CN103342999A

CN103342999A - 一种生物功能化金纳米荧光探针及其制备方法

Info

Publication number: CN103342999A
Application number: CN2013101968513A
Authority: CN
Inventors: 刘刚; 陈小元; 王占通; 朱雷; 薛云新
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2013-10-09

Abstract

本发明公开了一种生物功能化金纳米荧光探针及其制备方法，其特征为：含有检测抗体或核酸适配体及荧光染料表面修饰的金纳米粒子。金纳米荧光探针能与疾病生物标识物高效识别，荧光染料处于淬灭状态，当向检测系统加入含巯基化合物后，金纳米粒子表面高效富聚的荧光染料发生脱离并导致荧光探针的显著激活，荧光强度与样品中的生物标识物的浓度成比例。本发明方法大大提高了疾病生物标识物的检测灵敏度，并同时具有设备简易、操作简单、且能批量检测的优点。

Description

一种生物功能化金纳米荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物功能化金纳米荧光探针，其制备方法及所属纳米材料用于肿瘤等疾病生物标识物检测应用，属于生物医学工程以及纳米医学领域。

背景技术

在疾病体外诊断方面，高特异性、高灵敏度和高通量特性的检测技术不仅能有效简化病变样品制备的流程，避免有毒害试剂的使用和反应抑制剂的干扰，同时快速检测方法的建立，简化操作流程，节约检测成本，提高了检测的时效性和准确性。目前临床生物标志物检测的金标准是酶联免疫吸附法。由于其中等程度的敏感性，只有生物标志物的水平已经达到临界阈值浓度后才能检测，限制了其用于疾病早期检测应用，因此临床上对超高灵敏检测的需求尤为紧迫。正像20世纪70年代的微米技术一样，纳米技术将成为21世纪的主导技术，为生物诊疗领域的发展提供了很大空间。目前光、磁和电响应纳米粒子已经广泛应用于纳米医学、分子影像学等领域。

金纳米颗粒具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。因此，以金纳米颗粒为免疫标记物的检测技术得到了很大的推广应用。如将蛋白质等高分子吸附到纳米金颗粒表面的包被过程而形成的纳米金标记技术在基础研究和实验中成为非常有用的工具。通常情况下，纳米金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合，而且吸附后不会使生物分子变性，由于金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，但在定量检测及灵敏度方面尚待提高改进。

开发出具有低背景值，高靶向性和高敏感性的纳米生物检测探针成为了当前纳米医学领域研究热点。可激活分子探针基本结构是由以下几部分构成的：某种蛋白酶的底物，一个荧光报告基团和一个相应的荧光淬灭基团。与传统分子探针相比较，可激活分子探针在初始状态下处于“淬灭”状态，而只有在与靶点分子结合后才会被“激活”而释放出强烈信号，从而为成像仪器所检测到。因此，智能分子探针具有低背景，高对比度和高敏感性等成像优势。

本项目将荧光染料高效富聚于金纳米粒子表面并处于淬灭状态，进一步修饰检测抗体或核酸适配体。金纳米荧光探针能与疾病生物标识物高效结合，荧光染料仍处于淬灭状态，当向检测系统加入含巯基化合物如半胱胺后，金纳米粒子表面高效富聚的荧光染料发生脱离并导致荧光探针的显著激活，荧光强度与样品中的生物标识物的浓度成比例，从而达到高灵敏度检测疾病生物标识物的目的。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种生物功能化的金纳米荧光探针；

