CN103305622A

CN103305622A - 利用非标记功能核酸形成g-四联体荧光法检测铅的方法

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Publication number: CN103305622A
Application number: CN2013102701872A
Authority: CN
Inventors: 周培; 詹深山; 吴远根; 罗艳芳; 詹学佳; 刘乐; 贺兰; 邢海波
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-06-28
Filing date: 2013-06-28
Publication date: 2013-09-18

Abstract

一种水质检测技术领域的利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法，通过功能核酸以及DNA嵌入剂构建铅离子检测体系；当检测体系中没有铅离子时，DNA嵌入剂嵌入到功能核酸中，在535nm处释放出荧光；当检测体系中加入铅离子后，铅离子促进功能核酸形成G-四联体结构，DNA嵌入剂再与G-四联体作用并抑制535nm处的荧光释放，基于释放出的荧光信号与铅离子浓度呈反比，则通过确定荧光信号实现铅离子的定量检测。本发明能够克服现有技术中需要标记功能核酸、涉及复杂的催化反应等缺陷，具有操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效的特点。

Description

利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法

技术领域

本发明涉及的是一种水质检测技术领域的方法，具体是一种利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法。

背景技术

铅是一种严重危害人类健康的重金属元素，具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性。进入人体的铅能破坏造血系统，阻碍血红素的合成，导致贫血；损伤大脑中枢及周围神经系统；影响消化系统功能，导致厌食；抑制生长激素的合成与释放，导致儿童发育迟缓；影响身体对其他金属元素的吸收、代谢；对肾脏损害极大，引起肾功能障碍；影响心脏正常运转，引发心肌损伤等。对于儿童，学术界已经确认，只要血铅水平超过或等于100μg／L，不管有无临床症状和体征，都可以确诊为儿童铅中毒。铅中毒会导致儿童智力下降，认知功能、神经行为和学习记忆等脑功能受损，严重者造成痴呆。因此，建立高灵敏度、高选择性的铅离子检测方法具有重要的现实意义。

传统的铅离子检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法和气相色谱法，这些方法虽早已成熟并准确可靠，但在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。新型的铅离子检测技术有化学传感器技术和生物传感器技术，其中功能核酸类生物传感器因具有选择性好、信号转换容易等特点而成为研究热点。用于铅检测的功能核酸通常包括两类：一类是核酸酶（DNAzyme），此类酶检测铅的原理是其底物链中包含一个核糖腺嘌呤（rA），铅离子可以特异性地从该位置将其底物链切断，通过将底物链的断裂转化成比色、化学发光和荧光等信号达到检测目的；另一类是富含鸟嘌呤（G）的单链寡核苷酸，铅离子可以促进此类寡核苷酸形成G-四联体（G-quadruplex）结构，结合G-四联体的相关特性选择合适的信号输出方法，也能达到检测铅的目的。与核酸酶相比，寡核苷酸具有合成成本低，稳定性好等特点，因而逐渐受到广泛关注。

荧光法是一种简便、快速、灵敏的检测方法，已结合功能核酸（尤其是单链寡核苷酸）被用来检测多种物质，关于铅离子的检测也有报道，但这些方法或需要用荧光基团标记功能核酸，或涉及复杂的催化反应。而利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法较少见报道。

