CN107362370A - 一种基于金纳米簇联合NGF siRNA治疗胰腺癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种NGF siRNA联合金纳米簇，所述NGF siRNA联合金纳米簇包含金纳米簇和NGF siRNA，并且所述金纳米簇与所述NGF siRNA之间以静电吸附作用相结合。本发明还提供了该NGF siRNA联合金纳米簇的制备方法，含有该NGF siRNA联合金纳米簇的药物组合物、试剂盒以及该NGF siRNA联合金纳米簇在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。本发明的NGF siRNA联合金纳米簇可提高siRNA的稳定性，延长体内循环时间，改善胰腺肿瘤的靶向性，提高NGF的沉默效应，提高胰腺癌的抗肿瘤治疗效果，且制备方法简单，反应条件温和，为胰腺癌的治疗开辟了新途径。

Description

一种基于金纳米簇联合NGF siRNA治疗胰腺癌的方法
技术领域
本发明涉及一种金纳米簇，具体涉及一种NGF siRNA联合金纳米簇，含有该NGF siRNA联合金纳米簇的药物组合物和试剂盒，以及该NGF siRNA联合金纳米簇的制备方法和应用。
背景技术
金纳米簇(GNC)具有显著的库伦阻塞效应和特殊的磁性质，与半导体类似的电子结构也使它具有特殊的荧光性能，因而在生物医药领域用于生物成像和生物分子(DNA、蛋白质、酶)检测等。已报道的金纳米簇应用例如为：金纳米簇修饰有TAT多肽，可用于荧光成像、基因递送和近红外光激发的光动力治疗；金纳米簇包载有聚丙烯酸和磷酸钙，以提供增强的荧光性质并可用于化疗；金纳米簇结合顺铂前药和叶酸，可用于荧光成像以及乳腺癌的靶向化疗；金纳米簇包载有壳聚糖并与自杀基因形成稳定复合物，可用于光学成像而无需使用额外的染料，且通过体外细胞实验验证其可抑制宫颈癌细胞；金纳米簇包载有BSA和DOX，可用作荧光探针和宫颈癌的治疗药物；以及，金纳米簇结合赫赛汀(Herceptin)，以体外细胞实验验证其可用于乳腺癌的成像和治疗；等。
胰腺癌是人类最致命的癌症之一，其确诊后5年生存率不到5％。胰腺癌的生长和发展与其所处的神经微环境密切相关。临床结果表明，胰腺癌肿瘤中最常见的现象是肿瘤内的神经密度的高度增加。胰腺肿瘤能分泌神经营养因子如神经生长因子(NGF)等。NGF是调节肿瘤中神经生长的关键生长因子，NGF及其受体在胰腺肿瘤和胰腺癌细胞中过度表达，促进了胰腺肿瘤的生长、侵袭和转移。这些现象表明，沉默胰腺肿瘤中的NGF基因，是治疗胰腺癌的一种潜在的有效途径。
siRNA是一种有效的基因干预手段。目前已报道采用皮下肿瘤模型和在肿瘤附近注射siRNA的方式验证了NGF siRNA可用于抑制乳腺癌的生长。然而，游离siRNA容易被血清中的核酸酶降解，因此，还需要进一步 研发稳定性更佳的用于预防和/或治疗癌症的基于NGF siRNA的药物组合物及制剂。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种制备条件温和、稳定性更好的NGF siRNA联合金纳米簇，以及用于制备该NGF siRNA联合金纳米簇的方法，含有该NGF siRNA联合金纳米簇的药物组合物、试剂盒，和该NGF siRNA联合金纳米簇的抗肿瘤应用。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种NGF siRNA联合金纳米簇，所述NGF siRNA联合金纳米簇包含金纳米簇和NGF siRNA，并且所述金纳米簇与所述NGF siRNA之间以静电吸附作用相结合。
NGF siRNA本身可用于沉默胰腺肿瘤中的NGF基因。但是，游离NGF siRNA很容易被血清中的核酸酶降解，并且容易被肾器官清除，导致其沉默效率较低。而且，由于其较大的尺寸和表面负电荷，游离NGF siRNA很难进入细胞和肿瘤中发挥基因沉默的作用。因此，目前较多关于siRNA的报道采用的是局部导入策略，例如皮下注射、瘤内注射等。尽管有将粒径较大的金纳米颗粒结合EGFR siRNA或GM3S siRNA的实验，但其也均为经皮肤给药，且均用于治疗皮肤相关疾病或症状(分别用于抑制皮肤肿瘤和加速糖尿病小鼠的皮肤伤口愈合)。为保持siRNA的稳定性，现有做法通常是对其进行化学修饰(如糖基修饰等)，或者采用脂质体包埋、高分子纳米颗粒富集(例如壳聚糖、环糊精、PEI等)、聚合物胶束包埋等方式，具体可参见文献Gavrilov 2012,Therapeutic siRNA:Principles,challenges,and strategies。
