CN112481291B

CN112481291B - GmSAP16蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

Info

Publication number: CN112481291B
Application number: CN201910777491.3A
Authority: CN
Inventors: 马有志; 徐兆师; 张向展; 于太飞; 陈隽; 陈明; 周永斌
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2039-08-22
Also published as: CN112481291A

Abstract

本发明公开了一种GmSAP16蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。本发明提供的的GmSAP16可以提高植物的耐盐性和抗旱性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

Description

GmSAP16蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及GmSAP16蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。

背景技术

干旱、高盐及低温等逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。因此，了解大豆对逆境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及大豆品种改良的重要任务之一。

在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

低温、干旱、土壤盐渍化是影响农业生产的严重问题。在有关植物抗逆境的众多研究中，科学家也克隆了许多不同来源的与抗逆境相关的功能基因并把它们转化到植物体中，但所取得的效果并不理想。植物的抗逆性状是多基因控制的复杂性状。植物对干旱、高盐及低温耐受性的强弱往往不取决于某一单一因子，其性状受许多因子影响。进一步对处于信号传导途径中的蛋白调节因子在植物多种信号途径相互作用中的调控机制进行研究，对深入理解植物的生物胁迫和非生物胁迫应答过程具有重要意义。因此，利用一个关键性蛋白调节因子促进多个功能基因的表达，从而增强植物的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种GmSAP16蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用。

第一方面，本发明要求保护GmSAP16蛋白或其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述GmSAP16蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述GmSAP16蛋白为如下任一所示蛋白质：

(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

所述GmSAP16蛋白来源于大豆。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

所述应用具体体现为：所述GmSAP16蛋白或能够表达所述GmDof41蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物耐逆性增加；所述GmSAP16蛋白或能够表达所述GmSAP16蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物耐逆性降低。

第二方面，本发明保护培育耐逆性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GmSAP16蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；所述GmSAP16蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

进一步地，本发明要求保护培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmSAP16蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物耐逆性大于受体植物；所述GmSAP16蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述“向受体植物中导入能够表达GmSAP16蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述GmSAP16蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。

可用现有的表达载体构建含有所述GmSAP16蛋白的编码基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmSAP16蛋白的编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用GmSAP16蛋白的编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

在本发明中，所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA1302的NcoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端1至576位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒。

在本发明中，所述重组表达载体具体可为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的重组载体。

在上述方法中，将携带有所述GmSAP16蛋白的编码基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。

所述“能够表达GmSAP16蛋白的核酸分子”是如下任一所述的DNA分子：

(D1)序列表的序列2所示的DNA分子；

(D2)在严格条件下与(D1)限定的DNA分子杂交且编码所述GmDof41蛋白的DNA分子；

(D3)与(D1)或(D2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述GmSAP16蛋白的DNA分子。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

第三方面，本发明要求保护上述GmSAP16蛋白或其相关生物材料，或，以上任一所述的方法在植物育种中的应用。

所述育种的目的是选育耐逆性高的植物。

以上任一所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性。

以上任一所述植物为(C1)或(C2)或(C3)：

(C1)双子叶植物或单子叶植物；

(C2)豆科植物或十字花科植物；

(C3)大豆或拟南芥。

所述拟南芥具体可为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)。

所述大豆具体可为大豆Williams 82。

实验表明，本发明的GmSAP16可以提高植物的耐盐性和抗旱性，可以用于制备提高植物抗逆性的产品以及直接用于抗逆，为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。

附图说明

图1为野生型和转基因拟南芥耐盐性检测结果。A：盐胁迫处理对照与250mM NaCl处理14天后的野生型与转基因植株；B:盐胁迫处理对照和盐处理后存活率。C:盐胁迫处理对照和盐处理后脯氨酸含量测定。D:盐胁迫处理对照和盐处理后丙二醛含量测定。OE-2、OE-3和OE-5分别为GmSAP16-2、GmSAP16-3和GmSAP16-5，为三个转GmSAP16基因株系。**表示与WT相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图2为野生型和转基因拟南芥抗旱性检测结果。A：干旱处理对照与干旱处理14天后的野生型与转基因植株；B:干旱处理对照与干旱处理14天后的野生型与转基因植株的存活率；C:干旱胁迫处理对照和干旱处理后脯氨酸含量测定。D:干旱胁迫处理对照和干旱处理后丙二醛含量测定。OE-2、OE-3和OE-5分别为GmSAP16-2、GmSAP16-3和GmSAP16-5，为三个转GmSAP16基因株系。**表示与WT相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图3为侵染不同菌株大豆的耐盐性检测结果。A:盐胁迫处理对照；B:250mM NaCl处理7天后的大豆植株。C：250mM NaCl处理10天后的大豆植株。GmSAP16-RNAi、CK和GmSAP16-OE分别表示侵染了K599-GmSAP16-RNAi，K599-pCAMBIA3301和K599-35S：GmSAP16的大豆。

