CN101456908B

CN101456908B - 一种转录因子蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101456908B
Application number: CN2008102468025A
Authority: CN
Inventors: 阳文龙; 张爱民; 刘冬成; 孙家柱; 李俊明
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2008-12-31
Filing date: 2008-12-31
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2028-12-31
Also published as: CN101456908A

Abstract

本发明公开了一种转录因子蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。本发明的转录因子具有DREB类转录因子家族共有的特征：具有一个含有58个氨基酸的EREBP/AP2保守区。该转录因子，可与多个逆境应答基因启动子共有的DRE调控元件特异结合，调控这些基因的表达，从而激活植物体内的多种抗逆机制，提高抗逆能力。因此本发明转录因子为基因工程改良植物耐逆性提供了一条新的技术途径，尤其在小麦等农作物抗逆性的综合改良过程中具有广泛的应用前景和巨大的经济价值。

Description

一种转录因子蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种转录因子蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

转录因子是生物体内与基因启动子区顺式作用元件相结合、调控该基因表达的蛋白质。它们在生物的生命活动中起着非常重要的作用，不仅参与了生物体的生长、发育，同时也调控着生物体对外界逆境如干旱、高盐、低温、病原物侵染等的应答反应。1994年，Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki在对拟南芥逆境应答基因rd29A启动子区域的研究中，发现了一个逆境胁迫应答顺式作用元件，即干旱应答元件(DRE，drought-responsive element)。1998年，刘强等运用酵母单杂交方法(yeast one-hybrid method)克隆出与该DRE元件结合的反式作用因子编码基因，即干旱应答元件结合蛋白(DREB，drought-responsive element binding protein)基因。该DREB基因表达的产物与顺式作用元件DRE结合后，可激活一系列与植物抗性相关基因的表达。自从对DREB类转录因子的研究工作开展以来，对其结构和功能的研究及其在植物遗传改良上的应用研究已成为生物化学及分子生物学等领域研究的热点。目前已发现植物中许多逆境应答基因启动子区域含有DRE元件；DREB类转录因子在植物中普遍存在，是植物中特有的调控对外界干旱、高盐、低温等逆境的应答反应的转录因子，具有巨大的潜在应用价值。

在水资源日益短缺的当今世界，大量培育耐旱节水高产优质的农作物新品种是解决粮食危机、实现农业可持续发展的最有效方式。小麦是世界上的重要粮食作物，是我国第三大粮食作物，对我国粮食安全、民生和可持续发展有着至关重要的意义。在我国由干旱引起的小麦减产常年达到15％以上，干旱是首要的减产因子。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种转录因子蛋白及其编码基因，该蛋白能与DRE元件特异结合。

本发明所提供的蛋白，来源于欧山羊草(Aegilops biuncialis)，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。

为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签

残基

序列

Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述蛋白的编码基因为如下1)、2)、3)或4)的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列2中自5′末端第1-768位核苷酸所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

4)与1)或2)限定的DNA序列具有95％以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

序列表中SEQ ID №：2所示的DNA长度为945bp，其中，自其5’端的第1-768位核苷酸为编码序列(开放阅读框架)，自5’端第127到第300位核苷酸为EREBP/AP2保守结构域的编码序列，编码58个氨基酸，其3’端的非翻译区长度为177bp；该基因的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID №：1所示，由255个氨基酸残基组成，该蛋白具有DREB蛋白家族的特征，其中自N端第43-100位为EREBP/AP2保守结构域。将欧山羊草的DREB基因命名为AebDREB，编码蛋白命名为AebDREB。

扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对具体可为如下1)、2)或3)所示的引物对：

1)一条引物的序列如序列表中序列3所示，另一条引物的序列如序列表中序列4所示；此引物对可用于扩增基因的全长；

2)一条引物的序列如序列表中序列3所示，另一条引物的序列如序列表中序列5所示；此引物对可用于扩增基因的编码区；

3)一条引物的序列如序列表中序列6所示，另一条引物的序列如序列表中序列7所示；此引物对可用于扩增基因的3’末端区。

含有上述任一所述基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为在载体YEpGAP112的多克隆位点插入序列表中序列2中自5’末端起第1-768位所示核苷酸序列得到的重组载体；所述重组菌是可以通过将上述任一种重组载体导入大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母得到的。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性植物的方法，是将上述任一所述基因导入植物中，培养得到抗逆性植物。