与现有技术明显不同的是，本发明采用金纳米簇作为递送NGF siRNA的高效递送平台，目前尚未见这样的报道。在此过程中发现，通过采用本发明的技术方案，金纳米簇可以为NGF siRNA提供有效保护，从而提高NGF siRNA的稳定性和在体内的循环时间以及肿瘤靶向性，继而提高NGF siRNA在肿瘤细胞和肿瘤组织中的递送效率，实现有效的NGF基因沉默，以此来抑制因NGF过度表达而引发的癌症(如胰腺癌)的发生和发展，为胰腺癌的治疗开辟了一种有前途的新途径。
根据本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇，其中，在所述NGF siRNA联合金纳米簇中，NGF siRNA与金纳米簇的质量比为1.5:1～3.5:1， 优选为2:1～3:1，更优选为3:1。
根据本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇，其中，所述金纳米簇的平均直径为1.63～3.57nm，优选为2.2～3.1nm，例如为2.66±0.45nm；
所述金纳米簇的表面优选带正电荷；和/或
所述金纳米簇的电位优选为19～21mV，优选为19.1～20.7mV，例如为19.9±0.8mV。
根据本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇，其中，所述NGF siRNA的序列为：siRNA sense 5’-CCACAGACAUCAAGGGCAA dTdT-3’(SEQ ID NO:1)，siRNA antisense 3’-dTdT GGUGUCUGUAGUUCCCGUU-5’(SEQ ID NO:2)。优选地，所述siRNA购自和/或合成自锐博生物科技有限公司(ribobio)。本发明涉及的siRNA序列确定自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的NGF数据库(accession number NM_002506)。
本发明的第二方面提供了一种制备方法，其用于制备本发明第一方面所述的NGF siRNA联合金纳米簇，该制备方法包括以下步骤：
(1)向HAuCl4溶液加入还原剂，加热并恒温搅拌，得到金纳米簇溶液；
(2)向所述金纳米簇溶液加入NGF siRNA并常温搅拌，得到所述NGF siRNA联合金纳米簇。
所述还原剂优选为谷胱甘肽(GSH)和多肽分子。所述多肽分子优选为CRRRRRRRRR(CR9)。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，在步骤(1)中：
HAuCl4与谷胱甘肽的摩尔比为1:0.5～3，优选为1:1.5，HAuCl4与CRRRRRRRRR的摩尔比为1:0.5～1.5，优选为1:0.75。
优选地，在室温下，优选在24～26℃下，更优选在25℃下，向HAuCl4溶液加入还原剂；和/或
优选地，加热恒温的温度为70℃。恒温搅拌的时间优选为12～36h，更优选为24h。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，在步骤(2)中：
所述NGF siRNA与金纳米簇的质量比为0.5～100:1，优选为1.5～5:1，更优选为2～3.5:1，最优选为3:1；
所述常温优选为22～28℃，更优选为24～26℃，例如为25℃；
所述搅拌优选为涡旋搅拌；和/或
所述搅拌的时间优选为15～90分钟，更优选为15～45分钟，最优选为30分钟。
本发明的第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，以及本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇或按照本发明第二方面的方法而制备的NGF siRNA联合金纳米簇。所述药物组合物的剂型优选为注射剂，更优选为静脉注射剂。
