CN1919867B

CN1919867B - 大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1919867B
Application number: CN2006100892127A
Authority: CN
Inventors: 张劲松; 陈受宜; 谢宗铭; 何锶洁; 杜保兴
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2006-08-09
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2026-08-09
Also published as: CN1919867A

Abstract

本发明公开了一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用。该蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQID№：2；2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆相关的蛋白质。该大豆Trihelix转录因子及其编码基因可用于培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，如耐盐、耐旱和耐寒大豆。

Description

大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用。

背景技术

环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如：EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB和PHD等等。Trihelix转录因子是植物特有的一类小的转录因子家族。Trihelix转录因子因其蛋白质结构中的DNA结合域有3个α-螺旋(helix-loop-helix-loop-helix)而得名。该蛋白家族的成员根据其DNA结合元件的特异性而划分为3个蛋白亚家族，即GT-1，GT-2和GT-3(Ayadi et al.，2004，Analysis of GT-3a identifies a distinct subgroupof trihelix DNA-binding transcription factors in Arabidopsis，FEBS Letters562，147-154.2004)。就蛋白质结构中DNA结合域数目而言，GT-1类和GT-3类仅在其N端有一个trihelix域，而GT-2类蛋白则具有两个trihelix域，分别位于C端和N端。

Trihelix转录因子调控光应答基因的表达。最近有报道，拟南芥中的PETAL LOSS是一个GT-2类的蛋白，它参与叶与花器官的正常发育(Brewer et al.，2004，PETALLOSS，a trihelix ranscription factor gene，regulates perianth architecturein the Arabidopsis flower.Development 131，4035-4046.)。而关于Trihelix转录因子是否在植物耐受非生物胁迫机制中发挥作用，尚未见报道。

大豆是我国五大作物之一，弄清其耐非生物胁迫分子机理，进而为提高其耐逆性提供基础，具有重要的理论及现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用。

本发明所提供的大豆Trihelix转录因子，名称为GmGT-2A，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆相关的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由500个氨基酸残基组成。GmGT-2A是一种Trihelix转录因子，具有两个trihelix域，分别位于C端和N端。N端的trihelix域是自序列2的氨基端第39(Ala)-101(Tyr)位氨基酸残基序列，C端的trihelix域是自序列2的氨基端第325(Ser)-394(Tyr)位氨基酸残基序列。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述大豆Trihelix转录因子的编码基因(GmGT-2A)也属于本发明的保护范围。

上述大豆Trihelix类转录因子的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQID №：1的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中的SEQ ID №：1由1503个脱氧核苷酸组成，自序列1的5′端第1-1503位核苷酸序列为编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质GmGT-2A；自5’端第115-303位核苷酸序列以及第973-1182位核苷酸序列为GmGT-2A中的2个trihelix结构域的编码序列。

含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。

可利用植物表达载体将本发明的GmGT-2A的编码基因导入植物细胞，获得对逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

将GmGT-2A构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GmGT-2A基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等双子叶植物。

实验结果表明，本发明的GmGT-2A的表达受高盐、干旱、低温和脱落酸ABA的诱导。ABA是与植物非生物胁迫应答相关的植物激素，因此GmGT-2A与植物对非生物逆境应答的调控相关。过量表达GmGT-2A的转基因拟南芥与未转基因的野生型拟南芥相比，其耐盐性、耐旱性和耐低温的能力均显著提高，说明转录因子GmGT-2A参与了植物对非生物胁迫应答的调控。

本发明的GmGT-2A基因对培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，如耐盐、耐旱和耐低温大豆，提高农作物特别是大豆的产量具有重要意义，并且从分子生物学角度证明了转录因子Trihelix家族中的一些成员确实参与植物对非生物胁迫应答的调控，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为含有GmGT-2A的植物表达载体的部分结构示意图