所述基因可以通过重组载体导入植物。

所述抗逆性可为抗低温和/或抗干旱。

所述植物具体可为欧山羊草(Aegilops biuncialis)。

本发明的转录因子具有DREB类转录因子家族共有的特征：具有一个含有58个氨基酸的EREBP/AP2保守区。酵母单杂交实验证明该转录因子具有转录激活功能。此外实验还表明AebDREB基因明显受干旱和低温的诱导表达。所以该转录因子，可与多个逆境应答基因启动子共有的DRE调控元件特异结合，调控这些基因的表达，从而激活植物体内的多种抗逆机制，提高抗逆能力。本发明的转录因子AebDREB可同时激活一系列抗性相关基因的表达，克服了传统植物抗逆基因工程中用单个功能基因提高抗逆性的局限性，使植物抗逆特性的大幅度提高成为可能。因此本发明转录因子为基因工程改良植物耐逆性提供了一条新的技术途径，尤其在小麦等农作物抗逆性的综合改良过程中具有广泛的应用前景和巨大的经济价值。

附图说明

图1为不同胁迫处理下欧山羊草总RNA的琼脂糖凝胶检测结果。

图2为不同胁迫处理下欧山羊草AebDREB RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果。

图3为不同胁迫处理下欧山羊草tubulin RT-PCR产物的琼脂糖凝胶检测结果。

图4为0mM 3-AT条件下，欧山羊草AebDREB酵母单杂交功能鉴定结果。

图5为40mM 3-AT条件下，欧山羊草AebDREB酵母单杂交功能鉴定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从生物公司购买。

实施例1、蛋白及其编码基因的发现

1、欧山羊草AebDREB基因的分离，具体包括如下步骤：

1)将欧山羊草(Aegilops biuncialis)种子(购自中国农业科学院)浸泡于1％次氯酸钠溶液中消毒20分钟后，用无菌水洗三遍，播于1/2MS固体培养基(pH5.8)中，在22℃、16小时/8小时(光/暗)的条件下培养14天后，取幼苗洗净，将其置于超净工作台上自然风干4小时，随后用液氮速冻，保存于-80℃冰箱用于总RNA的提取。

2)用Trizol法(Trizol购于天根公司)提取步骤1)保存的受脱水胁迫4小时的欧山羊草植株的总RNA，经DNA酶I处理后备用。

3)用oligo(dT)引物和MMLV反转录酶(Promega公司产品)将步骤2)的总RNA反转录成cDNA。oligo(dT)引物序列为：5’-ACTCTATGAGAATTCGATGAGCGATCTGTTTTTTTTTT TTTTTTTT-3’。反应体系及参数为：

反应条件为：42℃90分钟，75℃10分钟。反转录产物存于-20℃待用。

4)根据已报道的DREB基因的AP2/EREBP保守区序列设计一个兼并引物，引物序列为：引物1(正向引物)：5’-G(C/a)CGC(C/t/g)TGCCTCAACTTC-3’；以步骤3)中的cDNA为模板，在引物1和oligo(dT)(反向引物)的引导下，用PCR方法扩增得到欧山羊草DREB基因的3’-末端；其中，

反应体系及参数

反应条件

PCR产物经纯化回收后克隆到T载体(Promega公司产品)中，挑阳性克隆送到诺赛公司测序，得到欧山羊草DREB基因的3’-末端cDNA序列。

5)将步骤4)获得的欧山羊草DREB基因的3’-末端cDNA序列送到基因库进行blast，与已报道的DREB基因序列进行序列比对，从中找出相似性高的基因序列；以这些序列为基础，在其5’-末端和3’-末端分别设计基因特异引物，引物序列为：引物2(正向引物)：5’-ATGGACGTCGCCGACATC-3’，引物3(反向引物)：5’-CCCTTTTCCCCAAAACTAGAAACC-3’；以步骤3)中的cDNA为模板，在引物2和引物3的引导下，用步骤4)的PCR反应体系及反应条件扩增得到欧山羊草DREB基因的全长cDNA序列。

