CN103497961A - 一种基因载体系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基因载体系统，包括：pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2～100)：1；所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5～80)：1；所述基因物质为质粒DNA或siRNA。本发明还提供了一种基因载体系统的制备方法以及一种氨基酸聚合物。本发明提供的基因载体引入了更多的带电基团，减少了遮蔽体系的用量，降低了应用时因遮蔽体系而产生的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及生物载体领域，特别涉及基因载体系统及其制备方法。
背景技术
基因治疗作为一种新兴的治疗模式已经有了很大的发展，在人类攻克遗传疾病及癌症等顽症的过程中占据着重要地位，并逐步成为一种常见的有效手段。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞以纠正基因的缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的的生物医学新技术。利用载体将外源基因导入靶细胞是一种基因治疗的有效方法，成功的基因治疗对基因载体的依赖性很大。常见的载体包括病毒类载体和非病毒载体，但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患，在基因治疗历史上不乏有患者死亡事件及并发症等的出现，在很大程度上都是由病毒类基因载体的不安全性造成的。
非病毒载体多为高分子阳离子聚合物，因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者。其中阳离子聚合物聚乙烯亚胺是非病毒类载体中受到关注最多的一个（Moleculardesign of functional polymers for gene therapy.Jeong JH,Kim SW,ParkTG.Park.Prog.Polym.Sci.2007；32(11):1239-1274），它在体外和体内的转染实验中得到应用并取得了一定的效果，但由于其毒性高、转染效率低于病毒类载体、在体内运输过程的非特异性吸附以缺乏靶向性等缺点，阻碍了它的进一步发展（Gene transfer with lipospermines andpolyethylenimines.Remy JS,Abdallah B,Zanta MA,Boussif O,Behr JP,Demeneix B.Adv.Drug Deliver.Rev1998Mar2；30(1-3):85-95.）。
肿瘤的理想基因治疗过程为：载有基因物质的基因载体在血液中循环，到达肿瘤组织后被肿瘤细胞内吞并完成转染治疗。但是，血液中含有很多带负电的蛋白类物质，带正点的载体容易与其吸附凝聚成大颗粒而发生沉淀（Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery.Structural effects on cellular internalization,buffering capacity,and geneexpression。Liu,Y,and Reineke,T.M.Bioconjugate Chem.2007；18,19-30.）；而且，正常体液环境中的细胞表面带负电，带正电的载体也容易接近正常细胞，被正常细胞内吞，因此，载体难于到达肿瘤组织，导致转染效率低。
为了提高基因载体体系进入目标组织细胞的效率，常用的方法是引入遮蔽体系。遮蔽体系通常选用带负电的高分子材料，复合在基因载体体系表面，使整个颗粒带负电。避免在血液运输过程中的非特异性吸附。但引入的遮蔽体系表面所带的负电会与细胞表面带负电荷产生斥力，影响载体体系与细胞的结合效率，致使其转染效率低。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基因载体系统，本发明提供的基因载体系统具有较高的转染效率。
本发明提供了一种基因载体系统，包括：pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；
所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；
所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2～100)：1；
所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5～80)：1；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
优选的，所述聚谷氨酸酯中，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为（1.5～50）：1，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比为（2～200）：1。
优选的，所述pH敏感遮蔽体系中，聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇中所含巯基和巯基乙酸所含巯基的摩尔数之和的比例为1：（2～20）；所述2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇与巯基乙酸的摩尔比为1：（0.1～10）。
优选的，所述阳离子载体与基因物质的质量比为(0.5～50)：1。
优选的，所述阳离子载体为聚乙烯亚胺,其数均分子量为500～40000。
优选的，所述pH敏感遮蔽体系中，聚乙烯亚胺具有式I线性结构或式II支化结构，
其中，a为聚合度，a≥1；b为聚合度，b≥1；c为聚合度，c≥1。
优选的，所述pH敏感遮蔽体系中，聚乙烯亚胺的数均分子量为500～25000，小分子烷胺的分子量为50～500。
本发明提供了一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤：
A）将基因物质与阳离子载体混合孵育，得到二元复合物；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA；
B）将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合，得到基因载体系统；
所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；
所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2～100)：1；
所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5～80)：1；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
优选的，所述聚谷氨酸酯中，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为（1.5～50）：1，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比为（2～200）：1。
