CN102329796A - 荠菜冷调节蛋白基因启动子及其在植物抗寒性改良中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种荠菜冷调节蛋白基因的启动子及其在植物的抗寒性改良中的应用。该启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其中荠菜冷调节蛋白基因及其启动子包含序列表SEQIDNO:1所示序列中的1960位碱基的核酸序列，该核苷酸序列编码一个受低温诱导表达的、能促进细胞产生抗冷力的基因。在-4℃诱导条件下，该启动子除了在叶中表达量上调外，还在茎中表达量上调。利用该基因启动子片段构建的诱导性表达载体可以在植物受到低温胁迫时启动目标基因的表达。本发明还提供上述启动子在培育抗寒植物中的应用，以改良农作物品种的抗寒性能。

Description

荠菜冷调节蛋白基因启动子及其在植物抗寒性改良中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学、植物基因工程技术领域，具体涉及植物逆境诱导启动子的克隆及其应用。

背景技术

低温寒害是农林业生产中一种严重的自然灾害，世界每年因此造成的损失十分巨大，据统计达2000亿美元。自然环境下温度是决定植物地域分布的主要限制因子，在栽培条件下更影响着农作物及园艺植物等的产量和品质。温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布及生长和产量，对植物生长发育起着决定性作用（Viswanathan C, Zhu JK. Molecular genetic analysis of cold-regulated gene transcription. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2002, 357(1423):877-886）。随着转基因技术的日益成熟，人们已从植物中分离了大批抗寒相关基因（蔺忠龙等. 植物抗冻基因最新研究进展, 北方园艺, 2009(1):119- 123）用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相关基因进行转基因抗寒植物培育时均发现在获得优良低温抗性植株的同时，普遍出现不同程度的生长延滞（retardation）现象。主要是利用抗寒相关基因进行的转基因植物都是在组成性启动子CaMV（cauliflower mosaic virus）35S驱动下产生的。这种基因的组成性表达对植物的生长造成了一定的影响。为了克服转基因植物出现的生长延滞现象，人们开始利用冷诱导启动子代替组成性启动子。冷诱导基因RD29A（来源于拟南芥COR78基因）启动子驱动的转基因植株的研究表明，转基因植株的生长延滞比CaMV35S启动子驱动的转基因植株所表现出来要轻微得多（Kasuga M, et al. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible RD29A promoter improved drought and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Phsiol, 2004, 45:346-350）。利用特异性的诱导型启动子避免外源基因在宿主植物中非特异性的持续、高效表达已经得到广泛共识，但是真正能应用于生产实际的特异性启动子不多，而冷诱导型特异启动子更少。目前特异启动子的克隆及其结构功能的研究是转基因植物研究中的一个热点，也是一个生发点。这一领域的研究成果将极大推动转基因植物基础研究的进展，加速转基因植物的产业化。

荠菜（Capsella bursa-pastoris）是一种1或2年野生的草本植物，平铺地面，喜阴，在南方是处处可见的一种可食用的蔬菜，属于十字花科、荠菜属Capsella Medik，在低温条件下能够正常生长发育并结实。早期的研究表明，拟南芥中的冷调节蛋白（cold-regulated, COR）基因是一种诱发基因，只有在特定的条件下（如零上低温），COR基因才被启动进而促进细胞产生抗冷力。过表达COR15a基因的拟南芥比野生型的植株的抗寒性也有显著提高（Artus NN, et al. Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. PNAS, 1996, 93:13404-13409）。拟南芥中COR基因有两个拷贝，分别称为AtCOR15a和AtCOR15b，这两个基因串联排列在拟南芥第二条染色体上。研究表明AtCOR15b对低温和外源施加的ABA有强烈响应，而对干旱不响应（Kathy S. et al. Arabidopsis thaliana corl5b, an apparent homologue of corl5a, is strongly responsive to cold and ABA, but not drought. Plant Mol Biol, 1993, 23: 1073-1077）。本发明所涉及的荠菜冷调节蛋白基因的启动子与拟南芥中的AtCOR15b同源，属于COR15b型，命名CbCOR15b，是从荠菜叶片的DNA中克隆到的。目前尚未发现CbCOR15b启动子序列和利用CbCOR15b启动子培育耐寒植物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是克隆、鉴定一个受低温强烈诱导表达的植物内源启动子，并利用该启动子构建抗寒相关基因表达载体，通过遗传转化方法达到提高植物的抗寒性，最终获得抗（耐）寒能力明显增强的优良植物品种。

