CN103305622A - 利用非标记功能核酸形成g-四联体荧光法检测铅的方法 - Google Patents
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Abstract
一种水质检测技术领域的利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法,通过功能核酸以及DNA嵌入剂构建铅离子检测体系;当检测体系中没有铅离子时,DNA嵌入剂嵌入到功能核酸中,在535nm处释放出荧光;当检测体系中加入铅离子后,铅离子促进功能核酸形成G-四联体结构,DNA嵌入剂再与G-四联体作用并抑制535nm处的荧光释放,基于释放出的荧光信号与铅离子浓度呈反比,则通过确定荧光信号实现铅离子的定量检测。本发明能够克服现有技术中需要标记功能核酸、涉及复杂的催化反应等缺陷,具有操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效的特点。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种水质检测技术领域的方法,具体是一种利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法。
背景技术
铅是一种严重危害人类健康的重金属元素,具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性。进入人体的铅能破坏造血系统,阻碍血红素的合成,导致贫血;损伤大脑中枢及周围神经系统;影响消化系统功能,导致厌食;抑制生长激素的合成与释放,导致儿童发育迟缓;影响身体对其他金属元素的吸收、代谢;对肾脏损害极大,引起肾功能障碍;影响心脏正常运转,引发心肌损伤等。对于儿童,学术界已经确认,只要血铅水平超过或等于100μg/L,不管有无临床症状和体征,都可以确诊为儿童铅中毒。铅中毒会导致儿童智力下降,认知功能、神经行为和学习记忆等脑功能受损,严重者造成痴呆。因此,建立高灵敏度、高选择性的铅离子检测方法具有重要的现实意义。
传统的铅离子检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法和气相色谱法,这些方法虽早已成熟并准确可靠,但在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员,费力费时,难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。新型的铅离子检测技术有化学传感器技术和生物传感器技术,其中功能核酸类生物传感器因具有选择性好、信号转换容易等特点而成为研究热点。用于铅检测的功能核酸通常包括两类:一类是核酸酶(DNAzyme),此类酶检测铅的原理是其底物链中包含一个核糖腺嘌呤(rA),铅离子可以特异性地从该位置将其底物链切断,通过将底物链的断裂转化成比色、化学发光和荧光等信号达到检测目的;另一类是富含鸟嘌呤(G)的单链寡核苷酸,铅离子可以促进此类寡核苷酸形成G-四联体(G-quadruplex)结构,结合G-四联体的相关特性选择合适的信号输出方法,也能达到检测铅的目的。与核酸酶相比,寡核苷酸具有合成成本低,稳定性好等特点,因而逐渐受到广泛关注。
荧光法是一种简便、快速、灵敏的检测方法,已结合功能核酸(尤其是单链寡核苷酸)被用来检测多种物质,关于铅离子的检测也有报道,但这些方法或需要用荧光基团标记功能核酸,或涉及复杂的催化反应。而利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法较少见报道。
经过对现有技术的检索发现,高晓霞于《基于核酸探针的汞离子和铅离子检测》(《湖南大学》2011年)中公开了三种基于核酸探针的汞离子和铅离子的检测方法:(1)基于环糊精/芘协同作用荧光检测汞离子(Hg~(2+))。实验设计了一条茎部含有错配胸腺嘧啶(T)碱基对,两端分别标记芘分子的DNA探针。在Hg~(2+)存在下,探针分子通过形成T-Hg~(2+)-T结构以及γ-环糊精的协同作用,产生芘分子的二聚体荧光信号。在优化的实验条件下,传感体系的响应信号在Hg~(2+)浓度为0.5μM至3.0μM的范围内呈良好的线性关系,检出限为0.3μM。此方法具有良好的选择性,同时基于芘分子二聚体荧光长寿命的特点,利用时间分辨技术,有望应用于复杂生物样品Hg~(2+)检测。(2)基于脱氧核酶(DNAzyme)免标记比色检测铅离子(Pb~(2+))。实验设计了一条包含DNAzyme以及富鸟嘌呤碱基(G)链的发夹型结构的核酸探针,通过Pb~(2+)作用后,将DNAzyme中底物链释放出来,形成G-四链体引发显色反应,通过吸收信号的响应来达到检测Pb~(2+)的目的。体系的响应信号在Pb~(2+)浓度为5nM至100nM的范围内呈良好的线性关系,检出限可以达到3nM。此外,该方法还具有良好的选择性。(3)基于脱氧核酶免标记荧光检测铅离子。利用DNAzyme可以在Pb~(2+)的作用下,发生特异性的断裂以及SYBR Green I(SG)与双链DNA杂交体间的嵌入作用,使得互补配对的双链与单链DNA产生不同的荧光信号,对Pb~(2+)进行检测。体系的响应信号在Pb~(2+)浓度为1μM至8μM的范围内呈良好的线性关系,检出限可以达到0.6μM。但该技术的缺陷或不足在于:(1)检测汞离子的DNA探针需要标记,这在一定程度上增加了成本;(2)其检测效果很大程度上依赖DNA探针中双链的存在,而双链的形成需要增加前期退火步骤并严格控制检测体系,不利于应用于实验室之外的实际检测;(3)检测铅离子的探针中存在核糖腺嘌呤rA,这除了会增加合成成本外,还会增加探针的不稳定性,导致不易保存。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足,提出一种利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法,采用富含G的功能核酸及本身几乎无荧光的DNA嵌入剂SG构建铅离子检测体系。当检测体系中没有铅离子时,SG嵌入到功能核酸中,在535nm左右释放出很强的荧光;当检测体系中加入铅离子后,铅离子促进功能核酸形成G-四联体结构,SG与G-四联体作用,只能释放较弱的荧光,并且荧光信号随着铅离子加入量的增多而显著减小,通过比较荧光信号的变化,即可实现对铅离子的检测。
