CN112430259B - 小麦盐胁迫相关蛋白TaCSN5及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦盐胁迫相关蛋白TaCSN5及其编码基因与应用。将本发明的TaCSN5基因导入拟南芥和小麦中得到的转基因拟南芥和小麦，对盐胁迫的耐受性低于野生型拟南芥和小麦，RNAi干扰和Crispr编辑的TaCSN5转基因小麦对盐胁迫的耐受性高于野生型拟南芥和小面。本发明的蛋白和基因将在培育耐盐植物中发挥重要的作用。

Description

小麦盐胁迫相关蛋白TaCSN5及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小麦盐胁迫相关蛋白TaCSN5及其编码基因与应用。

背景技术

干旱、盐渍和高温等逆境胁迫严重影响小麦生长发育和产量。解析小麦在逆境胁迫下的应答与信号传导机制，提高小麦的耐胁迫能力，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。目前发现植物的耐盐抗旱胁迫信号网络中主要有植物激素信号途径、脂质体信号途径、SnRK2(sucrose non-fermenting1-related protein kinase 2)和MAPK(mitogen-activatedprotein kinase)信号途径、ROS(reactive oxygen species)信号途径以及气孔信号途径。这些信号网络系统将植物的激素调节、新陈代谢、能量供应以及生长发育密切联系在一起。这说明植物对高盐干旱等胁迫的适应，不仅依赖于耐逆相关基因的表达，还依赖于由干旱和高盐等胁迫诱导引发的各种信号通路的综合调控作用。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，蛋白调节因子在调控植物胁迫相关基因表达的过程中起着重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供小麦盐胁迫相关蛋白TaCSN5及其编码基因与应用。

第一方面，本发明要求保护TaCSN5蛋白或其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述TaCSN5蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述TaCSN5蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)序列表的序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由序列2衍生的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；

所述TaCSN5蛋白来源于麦类小麦属(Triticum aestivum L.)。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述应用具体体现为：所述TaCSN5蛋白或能够表达所述TaCSN5蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物耐逆性增加；

所述TaCSN5蛋白或能够表达所述TaCSN5蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物耐逆性降低。

第二方面，本发明保护培育耐逆性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中TaCSN5蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；所述TaCSN5蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，本发明要求保护培育转基因植物的方法，包括如下步骤：降低受体植物中能够表达TaCSN5蛋白的核酸分子的表达量，得到转基因植物；所述转基因植物耐逆性大于受体植物；所述TaCSN5蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

转基因植物耐逆性大于所述受体植物体现为如下(1)-(3)中任一种：

(1)盐胁迫条件下，转基因植物的存活率高于受体植物；

(2)盐胁迫条件下，转基因植物的MDA含量低于受体植物；

(3)盐胁迫条件下，转基因植物的脯氨酸含量高于受体植物。

所述“降低受体植物中能够表达TaCSN5蛋白的核酸分子的表达量”是通过RNAi干扰或Crispr编辑技术实现的。

所述RNAi干扰是通过向所述受体植物中导入含有RNAi干扰的重组表达载体实现的。所述Crispr编辑技术是通过向所述受体植物中导入Crispr编辑载体实现的。

所述RNAi干扰载体具体可为将序列表的序列3所示的DNA分子插入pWMB110载体的SmaI和SacI酶切位点间得到的表达载体。

用于所述Crispr编辑的重组载体具体可为将序列表的序列4所示的DNA分子插入pBUE411质粒的BsaI酶切位点得到的重组载体。

所述“能够表达TaCSN5蛋白的核酸分子”是如下任一所述的DNA分子：

(D1)序列表的序列1所示的DNA分子；

(D2)在严格条件下与(D1)限定的DNA分子杂交且编码所述TaCSN5蛋白的DNA分子；

(D3)与(D1)或(D2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述TaCSN5蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第三方面，本发明要求保护TaCSN5蛋白或其相关生物材料或以上任一所述的方法在植物育种中的应用；所述相关生物材料为前文所述的生物材料；所述TaCSN5蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述育种的目的是选育耐逆性高的植物。

以上任一所述耐逆性为耐盐性。

以上任一所述植物为(C1)或(C2)或(C3)：

(C1)双子叶植物或单子叶植物；

(C2)禾本科植物或十字花科植物；

(C3)小麦或拟南芥。

所述小麦具体可为Fielder。

所述拟南芥具体可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。

本发明的实验证明，本发明发现的TaCSN5基因在盐胁迫的诱导下表达，且将TaCSN5基因导入拟南芥和小麦中得到的转基因拟南芥和转基因小麦，其对以上盐胁迫的抗性低于野生型拟南芥和受体小麦Fielder，RNAi干扰和Crispr植物的盐胁迫的抗性高于受体小麦。本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。