将得到的欧山羊草DREB基因的全长cDNA序列克隆测序，得到如序列表中SEQID №：2所示的核苷酸序列，该序列长度为945bp，3’端的非翻译区长度为177bp，其编码序列(开放阅读框架)长度为768bp，是自SEQ ID №：2的5’端的第1-768位碱基，其编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID №：1所示，具有255个氨基酸残基的蛋白质。将欧山羊草的DREB基因命名为AebDREB，编码的蛋白命名为AebDREB。对AebDREB进行生物信息学分析，结果表明：AebDREB具有DREB蛋白家族的特征，其中自N端第43-100位为EREBP/AP2保守结构域。

2、冷、干旱和盐诱导处理下AebDREB基因的表达模式

1)分别对实验1中培养的欧山羊草幼苗进行冷诱导、干旱诱导和盐诱导处理，处理方法如下：1)冷诱导处理：欧山羊草幼苗置于4℃光照培养箱处理，其根部置于蒸馏水中；2)干旱诱导处理：欧山羊草幼苗置于超净工作台上风干处理，湿度为50％；3)盐诱导处理：欧山羊草幼苗的根部置于250mM NaCl溶液中进行处理；分别于处理后0、1、2、4、8和24小时对经上述不同方法诱导处理的欧山羊草幼苗间隔取样，然后将样品立即用液氮速冻，-80℃保存用于提取总RNA。用Trizol法(Trizol购于天根公司)提取上述不同样品的总RNA，并用1.0％琼脂糖凝胶电泳对不同样品的总RNA进行检测，检测结果如图1A，B，C所示(A为冷处理，B为干旱处理，C为盐处理；泳道0、1、2、4、8和24分别表示第0、1、2、4、8和24小时采集的样品的总RNA)。

2)用RT-PCR法分析冷、干旱、盐诱导条件下AebDREB基因的表达模式

分别以步骤1)提取的不同样品的总RNA为模板，在引物2(正向引物)：5’-ATGGACGTCGCCGACATC-3’，和引物4(反向引物)：5’-GCTAAATTAGTCGAACAAGCAGCTCC-3’的引导下，用One-step realtime RT-PCR kit(TaKaRa)进行RT-PCR反应，检测在冷、干旱和盐诱导条件下AebDREB的表达模式，并在引物5(正向引物)：5’-ACCGCCAGCTCTTCCACCCT-3’和引物6(反向引物)：5’-TCACTGGGGCATAGGAGGAA-3’引导下，用同样的参数条件及反应条件下PCR扩增欧山羊草的看家基因微管蛋白tubulin基因(内参)，RT-PCR反应体系为：RNase Free H₂O 10.5μl，10×One step RNA PCR缓冲液2.5μl，dNTP混合物(各10mM)2.5μl，MgCl₂(25mM)5μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，M-MLV RTase(25U/μl)0.5μl，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μl)0.5μl，引物2和引物4(各10μM)各1μl，总RNA 1μg；反应条件：先50℃30分钟，94℃2分钟；再94℃30秒，58℃30秒，72℃60秒，进行22个循环；最后72℃5分钟。将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2A，B，C和图3A，B，C所示。(图2和图3中，A表示受冷诱导处理的欧山羊草，B表示受干旱诱导处理的欧山羊草，C表示受盐诱导处理的欧山羊草，泳道0、1、2、4、8和24分别表示第0、1、2、4、8和24小时采集的样品的RT-PCR产物，图2示目的条带，图3示tubulin基因)

结果表明基因AebDREB受低温和干旱诱导表达。

实施例2、蛋白及其编码基因的功能

1、基因AebDREB的制备

1)以实施例1中基因AebDREB的全长cDNA序列为模板，在引物2和引物4的引导下，用高保真Pfu DNA聚合酶(Promega公司)通过PCR法获得AebDREB的编码区；其中，

