CN103243096B - 一种植物组织特异表达启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物组织特异表达启动子及其应用。本发明提供的DNA片段，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：1)序列表的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)中所述DNA分子具有90％以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明提供了一个DNA片段，其为启动子，其可在拟南芥的根、胚轴(特别是叶和胚轴连接处)、叶片与茎连接处高量表达，在叶片、花和荚中不表达。说明该启动子是在植物特定组织表达的一个特异启动子，可能在人为控制遗传育种、抗逆和耐逆相关基因的表达、培育抗逆性和耐逆性植物的转基因研究中发挥重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物组织特异表达启动子及其应用。
背景技术
组织特异性启动子调控基因只在某些特定器官或组织表达，因此又称为器官或细胞特异性启动子。组织特异性启动子通常表现发育调节特性，有的在特异表达的同时具有诱导活性。组织特异性启动子中通常同时含有几种控制组织特异表达的元件，这些元件的种类、数目和相对位置等因素协同作用决定其表达特异性。组织特异性启动子的深入研究有助于阐明植物形态、发育过程和代谢途径，具有广泛的应用价值。
植物根负责植物体水分和营养物质的运输和吸收，对植物的生长发育起重要作用。通过对根特异表达启动子的一系列的研究，发现了多个植物根特异表达的调控元件。
将大麦(barley)IDS2启动子启动基因在根中特异表达且受铁缺乏的诱导。进一步研究发现该启动子中有两个与根特异表达和铁缺乏诱导相关的元件，分别为IDE1和IDE2，其对根特异及铁缺乏的诱导表达都是必需的，缺一不可(Kobayashi T，NakayamaY，Itai R N，et al.Identification of novel cis-acting elements，IDE1and IDE2，of the barley IDS2gene promoter conferring iron-deficiency-inducible，root-specific expression in heterogeneous tobacco plants[J].Plant J，2003，36：780-793.)。
烟草TobRB7基因是一个根特异性表达基因，主要在根部分生组织与未成熟的中柱鞘中表达。研究发现该基因转录起始位点上游636bp的序列就足以特异驱动GUS基因在转基因烟草的根部表达，在该启动子的-813到-636区存在一个抑制报告基因表达的负调控元件(Yamamoto Y，Taylor C，Acedo，G，et al.Characterization ofcis-acting sequences regulation root-specific gene expression in tobacco[J].Plant cell，1991，3：371-382.)。
大豆中SbPRP1基因编码一种脯氨酸丰度较高的蛋白，该基因主要在大豆的根部表达。研究发现SbPRP1启动子大小约1.1Kb，能够驱动GUS基因在转基因烟草的根尖、初生根、次生根的伸长区和根部皮层中表达。缺失分析发现，转录起始位点上游262bp的序列是决定根特异表达的关键区段，与根部核蛋白结合的-1080到-262区段，具有增强子的功能，能够增强报告基因在根部的表达(Suzuki H，Fowler T J，TierneyM L.Deletion analysis and localization of SbPRP1，a soybean cell wall proteingene，in roots of transgenic tobacco and cowpea[J].Plant Mol Biol，1993，21：109-119.)。
拟南芥Pyk10基因编码黑芥子酶(myrosinase)，该基因主要在拟南芥的根和下胚轴中表达。研究发现该启动子中存在CANNTG-motifs、GATA-motifs、ACGT核心序列、诱导物反应元件W-box(C/TTGACC/T)、植物激素应答元件(如as-1元件、生长素和脱落酸应答元件、Myb元件等)和细胞特异表达元件等若干器官特异性表达和应答植物激素反应的特异元件。其中CANNTG，ACGT，GATA等调控元件结合决定组织特异表达的转录因子，Myb元件是控制植物次生代谢以及调节细胞形态建成和信号转导通路中的重要元件(Nitz I.，Berkefeld H，Puzio P S，et al.Pyk10，a seedling and rootspecific gene and promoter from Arabidopsis thaliaha[J].Plant Sci，2001，161：337-346.)。
苜蓿的MsPRP2基因编码一种细胞壁蛋白，该基因主要在根部表达。Winicov等的研究发现，该基因启动子-652到+1区段可以驱动GUS报告基因在转基因烟草的根冠、根毛、根中部的脉管系统中特异表达，此外在盐胁迫条件下，该启动子驱动报告基因的表达强度增加(Winicov I，Valliyodan B，Xue L，et al.The MsPRP2 promoterenables strong heterologous gene expression in a root-specific manner and isenhanced by overexpression of A1fin 1[J].Planta，2004，219：925-935.)。
虽然已经对一系列根部特异表达的启动子进行了深入研究，但迄今为止还没有在这些根部特异表达的启动子中发现一致的根部特异调控元件。不同种类的根特异性表达基因通常都特异的在根部特种类群细胞中进行表达，因此，根特异启动子对基因的表达调控不仅受到启动子中不同调控元件的影响，也会受到特异细胞中蛋白质因子的影响，该调控是一个十分复杂的过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物组织特异表达启动子及其应用。