附图说明

图1为转TaCSN5拟南芥盐胁迫处理萌发实验。

图2为转TaCSN5拟南芥盐胁迫处理根长实验。

图3为转TaCSN5拟南芥土壤盐胁迫表型鉴定及生理指标的测定。

图4为过表达TaCSN5和TaCSN5 RNAi小麦PCR阳性检测和表达量检测。

图5为过表达TaCSN5和TaCSN5 RNAi小麦盐胁迫表型鉴定及生理指标的测定。

图6为过表达TaCSN5和TaCSN5 Crispr小麦盐胁迫表型鉴定及生理指标的测定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。

下述实施例中的普通小麦(Triticum aestivum L.)品种小白麦记载于文献“孙海桃等，小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选，中国农业科学，2011,44(22)：4740-4747.”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；公众也可从国家种质资源库获得(编号为ZM242)。

下述实施例中的pWMB110载体记载于文献“Xiao-Yu Cui,Yuan Gao,Jun Guo,Tai-Fei Yu,Wei-Jun Zheng,Yong-Wei Liu,Jun Chen,Zhao-Shi Xu and You-Zhi Ma*.BES/BZR Transcription Factor TaBZR2 Positively Regulates Drought Responses byActivation of TaGST11.Plant Physiology.2019,180:605–620”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pBUE411质粒记载于文献“Yuan Zong,Yanpeng Wang,Chao Li,Rui Zhang,Kunling Chen,Yidong Ran,Jin-Long Qiu,Daowen Wang&Caixia Gao Precisebase editing in rice,wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminasefusion.Nature Biotechnology.2017,35:438-440”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

小麦品种Fielder记载于文献“Xiao-Yu Cui,Yuan Gao,Jun Guo,Tai-Fei Yu,Wei-Jun Zheng,Yong-Wei Liu,Jun Chen,Zhao-Shi Xu,and You-Zhi Ma BES/BZRTranscription Factor TaBZR2 Positively Regulates Drought Responses byActivation of TaGST1.Plant Physiology.2019,180:605-620”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、TaCSN5的克隆

一、植物材料的处理

将水培生长10天左右的小白麦(Triticumaestivumcv.Xiaobaimai)三叶期整株幼苗用液氮速冻，-80℃保存备用。

二、总RNA的提取

采用Trizol法(TianGen)提取步骤一获得的处理后的小白麦幼苗叶片的总RNA。

三、cDNA的获得

第一链cDNA合成用反转录酶XL(AMV)。采用SMART法合成ds cDNA，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。通过5’RACE和3’RACE的方法获得序列表中的序列1。上述序列1也可以通过人工合成的方式获得。

将序列表中序列1所示的基因命名为TaCSN5基因，其开放阅读框架为自序列表的序列1的5′端第1-1095位核苷酸，将该基因编码的蛋白命名为TaCSN5蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2，由364个氨基酸残基组成。

实施例2、转TaCSN5拟南芥的获得及其耐逆性分析

一、转TaCSN5基因拟南芥的获得

1、重组表达载体的构建

(1)TaCSN5基因的克隆

提取小白麦叶片总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA模板，采用引物对TaCSN5-1302F和TaCSN5-1302R进行扩增，得到PCR产物。引物序列如(引物末端分别引入NcoI酶切识别位点，如下划线序列所示)：

TaCSN5-1302F：5'-GGGACTCTTGACCATGATGGAGCCCACCTCGTC-3'；

TaCSN5-1302R：5'-TCAGATCTACCATGGCTGCTTCGACCATGGGCTC-3。

将PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，其大小为1.1kb。并将该PCR产物进行测序，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1，即为TaCSN5基因。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.:DV807A)回收纯化大小为1.1kb的PCR产物。

(2)用限制性内切酶NcoI酶切步骤(1)回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；用限制性内切酶NcoI酶切pCAMBIA1302载体(Clontech公司)，回收载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物；

(3)将步骤(2)获得的连接产物热击转化TOP10菌株(Tiangen，CB104-03)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序。

测序结果表明，该质粒为将序列表中的序列1第1-1092位核苷酸所示的DNA片段插入pCAMBIA1302载体的NcoI酶切位点间得到的载体，并将该质粒命名为pCAMBIA1302-TaCSN5。

