CN102703060A - 一种靶向特性的可示踪贵金属荧光探针及抗肿瘤前药 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤早期诊断活体检测试剂及肿瘤靶向治疗前药，具体涉及一种靶向特性的可示踪贵金属荧光探针及抗肿瘤前药。本发明所合成的探针经实验证明无细胞毒性，安全有效，既可实现细胞水平成像，又可实现活体肿瘤成像，作为一种靶向荧光探针或前药有着很好的前景。

Description

一种靶向特性的可示踪贵金属荧光探针及抗肿瘤前药

技术领域

本发明涉及肿瘤早期诊断活体检测试剂及肿瘤靶向治疗前药。具体涉及靶向近红外荧光探针及前药。

背景技术

肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病。恶性肿瘤引起的死亡率仅次于心血管疾病，正在成为人类第一杀手，严重危害着人类的健康和生存。其发病率一直高居不下，且目前已呈现明显的年轻化趋势，单中国内地每年新增肿瘤患者竟达200万人。因此，提高癌症的诊断率与治愈率是提高人类健康及生存质量的重要手段。

目前，用于肿瘤诊断的常规手段为计算机断层成像（CT），核磁共振影像（MRI），超声（US）等。然而，这类技术用于肿瘤诊断的前提是实体肿瘤的体积生长到一定尺寸，这就为肿瘤早期诊断带来了局限。最近发展起来的用于组织功能型检测的技术，包括¹⁸F-脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层扫描（¹⁸FDG-PET），单光子发射计算机体层摄影术(SPECT)，可用于肿瘤的早期诊断。然而，有限的空间分辨率、高费用以及高专业操作技术要求阻碍了此类技术的广泛应用。因此，发展一种可互补的技术手段是目前实现早期肿瘤诊断的必经之路。当前治疗肿瘤的方法主要有放疗、化疗、手术疗法和基因治疗。放疗和化疗是非常重要的非手术疗法，但是放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时也对机体正常细胞产生严重损伤。尤其是化疗，由于药物本身缺乏靶向性，因而出现治愈率低、多药耐药性、毒副作用巨大等重大治疗问题。因此，提高抗肿瘤药物的特异性是目前化疗中亟待解决问题中的重中之重。

荧光纳米簇（NCs）是近年来金纳米材料中的研究亮点。NCs由数十个至数百个金原子堆砌而成，尺寸小于2纳米。由于NCs的尺寸接近于电子的费米波长级别（<1nm），因此与纳米粒或纳米棒的表面等离子体共振引起的对可见与近红外波段特定波长光的散射和吸收不同，荧光纳米簇具有较强的荧光特性（400nm-750nm）。2002年，Link S等报道采用硼氢化钠及谷胱甘肽还原法制备Au NCs，其荧光量子产率～10^-3（Link S,Beeby A,FitzGerald S,El-Sayed M,Schaaff T,Whetten R.Phys.J.Chem.B.2002,106:3410-3415.）。Xie J等利用BSA作为还原剂及稳定剂合成了Au NCs，其量子产率已提高至6%（Xie J,Zheng Y and Ying J Y.J.Am.Chem.Soc.2009,131:888-889.）。与传统的有机荧光染料相比，NCs的荧光具有稳定性高、Stoke位移大的优势；与同样具有优异荧光特性的无机荧光探针—量子点相比，Au NCs的生物毒性要低得多；同时，NCs的表面稳定剂为生物活性分子（BSA，DNA，多肽等），赋予了Au NCs与其它活性分子进一步偶联的能力。