本发明的第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇或按照本发明第二方面的方法而制备的NGF siRNA联合金纳米簇。
本发明的第五方面提供了一种应用，该应用为本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇、按照本发明第二方面的方法而制备的NGF siRNA联合金纳米簇或本发明第三方面的药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。所述癌症优选为NGF过度表达而引发的癌症，例如可以为胰腺癌；和/或所述药物优选为注射剂，更优选为静脉注射剂。
本发明的第六方面提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向需要的对象给予治疗有效量的本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇或按照本发明第二方面的方法而制备的NGF siRNA联合金纳米簇或本发明第三方面的药物组合物。
本发明的第七方面提供了一种用于预防和/或治疗癌症的NGF siRNA联合金纳米簇，该NGF siRNA联合金纳米簇为本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇或按照本发明第二方面的方法而制备的NGF siRNA联合金纳米簇。
与现有技术相比，本发明的NGF siRNA联合金纳米簇(以下简称为GNC-siRNA)可以具有但不限于以下有益效果：
1、本发明的GNC-siRNA可提高siRNA的稳定性，延长体内循环时间。通过体外实验验证可知，GNC-siRNA在血清中的稳定性比游离siRNA的稳定性更高；而且，对比GNC-siRNA和游离siRNA在小鼠体内不同血液循环时间后的荧光强度，结果也表明GNC-siRNA在血清中的稳定性更强。
2、本发明的GNC-siRNA可改善胰腺肿瘤的靶向性，提高NGF的沉默效应。通过体外和体内实验可得知，GNC-siRNA在胰腺癌细胞和胰腺肿瘤中的摄取量均明显高于游离siRNA的摄取量，并且可显著降低胰腺癌细胞 和胰腺肿瘤组织中的NGF mRNA表达和蛋白表达。
3、本发明的GNC-siRNA可提高胰腺癌的抗肿瘤治疗效果。通过体内实验可得知，GNC-siRNA能显著抑制小鼠中胰腺癌肿瘤的生长、发展和转移。
4、本发明的GNC-siRNA的制备方法简单，反应条件十分温和(可以为常温，常压，水相，pH中性附近)，极大地保护了siRNA的活性。也避免了以往的化学修饰方法对siRNA活性可能造成的不良影响。
5、本发明的GNC-siRNA对NGF siRNA的递送效率高，可达到3000mg siRNA/g金纳米簇(siRNA/GNC的质量比约为3:1)，相当于226μmol siRNA/g金纳米簇。相对于已知的金纳米颗粒递送siRNA而言，金纳米簇递送siRNA的效率更高。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明的NGF siRNA联合金纳米簇的合成技术路线图；
图2示出了实施例1的金纳米簇溶液的照片；
图3示出了实施例1的金纳米簇的TEM图；
图4示出了实施例1的金纳米簇的zeta电位；
图5示出了实施例1～10的NGF siRNA联合金纳米簇的zeta电位；
图6示出了实施例1中的金纳米簇和NGF siRNA联合金纳米簇的表面XPS图谱；
图7示出了试验例1中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图8示出了试验例2中的胰腺癌细胞摄取量图；
图9示出了试验例3中的PCR表征胰腺癌细胞中的NGF mRNA水平图表；
图10示出了试验例3中的蛋白印迹法表征胰腺癌细胞中的NGF蛋白水平图；
图11示出了试验例4中的用Cy-5荧光分子标记siRNA，游离siRNA和GNC-siRNA在小鼠血液中随时间的荧光强度的变化图；
图12示出了试验例5中的用Cy-5荧光分子标记siRNA，游离siRNA和GNC-siRNA在小鼠体内的胰腺肿瘤组织中的聚集。其中白色圆圈表示皮下胰腺肿瘤。
图13示出了试验例5中的用Cy-5荧光分子标记siRNA，游离siRNA和GNC-siRNA在胰腺肿瘤组织中聚集的体外图片；