图4为侵染不同菌株大豆的耐旱性检测结果。A:干旱胁迫处理对照；B:干旱胁迫处理14天后的大豆植株。C：复水3天后的大豆植株。GmSAP16-RNAi、CK和GmSAP16-OE分别表示侵染了K599-GmSAP16-RNAi，K599-pCAMBIA3301和K599-35S：GmSAP16的大豆。

图5为侵染不同菌株大豆表达量检测和在干旱及盐胁迫条件下的生理指标检测。A:侵染不同菌株大豆表达量检测；B:叶绿素含量的测定；C:脯氨酸含量的测定；D:丙二醛含量的测定。GmSAP16-RNAi、CK和GmSAP16-OE分别表示侵染了K599-GmSAP16-RNAi，K599-pCAMBIA3301和K599-35S：GmSAP16的大豆。**表示与CK相比差异达到极显著水平(p<0.01)。

图6为GmSAP16受胁迫诱导表达的荧光实时定量(Real-time)PCR图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的pCAMBIA3301载体、发根农杆菌K599和大豆Williams 82均由中国农业科学院作物科学研究所张辉研究员提供，记载在文章DOi:

10.1038/srep10342“Sun et al.，Targeted mutagenesis in soybean usingthe CRISPR-Cas9 system，Scientific Reports，2015.5.29”))，经张辉研究员同意后公众可从申请人处获得，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、GmSAP16基因可以提高拟南芥的耐盐性和抗旱性

本实施例提供了一种来源于大豆品种中黄39(中国农业科学院作物科学研究所)的基因，其名称为GmSAP16基因，其cDNA的序列为序列表中序列2，开放阅读框架为自序列表的序列2的5′端第1至579位，编码序列表中序列1所示的GmSAP16蛋白质。GmSAP16基因及其编码的蛋白质可以提高植物的耐盐性和抗旱性，具体检测步骤如下：

一、重组表达载体的构建

1、GmSAP16基因的克隆

根据GmSAP16基因的序列设计引物对(GmSAP16-1302F和GmSAP16-1302R)，引物分别引入NcoI酶切识别位点，以中黄39大豆cDNA为模板PCR扩增GmSAP16基因。

GmSAP16-1302F：5'-GGGACTCTTGACCATGATGGCATCGGGTGGAA-3'；

GmSAP16-1302R：5'-TCAGATCTACCATGGCATAGGCCTTAACAGAA-3'。

PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0(TaKaRa公司,Code No.:DV807A)回收纯化800bp左右的条带。

2、重组表达载体的构建

①用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收步骤1PCR产物；

②用限制性内切酶NcoI酶切pCAMBIA1302载体(Clontech公司)，回收载体骨架；

③将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接；

④将步骤③的连接产物电击转化TOP10菌株(天根生化科技(北京)有限公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒，将序列正确的重组质粒命名为pCAMBIA1302-GmSAP16，pCAMBIA1302-GmSAP16为在pCAMBIA1302的NcoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'端1至576位核苷酸所示的DNA片段得到的重组质粒，pCAMBIA1302-GmSAP16能表达GmSAP16。

二、转基因植物的获得

1、将步骤一得到的重组质粒pCAMBIA1302-GmSAP16导入农杆菌C58C1(北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌C58C1-pCAMBIA1302-GmSAP16。

2、将重组农杆菌C58C1-pCAMBIA1302-GmSAP16接种于LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素)液体培养基中，28℃、3000rpm培养约30小时；

3、将步骤2的菌液转至LB(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素)中进行扩大培养，28℃、300rpm培养约14小时(菌液OD600达到1.5-3.0)；