经过对现有技术的检索发现，高晓霞于《基于核酸探针的汞离子和铅离子检测》（《湖南大学》2011年）中公开了三种基于核酸探针的汞离子和铅离子的检测方法:(1)基于环糊精/芘协同作用荧光检测汞离子(Hg～(2+))。实验设计了一条茎部含有错配胸腺嘧啶(T)碱基对,两端分别标记芘分子的DNA探针。在Hg～(2+)存在下,探针分子通过形成T-Hg～(2+)-T结构以及γ-环糊精的协同作用,产生芘分子的二聚体荧光信号。在优化的实验条件下,传感体系的响应信号在Hg～(2+)浓度为0.5μM至3.0μM的范围内呈良好的线性关系,检出限为0.3μM。此方法具有良好的选择性,同时基于芘分子二聚体荧光长寿命的特点,利用时间分辨技术,有望应用于复杂生物样品Hg～(2+)检测。(2)基于脱氧核酶(DNAzyme)免标记比色检测铅离子(Pb～(2+))。实验设计了一条包含DNAzyme以及富鸟嘌呤碱基(G)链的发夹型结构的核酸探针,通过Pb～(2+)作用后,将DNAzyme中底物链释放出来,形成G-四链体引发显色反应,通过吸收信号的响应来达到检测Pb～(2+)的目的。体系的响应信号在Pb～(2+)浓度为5nM至100nM的范围内呈良好的线性关系,检出限可以达到3nM。此外,该方法还具有良好的选择性。(3)基于脱氧核酶免标记荧光检测铅离子。利用DNAzyme可以在Pb～(2+)的作用下,发生特异性的断裂以及SYBR Green I(SG)与双链DNA杂交体间的嵌入作用,使得互补配对的双链与单链DNA产生不同的荧光信号,对Pb～(2+)进行检测。体系的响应信号在Pb～(2+)浓度为1μM至8μM的范围内呈良好的线性关系,检出限可以达到0.6μM。但该技术的缺陷或不足在于：(1)检测汞离子的DNA探针需要标记，这在一定程度上增加了成本；(2)其检测效果很大程度上依赖DNA探针中双链的存在，而双链的形成需要增加前期退火步骤并严格控制检测体系，不利于应用于实验室之外的实际检测；(3)检测铅离子的探针中存在核糖腺嘌呤rA，这除了会增加合成成本外，还会增加探针的不稳定性，导致不易保存。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法，采用富含G的功能核酸及本身几乎无荧光的DNA嵌入剂SG构建铅离子检测体系。当检测体系中没有铅离子时，SG嵌入到功能核酸中，在535nm左右释放出很强的荧光；当检测体系中加入铅离子后，铅离子促进功能核酸形成G-四联体结构，SG与G-四联体作用，只能释放较弱的荧光，并且荧光信号随着铅离子加入量的增多而显著减小，通过比较荧光信号的变化，即可实现对铅离子的检测。

本发明能够克服现有技术中需要标记功能核酸、涉及复杂的催化反应等缺陷，具有操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效的特点。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过功能核酸以及DNA嵌入剂构建铅离子检测体系；当检测体系中没有铅离子时，DNA嵌入剂嵌入到功能核酸中，在535nm处释放出很强的荧光；当检测体系中加入铅离子后，铅离子促进功能核酸形成G-四联体结构，DNA嵌入剂再与G-四联体作用并抑制535nm的荧光释放，基于释放出的荧光信号与铅离子浓度呈反比，则通过确定荧光信号实现铅离子的定量检测。

所述的功能核酸富含鸟嘌呤（G），其序列如Seq ID No.1所示。

所述的DNA嵌入剂为市售SYBR Green I，其初始浓度为10000×。

所述的铅离子检测体系采用以下方式构建：

1)在2mL刻度离心管中，加入5μL浓度为5μM的功能核酸母液，补加去离子水至445μL，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下备用。

2)取16支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液的离心管，分别加入50μL不同浓度铅标准液，使得整个检测体系中的铅含量维持在0.5–600ppb，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育10min后，加入400×DNA嵌入剂母液5μL，25°C条件下避光孵育10min后，留作以下测定用。

由于市售DNA嵌入剂SYBR Green I的初始浓度为10000×，400×DNA嵌入剂母液由10000×初始液稀释25倍得来。

3)另取1支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液离心管，加入50μL超纯水，按步骤2)方法处理后作为空白对照体系溶液。

4)分别取500μL步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液，用荧光光度计进行扫描测定信号，并以步骤2）中不同浓度铅(C_Pb)与对应的相对荧光强度Q作图，绘制标准曲线。

所述的标准溶液和空白对照液分别置于内径为0.5cm×0.5cm，外径为1.0cm×1.0cm的石英荧光用比色皿中进行扫描测定。

所述的扫描是指：激发光狭缝为10nm，发射光狭缝为10nm，激发光波长为490nm条件下扫描，获得其荧光信号光谱。铅和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F₀，计算相对荧光强度Q=[F₀-F]/F₀×100%。

所述的标准曲线是指：根据铅浓度和相对荧光强度绘制的回归方程Q=0.452C_Pb+15.89，其中：C_Pb的单位为：ppb。

所述的定量检测是指：

在2mL刻度离心管中，加入5μL浓度为5μM的功能核酸母液，补加去离子水至445μL，充分混匀后再取50μL待测水样加入；然后置于25°C条件下孵育10min后，加入400×DNA嵌入剂母液5μL，25°C条件下避光孵育10min后，用荧光光度计进行扫描测定信号并计算相对荧光强度，经查对标准曲线求得样品中铅含量。

