CN102703441A - 发夹型核酸荧光探针及其在检测铅离子的应用 - Google Patents

Abstract

一种发夹型核酸荧光探针，该发夹型核酸荧光探针的序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’。发夹型核酸荧光探针在检测铅离子中的用途，使用方法由配制发夹型核酸探针储备液、配制发夹型核酸探针储备液、配制待测样品溶液、测定样品步骤组成，通过检测体系荧光强度的变化，能够实现铅离子的检测。该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简单、响应速度快、无需复杂仪器等优点。

Description

发夹型核酸荧光探针及其在检测铅离子的应用

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及基于发夹核酸荧光探针构型的转变检测铅离子。

背景技术

重金属原义是指比重大于5的金属，包括金、银、铜、铁、铅等，重金属在人体中累积达到一定程度，会造成慢性中毒。对环境污染和人体毒害最大的有5种：铅、汞、铬、砷、镉。这些重金属在水中不能被分解，人饮用后毒性放大，与水中的其他毒素结合生成毒性更大的有机物或无机物。铅，是重金属污染中毒性较大的一种，一但进入人体很难排除。直接伤害人的脑细胞，特别是胎儿的神经板，可造成先天大脑沟回浅，智力低下；对老年人造成痴呆、脑死亡等。英国科学家研究表明，铅可以缩短人的寿命，如果人类饮食铅的含量为零，那么人的寿命将过140岁。因此，铅离子的快速灵敏检测对人类健康和环境监测都有着十分重要的意义。

传统的检测铅离子的方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体法等，都可以有效地检测铅离子，但这些方法需要大型仪器，操作复杂，样品的使用量大，无法进行痕量检测，因此限制了其广泛的应用。

近几十年来发展的检测铅离子的方法有比色法、电化学分析法、荧光分析法，这种方法灵敏度低，重现性差，一般很少采用；电化学分析法，虽然灵敏度较高，但耗时耗力，选择性差，不利于快速检测样品；荧光分析法，灵敏度高，选择性好，时间短，可以进行痕量检测，因此得到广泛应用。

检测铅离子的荧光核酸探针越来越多，像8-17核酸酶，由H.Wang，Y.Kim，H.P.Liu，Z.Zhu，S.Bamrungsap and W.H.Tan，Engineering a UnimolecularDNA-Catalytic Probe for Single Lead Ion Monitoring，J.Am.Chem.Soc.，2009，131(23)，8221-8226公开；纳米粒子由F.Chai，C.Wang，T.Wang，L.Li，andZ.Su，Colorimetric Detection of Pb²⁺Using Glutathione Functionalized GoldNanoparticles，ACS Appl.Mater.Interfaces，2010，2(5)，1466-1470公开；G4核酸酶由T.Li，S.Dong and E.Wang，A Lead(II)-Driven DNA Molecular Devicefor Turn-On Fluorescence Detection of Lead(II)Ion with High Selectivityand Sensitivity.J.Am.Chem.Soc.，2010，132(38)，13156-13157公开。其中分子信标作为发夹结构的荧光核酸探针，是一种极好的生物分子传感器。分子信标技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析在临床诊断、基因检测等领域，分子信标也越来越显示出它的优势。但是一般的分子信标是双标记的核酸探针，造成其成本高，应用受限。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于克服已有技术的缺点，提供一种识别性能好、特异性高、选择性好、灵敏高的发夹型核酸荧光探针。

本发明所要解决的另一个技术问题在于为发夹型核酸荧光探针提供一种新用途。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：发夹型核酸荧光探针的序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’。

上述发夹型核酸荧光探针的合成方法由下述步骤组成：

脱保护：将预先连接在固相载体控制微孔玻璃上的活性基团被保护的核苷酸与12.1gmL三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团二甲氧基三苯甲基，获得游离的5′-羟基。

缩合：合成DNA的原料-单体，与2.9mL活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被二甲氧基三苯甲基保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

带帽反应：用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应。

氧化：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为磷酸三酯。

通过上述步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被连接上去。合成过程中可以观察三氯乙酸处理阶段的颜色判定合成效率。

氨解：通过氨水55℃处理，连接在控制微孔玻璃上的引物被切下来。

纯化：切下来的寡核苷酸粗品用高效液相色谱纯化手段进行纯化，OD260定量及抽干后对寡核苷酸进行分装，即合成了该发夹型核酸荧光探针。

所合成的发夹型核酸荧光探针在检测铅离子中的用途。其使用方法如下：

1、配制发夹型核酸探针储备液

取33μg序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’探针，加入pH为7.0、物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液35μL，配制成物质的量浓度为1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针储备液，置于-20℃冰箱中，备用。