本发明提供的DNA片段(1W)，来源于大豆(G1ycine max(L.)Merr.)，为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：
1)序列表的序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所述DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；
3)与1)中所述DNA分子具有90％以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。
上述序列1由1316个核苷酸组成。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
其中，重组载体为将上述DNA片段插入pBI121中得到的重组载体，具体为将上述DNA片段插入在pBI121的HindIII和SmaI识别位点间获得的重组载体。
扩增以上任一所述DNA片段全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列2，另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3。
上述DNA片段在使目的基因在植物组织中的表达中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述组织为根部或下胚轴，也可为叶片与茎连接处、花的基部或幼荚基部。
上述应用中，所述植物为双子叶植物。
上述应用中，所述双子叶植物为拟南芥。
上述DNA片段在植物的遗传育种中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述植物为双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
本发明的实验证明，本发明提供了一个DNA片段，其为启动子，其可使目的基因在拟南芥幼苗的根、下胚轴高量表达，成株期在根、下胚轴、叶片与茎连接处、花基部和幼荚基部表达，在叶片、花和荚中不表达。说明该启动子是在植物特定组织表达的一个特异启动子，可能在人为控制遗传育种、抗逆和耐逆相关基因的表达、培育抗逆性和耐逆性植物的转基因研究中发挥重要的作用。
附图说明
图1为大豆启动子1316bp目标片段的序列扩增
图2为测序质粒与表达载体空质粒双酶切检测
图3为启动子重组质粒转化农杆菌菌液PCR检测
图4为不同组织中GUS染色结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、DNA片段1W的获得
从大豆(文丰7号，(Glycine max(L.)Merr.国家农作物种质保存中心，编号ZDD02611)幼苗叶片中提取基因组DNA，稀释到10ng/μL，取稀释DNA模板3μL，2mM dNTP 1.5μL，2μM正、反向引物各1.5μL(Qs09D-1F：CCCAAGCTTGGGAGTCAATGAAACCGGATGGG(序列2)，Qs09D-1R：TCCCCCGGGGGAGGTTGTTCTTGTGATGTT(序列3))，10×Ex Buffer 2μL，Ex Taa 0.75U，加水补至20μL。94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，36个循环；72℃后延伸10min。
将PCR产物电泳检测，结果如图1所示，其中，M：100bp；1-8为文丰7号扩增产物，可以看出，该PCR扩增产物为1300bp左右。
回收该PCR产物，将其连接pMD18-T Vector，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌TOP10感受态细胞(天根生化科技有限公司)中，得到转化子。提取转化子的质粒送去测序，结果为该质粒中的PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，将该PCR产物命名为1W，其由1316bp个核苷酸组成，该质粒为将序列表中的序列1插入pMD18-TVector中得到的质粒，命名为pMD18-T-1W。
将pMD18-T-1W用HindIII和SmaI进行双酶切验证，，结果如图2所示，M1：100bpDNA ladder；1-3为pMD18-T-1W；4为1W片段；5为空载体pBI121；M2：500bp DNA ladder，得到1316bp目的片段，说明该质粒正确。
实施例2、启动子1W的功能验证及应用
1、转1W拟南芥的获得
1)植物表达载体的获得
将由实施例1得到的质粒pMD18-T-1W经HindIII和SmaI双酶切，得到的酶切产物(1316bp)与同样经过酶切的pBI121(Clontech公司)载体骨架(约13.6kb)连接，得到连接产物，将连接产物转入大肠杆菌Top10感受态细胞，得到转化子。
提取转化子的质粒，利用HindIII和SmaI双酶切，结果得到1316bp的目的片段的为阳性质粒。
将阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中的序列1插入pBI 121的HindIII和SmaI酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为pBI121-1W::GUS。
2)重组农杆菌的获得
将步骤1)得到的pBI121-1W::GUS转入农杆菌菌株GV3101(Promega公司)感受态细胞中，得到重组菌。
将重组菌进行用特异引物Qs09D-1F/Qs09D-1R进行菌液PCR扩增检测，结果如图3所示，其中，M：100bp DNA ladder；1：空载体pBI121；2-9：重组菌，可以看出，得到1300bp左右扩增片段的为阳性重组菌，命名为GV3101/1W::GUS。