本发明能够克服现有技术中需要标记功能核酸、涉及复杂的催化反应等缺陷,具有操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效的特点。
本发明是通过以下技术方案实现的,本发明通过功能核酸以及DNA嵌入剂构建铅离子检测体系;当检测体系中没有铅离子时,DNA嵌入剂嵌入到功能核酸中,在535nm处释放出很强的荧光;当检测体系中加入铅离子后,铅离子促进功能核酸形成G-四联体结构,DNA嵌入剂再与G-四联体作用并抑制535nm的荧光释放,基于释放出的荧光信号与铅离子浓度呈反比,则通过确定荧光信号实现铅离子的定量检测。
所述的功能核酸富含鸟嘌呤(G),其序列如Seq ID No.1所示。
所述的DNA嵌入剂为市售SYBR Green I,其初始浓度为10000×。
所述的铅离子检测体系采用以下方式构建:
1)在2mL刻度离心管中,加入5μL浓度为5μM的功能核酸母液,补加去离子水至445μL,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下备用。
2)取16支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液的离心管,分别加入50μL不同浓度铅标准液,使得整个检测体系中的铅含量维持在0.5–600ppb,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育10min后,加入400×DNA嵌入剂母液5μL,25°C条件下避光孵育10min后,留作以下测定用。
由于市售DNA嵌入剂SYBR Green I的初始浓度为10000×,400×DNA嵌入剂母液由10000×初始液稀释25倍得来。
3)另取1支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液离心管,加入50μL超纯水,按步骤2)方法处理后作为空白对照体系溶液。
4)分别取500μL步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液,用荧光光度计进行扫描测定信号,并以步骤2)中不同浓度铅(CPb)与对应的相对荧光强度Q作图,绘制标准曲线。
所述的标准溶液和空白对照液分别置于内径为0.5cm×0.5cm,外径为1.0cm×1.0cm的石英荧光用比色皿中进行扫描测定。
所述的扫描是指:激发光狭缝为10nm,发射光狭缝为10nm,激发光波长为490nm条件下扫描,获得其荧光信号光谱。铅和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F0,计算相对荧光强度Q=[F0-F]/F0×100%。
所述的标准曲线是指:根据铅浓度和相对荧光强度绘制的回归方程Q=0.452CPb+15.89,其中:CPb的单位为:ppb。
所述的定量检测是指:
在2mL刻度离心管中,加入5μL浓度为5μM的功能核酸母液,补加去离子水至445μL,充分混匀后再取50μL待测水样加入;然后置于25°C条件下孵育10min后,加入400×DNA嵌入剂母液5μL,25°C条件下避光孵育10min后,用荧光光度计进行扫描测定信号并计算相对荧光强度,经查对标准曲线求得样品中铅含量。
本发明提供的检测方法不需要大型仪器设备,检测灵敏度高,选择性好,操作简单,可用于检测饮用水中的铅含量是否超标。
附图说明
图1.非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅示意图。
图2.不同浓度铅加入功能核酸与DNA嵌入剂形成的检测体系后的荧光信号。
图3.相对荧光强度与不同浓度铅的关系。
图4.不同金属离子加入功能核酸形成的检测体系后的相对荧光强度。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示,本实施例包括以下步骤:
1)制备由功能核酸形成的检测体系:在2mL刻度离心管中,分别加入5μL浓度为5μM功能核酸(序列为5'-GGGTGGGTGGGTGGGT-3')母液,补加去离子水至445μL,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下备用。
2)制备已知铅浓度的检测体系:取16支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液的离心管,分别加入50μL不同浓度铅标准液,使得整个检测体系中的铅含量维持在0.5–600ppb,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育10min后,加入400×DNA嵌入剂母液5μL,25°C条件下避光孵育10min后,留作以下测定用。