2、重组菌的构建

(1)将步骤1获得的重组质粒pCAMBIA1302-TaCSN5转化农杆菌GV3101(购自北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。

(2)提取重组农杆菌的质粒送去测序，结果表明该质粒为pCAMBIA1302-TaCSN5，证明该重组菌为阳性重组农杆菌，并将其命名为GV3101/pCAMBIA1302-TaCSN5。

3、转TaCSN5拟南芥的获得

(1)将重组农杆菌GV3101/pCAMBIA1302-TaCSN5接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

(2)将步骤(1)获得的菌液转至YEP液体培养基(含50μg/ml利福平及卡那)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

(3)收集菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD600约为1.0；

(4)将拟南芥哥伦比亚生态型Col-0(美国拟南芥信息资源网，以下简称为野生型拟南芥，购自SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤(3)的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，混收T₀代转TaCSN5拟南芥种子。将T₀代转TaCSN5拟南芥种子播种到含有50mg/ml潮霉素的MS培养基上进行培养，得到7株T₁代转TaCSN5拟南芥幼苗。

分别将T₁代转TaCSN5拟南芥播种、自交，直到得到T₃代转TaCSN5拟南芥。

(5)提取T₃代转TaCSN5拟南芥植株的基因组DNA，以TaCSN5-1302F和TaCSN5-1302R为引物进行PCR检测，得到条带大小为1.1kb的阳性T₃代转TaCSN5拟南芥植株。

4、转空载体拟南芥的获得

采用pCAMBIA1302载体替代重组质粒pCAMBIA1302-TaCSN5，按照步骤2和步骤3所述的方法转化拟南芥，得到T₃代转空载体拟南芥植株。

二、转TaCSN5拟南芥的耐逆性分析

1、转TaCSN5拟南芥在盐胁迫下的种子萌发实验

分别将编号为#1、#3和#7的T₃代转TaCSN5拟南芥种子、野生型拟南芥种子(WT)和T₃代转空载体拟南芥种子播种在播种至含有不同浓度的NaCl(60mM、80mM和100mM NaCl)的1/2MS培养基上。经过3天的春化处理后在正常条件下进行培养，连续观察培养12、24、36、48、60、72、84、96、120小时后的各植株的萌发情况并统计萌发率。每个株系80个，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图1A和图1B所示，在正常条件下，转TaCSN5拟南芥和和WT的萌发率没有差别。在60mM、80mM和100mM NaCl处理下，T₃代转TaCSN5拟南芥种子和野生型拟南芥种子(WT)萌发率均有下降，但转TaCSN5拟南芥萌发率显著低于WT。转空载体拟南芥的萌发率与WT无显著差异。

2、转TaCSN5拟南芥在盐胁迫下的根长实验

分别将编号为#1、#3和#7的阳性T₃代转TaCSN5拟南芥种子、野生型拟南芥种子(WT)和T₃代转空载体拟南芥种子播种在1/2MS培养基上，经过3天春化处理后在正常条件下进行培养，正常生长6天后移至含有不同浓度NaCl(0mM、85mM、100mM和120mM)的1/2MS培养基上进行培养，培养7天后统计总根长。每个株系30株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图2A、B、C所示，T₃代转TaCSN5拟南芥在85mM、100mM和120mM的NaCl处理条件下长势均差于WT，而且转TaCSN5拟南芥叶片出现白化表型，盐胁迫条件下总根长短于野生型拟南芥，转TaCSN5拟南芥鲜重低于野生型拟南芥。在正常条件下，转TaCSN5拟南芥和WT的根长和鲜重没有差别。转空载体拟南芥的根长和鲜重与WT无显著差异。

3、转TaCSN5拟南芥在土壤中盐胁迫下的存活率实验

分别将编号为#1、#3和#7的阳性T₃代转TaCSN5拟南芥种子、野生型拟南芥种子(WT)和T₃代转空载体拟南芥种子播种在1/2MS培养基上，经过3天的春化处理后在正常条件下进行培养，培养一周后移至培养盆(蛭石：营养土为1:1)中，在16/8h的光照/黑暗培养室(22℃)培养，2周后用含250mM NaCl的水溶液浇灌(自然渗吸)进行高盐胁迫处理，处理10天后观察各植株的生长状态并统计存活率。每个株系30株，实验重复三次，结果取平均值。