反应体系及参数

反应条件

2)将步骤1)获得的AebDREB的编码区片段克隆到载体pGEM-T(Promega公司)上，获得重组载体，经测序检测无误后，用限制性内切酶Sac II和Pst I从重组载体上切下AebDREB的编码区片段，并将其与用相同酶酶切的YEpGAP112(ATCC公司)连接获得重组载体，命名为AebDREB/YEpGAP112，测序进行验证，结果表明载体构建正确，插入载体YEpGAP112的Sac II和Pst I位点间的基因序列为序列表中序列2中自5’末端起第1-768位核苷酸，获得阳性重组载体。

将阳性重组载体AebDREB/YEpGAP112分别转化到含双报道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株YM4271(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K，Plant Cell，1998，10(8)：1391-1406，)(中国科学院遗传与发育生物学研究所)和含突变型DRE元件酵母菌株YM4271(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K，Plant Cell，1998，10(8)：1391-1406，)(中国科学院遗传与发育生物学研究所)中，再将转化有重组载体AebDREB/YEpGAP112的重组酵母菌株涂于含有3-AT(浓度分别为0mM，40mM)的SD-Agar三缺固体培养基(His^-，Leu^-，Ura^-，Clontech公司)上检测其生长情况。

同时以含拟南芥DREB1A的重组载体DREB1A/YEpGAP112(Liu Q，Kasuga M，Sakuma Y，Abe H，Miura S，Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K，Plant Cell，1998，10(8)：1391-1406，)为对照，将其分别转化到含双报道子(HIS3和LacZ)的含野生型DRE元件酵母菌株YM4271和含突变型DRE元件酵母菌株YM4271中，再将转化有重组载体DREB1A/YEpGAP112的重组酵母菌株分别涂于含有3-AT(浓度分别为0mM，40mM)的SD-Agar三缺固体培养基(His^-，Leu^-，Ura^-，Clontech公司)上检测其生长情况。

结果如图4-5所示。1为拟南芥DREB1A在含野生型DRE元件酵母中；2为AebDREB基因在含野生型DRE元件酵母中；3为野生型酵母对照；4为拟南芥DREB1A基因在含突变型DRE元件酵母中；5为AebDREB基因在含突变型DRE元件酵母中；6为突变型酵母对照。

结果表明含AebDREB和野生型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培养基上生长良好，而含AebDREB和突变型DRE元件的酵母菌株在3-AT-SD-Agar三缺培养基上不能生长。说明AebDREB可特异结合DRE元件，从而激活下游目的基因的表达，具有调控欧山羊草抗逆性应答的功能。

序列表

<160>7

<210>1

<211>255

<212>PRT

<213>山羊草属欧山羊草(Aegilops biuncialis)

<400>1

Met Asp Val Ala Asp Ile Ala Ser Pro Ser Ala Gln Gln Val Gln Gly

1 5 10 15

His Arg Thr Val Ser Ser Glu Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr

20 25 30

Lys Phe His Glu Thr Arg His Pro Leu Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg

35 40 45

Gly Arg Val Gly Gln Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Ile Lys

50 55 60

Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asn Thr Ala Glu Met Ala Ala

65 70 75 80

Arg Ala His Asp Ala Ala Val Leu Ala Leu Ser Gly Arg Ala Ala Cys

85 90 95

Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Met Leu Pro Val Leu Ala Ala

100 105 110

Gly Ser Phe Gly Phe Gly Ser Ala Ser Glu Ile Lys Ala Ala Val Ala

115 120 125

Val Ala Val Val Ala Phe Gln Arg Lys Gln Ile Ile Pro Val Ala Val

130 135 140

Ala Val Val Ala Leu Gln Lys Gln Gln Val Pro Val Ala Val Ala Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Gln Gln Leu Lys Val Pro Val Ala Val Ala Val Val Ala

