CN104215618A - 基于纳米金聚散淬灭罗丹明b荧光的银离子检测方法 - Google Patents
基于纳米金聚散淬灭罗丹明b荧光的银离子检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种利用银离子特异性DNA调节纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光检测银的方法，通过将银离子特异性DNA和纳米金混合后加入硝酸钠溶液和罗丹明B，使得混合后得到的产物在570nm波长处的荧光信号的变化与银离子浓度呈正比例关系，从而实现定量精确检测。本发明不需要大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性好，操作简单，可用于检测饮用水中的银含量是否超标。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种水质安全技术领域的方法，具体是一种利用银离子特异性DNA调节纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光检测银的方法。
背景技术
随着现代化工业的发展，银在汽车工业、电子工业、制药业和成像工业等方面有诸多应用，由此引起的银离子污染也越来越严重。尽管银离子是一种非生物累积性毒素，但其进入人体会抑制含巯基类酶的活性，与胺类、咪唑类以及含羧基的多种代谢物结合，取代骨骼中羟磷灰石内诸如钙离子、铜离子等必须金属离子，导致人体银中毒，引发头疼、皮肤刺激、胃疼、器官水肿甚至是死亡。鉴于此，世界卫生组织(WHO)和美国环保署(EPA)将饮用水中银离子的最高允许值定为50ppb(约460nM)。因此，建立高灵敏度、高选择性的银离子检测方法具有重要的现实意义。
传统的银离子检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法和气相色谱法，这些方法虽早已成熟并准确可靠，但在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。新型的银离子检测技术有化学传感器技术和生物传感器技术，其中功能核酸类生物传感器因具有选择性好、信号转换容易等特点而成为研究热点。
最常见的用于银检测的功能核酸是银离子特异性DNA，其检测银的原理是其DNA链中富含胞嘧啶C，银离子可以特异性地与之作用，形成类似发卡结构的C‐Ag+‐C碱基错配。通过将DNA捕获银离子形成C‐Ag+‐C碱基错配的过程转化成比色、散射、化学发光和荧光等信号而达到检测银离子目的。
在诸多信号表达方法中，荧光法因其简便、快速和灵敏等优点而占大多数，但荧光法检测银离子存在的问题是银离子属于所谓的“沉默离子(silent ions)”，即其本身具有一定淬灭荧光的能力。因而现有的荧光法检测银离子的报道中，“on‐off”类型，即加入银离子后荧光变弱居多。相比“on‐off”类型，人们普遍认为“off‐on”类型更值得研发推广，因而开发基于银离子特异性DNA的“off‐on”类型荧光法检测银离子很有必要。
发明内容
本发明针对性克服现有利用功能核酸检测银离子的荧光方法大多属于“on‐off”类型，涉及复杂的反应等缺陷，提出一种基于纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光的银离子检测方法，利用银离子特异性DNA(名为Ag‐CC)、纳米金以及罗丹明B(简称RB)荧光法进行检测，不需要大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性好，操作简单，可用于检测饮用水中的银含量是否超标。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过将银离子特异性DNA和纳米金混合后加入硝酸钠溶液和罗丹明B，使得混合后得到的产物在570nm波长处的荧光信号的变化与银离子浓度呈正比例关系，从而实现定量精确检测。
步骤1)制备由银离子特异性DNA组成的检测体系混合液：在2mL刻度离心管中，加入7.5μL浓度为1μM的Ag‐CC母液，补加去超纯水至170μL，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下备用。
所述的银离子特异性DNA为Ag‐CC，其序列如Seq ID No.1所示。
步骤2)制备已知银浓度的检测体系：取若干支包含按步骤1)方法制备的检测体系混合液的离心管，分别加入10μL不同的银离子浓度标准液作为绘制标准曲线用的标准溶液以及加入10μL超纯水作为空白对照液，使得整个检测体系中的银含量维持在1500ppb以下，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入250μL纳米金，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入30μL，2M的NaNO3以及40μL，100μM的RB，25℃条件下避光孵育10min后，留作以下测定用。
步骤3)分别取500μL步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光用比色皿中，用荧光光度计进行扫描测定信号并绘制标准曲线。
步骤4)制备样品检测体系：取10μL待测水样，加入到步骤1)方法制备的检测体系离心管中，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入250μL纳米金并补加超纯水使得混合液总体积为430μL；经充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入30μL，2M的NaNO3以及40μL，100μM的RB，25℃条件下避光孵育10min后，用荧光光度计进行扫描测定信号，并经查对所述标准曲线得到银离子含量。
所述的扫描所采用的激发光狭缝为10nm，发射光狭缝为10nm，激发光波长为520nm条件下扫描，获得其荧光信号光谱。
所述的测定信号是指：银和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F0，计算增强的荧光强度ΔF＝F‐F0；以不同的银离子浓度(CAg)与对应的增强的荧光强度ΔF作图，绘制标准曲线。
所述的绘制标准曲线是指：以银离子浓度(CAg)作横轴，对应的增强的荧光强度ΔF作纵轴，用Origin pro 8.0软件拟合得到DoseResp拟合曲线，曲线方程为：
其中：A1＝‐90.86，A2＝3945.64，LOG x0＝718.46，p＝0.00227。
本发明通过利用银离子特异性DNA(名为Ag‐CC)、纳米金以及罗丹明B(Rhodamine B，简称RB)构建银离子检测体系；当检测对象中没有银离子时，Ag‐CC包裹到纳米金表面并维持其分散状态，分散状态的纳米金对RB的荧光有很强的淬灭作用，此时银离子检测体系在570nm左右释放较弱的荧光；当检测对象中存在银离子时，由于银离子与Ag‐CC作用形成含有C‐Ag+‐C碱基错配、类似发卡结构的复合物，使得纳米金表面呈裸露状态并在一定浓度盐的作用下发生聚集，而聚集状态的纳米金对RB荧光的淬灭作用相对较弱，因而此时银离子检测体系在570nm左右释放较强的荧光，并且荧光信号随着银离子加入量的增多而显著增强，通过比较荧光信号的变化，即可实现对银离子的检测。