结果如图3A、B、C、D所示，编号为#1、#3和#7的T₃代转TaCSN5拟南芥在盐胁迫处理后，长势均差于野生型拟南芥(WT)，转TaCSN5拟南芥存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型拟南芥(WT)。转TaCSN5拟南芥MDA含量显著高于野生型拟南芥。在正常条件下野生型拟南芥与转TaCSN5拟南芥无明显差异。转空载体拟南芥的各项数据与WT无显著差异。

脯氨酸含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司脯氨酸(PRO)含量测试盒(Comin公司，Code No.:PRO-2-Y)进行脯氨酸含量测定。称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；之后置90℃振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。取0.5mL样本+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min，每10min振荡一次。待冷却后，在试管中加入1mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8mL-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，于520nm波长处比色，记录吸光值A，并计算脯氨酸含量。

MDA含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司丙二醛(MDA)测试盒(Comin公司，Code No.:MDA-2-Y)进行MDA含量测定。称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.2mL样本,混匀。95℃水浴中保温30min，置于冰浴中冷却，10000g，25℃，离心10min。吸取上清液于200ul玻璃比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，记为A532和A600并计算MDA含量。

实施例3、转基因TaCSN5小麦的获得及其耐逆性分析

一、转TaCSN5小麦的获得

1、过表达TaCSN5重组载体的构建

(1)TaCSN5基因的扩增

以pCAMBIA1302-TaCSN5为模板，采用引物TaCSN5-110F和TaCSN5-110R进行扩增，得到PCR产物。引物序列如下，引物末端分别引入BamHI酶切识别位点并用下划线标注：

TaCSN5-110F：5'-CGACTCTAGAGGATCCATGGAGCCCACCTCGTC-3'；

TaCSN5-110R：5'-GGGTACCCGGGGATCCTCATGCTTCGACCATGGG-3'。

将PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，其大小为1.1kb。并将该PCR产物进行测序，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1，即为TaCSN5基因。

采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.:DV807A)回收纯化大小为1.1kb的PCR产物。

(2)用限制性内切酶BamHI酶切步骤(1)回收纯化的PCR产物，回收酶切产物；用限制性内切酶BamHI酶切pWMB110载体，回收载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物；

(3)将步骤(2)获得的连接产物热击转化TOP10菌株(Tiangen，CB104-03)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序。

测序结果表明，该质粒为将序列表中的序列1所示的DNA片段插入pWMB110载体的BamHI酶切位点间得到的载体，并将该质粒命名为pWMB110-TaCSN5，相关信息如图4A所示。

2、RNAi干扰TaCSN5重组载体的构建

(1)TaCSN5 RNAi干扰载体构建的具体操作为：人工合成序列1中的第376-600位核苷酸序列和它的反向互补序列，中间为146bp的玉米alcohol dehydrogenase(Adh)基因序列作为内含子，5’端加上SmaI酶切位点，3’端加上SacI酶切位点，其中片段合成由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成，具体合成序列片段如序列3所示。

(2)将pWMB110载体用SmaI和SacI酶切，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.:DV807A)回收酶切产物。并将(1)中人工合成的片段插入SmaI和SacI酶切的pWMB110载体中，构建成TaCSN5-pWMB110-RNAi干扰载体，相关信息如图4B所示。

3、TaCSN5 Crispr编辑载体的构建

(1)根据TaCSN5 PAM位点与sgRNA前导序列设计原则(NGG/NAG上游的19bp序列、PAM位点上游1-8个碱基包含常见内切位点、尽量减少脱靶效应的产生)在http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/选择sgRNA引导序列：

TaCSN5-sgRNA1：5'-AGATCATGGGCCTCATGCA-3'；

TaCSN5-sgRNA2：5'-CTGGAGAACAACATCCCGG-3'。

根据TaCSN5-sgRNA1和TaCSN5-sgRNA2设计如下序列将sgRNA分别构建到两个U6启动子上：

TaCSN5-MT1T2-R:5'-ATTATTGGTCTCTAAACCCGGGATGTTGTTCTCCAG-3'；

TaCSN5-MT1T2-R0:5'-CCGGGATGTTGTTCTCCAGCGCTTCTTGGTGCC-3'；

TaCSN5-MT1T2-F:5'-AATAATGGTCTCAGGCGAGATCATGGGCCTCATGCA-3'；

TaCSN5-MT1T2-F0:5'-GAGATCATGGGCCTCATGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'。

(2)具体操作如下：以TaCSN5-MT1T2-F0和TaCSN5-MT1T2-R0为引物，以pCBCMT1T2为模板扩增片段A；已A片段为模板，以TaCSN5-MT1T2-F和TaCSN5-MT1T2-R为引物扩增片段B。将片段B用BsaI酶切，采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa公司，Code No.:DV807A)回收酶切产物。