本发明通过以下技术方案实现：

首先是分离受低温强烈诱导表达的启动子，所提供的受低温强烈诱导表达的启动子来源于荠菜。该启动子控制的荠菜内源基因为编码受低温诱导表达的、能促进细胞产生抗冷性的基因，属于冷调节蛋白基因，该冷调节蛋白属COR15b型，故基因被命名为CbCOR15b，启动子被命名为CbCOR15bP （CbCOR15b Promoter）。CbCOR15bP是具有序列表SEQ ID NO: 1中的碱基第1-1123位的序列。CbCOR15bP控制的CbCOR15b基因是具有序列表SEQ ID NO: 1中碱基第1124-1960位的编码序列或含有与其编码的蛋白质同源性至少在80%以上具有相同功能的序列。

本发明所提供的冷调节蛋白基因的启动子（CbCOR15bP）（以下将这一启动子统称为CbCOR15bP）区域含有一个ABRE顺式作用元件，能特异地对低温和ABA起应答反应，一个CRT/DRE（C-repeat dehydration-responsive element）顺式作用元件，能够特异性的和一种受低温诱导的调控冷诱导基因的反式转录激活因子CBF（C-repeat binding transcription factor）结合，一个TGA-element（auxin-responsive element），可以和生长素反应因子（ARF）相结合，一个TCA-element (salicylic acid responsiveness)，一个GARE-motif（gibberellin-responsive element），以及两个CGTCA-motif（MeJA-responsiveness），能够分别被水杨酸、赤霉素和甲基茉莉酸所诱导。

本发明还利用CbCOR15bP构建的诱导性表达载体可以在植物受到低温胁迫时强烈地诱导报告基因GUS在叶和根中表达。

利用本发明所提供的CbCOR15bP构建的植物表达载体转化模式植物烟草，检测转基因烟草的抗寒的生理指标，显示植株耐寒性有了显著提高。

本发明详细技术方案如下：

一种分离出的荠菜DNA分子，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其中荠菜CbCOR15b启动子及其基因包含序列表SEQ ID NO:1所示序列中的1-1123和1124-1960位的核苷酸序列，1124-1960位碱基的核苷酸序列编码一个受低温诱导的、能促进细胞产生抗冷性的冷调节基因。

所述的一种分离的DNA分子，其启动子区（SEQ ID NO:1序列中1-1123位）包含有：包含一个ABRE顺式作用元件CACGTG，一个CRT/DRE元件TGGCCGAC，一个TGA顺式作用元件AACGAC，一个TCA顺式作用元件GAGAGGAATA，一个GARE顺式作用元件TGTGTTG, 两个MeJA顺式作用元件TGACG和CGTCA。

所述的CbCOR15bP全部或部分序列构建的植物表达载体。

所述的CbCOR15bP全部或部分序列构建的植物表达载体，通过遗传转化培育抗寒植物的方法。

所述的CbCOR15bP全部或部分序列构建的植物表达载体，通过遗传转化培育抗寒植物材料。所述的抗寒植物材料是指植株、种子或无性细胞系。

按照以上的技术方案，很显然，申请人或申请人以外的其他人可以利用本发明所提供的CbCOR15bP构建抗寒相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗寒性。受体植物主要包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物，当然也包括其他一些重要的经济作物，例如棉花、油菜或番茄等。