本发明提供的检测方法不需要大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性好，操作简单，可用于检测饮用水中的铅含量是否超标。

附图说明

图1.非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅示意图。

图2.不同浓度铅加入功能核酸与DNA嵌入剂形成的检测体系后的荧光信号。

图3.相对荧光强度与不同浓度铅的关系。

图4.不同金属离子加入功能核酸形成的检测体系后的相对荧光强度。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

如图1所示，本实施例包括以下步骤：

1)制备由功能核酸形成的检测体系：在2mL刻度离心管中，分别加入5μL浓度为5μM功能核酸(序列为5'-GGGTGGGTGGGTGGGT-3')母液，补加去离子水至445μL，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下备用。

2)制备已知铅浓度的检测体系：取16支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液的离心管，分别加入50μL不同浓度铅标准液，使得整个检测体系中的铅含量维持在0.5–600ppb，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育10min后，加入400×DNA嵌入剂母液5μL，25°C条件下避光孵育10min后，留作以下测定用。

4)分别取500μL步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光用比色皿(内径为0.5cm×0.5cm，外径为1.0cm×1.0cm)中，用荧光光度计进行扫描测定信号。具体的扫描条件为：激发光狭缝为10nm，发射光狭缝为10nm，激发光波长为490nm条件下扫描，获得其荧光信号光谱。铅和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F₀，计算相对荧光强度Q=[F₀-F]/F₀×100%。

5)以不同浓度铅(C_Pb)与对应的相对荧光强度Q作图，绘制标准曲线，其回归方程为Q=0.452C_Pb+15.89。

6)制备样品检测体系：取50μL待测水样，加入到按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液离心管中，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育10min后，加入400×DNA嵌入剂母液5μL，25°C条件下避光孵育10min后按步骤4)方法测定其Q。

7)根据样品测得的Q，查标准曲线，可以求得样品中铅含量。

8)验证：用本方法测定3份含铅浓度分别为15ppb、150ppb和300ppb的多离子混合液各一份，得到的回收率为97.5%-110.0%，证明了本方法的可靠性。

9)本方法测定水体铅的浓度范围为0.5–600ppb，最低检测限为3.79ppb。

Claims

1.一种利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法，其特征在于，通过功能核酸以及DNA嵌入剂构建铅离子检测体系；当检测体系中没有铅离子时，DNA嵌入剂嵌入到功能核酸中，在535nm处释放出荧光；当检测体系中加入铅离子后，铅离子促进功能核酸形成G-四联体结构，DNA嵌入剂再与G-四联体作用并抑制535nm处的荧光释放，基于释放出的荧光信号与铅离子浓度呈反比，则通过确定荧光信号实现铅离子的定量检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的功能核酸的序列如Seq ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的DNA嵌入剂为市售SYBR Green I，其初始浓度为10000×。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的铅离子检测体系采用以下方式构建：

1)在2mL刻度离心管中，加入5μL浓度为5μM的功能核酸母液，补加去离子水至445μL，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下备用；

2)取16支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液的离心管，分别加入50μL不同浓度铅标准液，使得整个检测体系中的铅含量维持在0.5–600ppb，充分混匀后再将离心管置于25°C条件下孵育10min后，加入400×DNA嵌入剂母液5μL，25°C条件下避光孵育10min后，留作以下测定用；

3)另取1支包含按步骤1)方法制备的由功能核酸形成检测体系混合液离心管，加入50μL超纯水，按步骤2)方法处理后作为空白对照体系溶液；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的标准溶液和空白对照液分别置于内径为0.5cm×0.5cm，外径为1.0cm×1.0cm的石英荧光用比色皿中进行扫描测定。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的扫描是指：激发光狭缝为10nm，发射光狭缝为10nm，激发光波长为490nm条件下扫描，获得其荧光信号光谱；铅和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F₀，计算相对荧光强度Q=[F₀-F]/F₀×100%。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的标准曲线是指：根据铅浓度和相对荧光强度绘制的回归方程Q=0.452C_Pb+15.89，其中：C_Pb的单位为：ppb。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的定量检测是指：在2mL刻度离心管中，加入5μL浓度为5μM的功能核酸母液，补加去离子水至445μL，充分混匀后再取50μL待测水样加入；然后置于25°C条件下孵育10min后，加入400×DNA嵌入剂母液5μL，25°C条件下避光孵育10min后，用荧光光度计进行扫描测定信号并计算相对荧光强度，经查对标准曲线求得样品中铅含量。