4、步骤3完成后收集菌体，4℃、4000g离心10min，用转化液(该转化液为向MS液体培养基中添加蔗糖和silwet得到的蔗糖和silwet质量百分比浓度分别为10％和0.02％的液体)重悬菌体得到菌体悬液，菌体悬液的OD600约为0.8-1.0；

5、将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司)整株与花盆一起倒扣在盛有步骤4的菌体悬液的容器中，使花序在菌体悬液中浸泡50s左右，浸泡完毕后，取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑色塑料布，24hr后揭开塑料布，直立放置花盆，进行正常的光照培养，收获T₁代种子，将T₁代种子播种于含有潮霉素的培养基(潮霉素浓度为50μg/L)中利用卡那霉素筛选得到T₁代阳性植株。

T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。将T₁代阳性植株得到的T₃代植株进行在DNA和cDNA水平鉴定(DNA水平鉴定的引物对：F:5'-TGCCTGAAATCCGACCACAA-3'；R:5'-TCAGCAGGGAAACGATGCTT-3'；预期条带为260bp；cDNA水平鉴定的引物对：GmSAP16-qRTF:5'-CGATTTTCTTCCTTTCACC；GmSAP16-qRTR:5'-GCTTCGCAAACAACAACCT-3'；预期条带为123bp)。从阳性植株中筛选得到在DNA和cDNA水平上的鉴定结果中均含有目的条带转基因植株，记为转GmSAP16基因植株。

按照步骤2-5的方法，将pCAMBIA1302-GmSAP16替换为pCAMBIA1302，其他步骤均不变，得到转空载体植株。

三、转基因植物的耐盐性鉴定

分别将T₃代转GmSAP16基因植株(OE-2、OE-4、OE-5)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行耐盐性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将种子于4℃春化处理3天，然后播种于培养基中，于萌发10天后移至营养土：蛭石为1:1小盆中，待长至3周后，用250mM NaCl水溶液进行盐处理两周，具体处理方法为：待长至3周后，将栽培盆放入含有约2L的250mM NaCl水溶液底盆中(和浇水的方式一样，浇水时把水倒入底盆中，然后把栽培小盆放入其中，让其自然渗吸)，让其自然渗吸，两周后统计存活率。设置以不添加NaCl的水溶液替代250mM NaCl水溶液的对照组(Control)。

脯氨酸含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司脯氨酸(PRO)含量测试盒(Comin公司，Code No.:PRO-2-Y)进行脯氨酸含量测定。称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；之后置90℃振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。取0.5mL样本+0.5mL试剂一+0.5mL试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min，每10min振荡一次。待冷却后，在试管中加入1mL试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8mL-1mL上层溶液于1mL玻璃比色皿中，于520nm波长处比色，记录吸光值A，并计算脯氨酸含量。

丙二醛含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司丙二醛(MDA)测试盒(Comin公司，Code No.:MDA-2-Y)进行MDA含量测定。称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。吸取0.6mL试剂一于1.5mL离心管中，再加入0.2mL样本,混匀。95℃水浴中保温30min，置于冰浴中冷却，10000g，25℃，离心10min。吸取上清液于200ul玻璃比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，记为A532和A600并计算MDA含量。

结果见图1，结果显示，在经盐处理后，转GmSAP16基因植株的存活率显著高于拟南芥Col-0，且过表达植株的脯氨酸含量高于WT，丙二醛含量低于WT，表明转GmSAP16基因植株具有耐盐性，GmSAP16基因及其所编码的蛋白质GmSAP16可以用来提高拟南芥的耐盐性。

按照上述方法，鉴定转空载体对照植株的耐盐性，结果显示，空载体对照植株表型与野生型拟南芥拟南芥Col-0无明显区别，且其存活率也与拟南芥拟南芥Col-0无显著差异。

四、转基因植物的抗旱性鉴定

分别将T₃代转GmSAP16基因植株(OE-2、OE-4、OE-5)和拟南芥Col-0(WT)(各60株)进行抗旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。

将种子于4℃春化处理3天，然后播种于培养基中，于萌发10天后移至营养土：蛭石为1:1小盆中，待长至3周后，干旱处理两周，复水3天，统计植株存活率。设置不进行干旱处理的对照组(Control)。