序列表SEQ ID NO：1，公开了本发明克隆的包含启动子序列的荠菜冷调节基因CbCOR15b全长基因序列。

序列表SEQ ID NO：2-3，公开了本发明用于克隆荠菜CbCOR15b启动子的引物序列。

附图说明

图1显示的是CbCOR15bp的全长基因序列。其中，起始密码子ATG和转录起始位点用方框表示； ATG前为启动子序列，ATG后为编码序列，编码序列中的小写字母为内含子；ABRE元件、CRT/DRE顺式作用元件、TGA作用元件，TCA作用元件，GARE作用元件和MeJA作用元件均用下划线表示。

图2 显示的是冷驯化和冷诱导下荠菜CbCOR15b和CbCOR15a基因在根茎叶中的表达特性。

图3显示的是用转基因烟草苗的PCR检测电泳图。

图4显示的是GUS基因的表达和组织化学染色图。其中，（a）为GUS基因的表达量检测图；（b）为GUS基因的组织化学染色图。

具体实施方式

下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 CbCOR15bP的分离和鉴定。

1．荠菜幼苗的培养

荠菜种子来源于上海白玉兰蔬菜种子有限公司，荠菜种子经过消毒处理后，播种于含有MS₀培养基的培养罐内，置于25℃下培养4周，其中光照周期为16h光照，8h黑暗。

2．启动子序列的克隆

采用Genome walking技术扩增荠菜CbCOR15b基因的启动子序列。实验操作按照Universal GenomeWalker^TM Kit（CLONTECH）的使用手册进行。荠菜的Genome walking库建好后，根据COR15b基因的cDNA序列的开放阅读框（ORF）设计2条引物：CbCOR15bF1：5’-GATCAGTCTGTTGTAATGA-3’（记为SEQ ID NO. 2）和CbCOR15bF2：5’- ACCATCG CCATGAGAGATATG-3’（记为SEQ ID NO. 3），与试剂盒中的2个接头引物配合，进行两轮PCR反应，同时电泳检测两轮PCR扩增产物。挑选第二轮中的特异条带进行克隆、测序。

测序显示克隆到的CbCOR15bP全长序列1123bp记为SEQ ID NO. 1。荠菜CbCOR15b基因编码框的第一个起始密码子在（1124bp）处，第一个起始密码子ATG前的1123个碱基为CbCOR15b的启动子序列，命名为CbCOR15bP。

实施例2 CbCOR15b冷诱导和冷驯化处理下的表达特性。

1. 荠菜的种植和处理

取适量新鲜荠菜种子，无菌处理后置于预先配置好的MS培养基（MS粉 4.41g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉8.5g/L）无菌培养罐中，26℃光照培养。冷驯化处理选取种子萌发后4周的幼苗，按温度梯度26℃ (4d), 12℃ (4d), 4℃ (4d), 0℃ (2h), -4℃ (2h)处理荠菜幼苗，冷诱导处理选取种子萌发后4周的幼苗，在4℃条件下，按时间0h, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h梯度处理荠菜幼苗，分别取叶片、茎段和根提取总RNA。

2. RNA抽提

RNA提取按照Plant RNA Mini Kit操作程序进行。

3. RT-PCR扩增

使用One Step RNA PCR Kit (AMV)进行。各管使用Total RNA模板为 1μg，RT-PCR操作按试剂盒操作程序进行。50℃ 30min，94℃ 2min反转录后，样品经30次循环（94℃ 30s，57℃ 30s，72℃- 30s），内参经18次循环（94℃ 30s，57℃ 30s，72℃- 30s），得到PCR产物。1%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

冷驯化结果表明，荠菜根、茎、叶中CbCOR15b的表达在不同的低温处理下均有一定变化，同时在低温（0-4℃）处理下具有组织特异性。CbCOR15b 26℃时在根、茎和叶中几乎没有表达，但随着温度降低，表达水平逐渐提高，12℃-4℃时在根、茎、叶中表达水平几乎没有提高，0℃时，在叶中和茎中表达水平提高明显，在根中表达提高不明显，到-4℃时，茎中表达水平增加较为明显（附图2A）。从附图2A中还可以看出CbCOR15b的表达模式与CbCOR15a不同，CbCOR15b在茎中受低温调控更明显。