3)转1W拟南芥的获得
采用花顶端法转化拟南芥以获得转基因拟南芥植株，具体过程如下：
(1)转化菌液的准备：从28℃培养的平板上挑取单菌落GV3101/1W::GUS于10mL含有相应抗生素的LB液体培养基中(50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素)，28℃恒温摇床上200rpm过夜摇菌，取2mL菌液接种于200mL LB液体培养基(含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平和50mg/L庆大霉素)中，28℃恒温摇床上200rpm培养至OD600＝0.8，将菌液分装于50mL离心管中，4℃，4000rpm离心10min离心收集菌体，用转化培养基重悬菌体；再次4℃，4000rpm离心10min离心收集菌体，最后用50mL转化培养基重悬菌体，得到菌体重悬液。
(2)转化拟南芥：将前一天浇透水的拟南芥(Arabidopsis thaliana，哥伦比亚生态型Col-0，SALK公司购买，以下简称为野生型拟南芥)花盆倒扣于装有500mL上述(1)得到的菌体重悬液的培养基中(含有0.2％的Silweet-77)，拟南芥的花序全部浸没在菌液中，侵染30s-3min。将侵染过的拟南芥植株用黑色塑料袋罩住，保湿24h。三天后再浸染一次，待种子成熟后，收获19个T0代转1W拟南芥种子。
(3)阳性植株筛选
将收获的T0代转1W拟南芥种子分装于1.5mL的离心管中；每管种子加1mL的70％酒精，浸泡10min；离心弃上清，1mL的无水乙醇浸泡10min；离心弃上清，种子置无菌风下吹干；将种子播种于含有卡那霉素(50mg/mL)的MS筛选培养基(普通的MS培养基加上筛选抗生素Kan)上，置4℃春化2d；移入拟南芥培养室培养，种子萌发后，能够继续生长并且保持绿色的即为初步筛选的转基因阳性苗，非转基因阳性苗则黄化死去。待在筛选培养基筛选出来的苗长出两片真叶时，移栽到土壤进一步生长，收获T1代种子，得到19个T1代转1W拟南芥种子。
(4)阳性植株的分子检测
剪取19株编号为1-19的T1代转1W拟南芥叶片，分别提取基因组DNA，以特异引物Qs09D-1F/Qs09D-1R进行PCR扩增，以野生型拟南芥为对照，得到大约1300bp目的片段的为阳性T1代转1W拟南芥，共得到5个编号为1-5的阳性T1代转1W拟南芥。
收获编号为1-5的阳性T1代转1W拟南芥的种子，进一步进行Kan抗性筛选，共得到编号为1-5的T2代转1W拟南芥纯合系种子。
2、转1W拟南芥的GUS组织化学染色
拟南芥生长的适宜温度为21-23℃，最适湿度60-70％，适宜光照强度：150μmol·sw-1·m-2，拟南芥培养室的培养环境为：温度22℃，湿度70％，光照时间和黑暗时间分别为：16h和8h；光照采用植物生长专用的日光灯。
将编号为5的T2代转1W拟南芥纯合系种子和野生型拟南芥种子播种在MS培养平板上萌发培养，生长至两片真叶完全展开，取编号为5的T2代转1W拟南芥纯合系和野生型拟南芥幼苗，同时将幼苗移栽到蛭石上，待生长不同时期剪取上述得到的编号为5的T2代转1W拟南芥纯合系和野生型拟南芥的幼苗、根、花和荚，分别置于2mL离心管中，加入1.8mL 90％丙酮，冰浴30min，倾去丙酮，用1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗两次(此操作在25℃下进行)，轻轻颠倒混匀，每次洗涤约15min，然后加入GUS组织化学染色反应液，37℃避光温育24h。弃去GUS染色反应液，加入1.8mL70％乙醇，4℃固定几小时，95％乙醇脱色2h，使用体视显微镜进行拍照。
GUS组织化学染色液所需母液及工作液配方如下：
(1)1mol/L磷酸盐缓冲液母液(pH7.2)(1000mL)：
NaH2PO4 38.9g
Na2HPO4 258.12g
调节pH值至7.2，蒸馏水定容1000mL，121℃灭菌20min。
(2)0.2mol/L NaH2PO4母液(pH 7.0)(100mL)：
3.12g NaH2PO4·2H2O溶于无菌双蒸水中，定容100mL
(3)0.2mol/L Na2HPO4母液(pH7.0)(100mL)：
7.17g NaH2PO4·12H2O溶于无菌双蒸水中，定容100mL
(4)GUS组织化学染色反应工作液(20mL)：
加ddH2O定容20mL，分装后-20℃贮存。
结果如图4所示，其中，A为编号为5的T2代转1W拟南芥幼苗(真叶期)纯合系的下胚轴、叶和根；B为编号为5的T2代转1W拟南芥幼苗GUS染色结果；C为编号为5的T2代转1W拟南芥花荚期植株GUS染色结果；D为编号为5的T2代转1W拟南芥纯合系的花、荚GUS染色结果，可以看出，编号为5的T2代转1W拟南芥的根、下胚轴、叶片与茎连接处、花基部和幼荚基部均有蓝颜色，说明1W启动子诱导了GUS在根、下胚轴和叶片与茎连接处、花和幼荚基部表达，尤其在叶和茎连接处有较高的GUS基因的表达，而在叶片和花、荚组织中没有检测到GUS的表达。而野生型拟南芥在任何组织部分均没有颜色。因此，说明，DNA片段1W能够驱动GUS在拟南芥的根和下胚轴表达，该片段为启动子。
Claims (6)
1.一种DNA片段，为序列表的序列1所示的DNA分子。
2.含有权利要求1中所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述的DNA片段插入pBI121中得到的重组载体。
4.扩增权利要求1中所述DNA片段全长的引物对；所述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列2，另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3。
5.权利要求1所述DNA片段在使目的基因在植物组织中的表达中的应用，所述植物为拟南芥，所述组织为根部或下胚轴。
6.权利要求1中所述DNA片段在植物的遗传育种中的应用；所述植物为拟南芥。
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