165 170 175

Leu Gln Gln Gln Gln Ile Ile Leu Pro Val Ala Cys Leu Ala Pro Glu

180 185 190

Phe Tyr Met Ser Ser Gly Asp Leu Leu Glu Leu Asp Glu Glu Gln Trp

195 200 205

Phe Gly Gly Met Asp Ala Gly Leu Leu Arg Glu Leu Gly Ala Gly Tyr

210 215 220

Ala Arg Val Thr Ala Gly Arg Glu Arg Glu Ala Gly Glu Arg Arg Ala

225 230 235 240

Glu Arg Arg Pro Asp Thr Ala Met Glu Leu Leu Val Arg Leu Ile

245 250 255

<210>2

<211>945

<212>DNA

<213>山羊草属欧山羊草(Aegilops biuncialis)

<400>2

atggacgtcg ccgacatcgc ctccccgtct gcccagcagg tgcagggcca ccggacggtg 60

tcgtcggagc cgccgaagcg gccggccgga cgcaccaagt tccacgagac gcgccacccg 120

ctgtaccgtg gcgtgcggcg ccgtggccgc gtcgggcagt gggtgtgcga ggtgcgcgtg 180

cccgggatca agggctccag gctctggctc ggcaccttca acacggccga gatggcggcg 240

cgcgcgcacg acgccgccgt gctcgcgctc tccggccgcg ccgcctgcct caacttcgcc 300

gattccgcat ggcgcatgct gcccgtgctc gcggccgggt ccttcggctt cggcagcgcg 360

agcgagatca aggccgccgt cgccgtcgcc gtcgtcgcgt tccagcggaa gcagattatt 420

ccggtcgccg tcgcggtcgt tgctctccag aagcagcagg ttccggtcgc cgtggccgtc 480

gtggcgctcc agcagctgaa ggttccggtc gccgtcgccg tcgtggcgct ccagcagcag 540

cagatcattc ttccagtcgc gtgcctggcg cccgagtttt acatgtcttc cggcgacctg 600

ttggagctcg acgaggagca gtggtttggc ggcatggacg ccgggttact acgcgagctt 660

ggcgcagggt atgctcgtgt caccgccgga cgagagcgcg aggccggaga acggcgagca 720

gagcggcgtc cagacaccgc tatggagctg cttgttcgac taatttagcg ctactgtcaa 780

gttgtagata gtcgcgttct tccagatttc ggaagaaacg tagtactagg cagtttgttc 840

cttcatttgt agtagtattt gtcgaggtcc cggtttctag ttttggggaa aagggctaga 900

ttgcttaata catcaattgt tggttctgaa aaaaaaaaaa aaaaa 945

<210>3

<211>18

<212>DNA

<220>

<223>

<400>3

atggacgtcg ccgacatc 18

<210>4

<211>24

<212>DNA

<220>

<223>

<400>4

cccttttccc caaaactaga aacc 24

<210>5

<211>26

<212>DNA

<220>

<223>

<400>5

gctaaattag tcgaacaagc agctcc 26

<210>6

<211>46

<212>DNA

<220>

<223>

<400>6

actctatgag aattcgatga gcgatctgtt tttttttttt tttttt 46

<210>7

<211>18

<212>DNA

<220>

<221>misc-feature

<222>(2，6)

<223>m＝c或a，b＝c或t或g

<400>7

gmcgcbtgcc tcaacttc 18

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)或2)的基因：

2)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子。

4.扩增权利要求2或3所述基因的引物对，其特征在于：所述引物对为如下1)或2)所示：

1)一条引物的序列如序列表中序列3所示，另一条引物的序列如序列表中序列4所示；

2)一条引物的序列如序列表中序列3所示，另一条引物的序列如序列表中序列5所示。

5.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。

6.含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。

7.含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。

8.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。

9.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在载体YEpGAP112的多克隆位点插入序列表中序列2中自5’末端起第1-768位所示核苷酸序列得到的重组载体。

10.一种培育抗逆性植物的方法，是将权利要求2或3中所述的基因导入植物中，培养得到抗逆性植物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗低温和/或抗干旱。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述植物为欧山羊草(Aegilops biuncialis)。