结果见图2，结果显示，在经干旱与复水处理后，转GmSAP16基因植株的存活率显著高于拟南芥Col-0，且转GmSAP16基因植株的脯氨酸含量高于WT，丙二醛含量低于WT，表明，转GmSAP16基因植株具有抗旱性，GmSAP16基因及其所编码的蛋白质GmSAP16可以用来提高拟南芥的抗旱性。

实施例2、GmSAP16基因及其编码的蛋白质可以提高毛状根大豆的耐盐性和抗旱性

一、GmSAP16植物过表达载体构建

1、根据大豆GmSAP16 cDNA序列和pCAMBIA3301载体中NcoI，BglII酶切位点两侧序列与同源重组要求[正向引物与载体左臂重叠区域(15-25nt)加上基因插入片段正向序列(20-25nt左右)，反向引物与载体右臂重叠区域(15-25nt)加上基因插入片段反向序列(20-25nt左右)]设计引物序列如下：

GmSAP16-3301-T-F：5'-GGACTCTTGACCATGATGGCATCGGGTGGAA-3'；

GmSAP16-3301-T-R：5'-ATTCGAGCTGGTCACCATAGGCCTTAACAGAA-3'。

2、以中黄39大豆cDNA模板，使用北京全式金生物技术有限公司的

FastPfu PCR SurperMix进行PCR扩增，得到PCR产物；

3、将步骤2得到的PCR产物经琼脂糖电泳检测后，纯化回收酶切产物；

4、先用NcoI与BglII内切酶酶切pCAMBIA3301载体，回收载体骨架；

5、用北京全式金生物技术有限公司的Quick-Fusion Clong Kit将步骤3回收的酶切产物克隆到pCAMBIA3301载体中，将得到的序列正确的重组载体命名为35S：GmSAP16。35S：GmSAP16为将pCAMBIA3301载体的NcoI与BglII的识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的重组载体，该重组载体能表达GmSAP16，GmSAP16基因的表达由35S强启动子启动，由NOS强终止子终止。

二、GmSAP16-RNAi载体构建

1、GmSAP16 RNAi干扰载体构建的具体操作为：人工合成序列2中的第34-228位核苷酸序列和它的反向互补序列，中间为146bp的玉米alcohol dehydrogenase(Adh)基因序列作为内含子，5’端加上NcoI酶切位点，3’端加上BstEII酶切位点，其中片段合成由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成，具体片段信息如序列3所示。

2、用NcoI酶和BstEII酶对pCAMBIA3301载体进行酶切，回收载体骨架；

3、将步骤1和2得到的回收产物用Infusion重组酶在50℃反应20min得到连接产物；

4、将步骤3得到的连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆摇菌，用通用引物M13F(GTAAAACGACGGCCAG)+M13R(CAGGAAACAGCTATGAC)检测菌液，之后用M13F测序验证，将得到的序列正确的重组载体命名为GmSAP16-RNAi(将pCAMBIA3301载体的NcoI和BstEII酶切位点间插入序列表的序列3所示的DNA分子。

三、大豆毛状根的转化过程

将35S：GmSAP16、pCAMBIA3301载体和GmSAP16-RNAi分别导入发根农杆菌K599中，将得到的重组菌分别命名为K599-35S：GmSAP16、K599-pCAMBIA3301和K599-GmSAP16-RNAi。

1、将大豆Williams82种子播于混合土中(营养土：蛭石＝1：1)1-2cm深。置于温室，白天28℃/晚上20℃，每天浇水；

2、用注射器分别挑取K599-35S：GmSAP16、K599-pCAMBIA3301和K599-GmSAP16-RNAi侵染6天大子叶尚未展开的幼苗大豆的子叶节；

3、侵染完用塑料盒盖上；

4、待长出毛状根后，用蛭石将大豆子叶节侵染位点及其以下部分埋住，浇水浇透。28℃，14h光照/10h黑暗，白天28℃/晚上20℃，培养30天，每两天交一次水，保持浸染部分的潮湿环境；

5、30天后，当毛状根长到5-10cm时，将主根减去(此时毛状根用于GmSAP16基因表达量检测)，得到的植株称为复合体植株，将复合体植株埋入混合土中(营养土：蛭石＝1：1)，每三天浇一次水；

