CN108034676A - 一种基因载体系统及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因载体系统，包括带正电荷的金纳米簇、带负电荷的高分子遮蔽体系和基因物质，其中带正电荷的金纳米簇与带负电荷的高分子遮蔽体系的质量比为(2～10)：1，带正电荷的金纳米簇与基因物质的质量比为(2～5)：1，基因载体系统尺寸在100‑200nm。同时公开了载体系统的构建方法。其采用带负电高分子多糖作为高分子遮蔽体系与金纳米簇相结合，调整载体系统的整体带电性，避免基因载体在细胞内容易吸附各种生物分子，提高转染效率；金纳米簇与基因物质以及多糖的结合效果良好，形成的聚合物毒性低，尺寸在100‑200nm，有利于进入细胞，提高了转染效率。

Description

一种基因载体系统及其构建方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种以金纳米簇作为阳离子载体，多糖类物质作为阴离子遮蔽体系构建的基因载体系统。
背景技术
21世纪是生物技术的世纪，农业领域中越来越多的运用到生物技术，生物技术为农业生产带来巨大的变化。转基因技术是指运用科学的技术手段，将特定的基因片段转入特定生物中，使得该生物个体具有该基因所携带的性状。转基因技术通过在分子和细胞水平上对基因进行操作，打破物种间的生物隔离的天然屏障，从而实现对目标物性状的定向改良，这项技术是生物技术领域的发展前沿之一。自从人类刀耕火种的生活方式以来人类对农作物遗传的改良就从来没有停止。传统的改良农作物的方式主要是对自然产生变异的优良基因进行选择和利用，只能被动的对现有的优良基因进行筛选，不具有主观能动性，其过程漫长。而且传统的技术存在着一定的局限性，不具有高效性。传统的技术只能在生物种内个体间进行基因的转移，转基因技术就不存在这个局限。
转基因成功的一个重要的条件，就是要将所需基因成功地输送到目标细胞体内。只有在这个前提下，转基因才能实现。目前用于基因转染的非病毒载体种类繁多，其中占多数的是阳离子高聚物及相关复合体，例如使用范围很广的阳离子聚合物聚乙烯亚胺(Molecular design of functional polymers for gene therapy.Jeong JH,Kim SW,Park TG.Park.Prog.Polym.Sci.2007；32(11):1239-1274)。但是阳离子聚合物往往毒性较高，在体内运输过程会产生非特异性吸附(Gene transfer with lipospermines andpolyethylenimines.Remy JS,Abdallah B,Zanta MA,Boussif O,Behr JP,DemeneixB.Adv.Drug Deliver.Rev1998Mar2；30(1-3):85-95.)。然而阳离子高聚物基因载体存在转染效率低，细胞毒性大等缺点。
金纳米材料具有化学性质稳定、亲和力强、生物相容性好、易于表面修饰等优点，是生物医学领域研究和应用最早的纳米材料之一。例如，中国发明专利CN2008100514118公开了一种含纳米金颗粒的非病毒基因载体、制备方法和应用，其通过硫金键将纳米金颗粒和阳离子聚合物结合在一起作为基因载体。中国发明专利CN2014100294486公开了一种脂质保护的纳米金基因载体及其制备方法，首先制备磷脂泡囊溶液，然后在还原剂的作用下，金离子在溶液中与磷脂泡囊反应，得到脂质保护的纳米金基因载体。上述方法制备的基因载体体系虽然在细胞中取得了良好的转染效果，但是制备方法复杂，阳离子高聚物进入生物细胞时，各种生物分子容易吸附在阳离子高聚物表面，形成聚集，影响其转染效率。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种利用多肽修饰的金纳米簇作为带正电的基因载体，高分子多糖聚合物作为带负电的遮蔽体系的新型基因载体系统。解决有现有基因载体系统存在的转染率低、毒性高、容易导致细胞死亡、制备方法复杂、在细胞内容易吸附各种生物分子等问题。
为了实现上述目的，本发明一种基因载体系统，包括带正电荷的金纳米簇、带负电荷的高分子遮蔽体系和基因物质，其中带正电荷的金纳米簇与带负电荷的高分子遮蔽体系的质量比为(2～10)：1，带正电荷的金纳米簇与基因物质的质量比为(2～5)：1，基因载体系统尺寸在100-200nm。