(3)用BsaI对pBUE411载体进行酶切，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(TaKaRa公司，Code No.:DV807A)回收载体骨架；并将酶切后的B片段(如序列4所示)和BsaI酶切后的pBUE411质粒骨架进行连接，得到TaCSN5-pBUE411-Crispr载体。

4、重组菌的构建

(1)将步骤1、2、3获得的重组质粒pWMB110-TaCSN5，TaCSN5-pWMB110-RNAi，TaCSN5-pBUE411-Crispr分别转化农杆菌EHA105(购自北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。

(2)提取重组农杆菌的质粒送去测序，结果表明pWMB110-TaCSN5，TaCSN5-pWMB110-RNAi，TaCSN5-pBUE411-Crispr重组菌均为阳性重组农杆菌，并将其分别命名为EHA105/pWMB110-TaCSN5，EHA105/TaCSN5-pWMB110-RNAi，EHA105/TaCSN5-pBUE411-Crispr。

5、转TaCSN5小麦的获得和检测

(1)将重组农杆菌EHA105/pWMB110-TaCSN5，EHA105/TaCSN5-pWMB110-RNAi，EHA105/TaCSN5-pBUE411-Crispr分别接种于YEP液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

(2)将步骤(1)获得的菌液转至YEP液体培养基(含50μg/ml利福平及卡那)中，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

(3)收集步骤(2)获得的菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD600约为1.0；

(4)超净工作台内，用1ml注射器针头挑取农杆菌菌落，注射小麦品种Fielder幼胚，然后将注射后的幼胚在无菌、高湿条件下培养，直至组培小麦苗长出，继续培养小麦苗，直至收获T₀代TaCSN5过表达，RNAi干扰和Crispr编辑小麦种子。

分别将T₀代TaCSN5过表达，RNAi干扰和Crispr编辑小麦种子播种、自交，直到得到T₃代小麦。

(5)利用qRT-PCR，PCR和Bar试纸条检测TaCSN5过表达和TaCSN5RNAi干扰小麦阳性植株。

对于qRT-PCR检测TaCSN5过表达和TaCSN5 RNAi干扰小麦表达量具体操作如下:分别提取TaCSN5过表达，TaCSN5 RNAi干扰不同小麦株系和受体小麦叶片RNA，反转录为cDNA，以如下序列为引物进行qRT-PCR检测：

TaCSN5-qRT-F:5'-GTCGCCGCTGGCTAAGGT-3'；

TaCSN5-qRT-R：5'-GCTTGCCTTGCTTTTGCT-3'。

结果如图4C,D所示，过表达株系表达量均比Fielder有明显提高，且310-5-2-1,311-1-9和311-2-11表达量相对一致，此后命名为#1，#9,#11以作为后续实验分析。干扰株系TaCSN5-RNAi-8，TaCSN5-RNAi-9，TaCSN5-RNAi-10表达量相对于Fielder有明显降低，且表达量相似，此后命名为Ri-8和Ri-10以作为后续试验分析。

对于PCR检测，分别提取TaCSN5过表达和TaCSN5 RNAi干扰不同小麦株系和受体小麦叶片DNA。

对于TaCSN5过表达植株PCR检测，以DNA为模板，以如下序列为引物进行检测：

110-JC-F：5'-CCCTgTTgTTTggTgTTACTTCTg-3'；

TaCSN5-qRT-R：5'-GCTTGCCTTGCTTTTGCT-3'。

对于TaCSN5过表达植株PCR检测，以DNA为模板，以如下序列为引物进行检测：

110-JC-F：5'-CCCTgTTgTTTggTgTTACTTCTg-3'；

RNAi-JianR:5'-CCAAGGTATCTAATCAGCCATC-3'。

结果如图4E,F所示，在阳性株系中均能检测到特异性条带，在受体Fidler中没有特异性条带，说明上述均为阳性株系。

由于pWMB110载体中带有抗除草剂Bar标签，所以利用QuickStix Kit(EnviroLogix,USA AS013LS)试剂盒对TaCSN5过表达和TaCSN5 RNAi干扰小麦株系进行Bar试纸条进行检测。如图4G，H所示，TaCSN5过表达和TaCSN5 RNAi干扰小麦株系均为阳性株系，但是Fielder没有检测到Bar。