6、45天后，待毛状根恢复到足够健康时，按照实施例1中的方法进行盐处理和干旱处理。

7、盐处理结果和生理指标测定结果见图3和图6；旱处理结果和生理指标测定结果见图4和图6。其中，所测生理指标为叶绿素、脯氨酸和丙二醛，所测叶绿素、脯氨酸和丙二醛分别为叶片的叶绿素、脯氨酸和丙二醛的含量。叶绿素含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司植物叶绿素(chlorophyll)含量测试盒(Comin公司，Code No.:CPL-2-G)进行脯氨酸含量测定。称取0.1g叶片去掉中脉，剪碎，用蒸馏水洗干净。加入1mL蒸馏水，少量试剂一(约50mg)，在黑暗或弱光条件下充分研磨，转入10mL玻璃试管。提取液准备：取400mL无水乙醇和800mL丙酮，充分混匀待用。用提取液冲洗研钵，将所有冲洗液转入玻璃试管，用提取液补充至10mL，玻璃试管置于黑暗条件浸提3h，直至试管底部组织残渣完全变白。取浸提液200μL于96孔板，提取液调零，测定663nm和645nm处吸光值，并计算叶绿素含量。

各植株GmSAP16基因表达量检测结果显示，侵染了K599-35S：GmSAP16的大豆毛状根中GmSAP16基因的表达量显著高于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根，侵染了K599-GmSAP16-RNAi的大豆毛状根中GmSAP16基因的表达量显著低于侵染了K599-pCAMBIA3301的大豆毛状根。

盐处理和干旱处理的结果显示，与侵染K599-pCAMBIA3301的大豆相比，侵染K599-35S：GmSAP16的大豆表现出了更强的耐盐性和抗旱性，而侵染K599-GmSAP16-RNAi的大豆则表现出了更弱的耐盐性和抗旱性。表明，GmSAP16基因及其所编码的蛋白质GmSAP16可以用来提高大豆的耐盐性和抗旱性。

实施例3、实时荧光定量PCR分析GmSAP16的表达特性

一、胁迫处理

取室温生长20d左右的大豆中黄39幼苗进行以下处理：

(1)干旱处理(图6中A)：将盆栽的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，自然干旱1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(2)高盐处理(图6中B)：将大豆幼苗置于200mM的NaCl水溶液中，光照培养1小时、2小时、4小时、8小时、12小时后和24小时分别取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。

(3)对照的处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。

二、mRNA的分离

采用Trizol法(TianGen)提取大豆叶片总RNA。

三、反转录为cDNA

将纯化的mRNA反转录为cDNA。

四、实时荧光定量PCR

将cDNA稀释50倍后用作qRT-PCR的模板。用基因的特异引物对(引物序列为SAP16-qRTF：CGATTTTCTTCCTTTCACC，SAP16-qRTR：GCTTCGCAAACAACAACCT)对样品进行qRT-PCR扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin(RT-GmactinF：ACATTGTTCTTAGTGGTGGCT，RT-GmactinR：CTGTTGGAAGGTGCTGAG)做内参。qRT-PCR在

7500实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用LivakKJ和SchmittgenTD(2001)报道的方法，即

计算相对表达量。

ΔΔC_T＝(C_T.Target－C_T.Actin)_Timex－(C_T.Target－C_T.Actin)_Time0

Timex表示任意时间点，Time₀表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。

结果见图6。结果显示，干旱和高盐处理均使GmSAP16基因的表达升高。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> GmSAP16蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 192