冷诱导结果表明，荠菜根、茎、叶中CbCOR15b的表达在-4℃低温处理下有不同程度的冷应答，同时也具有组织特异性。在-4℃放置前根、茎、叶中的CbCOR15b均没有表达，在移入-4℃ 1h 时叶中CbCOR15b有微量表达，3h，6h时表达提高明显，24h时表达水平有所下降；在移入-4℃ 1h，3h，6h根中的CbCOR15b均没有表达，到24h表达水平才有一定的提高；在移入-4℃ 1h 时茎中的CbCOR15b没有表达，3h，6h和24h时表达逐渐增加（附图2B）。从附图2B中还可以看出CbCOR15b的表达模式与CbCOR15a不同，CbCOR15b在茎中受低温调控表达水平增加得更明显。

实施例3 荠菜COR15bP启动子低温诱导活性分析。

在该实施例中，将克隆到的CbCOR15bP序列加上酶切位点BglⅡ和PstⅠ,连至pCAMBA1301载体上（由澳大利亚 CAMBIA [the Center of the Application of Molecular Biology to International Agriculture，Australia]惠赠），构建一个驱动GUS基因的植物表达载体。转化烟草实验表明，CbCOR15bP在低温诱导下能增强GUS基因的表达。因此，CbCOR15bP在作物抗寒基因工程育种中具有较好的应用前景。

表达载体的构建。

在本实施方案中，构建表达载体pCAMBA1301-COR15bP-GUS

切除商品化的植物表达载体pCAMBA1301自带的CaMV35S启动子，连入荠菜COR15bP，调控GUS基因的表达。用商品化的植物表达载体pCAMBA1301，作为荠菜COR15bP在双子叶植物烟草中表达实验的对照。

农杆菌介导法对烟草的转化。

1. 农杆菌的培养  挑取单菌落，在2ml农杆菌液体培养基中，28°C培养过夜；取1mL以上培养物，加入50mL农杆菌液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀=0.6-1.0；8000rpm离心10min，收集菌体，用MS₀重悬，使OD₆₀₀=1.0。

2. 共培养  取烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.8× 0.8cm左右的叶盘，放在MS₁培养基上，防止叶盘脱水；将叶盘放入农杆菌培养液中，190rpm，28℃摇床上浸染10min；用药勺捞出叶盘，放在灭菌的吸水纸上，吸干叶盘上的多余菌液；将吸干的叶盘平放在加盖一层滤纸的MS₁培养基上，25℃左右，于暗处共培养约2d。

3. 诱导丛生芽  共培养后，按以下步骤将叶盘表面的农杆菌洗掉，其间不时摇动，使叶盘充分接触下列溶液：无菌水，15min；无菌水+羧苄青霉素（500mg/L），15min；MS₀ +羧苄青霉素（500mg/L），20min。用药勺捞出叶盘，放在吸水纸上，吸干多余水分；将叶盘放在MS₂培养基上，叶盘边缘轻压入培养基中；25℃左右，16h光照培养。

4. 诱导生根  在MS₂培养基上诱导约4周后，将叶缘长出的幼芽从基部与叶盘切开，将幼芽插入MS₃培养基中诱导生根，25℃左右，16h光照培养。

5. 诱导生根后约3-4周，挑选生长茁壮根系发达的植株，首先将培养基罐子打开适应外界环境5-7天，然后将幼苗温柔取出，在水中轻柔洗净培养基残余（不要伤害根系）后栽入普通土质中培养（腐殖质土+珍珠岩+沸石）。标好编号待检测。25°C左右，16h光照培养。

转基因烟草微量DNA提取及PCR检测筛选。

1.  取少量转基因植株叶片，剪碎，置研钵中，加入1mL提取缓冲液（100 mmol/L Tris·Cl pH 8.0，20mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，1.5% SDS），研磨成浆。