本发明的另一目的在于提供一种新的生物功能化金纳米荧光探针的制备方法；

本发明的再一目的是提供一种所述的金纳米荧光探针作为肿瘤等疾病生物标识物检测系统的应用。

本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

一种新的生物功能化的金纳米荧光探针，其特征为含有检测抗体或核酸适配体，荧光染料表面修饰的金纳米粒子。

其中，所述的金纳米颗粒包括纳米金粒子、纳米金棒、纳米金星、纳米金囊，纳米金笼或纳米金壳中的至少一种。

其中，所述的荧光染料包括：荧光素类染料：包括标准荧光素及其衍生物，如异硫氰酸荧光素（FITC）、羟基荧光素（FAM）、四氯荧光素（TET）等。罗丹明类染料：主要包括R101、四乙基罗丹明（RB200）和羧基四甲基罗丹明（TAMRA）等。菁染料：一类是噻唑橙（thiazole orange,TO）、噁唑橙（oxazole orange,YO）系列及其二聚体染料，另一类是多甲川系列菁染料。以及其他荧光染料，例如二苯乙烯、萘酰亚胺、香豆素类、吖啶类、芘类等。罗丹明B异硫氰酸酯等。本发明优选采用罗丹明B异硫氰酸酯。

其中，所述的抗体或核酸适配体，为一种或多种检测抗体或核酸适配体，其根据检测靶标物质而定。

其中，所述探针采用荧光激活剂激活，所述的荧光激活剂包括一种或多种含巯基化合物。所述的含巯基化合物包括半胱胺（CS）、二硫基苏糖醇、硫基十一酸、聚乙二醇、谷胱甘肽等。优选采用半胱胺。

生物功能化金纳米荧光探针制备方法，包括

1）枸橼酸盐-金纳米粒子溶液中加入过量荧光染料中，反应0.5-3小时后，离心分离去除过量的荧光染料；

2）将2抗或核酸适配体加入到表面富集荧光染料的金纳米粒子溶液中，在室温条件下轻微震摇1-3小时；将2抗-荧光染料-金纳米粒子复合物溶液进行两次离心分离以除去过量的2抗；

3）用牛血清白蛋白将金纳米颗粒表面的活性位点进行封闭半小时，离心后重新分散于PBS溶液中，获得可激活金纳米荧光探针，4℃保存备用。

更佳地，金纳米荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

1）枸橼酸盐-金纳米粒子溶液中加入K₂CO₃溶液（100mM），使得该溶液pH调至9.0。

2）剧烈搅拌状态下将罗丹明B异硫氰酸酯荧光染料（10mM）加入该混合物。反应1小时后，将所得的溶液进行离心分离（14000转/分钟，15分钟）以除去过量的荧光染料，纳米复合物重新分散于K₂CO₃溶液（pH9.0）中。

3）将抗体（2抗）（10μL，1mg/mL）加入到表面富集荧光染料的金纳米粒子溶液中，在室温条件下轻微震摇两小时。

4）将抗体（2抗）-荧光染料-金纳米粒子复合物溶液进行两次离心分离以除去过量的2抗，纳米复合物重新分散于K₂CO₃溶液（pH9.0）中。

4）用牛血清白蛋白（10％）将金纳米颗粒表面的活性位点进行封闭半小时，离心后重新分散于PBS溶液中，4℃保存备用。

本发明研制出的一种新的生物功能化的金纳米荧光探针，荧光染料高效富聚于金纳米粒子表面并处于淬灭状态，进一步修饰检测抗体或核酸适配体。金纳米荧光探针能与疾病生物标识物高效结合，荧光染料仍处于淬灭状态，当向检测系统加入含巯基化合物如半胱胺后，金纳米粒子表面高效富聚的荧光染料发生脱离并导致荧光探针的显著激活，荧光强度与样品中的生物标识物的浓度成比例，从而达到高灵敏度检测疾病生物标识物的目的。该探针的敏感性提高的关键在于荧光染料分子高效富集并淬灭以及高效迅速脱离金纳米粒子而恢复荧光。