图14示出了试验例6中的原位胰腺肿瘤模型的构建、给药时间和小鼠牺牲时间示意图；
图15示出了试验例6中的给药过程过小鼠的体重变化图；
图16示出了试验例6中的生物发光法标记的原位胰腺肿瘤的生长结果图；
图17示出了试验例6中的原位胰腺肿瘤的发光强度的统计结果图；
图18示出了试验例6中的实验结束后收集的原位胰腺肿瘤的体外照片；
图19示出了试验例6中的原位胰腺肿瘤的称重统计结果图；
图20示出了试验例6中的生物发光法标记的原位胰腺肿瘤在肠系膜的转移结果图；
图21示出了试验例6中的肠系膜上转移的胰腺肿瘤的发光强度的统计结果图。
图22示出了试验例7中的PCR表征胰腺肿瘤组织中的NGF mRNA水平图表；
图23示出了试验例7中的蛋白印迹法表征胰腺肿瘤组织中的NGF蛋白水平图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
HAuCl4和GSH购自Sigma-Aldrich公司，多肽分子CR9由吉尔生化有限公司合成；NGF siRNA由锐博生物科技有限公司(ribobio)公司合成。
nsRNA(nonsense siRNA)序列：nsRNA sense 5’-GCUGACCCUGAAGUUCAUCdTdT-3’(SEQ ID NO:3)；nsRNA antisense 3’-dTdTCGACUGGGACUUCAAGUAG-5’(SEQ ID NO:4)。由锐博生物科技有限公司(ribobio)公司合成。
仪器：
透射电子显微镜(TEM)，FEI公司、型号Tecnai G2 20 S-TWIN。
zeta电位仪，英国马尔文仪器有限公司、型号NanoZS,Malvern。
X射线光电子能谱仪(XPS能谱仪)，Thermo Scientific公司、型号ESCALAB 250XI。
实施例 1
本实施例用于说明本发明的NGF siRNA联合金纳米簇(GNC-siRNA)及其制备方法。
通过以下步骤制备本发明的GNC-siRNA(技术路线如图1所示)：
(1)在25℃下向HAuCl4溶液加入还原剂GSH和CR9，其中HAuCl4为100mM，GSH为150mM，CR9为75mM，相当于HAuCl4与GSH的摩尔比为1:1.5，HAuCl4与CR9的摩尔比为1:0.75，然后加热至70℃并恒温搅拌24h，得到金纳米簇溶液。
金纳米簇溶液的颜色呈浅黄绿色(如图2所示。因专利公布的原因，图2可能显示不正确的颜色，这不能限制本发明)。使用TEM观察金纳米簇的大小和表面形貌，TEM图如图3所示，其平均直径为2.66±0.45nm，并且分散性良好。使用zeta电位仪测得金纳米簇的表面带正电荷(如图4所示)，zeta电位为19.9±0.8mV。
(2)向所述金纳米簇溶液加入NGF siRNA，在25℃下涡旋搅拌30min，得到所述GNC-siRNA。其中，NGF siRNA与金纳米簇(金纳米簇的质量由ICP-MS测量)的质量比为3:1。如图1下图所示，通过静电吸附作用，将带有负电荷的NGF siRNA吸附在带正电荷的金纳米簇的表面。该GNC-siRNA的zeta电位见图5。
图6为XPS能谱仪测定的GNC(来自步骤(1))和GNC-siRNA(来自步骤(2))的表面XPS图谱。由该图谱可知，GNC没有P的峰，说明不含磷元素，GNC-siRNA中出现P的峰，说明GNC-siRNA含磷元素(P元素来自于核酸)，即GNC表面静电吸附有NGF siRNA。
实施例 2 ～ 10
本实施例用于说明本发明的GNC-siRNA及其制备方法。
按照与实施例1相同的方法制备实施例2～10的GNC-siRNA，区别仅在于，步骤(2)中的NGF siRNA与金纳米簇的质量比分别为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3.5:1、4:1、5:1、100:1。
使用zeta电位仪测量上述GNC-siRNA的zeta电位，结果见图5。其中，将步骤(2)的金纳米簇溶液作为质量比0:1。从图5中可看出，当NGF siRNA/GNC质量比大于3时，溶液的zeta电位不变，表明siRNA达到饱和状态。因此，GNC-siRNA的siRNA负载量最高可达3000mg siRNA/g金纳米簇，相当于226μmol siRNA/g金纳米簇。