2. 吸入1.5mL EP管中，剧烈摇动混匀。

3.  60℃水浴保温30-60min，不时颠倒混匀。 

4. 室温下10000rpm离心5min。

5.  小心吸取上清于新的离心管中，加入等体积氯仿，剧烈震动。

6. 室温下10000rpm离心5min。

7. 小心将上清吸入新的离心管中。

8. 加入1倍体积异丙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。8000rpm离心5min，弃掉上清；75%酒精洗1次，晾干沉淀。

9. 加入5μL RNaseA（10μg/μL），37℃ 10min，除去RNA。

10. 加50-100μL水融解，-20℃贮存。

11.  以提取出的DNA为模板，用表达载体自带HYG基因引物、CbCOR15bP特异性引物和GUS基因的引物分别进行PCR扩增，鉴定目的基因在转基因烟草基因组中的整合状况，结果显示119个株系中有35个株系在三种引物扩增下均能PCR出特异的条带，说明这35个株系是转基因阳性植株（见附图3）。

转基因烟草RNA提取及RT-PCR检测。

常温下以及4°C冷处理烟草转基因阳性植株30号株系苗，取叶片和根，提取总的RNA，经DNase I消化基因组DNA，以烟草中GAPDH基因（GenBank Accession No.：AJ133422）为内参，对转基因烟草苗30号株系在4℃处理后GUS的表达量进行RT-PCR检测，结果显示在4℃处理下，烟草叶片和根中GUS基因的表达量明显高于26℃条件下的GUS基因的表达量（附图4a所示）。

低温逆境处理和GUS组织化学染色。

常温下以及4℃冷处理烟草30号株系苗，取叶片和根，用GUS反应液（0.0577 mol/L NaH₂PO4，0.0423 mol/L Na₂HPO₄，pH 7.0，3g/L EDTA pH 7.0，1g/L 铁氰化钾，0.75g/L X-gluc；0.1% NP40）浸泡上述各处理烟草幼叶和根，抽真空（200 Mbar，15min），37℃温育过夜，用75%乙醇脱色脱水，蒸馏水清洗，然后观察拍照。

GUS 基因的表达产物可将反应液中的X-Gluc水解成蓝色物质，使组织呈现蓝色，蓝色的深浅及斑点数量，能在一定程度上反应GUS 基因的表达水平。在正常培养条件下pCAMBA1301-COR15bP-GUS载体转化的阳性烟草幼叶和根中没有显示蓝色斑点，但在冷诱导条件下，pCAMBA1301-COR15bP-GUS载体转化的阳性烟草幼叶和根显现蓝色。由此说明，CbCOR15bP在烟草细胞中可受低温诱导启动结构基因的表达（见附图4b）。

                         SEQUENCE LISTING

<110>  复旦大学

<120>  荠菜冷调节蛋白基因启动子及其在植物抗寒性改良中的应用

<130>  001

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1960

<212>  DNA

<213>  

 

<400>  1

gatcagtctg ttgtaatgat ttctattaaa ttcacatcaa ccctcgaaat aagagacatg     60

 

gctcgcagtt aaactaattg tactcttaca accagcttgt gctaggacga gcatatgtaa    120

 

ttaagctcgt tcgttaggct cttgtctctt ttgtgacgaa aataaatggg atggcacaaa    180

 

agaaaaataa ttaattatca ccacatctcg gcactccccg tcacacacat catcatcaag    240

 

tagtctatcc ataattagat tgtctctgcc cgataatatg actctctccc aaatgtgaag    300

 

gctctattac tattagtagt ggaacttaaa tcacatccca aactagcgaa gtatgtcatt    360

 

tggcattgcc acaacagcac actgttcaat gttcatatac ctaattaacc aatgtgagac    420

 

gacatatctt ataggctcct ttgttgttag tttcaacttt caagcaagag aggaatacac    480

 

atgctcattt cacataattt ttgtgtcctt tctagcttat tgtaaataac gttttgtgct    540

 