优选的，所述混合孵育的时间为10～30分钟。
本发明提供了一种氨基酸聚合物，为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物；所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到。
优选的，所述聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇中所含巯基和巯基乙酸所含巯基的摩尔数之和的比例为1：（2～20）；所述2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇与巯基乙酸的摩尔比为1：（0.1～10）；所述γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为（1.5～50）：1；所述γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比为（2～200）：1。
与现有技术相比，本发明提供的基因载体系统包括pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质。在本发明中，所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到。由于pH敏感遮蔽体系每一个聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）的链节都会引入两个带电基团,即带正电的2-氨基乙硫醇（MEA）和带负电的巯基乙酸（MAA），因此具有pH值敏感性，在中性或偏碱性的环境中，其带有负电荷，可以有效保护阳离子载体和基因物质；在酸性环境下，其电荷翻转，表现为带正电荷，有利于其接近表面带有负电荷的细胞，从而提高基因载体系统与细胞的结合效率，提高转染效率。同时每个聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）单元引入两个可用于电荷翻转的带电基团，带电量增加，大大提高了翻转能力，有效的提高了转染效率，减少pH敏感遮蔽材料的用量，降低基因载体系统在体内或体外应用时因遮蔽体系而产生的细胞毒性。
实验结果表明，本发明所提供的基因载体系统在酸性条件下对Huh7细胞（人肝癌细胞）的转染效率与相同条件下不含pH敏感遮蔽体系的基因载体系统的转染效率进行对比，最高时转染效率能提高40倍；本发明所提供的基因载体系统在酸性条件下的转染效率相对于中性条件下，最高能提高的200余倍。同时，本发明提供的基因载体系统在搭载siRNA用于基因沉默时也有良好的表现，其沉默效率最高可达80%。进一步的，本发明所提供的基因载体系统用于体内试验时，在搭载基因物质为p-DNA时，有良好的转染效果；在搭载基因物质为VEGF-siRNA时，能够有良好的抑制肿瘤生长的效果。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
在本发明书中，所述聚乙烯亚胺可用PEI表示，小分子烷胺可用R表示，聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）可用PPLG表示，聚乙烯亚胺-聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）可用PEI-PPLG表示，小分子烷胺-聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）可用R-PPLG表示，2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇可用MEA-BOC表示，巯基乙酸可用MAA表示；所述由聚乙烯亚胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物表示为聚合物α；所述小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物表示为聚合物β。
本发明提供了一种氨基酸聚合物，为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物；所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到。当所述氨基酸聚合物是由聚乙烯亚胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物时，即为聚合物α；当所述氨基酸聚合物是由小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物时，即为聚合物β。
本发明所述氨基酸聚合物中，用于引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合的聚乙烯亚胺具有式I线性结构或式II支化结构：
其中，a、b、c均为聚合度，优选为a≥1，b≥1，c≥1；所述氨基酸聚合物中，用于引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合的聚乙烯亚胺的数均分子量优选为500～25000，更优选为600～20000。
本发明所述氨基酸聚合物中，所述由聚乙烯亚胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物α。所述聚合物α，具有式III结构：
其中，
R`为聚乙烯亚胺去除氨基以后的剩余基团；x、y、z、w均为聚合度，优选为x≥0，y≥0，z≥0，w≥0，且x+y+z+w>0。
所述聚合物α在聚合过程中，聚乙烯亚胺中的每一个伯胺基团都能作为一个引发中心引发聚合，一个伯胺引发之后就形成一个支链，由于受空间位阻等因素的影响，由每个伯胺基团引发所得的支链链长并不相同，上述支链的平均数均分子量优选为200～6000，更优选为500～5000。
本发明所述氨基酸聚合物中，所述由小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物β。所述小分子烷胺的分子量优选为50～500，更优选为60～200；本发明对小分子烷胺的其他性质没有特别限制，优选为正己胺；所述聚合物β，具有式IV结构：
其中，
R``为R去除氨基以后的剩余基团；x、y、z、w均为聚合度，优选为x≥0，y≥0，z≥0，w≥0，且x+y+z+w>0；所述聚合物β的数均分子量优选为1000～40000，更优选为2000～30000。
本发明所述氨基酸聚合物中，所述γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比优选为（1.5～50）：1，更优选为（2～40）：1；所述γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比优选为（2～200）：1，更优选为（5～150）：1；所述聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇中所含巯基和巯基乙酸所含巯基的摩尔数之和的比例优选为1：（2～20），更优选为1：（3～18）；所述2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇与巯基乙酸的摩尔比优选为1：（0.1～10），更优选为1：（0.5～8）。