2、退火发夹型核酸探针溶液

取1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针溶液2μL，用1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释至1.0×10^-6mol/L作为探针母液，在水浴锅中加热到90℃，保持5分钟进行热处理，冷却至室温，放于4℃冰箱中过夜。

3、配制待测样品溶液

a.打开水管放水20分钟，量取自来水100mL，煮沸5分钟去除氯，备用。

b.37℃，用1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将离体的人血清稀释100倍。

4、测定样品

a.配制铅离子标准溶液：按常规方法分别配制物质的量浓度为1.0×10^-4mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-7mol/L的铅离子标准溶液。

b.制作标准曲线：取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液98μL，取步骤2中1×10^-6mol/L的探针母液2μL，配制成探针最终浓度为2×10^-8mol/L的混合溶液，室温静置15分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F₀；在上述的混合溶液中逐级加入0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-4mol/L的铅离子标准溶液，得到最终铅离子标准溶液的物质的量浓度为5×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L和5×10^-7mol/L，室温静置5分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F，荧光分光光度计的激发波长为480nm、发射波长为520nm、激发波长和发射波长狭缝宽度均为10nm、负高压为700V，以lg浓度为5×10^-10～5×10^-7mol/L铅离子溶液为横坐标X，1-F/F₀为纵坐标Y，由origin 7.5软件作图，得到标准曲线的线性回归方程：

Y＝0.2005X+1.8984

线性相关系数为0.9969。

c.检测样品溶液中的铅离子：取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液48μL和步骤2中1×10^-6mol/L的探针母液2μL，加入50μL水样，混合均匀，静置15分钟，用荧光分光光度计检测水样的荧光强度，采用标准加入法进行铅离子的回收。

将步骤2中1×10^-6mol/L的探针母液2μL和1μL离体的人血清加入到97μL物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液中，混合均匀，静置15分钟，用荧光分光光度计检测血清的荧光强度，采用标准加入法进行铅离子的回收，按下式计算铅离子的回收率：

R％＝m_测/m_实

式中m_测是待测样品中铅的质量，m_实是标准样品中铅的质量。

本发明的有益效果如下：

1、本发明发夹型核酸荧光探针用于检测铅离子的方法具有灵敏度高、选择性好、检测限低等优点。

2、本发明所用试剂廉价，分析成本较低，且操作简单、方便，有利于实际样品的检测，检测速度快，仅需5分钟。

附图说明

图1是发夹型核酸荧光探针的圆二色谱图。

图2是不同浓度铅离子与发夹型核酸荧光探针作用的荧光光谱图。

图3是发夹型核酸荧光探针对铅离子的选择性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

发夹型核酸荧光探针的序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGG TGACGGGG-3’。该探针的合成方法如前所述。发夹型核酸荧光探针在检测水样中铅离子的用途，其使用方法如下：

1、配制发夹型核酸探针储备液

取33μg序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’探针，加入pH为7.0、物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液35μL，配制成物质的量浓度为1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针储备液，置于-20℃冰箱中，备用；

2、退火发夹型核酸探针溶液

取1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针溶液2μL，用1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释至1.0×10^-6mol/L作为探针母液，在水浴锅中加热到90℃，保持5分钟进行热处理，冷却至室温，放于4℃冰箱中过夜；

3、配制待测样品溶液

打开水管放水20分钟，量取自来水100mL，煮沸5分钟去除氯，备用；

4、测定样品

a.配制铅离子标准溶液

按常规方法分别配制物质的量浓度为1.0×10^-4mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-7mol/L的铅离子标准溶液。

b.制作标准曲线

取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液98μL，取步骤2中1×10^-6mol/L的探针母液2μL，配制成探针最终浓度为2×10^-8mol/L的混合溶液，室温静置15分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F₀；在上述的混合溶液中逐级加入0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-4mol/L的铅离子标准溶液，得到最终铅离子标准溶液的物质的量浓度为5×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L和5×10^-7mol/L，室温静置5分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F，荧光分光光度计的激发波长为480nm、发射波长为520nm、激发波长和发射波长狭缝宽度均为10nm、负高压为700V，以lg浓度为5×10^-10～5×10^-7mol/L铅离子溶液为横坐标X，1-F/F₀为纵坐标Y，由origin 7.5软件作图，得到标准曲线的线性回归方程：