图2为GmGT-2A在非生物逆境胁迫下的表达特性图

图3A为转GmGT-2A基因的拟南芥T1代株系L1和L2与野生型植株在盐胁迫下和正常生长条件下的生长比较图

图3B为转GmGT-2A基因的拟南芥T1代株系L1和L2与野生型植株在自然干旱条件下的生长情况

图3C为转GmGT-2A基因的拟南芥T1代株系L1和L2与野生型植株在低温条件下的生长情况

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、大豆GmGT-2A基因的筛选及其cDNA的克隆

首先用BLAST程序将各拟研究转录因子家族的保守的DNA结合域序列与大豆EST数据库中的序列进行比对，分别得到13个Trihelix家族成员的EST该片段。以栽培大豆品种南农1138-2为材料，取15天苗龄的大豆苗分别进行冷(4℃)，盐(150mMNaCl溶液)，ABA(100μM溶液)，大气干旱处理(即用滤纸吸干根部水份，置于空气中)。上述处理0、1、3、6、12小时后，分别采收叶子，提取RNA。

根据上述13个Trihelix家族成员的EST，设计各自特异的RT-PCR引物。用RT-PCR方法对上述基因在盐、干旱、冷、ABA胁迫下的应答反应进行分析。上述13个基因中，有2个基因，其中包括GmGT-2A，在高盐、干旱、低温和ABA胁迫下均受诱导表达，遂作为候选基因，进一步开展了基因克隆及其功能分析研究。

利用RACE的方法，在人工进一步拼接的EST序列基础上设计RACE引物，其中5′RACE的特异巢式引物1(GSP₁)为5′GTTCTCGAATTTCTCCTTGCACTTCTTCGC-3′，特异巢式引物2(GSP₂)5′-GCAAAGCCATTGTCTCCTCTCTCGGCCACC-3′；3′RACE的特异巢式引物1(GSP₃)5′-GAACCGGTGGCCGAGAGAGGAGACAATGGC-3′，特异巢式引物2(GSP₄)5′-CAAGTACCATAGGAGAACTAAAGAAGGTCG-3′，巢式通用引物序列(NUP)为5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′。

5′RACE第一链cDNA的合成：取1μg大豆品种南农1138-2的RNA，加1μl的5′-CDS primer[5′-(T)₂₅N-1N-3′(N＝A，C，G或T；N_-1＝A，G或C)]，加1μl的SMARTII A oligo，加水至终体积5μl，70℃水浴2分钟，然后置冰上2分钟，然后分别加2μl 5×first strand buffer，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP mix(10mM)，1μl

PowerScript reverse transcriptase，然后混匀，42℃反转录1.5小时，然后加超纯水至250μl，在72℃下变性7分钟，获得第一链cDNA。置-20℃冰箱待用。

5′RACE反应程序：分2步扩增。第一步扩增反应体系25μl∶17.25μl超纯水，2.5μl 10×GC buffer I，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl LA-Taq酶，1.25μl 5’-RACE第一链cDNA，2.5μl UPM(10×)，0.5μl GSP1(10μM)，混匀，上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃5sec；68℃10sec、72℃3min，25个循环；4℃保存。

巢式反应体系50μl∶36μl超纯水，5μl 10×GC buffer I，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl LA-Taq酶，5μl第一步扩增产物(50×)，1μl NUP(10μM)，1μl GSP₂(10μM)，混匀，上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃，5sec；68℃，10sec；72℃，3min，30个循环。将反应产物回收后，连接PMD18-T vector，测序。

3’RACE第一链cDNA的合成：取1μg大豆南农1138-2的RNA，加1μl的3’-CDSprimer[5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀N-1N-3’(N＝A，C，G or T；N-1＝A，G or C)]，加1μl的SMART II A oligo，加水至终体积5μl，70℃水浴2分钟，然后置冰上2分钟，然后分别加2μl 5×first strand buffer，1μl DTT(20mM)，1μl dNTPmix(10mM)，1μl PowerScript reverse transcriptase，然后混匀，42℃反转录1.5小时，然后加超纯水至250μl，在72℃下变性7分钟，获得3’RACE第一链cDNA。置-20℃冰箱待用。

3’RACE反应程序：分2步扩增。第一步扩增反应体系25μl∶17.25μl超纯水，2.5μl 10×GC buffer I，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl LA-Taq酶，1.25μl 3’-RACE第一链cDNA，2.5μl UPM(10×)，0.5μl GSP₃(10μM)，混匀，上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃5sec；68℃10sec、72℃3min，25个循环；4℃保存。