(6)TaCSN5 Crispr编辑小麦检测

提取TaCSN5 Crispr编辑小麦DNA，用如下引物进行扩增：

TaCSN5-sgRNA-F：5'-AGCGGAGCCCGAACCGAGCAGA-3'；

TaCSN5-sgRNA-R：5'-ACAAAGGCAGACAAGTTCA-3'。

对扩增产物进行测序，检测TaCSN5Crispr编辑株系，测序结果表明TaCSN5-Crispr编辑小麦株系#2和#3出现碱基缺失，并作为候选实验分析。

二、转空载体小麦的获得

1、采用pWMB110载体替代pWMB110-TaCSN5和TaCSN5-pWMB110-RNAi干扰载体，转化小麦品种Fielder，得到T₃转空载体小麦(pWMB110)。

2、采用pBUE411质粒替代TaCSN5-pBUE411-Crispr载体，转化小麦品种Fielder，得到T₃转空载体小麦(pBUE411)。

三、转TaCSN5小麦的耐逆性分析

1、分别将编号为#1、#9和#11的T₃代过表达TaCSN5小麦种子、编号为Ri-8和Ri-10的TaCSN5RNAi干扰种子、T₃转空载体小麦(pWMB110)、T₃转空载体小麦(pBUE411)及Fielder种子播种在小盆中正常生长7天，再用400mM NaCl进行盐胁迫处理16天，观察生长状态并测定相关生理指标。

结果如图5所示，编号为#1、#9和#11的T₃代过表达TaCSN5小麦在400mM的NaCl的处理后，长势均差于Fielder，编号为Ri-8和Ri-10的TaCSN5RNAi干扰小麦幼苗在400mM的NaCl的霍格兰培养基处理后，长势好于Fielder，且TaCSN5 RNAi干扰小麦脯氨酸含量和存活率高于Fielder，TaCSN5 RNAi干扰小麦MDA含量低于Fielder。正常条件下TaCSN5过表达，TaCSN5RNAi干扰和Fielder小麦无明显差别。转空载体小麦(pWMB110)和T₃转空载体小麦(pBUE411)与野生型小麦在各项数据无显著差异。

2、分别将编号为#1、#9和#11的T₃代过表达TaCSN5小麦种子、编号为#2和#3的基因编辑小麦种子、T₃转空载体小麦(pWMB110)、T₃转空载体小麦(pBUE411)及Fielder种子播种在小盆中正常生长7天，再用400mM NaCl进行盐胁迫处理16天，观察生长状态并测定相关生理指标。

结果如图6所示编号为#1、#9和#11的T₃代过表达TaCSN5小麦在400mM的NaCl的处理后，长势均差于Fielder，编号为#2和#3的TaCSN5 Crispr干扰小麦幼苗在400mM的NaCl的霍格兰培养基处理后，长势好于Fielder，且TaCSN5 Crispr编辑小麦脯氨酸含量和存活率高于Fielder，TaCSN5 Crispr编辑小麦MDA含量低于Fielder。正常条件下TaCSN5过表达，TaCSN5 Crispr和Fielder小麦无明显差别。转空载体小麦(pWMB110)和T₃转空载体小麦(pBUE411)与野生型小麦在各项数据无显著差异。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 小麦盐胁迫相关蛋白TaCSN5及其编码基因与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1095