由此可知，在实施例1～10所得的GNC-siRNA中，NGF siRNA与金纳米簇的质量比分别为3:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3:1、3:1、3:1。
实施例 11
本实施例用于说明本发明的GNC-siRNA及其制备方法。
通过以下步骤制备本发明的GNC-siRNA(技术路线如图1所示)：
(1)在24℃下向HAuCl4溶液加入还原剂GSH和CR9，其中HAuCl4为100mM，GSH为50mM，CR9为50mM，相当于HAuCl4与GSH的摩尔比为1:0.5，HAuCl4与CR9的摩尔比为1:0.5。然后加热至70℃并恒温搅拌12h，得到金纳米簇溶液。金纳米簇溶液的颜色呈浅黄绿色。使用TEM观察金纳米簇的大小和表面形貌，其平均直径为2.41nm，并且分散性良好。使用zeta电位仪测得金纳米簇的表面带正电荷，zeta电位为20.3mV。
(3)向所述金纳米簇溶液加入NGF siRNA，在24℃下涡旋搅拌15min，得到所述GNC-siRNA。其中，NGF siRNA与金纳米簇(金纳米簇的质量由ICP-MS测量)的质量比为3:1。
本实施例的GNC-siRNA的XPS图谱存在P峰，说明GNC表面静电吸附有NGF siRNA。本实施例所得的GNC-siRNA中，NGF siRNA与金纳米簇的质量比为3:1。
实施例 12
本实施例用于说明本发明的GNC-siRNA及其制备方法。
通过以下步骤制备本发明的GNC-siRNA(技术路线如图1所示)：
(1)在26℃下向HAuCl4溶液加入还原剂GSH和CR9，其中HAuCl4为100mM，GSH为300mM，CR9为150mM，相当于HAuCl4与GSH的摩尔比为1:3，HAuCl4与CR9的摩尔比为1:1.5。然后加热至70℃并恒温搅拌36h，得到金纳米簇溶液。金纳米簇溶液的颜色呈浅黄绿色。使用TEM观察金纳米簇的大小和表面形貌，其平均直径为2.89nm，并且分散性良好。使用zeta电位仪测得金纳米簇的表面带正电荷，zeta电位为20.1mV。
(3)向所述金纳米簇溶液加入NGF siRNA，在26℃下涡旋搅拌45min，得到所述GNC-siRNA。其中，NGF siRNA与金纳米簇(金纳米簇的质量由ICP-MS测量)的质量比为3:1。
本实施例的GNC-siRNA的XPS图谱存在P峰，说明GNC表面静电吸附有NGF siRNA。本实施例所得的GNC-siRNA中，NGF siRNA与金纳米簇的质量比为3:1。
实施例 13
本实施例用于说明本发明的GNC-siRNA及其制备方法。
通过以下步骤制备本发明的GNC-siRNA(技术路线如图1所示)：
(1)在25℃下向HAuCl4溶液加入还原剂GSH和CR9，其中HAuCl4为100mM，GSH为250mM，CR9为100mM，相当于HAuCl4与GSH的摩尔比为1:2.5，HAuCl4与CR9的摩尔比为1:1。然后加热至70℃并恒温搅拌24h，得到金纳米簇溶液。金纳米簇溶液的颜色呈浅黄绿色。使用TEM观察金纳米簇的大小和表面形貌，其平均直径为2.75nm，并且分散性良好。使用zeta电位仪测得金纳米簇的表面带正电荷，zeta电位为19.6mV。
(3)向所述金纳米簇溶液加入NGF siRNA，在25℃下涡旋搅拌60min，得到所述GNC-siRNA。其中，NGF siRNA与金纳米簇(金纳米簇的质量由ICP-MS测量)的质量比为3:1。
本实施例的GNC-siRNA的XPS图谱存在P峰，说明GNC表面静电吸附有NGF siRNA。本实施例所得的GNC-siRNA中，NGF siRNA与金纳米簇的质量比为3:1。
试验例 1
本试验例用于验证不同siRNA在血清中的稳定性。
在含有10％血清(v/v)的培养基中培养游离NGF siRNA和实施例1的GNC-siRNA，使siRNA的初始浓度均为100nM，孵育0min、15min、30min、45min和60min后，提取溶液各5μl，加入到聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中，在160V电压下跑胶45min，并用GelRed对核酸进行染色和紫外显影，评价siRNA核酸的位置和分布。结果如图7所示，表明本发明的GNC-siRNA在血清中的稳定性比游离siRNA的稳定性更强。