3′RACE巢式反应体系50μl∶36μl超纯水，5μl 10×GC buffer I，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl LA-Taq酶，5μl第一步扩增产物(50×)，1μl NUP(10μM))，1μlGSP₄(10μM)，混匀，上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃，5sec；68℃，10sec；72℃，3min，30个循环。将反应产物回收后，连接PMD18-T vector，测序。

通过测序表明所扩增的5′端和3′端序列属于目的基因组分，然后通过人工拼接，找到最大阅读框，再通过NCBI BLAST，确定是目的基因的全长，然后从该基因的起始密码子向5′非翻译区延伸，设计正向引物5′-GTCGGATCCCTGTAACTTGGGTGTAACCG-3′，从终止密码子起向3′端非翻译区延伸设计反向引物5′-CGAGAGCTCTTAACTCATAATTGCAATGG-3′，以大豆品种南农1138-2的RNA为模板，取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，获得cDNA片段做为模板，进行扩增。PCR的反应体系为50μl，其中包括4μl一链cDNA(0.05μg)、6μl引物(20μM)、5μl 10×pfu PCR Buffer、1.0μl dNTP(10mM)和1U pfu Taq DNA聚合酶，余用超纯水补齐。上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性4min；94℃变性30sec，56℃复性30sec、72℃延伸3min，共30个循环；然后72℃延伸10min。将所扩增的目的基因连接pMD18-T vector，测序，结果表明，获得候选基因的全长ORF序列，命名为GmGT-2A，GmGT-2A的全长为1503bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列1的5’端第1-1503位核苷酸序列为编码序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质GmGT-2A；自5’端第115-303位核苷酸序列以及第973-1182位核苷酸序列为GmGT-2A中的2个trihelix结构域的编码序列。序列表中序列2由500个氨基酸残基组成。GmGT-2A具有两个trihelix域，分别位于C端和N端。Trihelix结构域氨基酸残基非常保守，而中间部分的序列变异较大。N端的trihelix域是自序列2的氨基端第39(Ala)-101(Tyr)位氨基酸残基序列，C端的trihelix域是自序列2的氨基端第325(Ser)-394(Tyr)位氨基酸残基序列，因此GmGT-2A属于GT-2亚家族。

实施例2、GmGT-2A基因在非生物胁迫下的表达特性

对大豆南农1138-2进行干旱、NaCl、ABA和低温处理用于分析大豆GmGT-2A在非生物胁迫下的表达情况。将南农1138-2的种子种在盆中，生长2星期后，对幼苗分别进行冷(4℃)，盐(150mM NaCl溶液)，大气干旱，ABA处理。在不同处理时段，分别采收叶子，用于提取RNA。具体方法如下所述：

下述胁迫处理：

干旱处理：将大豆南农1138-2幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，分别在光照条件下干旱培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

盐处理：将大豆南农1138-2幼苗的根系置于150mM NaCl溶液中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

低温处理：将大豆南农1138-2幼苗置于4℃培养箱中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

ABA处理：将大豆南农1138-2幼苗的根系置于100μM ABA溶液中，分别在光照培养0小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。

分别提取上述处理大豆南农1138-2叶片总RNA。分别以用上述方法处理的大豆样品以及没有经过胁迫处理的大豆样品(对照)的RNA为模板，取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，获得cDNA片段做为模板；根据已知EST序列，设计特异的RT-PCR引物对，其中正向引物为5′-AGGAAACCCCGCTAGAGAAC-3′，反向引物为5′-GCGTTCAGGACAACATCATC-3′。采用RT-PCR方法。RT-PCR的反应体系为20μl，其中包括1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl 10×PCR Buffer、0.5μl dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，余用超纯水补齐。上面覆盖液体石蜡油。整个反应于PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性4min；94℃变性30sec、56℃复性30sec、72℃延伸1min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。以扩增大豆的一个组成性表达的Tubulin基因的产物作为对照，其引物为5′-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3′和5′-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3′。扩增产物在1.0％琼脂糖胶(含溴化乙锭)，1×TAE电泳分离，紫外灯下观察照相。对上述基因在盐、干旱、冷胁迫以及ABA处理下的应答反应进行分析。如图2所示，GmGT-2A基因的表达受高盐、干旱和低温诱导和ABA诱导。因此GmGT-2A可能参与植物对非生物胁迫的应答反应。