本发明所述的金纳米复合物的制备及检测过程简便，价格便宜，灵敏度高（1pg/mL），更加有利于在临床上推广应用。

本发明所用纳米金颗粒还可以包括纳米金囊，纳米金笼，纳米金壳等，其它更多可选荧光染料包括并不限于罗丹明B异硫氰酸酯等，制备方法类似。

本发明的有益效果：

1.本发明在纳米金颗粒表面进行荧光染料及待测抗体或核酸适配体修饰，具有荧光可激活性能。

2.本发明所述的纳米金颗粒的表面能高效富集荧光染料分子并使荧光染料有效淬灭，提高检测灵敏度。

3.本发明所述的纳米金复合物最低可以检测到1pg/mL水平的生物标志物，灵敏度高，简便易行，价格便宜，更加有利于在临床上推广应用。

附图说明

图1为图1生物功能化金纳米荧光探针构建示意图；

图2为金纳米荧光探针各部分组成及激活前后荧光成像，在高浓度含巯基化合物情况下时，荧光染料分子迅速高效地从金纳米粒子的表面脱离并导致荧光恢复。

图3为半胱胺对金纳米荧光探针激活时间效率图；

图4为不同含巯基化合物（1mM）对金纳米荧光探针的可激活效率；

图5为标准PSA溶液ELISA试剂盒(上)及金纳米荧光探针检测结果(下)；

图6为临床PSA血清样本ELISA试剂盒(上)及金纳米荧光探针检测结果(下)

具体实施方式

以下通过具体的制备例和实施例可使本发明得到更清楚地说明：

一、制备例：以下步骤中的所使用的化学物质为市售商品。

金纳米荧光探针的制备及用于生物标志物的检测方法，包括以下步骤：

1）1mL枸橼酸盐-金纳米粒子溶液中加入20μL K₂CO₃溶液（100mM），使得该溶液pH调至9.0。

2）剧烈搅拌状态下将1μL罗丹明B异硫氰酸酯荧光染料（10mM）加入该混合物。反应1小时后，将所得的溶液进行离心分离（14000转/分钟，15分钟）以除去过量的荧光染料，纳米复合物重新分散于1mL K₂CO₃溶液（pH9.0）中。

3）将抗体（2抗）或核酸适配体（10μL，1mg/mL）加入到表面富集荧光染料的金纳米粒子溶液中，在室温条件下轻微震摇两小时。

4）将抗体（2抗）-荧光染料-金纳米粒子复合物溶液进行两次离心分离（14000转/分钟，15分钟）以除去过量的抗体2，纳米复合物重新分散于1mL K₂CO₃溶液（pH9.0）中。

4）用1mL的牛血清白蛋白（10％）将金纳米颗粒表面的活性位点进行封闭半小时，离心（14000转/分钟，15分钟X3次）后重新分散于1mL PBS溶液中，4℃保存备用。

5）将抗体（1抗）溶于100mM Na2CO3-NaHCO3（pH9.6）缓冲液中，取到96孔板孔中（50uL/孔），4℃过夜或常温4小时后，加入PBS冲洗3次，加1％牛血清白蛋白（BSA）进行封闭（37℃，1小时）。

7）将标准抗原（1pg/mL到100ng/mL）及待测样本溶液中加入到96孔板孔中，并在37℃下温育1小时。

8）PBS冲洗3次，加50uL抗体（2抗）-荧光染料-金纳米粒子复合物溶液到96孔板孔中，37℃下温育1小时。

9）加入PBS冲洗4次，加入适量半胱胺（1mM），避光震摇1分钟后测试荧光强度，以标准抗原对照建立标准曲线，计算得出待测样本中生物标志物的含量。

二、实施例：

1.金纳米荧光探针可激活效率：

可激活金纳米荧光探针由两部分组成：检测抗体或核酸适配体和荧光染料富集于表面的金纳米粒子。荧光染料能够被金纳米粒子淬灭，在高浓度含巯基化合物存在情况下，在高浓度含巯基化合物情况下时，荧光染料分子迅速高效地从金纳米粒子的表面脱离并导致荧光恢复（图2）。

当荧光染料富集于金纳米粒子表面后，金纳米粒子上的有机层厚度没有增加，表明荧光染料分子是通过替换枸橼酸盐而吸附在金纳米粒子表面，而不是通过表面静电相互作用附着到带负电荷的枸橼酸盐层。检测抗体及BSA封闭后，金纳米粒子表面变成负电荷。紫外吸收光谱检测可见520nm处的金纳米粒子吸收峰以及555nm处的荧光染料吸收峰。