试验例 2
本试验例用于验证不同siRNA在胰腺癌细胞中的摄取量。
用Cy5荧光分子(激发/发射＝649/670nm)标记siRNA，形成Cy5-siRNA。在培养皿中培养胰腺癌细胞Panc-1细胞至80％细胞融合度，在培养基中分别加入游离siRNA和实施例1的GNC-siRNA，使siRNA的初始浓度均为100nM。培养1h后，清洗细胞，用4％多聚甲醛固定细胞，清洗细胞，然后利用共聚焦激光显微镜观察Panc-1癌细胞对Cy5-siRNA的摄取情况。结果如图8所示，表明本发明的GNC-siRNA在胰腺癌细胞中的摄取量明显高于游离siRNA的细胞摄取量。
试验例 3
本试验例用于验证不同siRNA在胰腺癌细胞中的NGF基因沉默效应。
在培养皿中培养胰腺癌细胞Panc-1细胞至70％～80％融合度，在培养基中分别加入游离siRNA和实施例1的GNC-siRNA，使siRNA的初始浓度均为100nM，并且以未处理组、GNC-nsRNA(结合nonsense siRNA的金纳米簇。其中siRNA的初始浓度相同均为100nM)组作为对照。培养48h后，清洗细胞。利用PCR表征细胞中NGF mRNA的表达水平，利用蛋白印迹表征细胞中NGF蛋白的表达水平。结果分别如图9和图10所示，表明相对于游离siRNA，本发明的GNC-siRNA显著降低了胰腺癌细胞中的NGF mRNA表达和NGF蛋白表达。
试验例 4
本试验例用于验证不同siRNA在小鼠体内的循环时间。
用Cy5荧光分子(激发/发射＝649/670nm)标记siRNA，得到 Cy5-siRNA。小鼠尾静脉分别注射游离siRNA和实施例1的GNC-siRNA，使siRNA的注射量相同，每只小鼠注射30μg Cy5-siRNA。尾静脉注射0h、1h、2h、3h、6h后，分别收集小鼠血液约150μl。之后将100μl血液转移到PCR小管中，采用CRI Maestro 2多光谱小动物活体成像系统分析游离siRNA和实施例1的GNC-siRNA在血液中的荧光强度，采用激发和发射光谱为649nm和670nm。结果如图11所示，表明本发明的GNC-siRNA在血清中的稳定性增强，比游离siRNA的体内循环时间明显增加。
试验例 5
本试验例用于验证不同siRNA在小鼠体内的肿瘤靶向性。
用Cy5荧光分子(激发/发射＝649/670nm)标记siRNA。在荷载皮下肿瘤的Balb/c裸鼠中，采用尾静脉分别注射游离siRNA和实施例1的GNC-siRNA，使siRNA的注射量相同，均为每只小鼠注射30μg Cy5-siRNA，以生理盐水注射组作为对照。尾静脉注射0h、3h、6h、24h后，采用CRI Maestro 2多光谱小动物活体成像系统分析游离siRNA和实施例1的GNC-siRNA在小鼠体内分布，采用CRI Maestro 2成像系统的黄色滤光片，采集从650nm到800nm的荧光发射信号。结果如图12所示。
注射siRNA 24h之后，解剖小鼠并取出肿瘤组织，用上述成像系统进行体外成像，观察游离siRNA和GNC-siRNA在肿瘤部位的荧光分布。结果如图13所示。
以上结果均表明，本发明的GNC-siRNA在胰腺肿瘤中的摄取量明显高于游离siRNA的摄取量。
试验例 6
本试验例用于验证不同siRNA在小鼠中的抗肿瘤效果。
在Balb/c裸鼠中，在胰腺的胰头部位种植1×106个标记有荧光素酶的胰腺癌细胞(Panc-1-luc)，构建原位胰腺癌肿瘤模型。大约2周后，形成原位的胰腺肿瘤。对小鼠进行尾静脉注射游离siRNA和实施例1的GNC-siRNA，保持注射的siRNA量均为每只小鼠30μg siRNA，并且以生理盐水注射组、GNC注射组(GNC注射量相同)、GNC-nsRNA注射组(GNC和siRNA的注射量相同)作为对照，每两天注射一次，一共注射7次。采用小动物体内生物发光成像法(原理：荧光素酶与荧光素底物的特异性反 应并发出光子)，观察小鼠中原位胰腺癌的生长，观测到的光子强度与肿瘤的生长大小成正比。28天后，牺牲并解剖小鼠，取出胰腺及周围的肠系膜，用生物发光成像法观察肿瘤在肠系膜的转移。之后取出胰腺中的原位肿瘤，并对肿瘤组织进行称重。
原位胰腺肿瘤模型的构建、给药时间和小鼠牺牲时间如图14所示。