叶酸即维生素B11，其在生物体转运途径是通过叶酸受体（FR）介导的内吞作用摄取叶酸及其衍生物进入细胞内。FR是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，在多种肿瘤细胞表面过量表达，如卵巢癌、子宫颈癌、肾癌等，而在正常组织中低水平表达。目前，多项研究证实叶酸可以作为一种靶向物质，将治疗药物或检测成像物质运载到肿瘤部位，起到靶向性治疗和定位的效果。2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）是葡萄糖类似物，为代谢过程中不可缺少的能量来源。恶性肿瘤即使在有氧条件下也表现出高糖酵解率和高葡萄糖需求，通过葡萄糖转运体（GLUT1）完成对葡萄糖的摄取。研究表明，2-DG可被GLUT1识别并运送到细胞膜上被2-脱氧-6-磷酸己糖激酶的磷酸化。因为2-DG的2位缺少羟基，从而抑制2-脱氧葡萄糖6-磷酸进一步代谢并在细胞内保留。由于GLUT1在肿瘤部位呈现高表达和高活性，因此利用2-DG作为肿瘤靶向配体可有效实现对肿瘤的特异性识别。2-DG在体内具有较好的稳定性，与放射性同位素标记成像相比，在长时间成像中更具优势。目前，2-DG荧光类似物可作为新型的准确检测在生物体中的药物对肿瘤疗效的无创性探针。O’Neil（O’Neil RG,Wu L,Mullani N.Mol.Imag.Biol.2005;7(6):388-392.）和Lloyd（Lloyd PG,Hardin CD,Sturek M.Physiol.Res.1999;48(6):401-410.）合成了2-（N-7-nitrobenz2 OXA-1，3 diaxol-4-基）氨基]-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG），并通过MCF-7人乳腺癌细胞证实该化合物主要通过GLUT己糖激酶途径吸收。张等人合成了焦脱镁叶绿酸衍生化2-DG，既是一个肿瘤靶向性近红外荧光探针，又可作为光动力疗法中的治疗试剂（Zhang M,Zhang Z,Blessington D,Li H,Busch TM,Madrak V.Bioconjug.Chem.2003;14(4):709-714.）。程等用荧光显微镜技术证实Cy5.5染料共价偶联的2-DG可与不同的细胞株具有一定的亲和性(Cheng Z,Levi J,Xiong Z,Gheysens O,Keren S,Chen X,Gambhir SS.Bioconjug.Chem.2006;17(3):662-669.)。最近，Kovar等通过肿瘤裸鼠模型证实近红外荧光染料（IRDye800）偶联2-DG是一个广泛适用的体内光学成像剂并做了在小鼠体内的肿瘤成像（Kovar JL,Volcheck W,Sevick-Muraca E,Simpson MA,Olive DM.Anal.Biochem.2009;384(2):254–262.）。

七甲川菁类染料、近红外苊醌类荧光染料均是是吲哚青绿(ICG)的衍生物。其发射波长为700～1200nm,在该范围内生物分子自身荧光较弱,可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度.并且近红外荧光具有较强的穿透性，通过近红外荧光成像能够观测到机体组织深部的信息。在不同纳米材料、药物、生物活性分子上链接近红外荧光染料，有利于实现活体内生物信号的实时、在位、无损检测。

目前，在大多数体外细胞水平和体内活体水平进行探针或药物肿瘤靶向特性考察是需要匹配不同的荧光探针，这给实际应用带来很多不便。如Guo等将2-DG偶联近红外荧光染料，可以在活体进行实时成像，而在细胞水平考察中又进一步进行了可见波段荧光探针的标记以利于荧光观察（Guo J,Du C,Shan L,Zhu H,Xue B,Qian Z,Achilefu S,Gu Y.Contrast.Media.Mol.Imaging.2012,7(3):289-301.）。由于细胞水平及动物水平考察了不同的探针，在一定程度上不具有一致性且增加了方法的复杂性。Xu等合成牛血清白蛋白表面修饰的荧光金纳米簇（Au-BSA），由于缺少靶向分子，Au-BSA靶向到肿瘤部位的时间较长，同时肿瘤部位与其他组织部位的对比度不高（Wu X,He X,Wang K,Xie C,Zhou BQing Z.Nanoscale.2010,2,2244-2249）。

在本发明中，选用贵金属荧光纳米簇作为可见波段的荧光探针，进一步偶联靶向性分子（提高肿瘤特异性）及近红外有机荧光染料，得到一种既可用于细胞水平考察又能进行活体实时示踪，同时具有肿瘤靶向特性的多功能性荧光探针；此外，选择含有氨基或羧基的抗肿瘤药物与肿瘤靶向性分子偶联的贵金属荧光纳米簇进行共价连接，得到一种具有肿瘤特异性的抗肿瘤前药。该发明既赋予了荧光探针多重特性（可见波段荧光，近红外波段荧光及肿瘤特异性），又拓展了荧光探针的应用领域（肿瘤诊断与肿瘤治疗），极具应用前景。

发明内容

本发明公开了具有靶向特性的可示踪贵金属荧光探针及抗肿瘤前药。与传统荧光探针相比，本发明产具有高肿瘤靶向性，同时可实现细胞水平及活体水平的在位示踪；该产品可用于肿瘤的早期诊断，简化实验程序，降低使用不同荧光探针时产生的实验误差。同时，以靶向性分子偶联贵金属荧光探针进一步共价连接抗肿瘤药物，可使无靶向性的化疗药物具有靶向性，减少毒副作用，对提高肿瘤的治愈率有很重要的意义。本发明所合成的探针经实验证明无细胞毒性，安全有效，既可实现细胞水平成像，又可实现活体肿瘤成像，作为一种新型靶向荧光探针或前药有着很好的前景。