gttgagcaat ataggtttta gagtaacatt gacatttata agtacaaact gacccctaag    600

 

gcactgaaga taaaccaaaa taatgttaaa tagttgttct taactcaatt gctaatcact    660

 

agtacacatt ttcagcttaa cgactaatac aactatcctt tatgtatacc tcaatgatca    720

 

gtctactaat cgttagtgtt gaaagttgca aatcaaataa aaatgctaac atgtaaagtt    780

 

tggttgccaa aaatgctaac atgtatataa cggttataac cacaacttga tggccgacct    840

 

ctttttttgt tggtgctaag ttagtaacca tagaaatgat tacacgtagc taaaaatacg    900

 

aacgaacaaa aactcttctt agttaacgat actagctagt aatgcgcaaa aatatcttga    960

 

actgacacgt gtacataaat ttggattctc tcattggccg agaggtctat aagacgatac   1020

 

tattggagat tagatgcttc tcatctcact ttctccatat gtacaaactc agttcctttt   1080

 

ctattttatt tatttccttc taagaaacat atctctcatg gcgatgtctt tctcaggagc   1140

 

tgttctcagt ggcatgggtt cttctttcca cagcggagta accaagcaga gtagcgttgg   1200

 

cgccgtcgga gttggccgga agagtgaact cgtcgtcgtt gctcagcgca agaagtcgtt   1260

 

gatatacgcc gtcaaaggtg acggcaacat cctcgatgac cttaacgaag ccacgtgagt   1320

 

ctatgttata tatctttgaa caatcttcct cgtgtgacta gtttaagtct atctagatat   1380

 

ttttactcaa aaaactctaa tgtatattac gtacgtagta ctccacatga atttttgttt   1440

 

ttggttaatt ccaccatatt agtttgataa agactcactg taatataatt aatggtcttt   1500

 

gttgaggatt gattttatcc actgagccat ttggaaaaaa tatacatata taccgatcta   1560

 

cttttataaa aaaaaagatg tttactttaa taagtatatg ataaaagtaa atatttgttt   1620

 

ttggaaatat ataatatata aaagatatat ttgagtactc tttagaacaa acgactcaaa   1680

 

ttcatgacca aatgttttaa aaccgtttac tcaataatct gaataaacgt gcagaaagaa   1740

 

agcttcggat ttcatgacgg agaagacaaa ggaagctttg gtggatggtg agaaagcaaa   1800

 

agactacgtt gttgagaaaa ccatcgaagc caatgatacg gcgacagagg aagcaaagaa   1860

 

agcttttgat tatgtgacgg agaaaggcaa agaagccgga aacaaggcgg ctgagttcgt   1920

 

agagggtaaa gctggagagg ctaaggatgc caccaagtag                         1960

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  

<400>  2

gatcagtctg ttgtaatga                                                  19

 

<210>  3

<211>  21

<212>  DNA

<213>  

<400>  3

accatcgcca tgagagatat g                                               21

 

 

Claims (5)

1.一种分离的具有低温诱导表达特性的荠菜冷调节蛋白基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中碱基第1-1123位的序列所示。

2.如权利要求1所述的荠菜冷调节蛋白基因的启动子，其特征在于启动子区包含一个ABRE顺式作用元件CACGTG，一个CRT/DRE元件TGGCCGAC，一个TGA顺式作用元件AACGAC，一个TCA顺式作用元件GAGAGGAATA，一个GARE顺式作用元件TGTGTTG, 两个MeJA顺式作用元件TGACG和CGTCA。

3.由权利要求1所述的荠菜冷调节蛋白基因的启动子构建的植物表达载体。

4.如权利要求1所述的荠菜冷调节蛋白基因的启动子在植物的抗寒性改良中的应用。

5.如权利要求4所述的荠菜冷调节蛋白基因的启动子在植物的抗寒性改良中的应用，其特征在于所述植物为水稻、小麦、玉米、棉花、油菜或番茄。

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