图15为实验过程中小鼠的体重变化，结果显示给药过程中小鼠的体重变化不明显，表明不同的给药方式对小鼠没有造成明显的毒性。
图16为生物发光法标记的原位胰腺肿瘤的生长结果。图17为原位胰腺肿瘤的发光强度的统计结果。图18为实验结束后收集的原位胰腺肿瘤的体外照片。图19为原位胰腺肿瘤的称重统计结果。上述结果均表明本发明的GNC-siRNA能显著抑制小鼠原位胰腺肿瘤的生长。
图20为用生物发光法标记的原位胰腺肿瘤在肠系膜的转移结果。图21为肠系膜上转移的胰腺肿瘤的发光强度的统计结果。上述结果表明本发明的GNC-siRNA能显著抑制胰腺肿瘤的转移。
试验例 7
本试验例用于验证不同siRNA在小鼠体内的胰腺肿瘤中的NGF基因沉默效应。
取试验例6中的肿瘤组织，利用PCR表征细胞中NGF mRNA的表达水平，利用蛋白印迹表征细胞中NGF蛋白的表达水平。结果分别如图22和图23所示，表明相对于游离siRNA，本发明的GNC-siRNA显著降低了胰腺肿瘤组织中的NGF mRNA表达和NGF蛋白表达。
试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇或按照本发明第二方面的方法而制备的NGF siRNA联合金纳米簇。
该试剂盒中还可以包括用于PCR扩增、载体构建等所需的各种试剂，包括但不限于扩增缓冲液、引物、模板DNA、酶等。
此外，所述试剂盒中还可包括使用说明书和/或使用/分析软件。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，以及本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇或按照本发明第二方面的方法而制备的NGF siRNA联合金纳米簇。所述NGF siRNA联合金纳米簇在该药物组合物中可以为有效量的或治疗有效量的。
如本文所用，“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物(如哺乳动物和禽类)而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。“药学上可接受的载体”是指用于给药的载体，可以包括各种赋形剂和稀释剂等。
本发明的药物组合物可以含有安全有效量的本发明的NGF siRNA联合金纳米簇作为活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体可以包括但不限于：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型可以依需要制备为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、稀释剂等。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅料的水溶液通常以常规方法进行制备。该药物组合物更适宜在无菌条件下制造。根据上述实验结果，由于本发明的NGF siRNA联合金纳米簇在血清中的稳定性较好，因而适合制备为注射剂，尤其是静脉注射剂。
本发明所述的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数，例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，在绝大部分情况下，当本发明的活性成分每天可以以约0.01mg-50mg/kg动物体重(较佳的1mg-5mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。更为具体的，在一种实施方案中，剂量为：30μg/小鼠(～20g)，即～1.5mg/kg；一般，尾静脉注射siRNA的范围在1μg-400μg/小鼠之间，即给药量是0.05-20mg/kg，如此类推。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括但不限于：水、生理盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或 其组合。载体的选择通常应与给药方式相匹配，这是本领域的普通技术人员所熟知的。
本发明还提供了所述药物组合物的应用，其用于制备预防和/或治疗癌症的药物。优选地，所述癌症为NGF过度表达而引发的癌症，例如可以为胰腺癌。