Y＝0.2005X+1.8984

线性相关系数为0.9969。

c.检测水样品溶液中的铅离子

取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液48μL和步骤2中1×10^-6mol/L的探针母液2μL，加入50μL水样，混合均匀，静置15分钟，用荧光分光光度计检测水样的荧光强度，采用标准加入法进行铅离子的回收。检测和计算结果见表1。

表1  用发夹型核酸探针检测自来水中Pb²⁺含量

由表1可见，回收率为98.86％～100.3％，表明用发夹型核酸探针可以有效地检测水样中的铅离子。

实施例2

发夹型核酸荧光探针的序列为5’FAMGT-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGG TGACGGGG-3’。

该探针的合成方法如前所述。发夹型核酸荧光探针在检测离体人血清中铅离子的用途，其使用方法如下：

配制发夹型核酸探针储备液步骤1、退火发夹型核酸探针溶液2与实施例1相同。

在配制待测样品溶液步骤3中，37℃，用1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将离体的人血清稀释100倍

在测定样品步骤4中，配制铅离子标准溶液、制作标准曲线与检测水样品溶液中的铅离子相同。检测离体人血清中铅离子的方法如下：

将步骤2中1×10^-6mol/L的探针母液2μL和1μL离体的人血清加入到97μL物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液中，混合均匀，静置15分钟，用荧光分光光度计检测血清的荧光强度，采用标准加入法进行铅离子的回收，按下式计算铅离子的回收率：

R％＝m_测/m_实

式中m_测是待测样品中铅的质量，m_实是标准样品中铅的质量。检测和计算结果见表2。

表2  用发夹型核酸探针检测离体人血清中的Pb²⁺含量

由表2可见，回收率为92.93％～103.9％，表明用发夹型核酸探针可以有效地检测离体人血清中的铅离子。

为了验证本发明发夹型核酸荧光探针的有益效果，发明人采用本发明实施例1的发夹型核酸荧光探针进行了大量实验，各种试验情况如下：

1、圆二色谱实验

取1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针储备液4μL和1.0×10^-4mol/L的铅离子标准溶液10μL于离心管中，再加入1.0×10^-2mol/L pH为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释至200μL，使发夹型核酸荧光探针的最终浓度为2.0×10^-6mol/L，铅离子浓度为5.0×10^-6mol/L，在水浴锅中逐渐加热到90℃，保持5分钟进行热处理，冷却至室温，放于4℃冰箱中过夜。用宽度为1mm的石英比色皿，以100nm/min的速度，在210～350nm的范围内扫描圆二色光谱，平行测量三次取平均值，实验结果见图1，在图1中，曲线a为不存在铅离子时2.0×10^-6mol/L发夹型核酸荧光探针的圆二色谱光谱曲线，曲线b为存在5.0×10^-6mol/L铅离子时发夹型核酸荧光探针的圆二色谱光谱曲线。由图1可见，通过正峰240nm和负峰260nm圆二色谱增大，说明G-四链体形成。

2、发夹型核酸荧光探针测铅离子的灵敏度

取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液98μL和1×10^-6mol/L的探针母液2μL，配制成探针最终浓度为2×10^-8mol/L的混合溶液，室温静置15分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F₀，见图2中的曲线a；在上述的混合溶液中逐级加入0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-4mol/L的铅离子标准溶液，得到最终铅离子标准溶液的物质的量浓度为5×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L和5×10^-7mol/L，室温静置5分钟，用荧光分光光度计检测上述铅离子标准溶液的荧光强度F，见图2中的曲线b～h。在图2中，曲线a～h分别是铅离子的浓度为0，5.0×10^-10、1.0×10^-9、5.0×10^-9、1.0×10^-8、5.0×10^-8、1.0×10^-7、5.0×10^-7mol/L对应的荧光强度，插图为以lg浓度为5×10^-10～5×10^-7mol/L铅离子溶液为横坐标X，1-F/F₀为纵坐标Y得到的标准曲线。荧光分光光度计的激发波长为480nm、发射波长为520nm、激发波长和发射波长狭缝宽度均为10nm、负高压为700V，以lg浓度为5×10^-10～5×10^-7mol/L铅离子溶液为横坐标X，1-F/F₀为纵坐标Y，由origin 7.5软件作图，得到标准曲线的线性回归方程：