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 1

atggagccca cctcgtcgtc ggcggtggcg aggcagacgt gggagctgga gaacaacatc 60

ccggcggccg cctccgaccc ggacgccatg gacgcgatct accactacga cgaggcggcc 120

aacgcgcggg cccaccagga gaagccctgg gccaccgacc cgcaccactt ccgccgtgcc 180

aggatctccg ccctcgcgct cctcaagatg gtcgtccacg cccgcgccgg cggcaccatc 240

gagatcatgg gcctcatgca gggcaagttc gagggcgact ccatcatcgt catggacgcc 300

ttcgcgctcc ccgtcgaggg caccgagacc agggtcaacg cccaggccga cgcctacgag 360

tacatggtcg agtactccac catcaacaag caggctggaa ggttggaaaa tgtggttggc 420

tggtaccact cacatcctgg ttatggatgc tggctgtcag gcattgatgt ttcaactcag 480

atgcttaatc agcagtttca agaaccatgg ttggctgttg tgatagaccc tacaaggact 540

gtttctgctg gtaaagtgga cattggagct tttaggacat acccaaaaga ttacaagcca 600

ccggatgagc ctgtgtctga gtatcagacc ataccactca acaagataga agattttggt 660

gttcactgca aacagtacta ttctttggat ataacctatt tcaagtcatc cctggactct 720

cacctccttg atctactctg gaacaagtac tgggtcaaca cattatcttc atcaccactt 780

ctgggcaaca gggattatgt tgctggacaa atctttgatt tagctgataa actagagcaa 840

gctgaagggc aactggcaca cagtcgattt ggcatgctta tgccatcaca gcgaaagaaa 900

gagcaagagg agtcgccgct ggctaaggta acccgggata gctccaaaat tactgctgaa 960

caggttcatg gtctcatgtc acaggtcatc aaggacatcc tcttcaactc tgtgcacccg 1020

tcaagcaaaa gcaaggcaag cggaagcgga accgccccag attcacctgt gcctgagccc 1080

atggtcgaag catga 1095

<210> 2

<211> 364

<212> PRT

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 2

Met Glu Pro Thr Ser Ser Ser Ala Val Ala Arg Gln Thr Trp Glu Leu

1 5 10 15

Glu Asn Asn Ile Pro Ala Ala Ala Ser Asp Pro Asp Ala Met Asp Ala

20 25 30

Ile Tyr His Tyr Asp Glu Ala Ala Asn Ala Arg Ala His Gln Glu Lys

35 40 45

Pro Trp Ala Thr Asp Pro His His Phe Arg Arg Ala Arg Ile Ser Ala

50 55 60

Leu Ala Leu Leu Lys Met Val Val His Ala Arg Ala Gly Gly Thr Ile

65 70 75 80

Glu Ile Met Gly Leu Met Gln Gly Lys Phe Glu Gly Asp Ser Ile Ile

85 90 95

Val Met Asp Ala Phe Ala Leu Pro Val Glu Gly Thr Glu Thr Arg Val

100 105 110

Asn Ala Gln Ala Asp Ala Tyr Glu Tyr Met Val Glu Tyr Ser Thr Ile

115 120 125

Asn Lys Gln Ala Gly Arg Leu Glu Asn Val Val Gly Trp Tyr His Ser

130 135 140

His Pro Gly Tyr Gly Cys Trp Leu Ser Gly Ile Asp Val Ser Thr Gln

145 150 155 160

Met Leu Asn Gln Gln Phe Gln Glu Pro Trp Leu Ala Val Val Ile Asp

165 170 175

Pro Thr Arg Thr Val Ser Ala Gly Lys Val Asp Ile Gly Ala Phe Arg

180 185 190

Thr Tyr Pro Lys Asp Tyr Lys Pro Pro Asp Glu Pro Val Ser Glu Tyr

195 200 205

Gln Thr Ile Pro Leu Asn Lys Ile Glu Asp Phe Gly Val His Cys Lys

210 215 220

Gln Tyr Tyr Ser Leu Asp Ile Thr Tyr Phe Lys Ser Ser Leu Asp Ser

225 230 235 240

His Leu Leu Asp Leu Leu Trp Asn Lys Tyr Trp Val Asn Thr Leu Ser

245 250 255

Ser Ser Pro Leu Leu Gly Asn Arg Asp Tyr Val Ala Gly Gln Ile Phe

260 265 270

Asp Leu Ala Asp Lys Leu Glu Gln Ala Glu Gly Gln Leu Ala His Ser

275 280 285

Arg Phe Gly Met Leu Met Pro Ser Gln Arg Lys Lys Glu Gln Glu Glu

290 295 300

Ser Pro Leu Ala Lys Val Thr Arg Asp Ser Ser Lys Ile Thr Ala Glu

305 310 315 320

Gln Val His Gly Leu Met Ser Gln Val Ile Lys Asp Ile Leu Phe Asn

325 330 335

Ser Val His Pro Ser Ser Lys Ser Lys Ala Ser Gly Ser Gly Thr Ala

340 345 350

Pro Asp Ser Pro Val Pro Glu Pro Met Val Glu Ala

355 360

<210> 3

<211> 612

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccccgggt ccaccatcaa caagcaggct ggaaggttgg aaaatgtggt tggctggtac 60