预防和 / 或治疗方法
本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向需要的对象给予治疗有效量的本发明第一方面的NGF siRNA联合金纳米簇或按照本发明第二方面的方法而制备的NGF siRNA联合金纳米簇或本发明第三方面的药物组合物。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种NGF siRNA联合金纳米簇，其特征在于，所述NGF siRNA联合金纳米簇包含金纳米簇和NGF siRNA，并且所述金纳米簇与所述NGFsiRNA之间以静电吸附作用相结合。
2.根据权利要求1所述的NGF siRNA联合金纳米簇，其特征在于，在所述NGF siRNA联合金纳米簇中，NGF siRNA与金纳米簇的质量比为1.5～3.5:1，优选为2～3:1，最优选为3:1。
3.根据权利要求1或2所述的NGF siRNA联合金纳米簇，其特征在于：
所述金纳米簇的平均直径为1.63～3.57nm，优选为2.2～3.1nm；
所述金纳米簇的表面优选带正电荷；和/或
所述金纳米簇的电位优选为19～21mV，更优选为19.1～20.7mV。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的NGF siRNA联合金纳米簇，其特征在于，所述NGF siRNA的序列为：siRNA sense5’-CCACAGACAUCAAGGGCAA dTdT-3’，siRNA antisense 3’-dTdTGGUGUCUGUAGUUCCCGUU-5’。
5.权利要求1至4中任一项所述的NGF siRNA联合金纳米簇的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)向HAuCl4溶液加入还原剂，加热并恒温搅拌，得到金纳米簇溶液；
(2)向所述金纳米簇溶液加入NGF siRNA并常温搅拌，得到所述NGFsiRNA联合金纳米簇；
所述还原剂优选为谷胱甘肽和多肽分子，所述多肽分子优选为CRRRRRRRRR。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中：
HAuCl4与谷胱甘肽的摩尔比为1:0.5～3，优选为1:1.5，HAuCl4与CRRRRRRRRR的摩尔比为1:0.5～1.5，优选为1:0.75；
优选地，在室温下，优选在24～26℃下，更优选在25℃下，向HAuCl4溶液加入还原剂；和/或
优选地，加热恒温的温度为70℃；恒温搅拌的时间优选为12～36h，更优选为24h。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中：
所述NGF siRNA与金纳米簇的质量比为0.5～100:1，优选为1.5～5:1，更优选为2～3.5:1，最优选为3:1；
所述常温优选为22～28℃，更优选为24～26℃；
所述搅拌优选为涡旋搅拌；和/或
所述搅拌的时间优选为15～90分钟，更优选为15～45分钟，最优选为30分钟。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含药学上可接受的载体，以及权利要求1至4中任一项所述的NGF siRNA联合金纳米簇或按照权利要求5至7中任一项所述的方法制备的NGF siRNA联合金纳米簇；所述药物组合物的剂型优选为注射剂，更优选为静脉注射剂。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至4中任一项所述的NGF siRNA联合金纳米簇或按照权利要求5至7中任一项所述的方法制备的NGF siRNA联合金纳米簇。
10.权利要求1至4中任一项所述的NGF siRNA联合金纳米簇、按照权利要求5至7中任一项所述的方法制备的NGF siRNA联合金纳米簇或权利要求8所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用；所述癌症优选为胰腺癌；和/或所述药物优选为注射剂，更优选为静脉注射剂。
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