Y＝0.2005X+1.8984

线性相关系数为0.9969。

基于发夹型核酸荧光探针构型的转变能够快速灵敏的检测铅离子，检测铅离子浓度的线性范围是5×10^-10～5×10^-7mol/L，计算出检测铅离子的检测限为4.0×10^-10mol/L，具体计算公式如下：

$\mathrm{DL}=\frac{3S_{b}C}{{\stackrel{\‾}{X}}_c-{\stackrel{\‾}{X}}_b}$

式中S_b是11次空白测定的标准偏差，X_c是对一个浓度为C的标准溶液进行3次平行测定得到的响应信号，X_b为11次空白测定的平均值，C为稍高于检出限的浓度。

3、发夹型核酸荧光探针测铅离子的选择性

与现有的线性核酸荧光探针进行了对比实验，发夹型核酸探针检测铅离子(Pb²⁺)的选择性特别高。实验中的线性核酸探针序列为5’-FAM-ACGCTTGGGTGGGTGGGTGGTCAATGGG-3’，具体使用方法与发夹型核酸探针相同，通过比较Pb²⁺与Cd²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、K⁺、Na⁺、Cr³⁺金属离子的作用，分别用荧光分光光度计进行检测。实验结果见图3，黑色柱子代表本发明中的发夹型核酸探针检测各种金属离子的荧光比值，灰色柱子代表上述的线性核酸探针检测各种金属离子的荧光比值，发夹型核酸探针和线性核酸探针的最终浓度均为2×10^-8mol/L，检测铅离子的浓度为5.0×10^-7mol/L，其它金属离子浓度均为1.0×10^-6mol/L，说明发夹型核酸荧光探针检测铅离子具有较高的选择性。

Claims (3)

1.一种发夹型核酸荧光探针，其特征在于：该发夹型核酸荧光探针的序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’。

2.权利要求1所述的发夹型核酸荧光探针在检测铅离子中的用途。

3.按照权利要求2所述的发夹型核酸荧光探针在检测铅离子中的用途，其特征在于使用方法如下：

(1)配制发夹型核酸探针储备液

取33μg序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’探针，加入pH为7.0、物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液35μL，配制成物质的量浓度为1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针储备液，置于-20℃冰箱中，备用；

(2)退火发夹型核酸探针溶液

取1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针溶液2μL，用1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释至1.0×10^-6mol/L作为探针母液，在水浴锅中加热到90℃，保持5分钟进行热处理，冷却至室温，放于4℃冰箱中过夜；

(3)配制待测样品溶液

a.打开水管放水20分钟，量取自来水100mL，煮沸5分钟去除氯，备用；

b.37℃，用1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将离体的人血清稀释100倍；

(4)测定样品

a.配制铅离子标准溶液：按常规方法分别配制物质的量浓度为1.0×10^-4mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-7mol/L的铅离子标准溶液；

b.制作标准曲线：取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液98μL，取步骤(2)中1×10^-6mol/L的探针母液2μL，配制成探针最终浓度为2×10^-8mol/L的混合溶液，室温静置15分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F₀；在上述的混合溶液中逐级加入0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-4mol/L的铅离子标准溶液，得到最终铅离子标准溶液的物质的量浓度为5×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L和5×10^-7mol/L，室温静置5分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F，荧光分光光度计的激发波长为480nm、发射波长为520nm、激发波长和发射波长狭缝宽度均为10nm、负高压为700V，以lg浓度为5×10^-10～5×10^-7mol/L铅离子溶液为横坐标X，1-F/F₀为纵坐标Y，由origin 7.5软件作图，得到标准曲线的线性回归方程：

Y＝0.2005X+1.8984

线性相关系数为0.9969。

c.检测样品溶液中的铅离子：取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液48μL和步骤(2)中1×10^-6mol/L的探针母液2μL，加入50μL水样，混合均匀，静置15分钟，用荧光分光光度计检测水样的荧光强度，采用标准加入法进行铅离子的回收；

将步骤(2)中1×10^-6mol/L的探针母液2μL和1μL离体的人血清加入到97μL物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液中，混合均匀，静置15分钟，用荧光分光光度计检测血清的荧光强度，采用标准加入法进行铅离子的回收，按下式计算铅离子的回收率：

R％＝m_测/m_实

式中m_测是待测样品中铅的质量，m_实是标准样品中铅的质量。

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