gly Tyr Lys Ser Val

450 455 460

Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ile Ala Ile Ser Ile Phe Val Ser Phe Ser

465 470 475 480

Phe Ala Ser Met Tyr Gly Ile Ala Val Ala Ala Leu Gly Met Leu Ser

485 490 495

Thr Ile Ala Thr Gly Leu Ala Ile Asp Ala Tyr Gly Pro Ile Ser Asp

500 505 510

Asn Ala Gly Gly Ile Ala Glu Met Ala Gly Met Ser His Arg Ile Arg

515 520 525

Glu Arg Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ala Gly Asn Thr Thr Ala Ala Ile

530 535 540

Gly Lys Gly Phe Ala Ile Gly Ser Ala Ala Leu Val Ser Leu Ala Leu

545 550 555 560

Phe Gly Ala Phe Val Ser Arg Ala Gly Ile Ser Thr Val Asp Val Leu

565 570 575

Thr Pro Lys Val Phe Ile Gly Leu Ile Val Gly Ala Met Leu Pro Tyr

580 585 590

Trp Phe Ser Ala Met Thr Met Lys Ser Val Gly Ser Ala Ala Leu Lys

595 600 605

Met Val Glu Glu Val Arg Arg Gln Phe Asn Thr Ile Pro Gly Leu Met

610 615 620

Glu Gly His Ala Lys Pro Asp Tyr Ala Thr Cys Val Lys Ile Ser Thr

625 630 635 640

Asp Ala Ser Ile Lys Glu Met Ile Pro Pro Gly Ala Leu Val Met Leu

645 650 655

Thr Pro Leu Ile Ile Gly Thr Phe Phe Gly Val Glu Thr Leu Ser Gly

660 665 670

Val Leu Ala Gly Ser Leu Val Ser Gly Val Gln Ile Ala Ile Ser Ala

675 680 685

Ser Asn Thr Gly Gly Ala Trp Asp Asn Ala Lys Lys Tyr Ile Glu Ala

690 695 700

Gly Ala Ser Glu His Ala Arg Ser Leu Gly Pro Lys Gly Ser Glu Pro

705 710 715 720

His Lys Ala Ala Val Ile Gly Asp Thr Ile Gly Asp Pro Leu Lys Asp

725 730 735

Thr Ser Gly Pro Ser Leu Asn Ile Leu Ile Lys Leu Met Ala Val Glu

740 745 750

Ser Leu Val Phe Ala Pro Phe Phe Ala Thr His Gly Gly Leu Leu Phe

755 760 765

Lys Ile Phe

770

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 3

gcctataata ttcaatgcag ggtttcagtc cagggcatcc ataccaacat a 51

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 4

ctgggctgga cttattattg ggtttgtgga tgttgctgat tcctgccg 48

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 5

acagacaaga atgcc 15

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 6

tggggtctga tctttttggt cagatcagca ccgacatcag 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

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tcaaccatga tttcactgcc gataccacca ccgactctcc 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 8

tttttttctg gcgaggatgg cagatcagca ccgacatcag 40

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 9

tttttttctg gcgaggatgg cagatcagca ccgacatcag 40

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<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 10

atggaggttt gtcagtgata gccaatgctg gatggacgag gaa 43

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<211> 44

<212> DNA

<213> 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）

<400> 11

actgtgccaa tctacgaggg tagcgatacc tgagaacata gtgg 44

Claims

1.一种沙冬青焦磷酸酶，其特征在于为具有SEQ ID NO.2所示氨基酸残基序列的蛋白质。

2.沙冬青焦磷酸酶编码基因，其特征在于DNA序列为SEQ ID NO.1所示序列，或为编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的沙冬青焦磷酸酶编码基因，其特征在于：该基因的编码框为自5’端第353位到第2668位碱基的DNA序列。

4.含有权利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的编码基因的表达载体。

5.含有权利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的编码基因的细胞系。

6.如权利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的编码基因在植物耐盐耐旱性状改良中的应用。