3)另取1支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液离心管,加入50μL超纯水,按步骤2)方法处理后作为空白对照体系溶液。
4)分别取500μL步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液,置于石英荧光用比色皿(内径为0.5cm×0.5cm,外径为1.0cm×1.0cm)中,用荧光光度计进行扫描测定信号。具体的扫描条件为:激发光狭缝为10nm,发射光狭缝为10nm,激发光波长为490nm条件下扫描,获得其荧光信号光谱。铅和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F0,计算相对荧光强度Q=[F0-F]/F0×100%。
5)以不同浓度铅(CPb)与对应的相对荧光强度Q作图,绘制标准曲线,其回归方程为Q=0.452CPb+15.89。
6)制备样品检测体系:取50μL待测水样,加入到按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液离心管中,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育10min后,加入400×DNA嵌入剂母液5μL,25°C条件下避光孵育10min后按步骤4)方法测定其Q。
7)根据样品测得的Q,查标准曲线,可以求得样品中铅含量。
8)验证:用本方法测定3份含铅浓度分别为15ppb、150ppb和300ppb的多离子混合液各一份,得到的回收率为97.5%-110.0%,证明了本方法的可靠性。
9)本方法测定水体铅的浓度范围为0.5–600ppb,最低检测限为3.79ppb。
Claims (8)
1.一种利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法,其特征在于,通过功能核酸以及DNA嵌入剂构建铅离子检测体系;当检测体系中没有铅离子时,DNA嵌入剂嵌入到功能核酸中,在535nm处释放出荧光;当检测体系中加入铅离子后,铅离子促进功能核酸形成G-四联体结构,DNA嵌入剂再与G-四联体作用并抑制535nm处的荧光释放,基于释放出的荧光信号与铅离子浓度呈反比,则通过确定荧光信号实现铅离子的定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的功能核酸的序列如Seq ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的DNA嵌入剂为市售SYBR Green I,其初始浓度为10000×。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的铅离子检测体系采用以下方式构建:
1)在2mL刻度离心管中,加入5μL浓度为5μM的功能核酸母液,补加去离子水至445μL,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下备用;
2)取16支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液的离心管,分别加入50μL不同浓度铅标准液,使得整个检测体系中的铅含量维持在0.5–600ppb,充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育10min后,加入400×DNA嵌入剂母液5μL,25°C条件下避光孵育10min后,留作以下测定用;
3)另取1支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液离心管,加入50μL超纯水,按步骤2)方法处理后作为空白对照体系溶液;
4)分别取500μL步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液,用荧光光度计进行扫描测定信号,并以步骤2)中不同浓度铅(CPb)与对应的相对荧光强度Q作图,绘制标准曲线。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征是,所述的标准溶液和空白对照液分别置于内径为0.5cm×0.5cm,外径为1.0cm×1.0cm的石英荧光用比色皿中进行扫描测定。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征是,所述的扫描是指:激发光狭缝为10nm,发射光狭缝为10nm,激发光波长为490nm条件下扫描,获得其荧光信号光谱;铅和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F0,计算相对荧光强度Q=[F0-F]/F0×100%。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征是,所述的标准曲线是指:根据铅浓度和相对荧光强度绘制的回归方程Q=0.452CPb+15.89,其中:CPb的单位为:ppb。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的定量检测是指:在2mL刻度离心管中,加入5μL浓度为5μM的功能核酸母液,补加去离子水至445μL,充分混匀后再取50μL待测水样加入;然后置于25°C条件下孵育10min后,加入400×DNA嵌入剂母液5μL,25°C条件下避光孵育10min后,用荧光光度计进行扫描测定信号并计算相对荧光强度,经查对标准曲线求得样品中铅含量。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130918 |