cactcacatc ctggttatgg atgctggctg tcaggcattg atgtttcaac tcagatgctt 120

aatcagcagt ttcaagaacc atggttggct gttgtgatag accctacaag gactgtttct 180

gctggtaaag tggacattgg agcttttagg acatacccaa aagattacaa gccagatccg 240

atcgaaaaac gggagtctgc ccctaagaca gataagccgc caagaaggcg caagtcaacc 300

gcgagttgtt gtatcatatc tactgacaaa gatcacaaat gggatggctg attagatacc 360

ttggcctccc agatcgattc tggcttgtaa tcttttgggt atgtcctaaa agctccaatg 420

tccactttac cagcagaaac agtccttgta gggtctatca caacagccaa ccatggttct 480

tgaaactgct gattaagcat ctgagttgaa acatcaatgc ctgacagcca gcatccataa 540

ccaggatgtg agtggtacca gccaaccaca ttttccaacc ttccagcctg cttgttgatg 600

gtggagagct cg 612

<210> 4

<211> 1367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtctccaag ttctaggatt ttcagaactg caacttattt tatcaaggaa tctttaaaca 60

tacgaacaga tcacttaaag ttcttctgaa gcaacttaaa gttatcaggc atgcatggat 120

cttggaggaa tcagatgtgc agtcagggac catagcacaa gacaggcgtc ttctactggt 180

gctaccagca aatgctggaa gccgggaaca ctgggtacgt tggaaaccac gtgatgtgaa 240

gaagtaagat aaactgtagg agaaaagcat ttcgtagtgg gccatgaagc ctttcaggac 300

atgtattgca gtatgggccg gcccattacg caattggacg acaacaaaga ctagtattag 360

taccacctcg gctatccaca tagatcaaag ctgatttaaa agagttgtgc agatgatccg 420

tggcgagatc atgggccctc atgcagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 480

tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttttt tcgttttgca 540

ttgagttttc tccgtcgcat gtttgcagtt ttattttccg ttttgcattg aaatttctcc 600

gtctcatgtt tgcagcgtgt tcaaaaagta cgcagctgta tttcacttat ttacggcgcc 660

acattttcat gccgtttgtg ccaactatcc cgagctagtg aatacagctt ggcttcacac 720

aacactggtg acccgctgac ctgctcgtac ctcgtaccgt cgtacggcac agcatttgga 780

attaaagggt gtgatcgata ctgcttgctg ctcatgaatc caaaccacac ggagttcaaa 840

ttcccacaga ttaaggctcg tccgtcgcac aaggtaatgt gtgaatatta tatctgtcgt 900

gcaaaattgc ctggcctgca caattgctgt tatagttggc ggcagggaga gttttaacat 960

tgactagcgt gctgataatt tgtgagaaat aataattgac aagtagatac tgacatttga 1020

gaagagcttc tgaactgtta ttagtaacaa aaatggaaag ctgatgcacg gaaaaaggaa 1080

agaaaaagcc atactttttt ttaggtagga aaagaaaaag ccatacgaga ctgatgtctc 1140

tcagatgggc cgggatctgt ctatctagca ggcagcagcc caccaacctc acgggccagc 1200

aattacgagt ccttctaaaa gctcccgccg aggggcgctg gcgctgctgt gcagcagcac 1260

gtctaacatt agtcccacct cgccagttta cagggagcag aaccagctta taagcggagg 1320

cgcggcacca agaagcgctg gagaacaaca tcccgggttt tagagct 1367

Claims (8)

1.TaCSN5蛋白或其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述TaCSN5蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述TaCSN5蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)在(A1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述耐逆性为耐盐性；

所述植物为小麦或拟南芥。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用具体体现为：所述TaCSN5蛋白或能够表达所述TaCSN5蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物耐逆性增加；

所述TaCSN5蛋白或能够表达所述TaCSN5蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量升高，植物耐逆性降低。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述能够表达所述TaCSN5蛋白的核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

4.培育耐逆性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中TaCSN5蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

所述TaCSN5蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A4)在(A1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述耐逆性为耐盐性；

所述植物为小麦或拟南芥。

5.培育转基因植物的方法，包括如下步骤：降低受体植物中能够表达TaCSN5蛋白的核酸分子的表达量，得到转基因植物；所述转基因植物耐逆性大于受体植物；

所述TaCSN5蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A4)在(A1)所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述耐逆性为耐盐性；

所述植物为小麦或拟南芥。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中能够表达TaCSN5蛋白的核酸分子的表达量是通过RNAi干扰或Crispr编辑技术实现的。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述能够表达TaCSN5蛋白的核酸分子为序列表中序列1所示的DNA分子。

8.TaCSN5蛋白或其相关生物材料或权利要求4至7任一所述的方法在植物育种中的应用；所述育种的目的是选育耐逆性高的植物；

所述相关生物材料为能够表达所述TaCSN5蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述TaCSN5蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A4)在(A1所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述耐逆性为耐盐性；

所述植物为小麦或拟南芥。

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