实施例3、GmGT-2A蛋白及其编码基因的功能鉴定

一、转GmGT-2A基因拟南芥株系的获得及其耐盐性鉴定

根据GmGT-2A基因序列设计引物：GmGT-2A ORF正向引物：5’-GTCGGATCCCTGTAACTTGGGTGTAACCG-3’(BamH I)，GmGT-2A ORF反向引物：5’-CGAGAGCTCTTAACTCATAATTGCAATGG-3’(Sac I)，应用RT-PCR方法，从大豆总RNA中扩增GmGT-2A基因。具体方法如下所述：取南农1138-2叶片，置于液氮中研碎，悬于4mol/L异硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。取5μg总RNA用反转录试剂盒(Promega公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板进行PCR扩增反应。20μlPCR反应体系为：1μl一链cDNA(0.05μg)、1μl引物(20μM)、2μl10×PCR缓冲液、0.4μl dNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补足20μl，液面覆盖液体石蜡油。反应在PE9600型PCR仪上进行，其程序为94℃变性5min；再94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，共30-32个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物为1521bp，含有序列表中序列1的核苷酸序列，然后克隆于pMD18-T质粒的多克隆位点，得到重组载体pMDGmGT-2A。

用BamHI和SacI双酶切pMDGmGT-2A，得到包含GmGT-2A完整编码框的片段，将其正向插入pBI121植物表达载体的BamHI和SacI酶识别位点之间，然后测序验证，将确认含有GmGT-2A的植物表达载体，命名为pBI121-GmGT-2A，其部分结构示意图如图1所示。pBI121-GmGT-2A通过根癌农杆菌GV3101的介导转化拟南芥，PCR检测结果表明获得31个转化植株，RT-PCR分析表明其中至少3株中GmGT-2A的表达量很高，将表达量高的2株分别命名为L-1、L-2。将L-1和L-2的种子种入MS培养基，将得到的L-1、L-2的T1代株系幼苗分别命名为L1、L2，5天后和同时播种的未转基因拟南芥(WT)幼苗分别移栽到含0mM、75mM、125mM、150mM和180mM NaCl的MS培养基中培养16天，每个处理各30株。结果表明，正常生长条件下，野生型和转pBI121-GmGT-2A植株没有差别，在75mM NaCl条件下也差别不大，但在125mMNaCl条件下野生型植株出现叶片反卷，而转pBI121-GmGT-2A植株基本正常，在150mMNaCl条件下野生型植株叶片完全卷缩成一团，植株呈现紫红色，转pBI121-GmGT-2A植株出现轻微的反卷现象。在180mM NaCl条件下野生型植株生长停止，开始死亡，然而转pBI121-GmGT-2A植株中有80％-90％的能维持缓慢生长。

将在75mM、125mM、150mM和180mM NaCl条件下处理16天的幼苗(每个处理各30株)转移到正常条件的蛭石中恢复生长，分别恢复8天以及21天后观察其恢复生长情况。结果如图3A所示，结果表明，在高浓度NaCl处理下，野生型的拟南芥成活率较低(在75mM和125mM NaCl处理中，野生型的30株苗均能恢复生长，但在150mMNaCl处理和180mM NaCl处理下，分别有9株和6株能恢复生长)，而且生长受到了抑制，而转pBI121-GmGT-2A植物恢复生长良好(在75mM和125mM NaCl处理中，转基因植株的30株苗均能恢复生长，而在150mM NaCl处理和180mM NaCl处理下，分别有27株和25株能恢复生长)。结果表明，GmGT-2A基因与耐盐性相关，其过量表达可提高植物的耐盐性。

二、转GmGT-2A基因拟南芥株系的耐旱性鉴定

将在MS培养基中生长7天的野生型和转pBI121-GmGT-2A拟南芥T1代L1、L2株系的幼苗(各30株)在26-28℃中大气干旱，即停止浇水，16天后观察结果，以在正常条件下培养的野生型和转pBI121-GmGT-2A拟南芥T1代L1、L2株系的幼苗为对照。结果如图3B所示，结果表明，转pBI121-GmGT-2A植株无论苗期还是开花期，均表现出明显的耐旱性。野生型植株存活率达43％；而转基因植株仍然有80％以上能正常生长，结实，其中，T1代L1株系有90％能正常生长，结实；L2株系有86％能正常生长，结实。