本发明所述基因载体系统的构建方法，具体包括以下步骤：
(1)分别配置一定浓度的带正电荷的金纳米簇溶液，带负电荷的高分子遮蔽体系溶液和基因物质溶液；
(2)将步骤1中的带正电荷的金纳米簇溶液，带负电荷的高分子遮蔽体系溶液和基因物质溶液按照一定的比例进行混合，充分混匀后，静止10min。
进一步地，所述带正电荷的金纳米簇溶液浓度为20μg/ml～500μg/ml，带负电荷的高分子遮蔽体系溶液浓度为20μg/ml～500μg/ml和基因物质溶液浓度为20μg/ml～800μg/ml。
优选地，所述带正电荷的金纳米簇溶液浓度为100μg/ml，带负电荷的高分子遮蔽体系溶液浓度为100μg/ml和基因物质溶液浓度为200μg/ml，带正电荷的金纳米簇、带负电荷的高分子遮蔽体系和基因物质的质量比为5:2:2。
进一步地，所述带负电荷的高分子遮蔽体系为硫酸葡聚糖，肝素钠和硫酸软骨素、聚丙烯酸和聚氨基甲酸酯中的一种，所述基因物质为质粒，mRNA，siRNA和miRNA中的一种。
进一步地，所述带正电荷的金纳米簇采用专利ZL201610389189.7，一种以多肽为还原剂和稳定剂制备金纳米簇的制备方法的制备。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)采用了对细胞活性的影响较小的金纳米簇，细胞转染过程中存活率较高；(2)采用带负电高分子多糖作为高分子遮蔽体系与金纳米簇相结合，调整载体系统的整体带电性，避免基因载体在细胞内容易吸附各种生物分子，提高转染效率；(3)金纳米簇与基因物质以及多糖的结合效果良好，形成的聚合物毒性低，尺寸在100-200nm，有利于进入细胞，提高了转染效率；(4)采用具有良好的水溶性、良好的生物相容性以及颗粒直径更小(2nm左右)的金纳米簇，直接与溶液中的高分子多糖和基因物质静电复合基因载体系统，合成方法简单，在转基因领域具有重要的应用价值；(5)金纳米簇具有荧光性，便于观察基因载体的表达；(6)基因载体系统对HEK293细胞转染绿色荧光蛋白的转染效率与PEI体系相比，细胞存活率能够提高1.5倍，最高转染效率能提高2倍。
附图说明：
图1为本发明实施例1涉及的基因载体系统运载绿色荧光蛋白质粒转染HEK293细胞的激光共聚焦显微镜表征结果(A是未转染的HEK293细胞成像结果，B是实施例1基因运载体系转染后的HEK 293细胞的成像结果)。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式和附图对本发明做进一步说明。
以下实施例中所使用的激光共聚焦显微镜型号为Nikon Al(配备405nmhe488nm激光)。
实施例1：
(1)金纳米簇的制备
用超纯水配置HAuCl4(20mmol/L)、KRKC(20mmol/L)和GSH(20mmol/L)的溶液，将玻璃瓶使用王水浸泡处理，清晰干净后烘干备用；向处理好的玻璃瓶中加入400μL的KRKC溶液及120μL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl4溶液280μL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+的终浓度为2mmol/L；将加入反应物的玻璃瓶放置在恒温水浴锅，温度设置在70℃反应12h；反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子的物质的得到金纳米簇；离心得上清液采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤，得到带正电荷的金纳米簇；所得金纳米簇使用石英晶体微天平测得浓度为C0；
(2)使用超纯水将步骤1所得的金纳米簇溶液稀释为100μg/mL，再配制100μg/mL硫酸葡聚糖溶液和200μg/mL绿色荧光蛋白EGFP的高纯度质粒溶液；
(3)取步骤2所得的金纳米簇的溶液100μL，硫酸葡聚糖溶液40μL，绿色荧光蛋白高纯度质粒溶液20μL混合孵育30min；