本发明的靶向特性的可示踪的贵重金属荧光探针，由贵重金属纳米簇、靶向性分子和近红外有机荧光染料通过共价偶联构成，其结构见图1。

其中重金属纳米簇优选金纳米簇、银纳米簇、铂纳米簇或铜纳米簇。

靶向性分子优选抗体、叶酸、多肽、甲硫酰胺或2-脱氧葡萄糖。更优选的靶向性分子为2-脱氧葡萄糖。

近红外有机荧光染料优选七甲川菁类染料或近红外苊醌类荧光染料。

近红外有机荧光染料更优选为吲哚花菁绿，结构式如下：

吲哚花菁绿结构式

本发明还公开了一种抗肿瘤靶向前药，由贵金属纳米簇、靶向性分子与肿瘤化疗药物共价结合构成。其中肿瘤化疗药物优选化学结构式中含有氨基或羧基的抗癌药物。肿瘤化疗药物更优选表柔比星、丝裂霉素或多柔比星。

本发明的靶向特性的可示踪的贵重金属荧光探针还可以连接上抗肿瘤化疗药物，用于抗肿瘤化疗药物的体内实时监测和肿瘤诊断、治疗。

抗肿瘤化疗药物优选表柔比星、丝裂霉素或多柔比星。

本发明的靶向特性的可示踪的贵重金属近红外荧光探针与抗肿瘤化疗药物摩尔比优选3:1～20:1。

本发明的近红外荧光探针可用下列方法制备（以金纳米簇-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖-吲哚花菁绿（Au-2DG-MPA）为例）：取金纳米簇溶液（Au NCs）及(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）两者混合避光搅拌反应，反应一段时间后后再加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)继续避光搅拌反应,反应时间不宜过长，然后加入2-DG避光搅拌反应过夜。将产物Au-2DG通过葡聚糖凝胶柱纯化，除去未反应的原料。取有机近红外染料MPA并将其活化。取纯化好的Au-2DG溶液与活化好的MPA溶液，混匀避光搅拌反应过夜，再经葡聚糖凝胶纯化后，即为最终产物Au-2DG-MPA。

本发明在可见光波段探针偶联靶向性分子的基础上连接近红外荧光染料赋予探针在近红外荧光成像的能力，同时可在可见波段进行细胞研究，又可以在近红外波段进行活体研究。该探针的设计解决了体外细胞研究和体内活体研究需要不同探针的问题，本发明只用一个探针即可进行细胞研究和体内活体研究，简化实验程序和换探针时产生的实验误差。将本发明合成的探针Au-2DG-MPA（未共价偶联2-DG的荧光金纳米簇Au NCs作为阴性对照）与乳腺癌细胞MCF-7孵育3小时后用磷酸盐缓冲液反复清洗3次，利用激光共聚焦荧光显微镜采集金纳米簇的红色荧光信号。结果表明，本发明合成的探针与肿瘤细胞有很好的亲和性，在3个小时的时间内已较多地穿过细胞膜进入到胞质中，而Au NCs在细胞中的荧光信号微弱（见图4）。该实验结果证实了2-DG作为靶向配体共价偶联至AuNCs，可增加荧光纳米簇对肿瘤细胞的亲和性；同时也证实了可从细胞水平对本发明的探针进行检测。将本发明合成的探针Au-2DG-MPA通过尾静脉注射到肿瘤裸鼠模型（乳腺癌MDA-MB-231）中，并在不同时间点（5min，30min，1h，4h，22h，24h，28h，46h，53h）对裸鼠模型进行近红外荧光图像的采集。结果表明该探针在4h左右即可靶向到肿瘤部位，在此后72h内其他脏器的荧光信号逐渐消失，而肿瘤部位荧光信号一直保持较高的信噪比（见图5）。与已报道的其它肿瘤靶向性荧光探针相比，如Shan等（Lingling Shan,Jianpeng Xue,Jing Guo et al.Bioconjugate Chemistry.2011,4,20;22(4):567-581）使用的叶酸作为靶向分子连接近红外染料则需要8小时才能靶向到肿瘤位置，本发明的探针仅需4个小时就可靶向至肿瘤部位，在临床应用中更具有潜力。

通过对共价偶联靶向配体的荧光纳米簇进行进一步活化，可共价连接上化学结构中含有羧基或氨基的抗肿瘤药物。例如，Au-2DG进一步活化，与多柔比星（DOX）连接，即可得到前药金纳米簇-2DG-多柔比星（Au-2DG-DOX），见图2所示。为了证实该前药的肿瘤特异性，将Au-2DG-DOX与DOX分别与肝癌细胞7402进行孵育1小时，再用磷酸盐缓冲液反复清洗三次后通过激光共聚焦荧光显微镜进行图像采集（见图7）。结果表明，与DOX相比，前药Au-2DG-DOX对肝癌细胞具有更高的亲和力，进入到细胞胞浆、细胞核中的数量明显增多。该结果与上述图5的结果相吻合，进一步证实了将探针或药物连接上靶向配体后，可增强其肿瘤特异性。