三、转GmGT-2A基因拟南芥株系的耐冻性鉴定

将在MS培养基中生长7天的野生型(对照)和转pBI121-GmGT-2A拟南芥T1代L1、L2株系的幼苗(各20株)，移植到正常蛭石中生长5天后，将对照与转pBI121-GmGT-2A拟南芥T1代L1、L2植株置于-20℃冰柜中处理105min，之后在正常生长条件下恢复8天后观察结果，结果如图3C所示，结果表明，野生型对照存活率为20％，而转pBI121-GmGT-2A植株仍然有80％以上(T1代L1株系18株，L2株系17株)的能恢复生长。

序列表

<160>2

<210>1

<211>1503

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>1

atgctggaaa tctcaacttc acaggaaacc ccgctagaga acgcggacgg cggctccgcg 60

gcggtctcgg acgggtcgaa agccgagcac ggcgaggacg atgaccggaa tcccgccgcg 120

aaccggtggc cgagagagga gacaatggct ttgctcaata taaggtccga aatggacgtt 180

gctttcaaag acgcaaacct caaagcccct ctctgggaac aagtctcaag gaaattatcg 240

gagctaggtt ataataggag tgcgaagaag tgcaaggaga aattcgagaa catttacaag 300

taccatagga gaactaaaga aggtcgtttt ggaaaatcaa acggtgcaaa aacttaccga 360

tttttcgagc aattggaagc tttagacgga aaccactcac ttcttcctcc gacaacaacc 420

gacaacaaca acaacaacaa caacgttggt gatgatgttg tcctgaacgc ggttccgtgt 480

tcggttagtg cggcggcgca cgagcactcg agttcgacga cgtcgtggtc ggggaagaag 540

aagaggaagc tgacgcagtt tctggagggg ttgatgaggg aagtgataga gaagcaagag 600

acgctgcaga ggaagttcgt ggaagtgttg gacaagtgtg aaaaagatcg aacggcgagg 660

gaggaagcgt ggaagaagga ggaactcgag aggatcaaga aagaacgcga gcttctggct 720

caggaaagat caatcgctgc tgccaaagac gaagctgttc ttgcttttct tagaaagttt 780

gcagaagcag aagacacggt gcagttactc gagaaaattc aggttcaaaa cgacaaacag 840

aaaaacatga aacaaaatgg cggtaatgat aatgctaatg gaggtggtgg tgtcgcagtt 900

gtcactgata tggataaaca agaatgtgga aatactaatg ttcgtgttag tgttgggaat 960

tttgtgcaca tgagtagttc tcgttggccg aaggatgaag tggaggcatt gataaggtta 1020

aggactcaaa ttgatgtgca ggcacaatgg aatagtaata acaataacaa taatgggtct 1080

aaagggcctc tttgggagga gatatcttca gctatgaaga gccttggtta tgatcgaagt 1140

gcaaagaggt gtaaagagaa atgggagaac ataaacaagt acttcaagag gataaaggag 1200

aagagcaaga ggaagcctca ggattccaag acgtgtcctt attatcatca ccttgaggct 1260

ttgtacagta agaagcctaa gaaggtggat cttgggaacg agttgaagcc tgaggagctg 1320

ttgatgcata tcatggtgag tcaaagtcaa gaacagcaac agcaacaaga gatgcagact 1380

cagactcagt caccatctga agatgctgag agagatcaga atcagggaga taatgaagat 1440

caaagtgagt atcagaatca gatggttgat aataatagtc cttccattgc aattatgagt 1500

taa 1503

<210>2

<211>500

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))

<400>2

Met Leu Glu Ile Ser Thr Ser Gln Glu Thr Pro Leu Glu Asn Ala Asp

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ala Ala Val Ser Asp Gly Ser Lys Ala Glu His Gly Glu