<212> PRT

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 1

Met Ala Ser Gly Gly Thr Glu Ala Phe Pro Asp Leu Gly Lys His Cys

1 5 10 15

Gln His Arg Asp Cys Asn Gln Leu Asp Phe Leu Pro Phe Thr Cys Asp

20 25 30

Gly Cys Gln Gln Ile Phe Cys Leu Glu His Arg Ser Tyr Lys Ser His

35 40 45

Ala Cys Leu Lys Ser Asp His Asn Ser Arg Lys Val Val Val Cys Glu

50 55 60

Ala Cys Ser Met Ser Ile Glu Thr Thr Gly His Val Gly Gln Asp Glu

65 70 75 80

Glu Ala Ile Leu Gln Lys His Leu Lys Ser Gly Asn Cys Asp Pro Thr

85 90 95

Lys Lys Lys Lys Pro Ile Cys Pro Val Lys Arg Cys Arg Glu Val Leu

100 105 110

Thr Phe Ser Asn Thr Ser Thr Cys Lys Thr Cys His Ile Lys Val Cys

115 120 125

Leu Lys His Arg Phe Pro Ala Asp His Ala Cys Ser Arg Gly Ala Ser

130 135 140

Ala Ser Ser Ser Ala Cys Val Ser Asn Gly Leu Trp Asn Asn Arg Phe

145 150 155 160

Leu Thr Ala Phe Ala Lys Arg Thr Gly Gln Glu Cys Ala Lys Asn Gly

165 170 175

Ala Thr Cys Ser Thr Ser Pro Pro Ser Thr Pro Ser Val Lys Ala Tyr

180 185 190

<210> 2

<211> 579

<212> DNA

<213> 大豆(Glycine max (Linn.) Merr.)

<400> 2

atggcatcgg gtggaacaga agcttttcca gatttgggta aacactgcca gcaccgcgat 60

tgcaaccagc tcgattttct tcctttcacc tgcgacggtt gccaacagat cttttgtttg 120

gaacacagat cctacaagtc ccacgcgtgc ctgaaatccg accacaacag cagaaaggtt 180

gttgtttgcg aagcatgttc catgtccatc gagaccaccg gccatgtggg acaagacgag 240

gaggcaatct tgcagaagca cctcaagtct ggtaattgtg accctaccaa gaagaagaaa 300

ccaatttgtc ccgtcaagcg ttgcagggag gttttgacgt tttccaacac cagcacatgt 360

aaaacttgcc acattaaggt gtgcctcaag catcgtttcc ctgctgatca tgcctgtagc 420

agaggagctt cagcttcttc atcagcttgt gtttctaatg gtttgtggaa caatcggttc 480

ttgactgctt ttgccaagag gactggacaa gaatgtgcca aaaatggtgc aacttgttct 540

acttctcctc ctagtacacc ttctgttaag gcctattga 579

<210> 3

<211> 554

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg ttgggtaaac actgccagca ccgcgattgc aaccagctcg attttcttcc 60

tttcacctgc gacggttgcc aacagatctt ttgtttggaa cacagatcct acaagtccca 120

cgcgtgcctg aaatccgacc acaacagcag aaaggttgtt gtttgcgaag catgttccat 180

gtccatcgag accaccggcc atgtggatcc gatcgaaaaa cgggagtctg cccctaagac 240

agataagccg ccaagaaggc gcaagtcaac cgcgagttgt tgtatcatat ctactgacaa 300

agatcacaaa tgggatggct gattagatac cttggcctcc cagatcgatt ccacatggcc 360

ggtggtctcg atggacatgg aacatgcttc gcaaacaaca acctttctgc tgttgtggtc 420

ggatttcagg cacgcgtggg acttgtagga tctgtgttcc aaacaaaaga tctgttggca 480

accgtcgcag gtgaaaggaa gaaaatcgag ctggttgcaa tcgcggtgct ggcagtgttt 540

acccaaggtg accc 554

Claims

1.GmSAP16蛋白或其相关生物材料在调控植物耐逆性中的应用；

所述相关生物材料为能够表达所述GmSAP16蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述GmSAP16蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；

所述植物为大豆或拟南芥。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用具体体现为：所述GmSAP16蛋白或能够表达所述GmSAP16蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物耐逆性增加；所述GmSAP16蛋白或能够表达所述GmSAP16蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物耐逆性降低。

3.培育耐逆性提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GmSAP16蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；

所述GmSAP16蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；

所述植物为大豆或拟南芥。

4.培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GmSAP16蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物耐逆性大于受体植物；

所述GmSAP16蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；

所述植物为大豆或拟南芥。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述“向受体植物中导入能够表达GmSAP16蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述GmSAP16蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述“能够表达GmSAP16蛋白的核酸分子”为序列表的序列2所示的DNA分子。

7.GmSAP16蛋白或其相关生物材料或权利要求3至6任一所述的方法在植物育种中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述GmSAP16蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述GmSAP16蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述育种的目的是选育耐逆性高的植物；

所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性；

所述植物为大豆或拟南芥。