(4)取200μL DMEM与步骤3预混合液进行混合，加入到培育着HEK293E细胞的24孔板中，每孔加入400μL的混合液，孵育4h；
(5)将步骤4的24孔板中的混合液吸出，每孔加入400μL的完全培养液继续培养12h；
(6)将细胞制片，固定；
(7)使用共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦成像，观察绿色荧光蛋白EGFP的表达情况，在500-530nm绿色荧光蛋白EGFP的荧光通道可以看到部分细胞中蛋白的表达，从图B中可以明显地观察到绿色荧光蛋白的荧光信号，说明转染基因已经成功表达，细胞的轮廓清晰，形态饱满，显示良好的生存状态，说明基因载体系统对细胞的毒性较小。经测定基因载体系统对HEK293细胞转染绿色荧光蛋白的转染效率与PEI体系相比，细胞存活率能够提高1.5倍，最高转染效率能提高2倍，对HEK293E转染12h后，存活率为76.8％。
实施例2：
(1)金纳米簇的制备
用超纯水配置HAuCl4(20mmol/L)、KRKC(20mmol/L)和GSH(20mmol/L)的溶液，将玻璃瓶使用王水浸泡处理，清晰干净后烘干备用；向处理好的玻璃瓶中加入400μL的KRKC溶液及120μL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl4溶液280μL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+的终浓度为2mmol/L；将加入反应物的玻璃瓶放置在恒温水浴锅，温度设置在70℃反应12h；反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子的物质的得到金纳米簇；离心得上清液采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤，得到金纳米簇，所得金纳米簇使用石英晶体微天平测得浓度为C0；
(2)使用超纯水将步骤1所得的金纳米簇溶液稀释为100μg/mL，再配制100μg/mL肝素钠溶液和50μg/mL红色荧光蛋白mCherry mRNA溶液；
(3)取步骤2所得的金纳米簇的溶液100μL，肝素钠溶液40μL，红色荧光蛋白mCherry mRNA溶液80μL混合孵育30min；
(4)取200μLDMEM与步骤3预混合液进行混合，加入到培育着HEK293E细胞的24孔板中，每孔加入400μL的混合液，孵育4h；
(5)将步骤4的24孔板中的混合液吸出，每孔加入400μL的完全培养液继续培养12h；
(6)将细胞制片，固定；
(7)使用共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦成像，观察红色荧光蛋白mCherry的表达情况，在700-730nm红色荧光蛋白mCherry的荧光通道可以看到部分细胞中蛋白的表达。对HEK293E转染12h后，细胞的存活率为79.4％。
实施例3：
(1)金纳米簇的制备
用超纯水配置HAuCl4(20mmol/L)、KRKC(20mmol/L)和GSH(20mmol/L)的溶液，将玻璃瓶使用王水浸泡处理，清晰干净后烘干备用；向处理好的玻璃瓶中加入400μL的KRKC溶液及120μL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl4溶液280μL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+的终浓度为2mmol/L；将加入反应物的玻璃瓶放置在恒温水浴锅，温度设置在70℃反应12h；反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子的物质的得到金纳米簇；离心得上清液采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤，得到带正电荷的金纳米簇，所得金纳米簇使用石英晶体微天平测得浓度为C0；
(2)使用超纯水将步骤1所得的金纳米簇溶液稀释为20μg/mL，配制20μg/mL肝素钠溶液和20μg/mL红色荧光蛋白mCherry mRNA溶液；