20 25 30

Asp Asp Asp Arg Asn Pro Ala Ala Asn Arg Trp Pro Arg Glu Glu Thr

35 40 45

Met Ala Leu Leu Asn Ile Arg Ser Glu Met Asp Val Ala Phe Lys Asp

50 55 60

Ala Asn Leu Lys Ala Pro Leu Trp Glu Gln Val Ser Arg Lys Leu Ser

65 70 75 80

Glu Leu Gly Tyr Asn Arg Ser Ala Lys Lys Cys Lys Glu Lys Phe Glu

85 90 95

Asn Ile Tyr Lys Tyr His Arg Arg Thr Lys Glu Gly Arg Phe Gly Lys

100 105 110

Ser Asn Gly Ala Lys Thr Tyr Arg Phe Phe Glu Gln Leu Glu Ala Leu

115 120 125

Asp Gly Asn His Ser Leu Leu Pro Pro Thr Thr Thr Asp Asn Asn Asn

130 135 140

Asn Asn Asn Asn Val Gly Asp Asp Val Val Leu Asn Ala Val Pro Cys

145 150 155 160

Ser Val Ser Ala Ala Ala His Glu His Ser Ser Ser Thr Thr Ser Trp

165 170 175

Ser Gly Lys Lys Lys Arg Lys Leu Thr Gln Phe Leu Glu Gly Leu Met

180 185 190

Arg Glu Val Ile Glu Lys Gln Glu Thr Leu Gln Arg Lys Phe Val Glu

195 200 205

Val Leu Asp Lys Cys Glu Lys Asp Arg Thr Ala Arg Glu Glu Ala Trp

210 215 220

Lys Lys Glu Glu Leu Glu Arg Ile Lys Lys Glu Arg Glu Leu Leu Ala

225 230 235 240

Gln Glu Arg Ser Ile Ala Ala Ala Lys Asp Glu Ala Val Leu Ala Phe

245 250 255

Leu Arg Lys Phe Ala Glu Ala Glu Asp Thr Val Gln Leu Leu Glu Lys

260 265 270

Ile Gln Val Gln Asn Asp Lys Gln Lys Asn Met Lys Gln Asn Gly Gly

275 280 285

Asn Asp Asn Ala Asn Gly Gly Gly Gly Val Ala Val Val Thr Asp Met

290 295 300

Asp Lys Gln Glu Cys Gly Asn Thr Asn Val Arg Val Ser Val Gly Asn

305 310 315 320

Phe Val His Met Ser Ser Ser Arg Trp Pro Lys Asp Glu Val Glu Ala

325 330 335

Leu Ile Arg Leu Arg Thr Gln Ile Asp Val Gln Ala Gln Trp Asn Ser

340 345 350

Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Ser Lys Gly Pro Leu Trp Glu Glu Ile

355 360 365

Ser Ser Ala Met Lys Ser Leu Gly Tyr Asp Arg Ser Ala Lys Arg Cys

370 375 380

Lys Glu Lys Trp Glu Asn Ile Asn Lys Tyr Phe Lys Arg Ile Lys Glu

385 390 395 400

Lys Ser Lys Arg Lys Pro Gln Asp Ser Lys Thr Cys Pro Tyr Tyr His

405 410 415

His Leu Glu Ala Leu Tyr Ser Lys Lys Pro Lys Lys Val Asp Leu Gly

420 425 430

Asn Glu Leu Lys Pro Glu Glu Leu Leu Met His Ile Met Val Ser Gln

435 440 445

Ser Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Met Gln Thr Gln Thr Gln Ser

450 455 460

Pro Ser Glu Asp Ala Glu Arg Asp Gln Asn Gln Gly Asp Asn Glu Asp

465 470 475 480

Gln Ser Glu Tyr Gln Asn Gln Met Val Asp Asn Asn Ser Pro Ser Ile

485 490 495

Ala Ile Met Ser

500

Claims

1.大豆GmGT-2A基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

3.含有权利要求1所述基因的转基因细胞系。

4.含有权利要求1所述基因的工程菌。

5.权利要求1所述的基因在培育耐逆性植物中的应用，所述耐逆性为耐盐性和/或耐旱性和/或耐寒性。