附图说明
图1为本发明原理示意图。
图2为实施例中不同的银离子浓度加入到检测体系后的荧光信号示意图。
图3为实施例中增强的荧光强度与不同的银离子浓度的关系示意图。
图4为实施例中不同金属离子加入到检测体系后的增强的荧光强度示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例包括以下步骤：
1)制备由银离子特异性DNA(Ag‐CC)形成的检测体系：在2mL刻度离心管中，分别加入7.5μL浓度为1μM的Ag‐CC(序列为5'‐CTCTCTTCTCTTCATTTTTCAACACAACACAC‐3')母液，补加去离子水至170μL，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下备用。
2)制备已知银浓度的检测体系：取17支包含按步骤1)方法制备的由银离子特异性DNA(Ag‐CC)形成检测体系混合液的离心管，分别加入10μL不同的银离子浓度标准液，使得整个检测体系中的银含量维持在5～1500ppb，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入250μL纳米金，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入30μL，2M的NaNO3以及40μL，100μM的RB，25℃条件下避光孵育10min后，留作以下测定用。
3)另取1支包含按步骤1)方法制备的由银离子特异性DNA(Ag‐CC)形成检测体系混合液离心管，加入10μL超纯水，按步骤2)方法处理后作为空白对照体系溶液。
4)分别取500μL步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液，置于石英荧光用比色皿(内径为0.5cm×0.5cm，外径为1.0cm×1.0cm)中，用荧光光度计进行扫描测定信号。具体的扫描条件为：激发光狭缝为10nm，发射光狭缝为10nm，激发光波长为520nm条件下扫描，获得其荧光信号光谱。银和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F0，计算增强的荧光强度ΔF＝F‐F0。
5)以不同的银离子浓度(CAg)与对应的增强的荧光强度ΔF作图，绘制标准曲线。
6)制备样品检测体系：取10μL待测水样，加入到步骤1)方法制备的检测体系离心管中，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入250μL纳米金并补加超纯水使得混合液总体积为430μL。该混合液充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入30μL，2M的NaNO3以及40μL，100μM的RB，25℃条件下避光孵育10min后，按步骤4)方法测定荧光信号并计算ΔF。
7)根据计算所得的ΔF值，查标准曲线，可以求得样品中银含量。
8)验证：用本方法测定3份含银浓度分别为200ppb、500ppb和1000ppb的多离子混合液各一份，得到的回收率为99.9％～102.7％，证明了本方法的可靠性。
9)本方法测定水体银的浓度范围为2.73～1500ppb，最低检测限为2.73ppb。
Claims (8)
1.一种基于纳米金聚散淬灭罗丹明B荧光的银离子检测方法，其特征在于，通过将银离子特异性DNA和纳米金混合后加入硝酸钠溶液和罗丹明B，使得混合后得到的产物在570nm波长处的荧光信号的变化与银离子浓度呈正比例关系，从而实现定量精确检测；
所述的银离子特异性DNA为Ag‐CC，其序列如Seq ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述方法具体包括以下步骤：
步骤1)制备由银离子特异性DNA组成的检测体系混合液；
步骤2)制备已知银浓度的检测体系：
步骤3)分别取步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液，用荧光光度计进行扫描测定信号并绘制标准曲线；
步骤4)制备样品检测体系，用荧光光度计进行扫描测定信号，并经查对所述标准曲线得到银离子含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤1具体是指：在2mL刻度离心管中，加入7.5μL浓度为1μM的Ag‐CC母液，补加去超纯水至170μL，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下备用。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤2具体是指：取若干支包含按步骤1)方法制备的检测体系混合液的离心管，分别加入10μL不同的银离子浓度标准液作为绘制标准曲线用的标准溶液以及加入10μL超纯水作为空白对照液，使得整个检测体系中的银含量维持在1500ppb以下，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入250μL纳米金，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入30μL，2M的NaNO3以及40μL，100μM的RB，25℃条件下避光孵育10min后，留作以下测定用。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的步骤4具体是指：取10μL待测水样，加入到步骤1)方法制备的检测体系离心管中，充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入250μL纳米金并补加超纯水使得混合液总体积为430μL；经充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育10min后，加入30μL，2M的NaNO3以及40μL，100μM的RB，25℃条件下避光孵育10min后用荧光光度计进行扫描测定信号，并经查对所述标准曲线得到银离子含量。
6.根据权利要求2或5所述的方法，其特征是，所述的扫描所采用的激发光狭缝为10nm，发射光狭缝为10nm，激发光波长为520nm条件下扫描，获得其荧光信号光谱。
7.根据权利要求2或5所述的方法，其特征是，所述的测定信号是指：银和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F0，计算增强的荧光强度ΔF＝F‐F0；以不同的银离子浓度CAg与对应的增强的荧光强度ΔF作图，绘制标准曲线。
8.根据权利要求2或4或5所述的方法，其特征是，所述的绘制标准曲线是指：以银离子浓度CAg作横轴，对应的增强的荧光强度ΔF作纵轴，用Origin pro 8.0软件拟合得到DoseResp拟合曲线，曲线方程为：其中：A1＝‐90.86，A2＝3945.64，LOG x0＝718.46，p＝0.00227。
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