综上所述，本发明产品通过在荧光纳米簇上偶联靶向配体及近红外荧光染料，使得体外细胞实验和活体实验通过同一探针即可实现；本发明所选择的靶向配体修饰的近红外荧光探针，比已报道的肿瘤靶向性荧光探针到达肿瘤部位所需的时间更短。通过荧光纳米簇偶联靶向配体后进一步偶联抗肿瘤药物得到的抗肿瘤前药能够主动靶向到肿瘤部位，使肿瘤部位的药物浓度显著提高，并降低药物对正常组织的毒性。

附图说明

图1是Au-2DG-MPA结构图

图2是Au-2DG-DOX结构图

图3是Au-2DG-MPA的吸收光谱和荧光光谱。

图4是Au-2DG-MPA的急性毒性考察得到组织切片图。

图5是Au-2DG-MPA及Au NCs对肿瘤细胞MCF-7亲和性的考察。

图6是Au-2DG-MPA在MDA-MB-231肿瘤裸鼠模型中的实时动态分布图。

图7是Au-2DG-DOX及DOX对肝肿瘤细胞系（7402）亲和性的考察。

具体实施方式

实施例1

Au NCs-2DG-MPA的制备：

取金纳米簇溶液1ml,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）11.5mg，两者混合避光搅拌反应，10min后再加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)继续避光搅拌反应,反应时间不宜过长，EDC易水解。反应2个小时后加入2-DG 24mg，避光搅拌反应过夜。将澄清的红棕色溶液(Au-2-DG)通过葡聚糖凝胶柱（G-25）纯化，除去未反应的原料。取有机近红外染料MPA 1mg，二环己基碳二亚胺（DCC）,N-羟基丁二酰亚胺(NHS)避光搅拌反应3小时。取纯化好的Au-2DG溶液1ml及活化好的MPA溶液200μl，混匀避光搅拌反应12小时，再经葡聚糖凝胶（G-25）纯化后，即为最终产物。

其吸收光谱和荧光光谱见图3。

实施例2

Au NCs-FA-MPA的制备：

取22mg叶酸，12mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（DCC）,N-羟基丁二酰亚胺(NHS)两者混合避光搅拌反应,反应时间不宜过长，EDC易水解。反应3个小时后加入FA 24mg，避光搅拌反应过夜。将澄清的红棕色溶液(Au-FA)通过葡聚糖凝胶柱（G-25）纯化，除去未反应的原料。取有机近红外染料MPA1mg，二环己基碳二亚胺（DCC），N-羟基丁二酰亚胺(NHS)避光搅拌反应3小时。取纯化好的Au-FA溶液1ml，活化好的MPA溶液200μl，混匀避光搅拌反应过夜，再经葡聚糖凝胶（G-25）纯化后，即为最终产物。

实施例3

Au NCs-2-DG-DOX的制备：

取金纳米簇溶液1ml，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）11.5mg，两者混合避光搅拌反应，10min后再加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)继续避光搅拌反应,反应时间不宜过长，EDC易水解。反应2个小时后加入蛋氨酸（也称甲硫氨酸）15mg，避光搅拌反应过夜。将澄清的红棕色溶液(Au-Met)通过葡聚糖凝胶柱（G-25）纯化，除去未反应的原料。取有机近红外染料DOX 1mg，二环己基碳二亚胺（DCC），N-羟基丁二酰亚胺(NHS)避光搅拌反应3小时。取纯化好的Au-2-DG溶液1ml，活化好的DOX溶液200μl，混匀避光搅拌反应过夜，再经葡聚糖凝胶（G-25）纯化后，即为最终产物。

Claims (9)

1.一种近红外纳米荧光探针，其特征是：由贵金属纳米簇、靶向性分子和近红外有机荧光染料通过共价偶联构成。

2.权利要求1的近红外纳米荧光探针，其中贵金属纳米簇为金纳米簇、银纳米簇、铂纳米簇或铜纳米簇。

3.权利要求1的近红外纳米荧光探针，其中靶向性分子为抗体、叶酸、多肽、甲硫酰胺或2-脱氧葡萄糖。

4.权利要求1的近红外纳米荧光探针，其中靶向性分子为2-脱氧葡萄糖。

5.权利要求1的近红外纳米荧光探针，其中近红外有机荧光染料为七甲川菁类染料或近红外苊醌类荧光染料。

6.权利要求1的近红外纳米荧光探针，其中近红外有机荧光染料为吲哚花菁绿。

7.一种抗肿瘤靶向前药，其特征是由权利要求1的近红外纳米荧光探针与肿瘤化疗药物共价结合构成。

8.权利要求7的肿瘤靶向前药，其中肿瘤化疗药物为化学结构式中含有氨基或羧基的抗癌药物。

9.权利要求7的抗肿瘤靶向前药，其中肿瘤化疗药物为表柔比星、丝裂霉素或多柔比星。

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