可激活金纳米荧光探针中荧光染料释放效率评价：高浓度含巯基化合物可以使荧光染料从金纳米粒子的表面有效释放（图4）。分子量最小的化合物半胱胺对可激活探针具有最好的释放效率。添加半胱胺（1毫摩尔）后，荧光在1分钟内显著增加，然后保持恒定，置换反应可以迅速完成（图3）。

2.金纳米荧光探针对疾病生物标志物检测效率：

在常用96孔板上进行前列腺特异性抗原（PSA）检测。将抗PSA抗体铺板，并随后通过加入1％BSA作为封闭剂。然后，加入含有PSA-标准的PBS溶液（0.1到100000pg/mL）及前列腺癌病人血清样本，并在37℃下温育1小时，用PBST冲洗后，加入可激活金纳米荧光探针，37℃下温育1小时。加入PBS冲洗4次，加入适量半胱胺（1mM），避光震摇1分钟后测试荧光强度，以标准抗原对照建立标准曲线，计算得出待测样本中生物标志物的含量。结果显示可激活金纳米荧光探针的检测极限低至1pg/mL的，超过了该极限检测的常规荧光探针（1ng/mL）3个数量级，能高效检测临床前列腺癌病人血清样本中的特异性抗原（图5，6）。

本发明人研制出的一种新的生物功能化金纳米荧光探针，其检测极限低至1pg/mL，超过了该极限检测的常规荧光探针（1ng/mL）3个数量级。该探针的敏感性提高的关键在于荧光染料分子高效富集并淬灭以及高效迅速脱离金纳米粒子而恢复荧光，背景信号低。本发明所述的可激活金纳米荧光探针制备简单、性能高效稳定、价格便宜更加有利于在临床上推广应用。

本发明所用金纳米颗粒还可以包括：纳米金囊，纳米金笼，纳米金壳等金纳米颗粒，其它更多可选荧光染料包括并不限于罗丹明B异硫氰酸酯等，其它更多可选荧光激活的含巯基化合物包括并不限于半胱胺等，制备方法类似。

Claims

1.一种生物功能化金纳米荧光探针，其特征在于探针含有检测抗体或核酸适配体、荧光染料和金纳米颗粒。

2.如权利要求1所述的生物功能化金纳米荧光探针，其特征在于，所述的金纳米颗粒包括纳米金粒子、纳米金棒、纳米金星、纳米金囊，纳米金笼或纳米金壳中的至少一种。

3.如权利要求1所述的生物功能化金纳米荧光探针，其特征在于，所述的荧光染料，包括罗丹明B异硫氰酸酯。

4.如权利要求1所述的生物功能化金纳米荧光探针，其特征在于，所述的抗体或核酸适配体，为一种或多种检测抗体或核酸适配体。

5.如权利要求1所述的生物功能化金纳米荧光探针，其特征在于，所述探针采用荧光激活剂激活，所述的荧光激活剂为一种或多种含巯基化合物。

6.如权利要求1所述的生物功能化金纳米荧光探针制备方法，包括

7.如权利要求6所述的生物功能化金纳米荧光探针制备方法，包括

1）枸橼酸盐-金纳米粒子溶液中加入过量罗丹明B异硫氰酸酯荧光染料；反应1小时后，进行离心分离去除过量的荧光染料，

2）将抗体或核酸适配体加入到表面富集荧光染料的金纳米粒子溶液中，在室温条件下轻微震摇两小时。将抗体-荧光染料-金纳米粒子复合物溶液进行两次离心分离以除去过量的抗体，

3）用重量百分比10％牛血清白蛋白将金纳米颗粒表面的活性位点进行封闭半小时，离心后重新分散于1mL PBS溶液中，获得可激活金纳米荧光探针，4℃保存备用。

8.如权利要求1所述的金纳米荧光探针的用途，其用于疾病生物标识物检测。