(3)取步骤2所得的金纳米簇的溶液100μL，肝素钠溶液40μL，mRNA溶液40μL混合孵育30min；
(4)取200μL DMEM与步骤3预混合液进行混合，加入到培育着HEK293E细胞的24孔板中，每孔加入400μL的混合液，孵育4h；
(5)将步骤4的24孔板中的混合液吸出，每孔加入400μL的完全培养液继续培养12h；
(6)将细胞制片，固定；
(7)使用共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦成像，观察红色荧光蛋白mCherry的表达情况，在700-730nm红色荧光蛋白mCherry的荧光通道可以看到部分细胞中蛋白的表达。对HEK293E转染12h后，存活率为72.6％。
实施例4：
(1)金纳米簇的制备
用超纯水配置HAuCl4(20mmol/L)、KRKC(20mmol/L)和GSH(20mmol/L)的溶液，将玻璃瓶使用王水浸泡处理，清晰干净后烘干备用；向处理好的玻璃瓶中加入400μL的KRKC溶液及120μL的GSH溶液混合均匀，再向其中加入HAuCl4溶液280μL，可观察到反应体系颜色由无色变为淡黄色，最后向玻璃瓶中加入超纯水使溶液中Au+的终浓度为2mmol/L；将加入反应物的玻璃瓶放置在恒温水浴锅，温度设置在70℃反应12h；反应结束后，将样品转移到离心管中离心除去大分子的物质的得到金纳米簇；离心得上清液采用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜过滤，得到金纳米簇，所得金纳米簇使用石英晶体微天平测得浓度为C0；
(2)使用超纯水将步骤1所得的金纳米簇溶液稀释为500μg/mL，配制500μg/mL硫酸软骨素溶液和800μg/mL绿色荧光蛋白EGFP的高纯度质粒溶液；
(3)取步骤2所得的金纳米簇的溶液100μL，硫酸软骨素溶液40μL，高纯度质粒溶液25μL混合孵育30min；
(4)取200μLDMEM与步骤3预混合液进行混合，加入到培育着HEK293E细胞的24孔板中，每孔加入400μL的混合液，孵育4h；
(5)将步骤4的24孔板中的混合液吸出，每孔加入400μL的完全培养液继续培养12h；
(6)将细胞制片，固定；
(7)使用共聚焦显微镜对细胞进行共聚焦成像，观察绿色荧光蛋白EGFP的表达情况，在500-530nm绿色荧光蛋白EGFP的荧光通道可以看到部分细胞中蛋白的表达。对HEK293E转染12h后，细胞的存活率为69.3％。

Claims (5)

1.一种基因载体系统，其特征在于，包括带正电荷的金纳米簇、带负电荷的高分子遮蔽体系和基因物质，其中带正电荷的金纳米簇与带负电荷的高分子遮蔽体系的质量比为(2～10)：1，带正电荷的金纳米簇与基因物质的质量比为(2～5)：1，基因载体系统尺寸在100-200nm。
2.一种权利要求1所述基因载体系统的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)分别配置一定浓度的带正电荷的金纳米簇溶液，带负电荷的高分子遮蔽体系溶液和基因物质溶液；
(2)将步骤(1)中的带正电荷的金纳米簇溶液，带负电荷的高分子遮蔽体系溶液和基因物质溶液按照一定的比例进行混合，充分混匀后，静止10min。
3.根据权利要求2所述基因载体系统的构建方法，其特征在于，所述带正电荷的金纳米簇溶液浓度为20μg/ml～500μg/ml，带负电荷的高分子遮蔽体系溶液浓度为20μg/ml～500μg/ml和基因物质溶液浓度为20μg/ml～800μg/ml。
4.根据权利要求3所述基因载体系统的构建方法，其特征在于，所述带正电荷的金纳米簇溶液浓度为100μg/ml，带负电荷的高分子遮蔽体系溶液浓度为100μg/ml和基因物质溶液浓度为200μg/ml，带正电荷的金纳米簇、带负电荷的高分子遮蔽体系和基因物质的质量比为5:2:2。
5.根据权利要求4所述基因载体系统的构建方法，其特征在于，所述带负电荷的高分子遮蔽体系为硫酸葡聚糖，肝素钠和硫酸软骨素、聚丙烯酸和聚氨基甲酸酯中的一种，所述基因物质为质粒，mRNA，siRNA和miRNA中的一种。
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