本发明所述氨基酸聚合物中，当氨基酸聚合物为所述聚乙烯亚胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，聚合物即α时优选按照以下方法制备：
①所述聚乙烯亚胺和聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）的共聚物聚乙烯亚胺-聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）（PEI-PPLG）的制备方法为：将PEI与γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐(PLG-NCA)分别溶于有机溶剂，在无水无氧下混合发生聚合反应，得到聚乙烯亚胺和聚γ-丙炔基-L-谷氨酸酯(PPLG)的共聚物PEI-PPLG。上述聚合反应对溶剂没有特殊要求，优选为二甲基甲酰胺（DMF）或氯仿，更优选为二甲基甲酰胺；上述聚合反应对温度没有要求，优选为20～40℃；上述聚合反应对时间没有要求，优选为40～80h；上述聚合反应对投料比例没有要求，优选的投料比例为γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比优选为（1.5～50）：1，更优选为（2～50）：1。
②所述接枝后的聚合物（PEI-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA））的制备方法为：将PEI-PPLG溶于有机溶剂，加入2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇（MEA-BOC）与巯基乙酸（MAA），紫外照射下反应得到接枝后的聚合物（PEI-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA））。上述反应对溶剂没有特殊要求，优选为二甲基甲酰胺；上述反应对时间没有要求，优选为0.3～5h；上述反应对投料比例没有要求，优选的投料比例为PEI-PPLG中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇所含巯基和巯基乙酸所含巯基（MEA-BOC+MAA）的摩尔数之和的比例为N三键：N（MEA-BOC+MAA）=1：（2～20）。上述反应对MEA-BOC与MAA的比例没有要求，优选的MEA-BOC与MAA的投料比为MEA-BOC与MAA的摩尔比为NMEA-BOC：NMAA=1：（0.1～10）。
③所述聚合物α的制备方法为：将PEI-PPLG-g-(MEA-BOC/MAA)溶解，加酸入脱保护，之后沉降抽干，并经过透析纯化得到聚合物α。反应对溶解的溶剂没有要求，优选为氯仿或DMF，更优选为DMF；反应对所加的酸的种类没有要求，优选为三氟乙酸和盐酸；反应对温度没有要求，优选为20～40℃。透析时分子截留量优选为1000～5000。
本发明所述氨基酸聚合物中，当氨基酸聚合物为所述小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，即聚合物β时，优选按照以下方法制备：
①所述小分子烷胺和聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）的共聚物小分子烷胺-聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）（R-PPLG）的制备方法为：将R与γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐(PLG-NCA)分别溶于有机溶剂，在无水无氧下混合发生聚合反应，得到小分子烷胺和聚γ-丙炔基-L-谷氨酸酯(PPLG)的共聚物R-PPLG。所述小分子烷胺的分子量优选为50～500，更优选为60～200；本发明对小分子烷胺的其他性质没有特别限制，优选为正己胺；上述聚合反应对溶剂没有特殊要求，优选为二甲基甲酰胺（DMF）或氯仿，更优选为二甲基甲酰胺；上述聚合反应对温度没有要求，优选为20～40℃；上述聚合反应对时间没有要求，优选为40～80h；上述聚合反应对投料比例没有要求，优选的投料比例为γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比优选为（2～200）：1，更优选为（5～150）：1。
②所述接枝后的聚合物（R-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA））的制备方法为：将R-PPLG溶于有机溶剂，加入2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇（MEA-BOC）与巯基乙酸（MAA），紫外照射下反应得到接枝后的聚合物（R-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA））。上述反应对溶剂没有特殊要求，优选为二甲基甲酰胺；上述反应对时间没有要求，优选为0.3～5h；上述反应对投料比例没有要求，优选的投料比例为R-PPLG中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇所含巯基和巯基乙酸所含巯基（MEA-BOC+MAA）所含巯基的摩尔数之和的比例为N三键：N（MEA-BOC+MAA）=1：（2～20）。上述反应对MEA-BOC与MAA的比例没有要求，优选的MEA-BOC与MAA的投料比为MEA-BOC与MAA的摩尔比为NMEA-BOC：NMAA=1：（0.1～10）。
③所述聚合物β的制备方法为：将R-PPLG-g-(MEA-BOC/MAA)溶解，加酸入脱保护，之后沉降抽干，并经过透析纯化得到聚合物β。反应对溶解的溶剂没有要求，优选为氯仿或DMF，更优选为DMF；反应对所加的酸的种类没有要求，优选为三氟乙酸和盐酸；反应对温度没有要求，优选为20～40℃。透析时分子截留量优选为1000～5000。
本发明提供了一种基因载体系统，包括：pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；
所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；
所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2～100)：1；
所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5～80)：1；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
本发明所述基因载体系统，包括：pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质。
所述pH敏感遮蔽体系即为上述氨基酸聚合物，为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物；所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到。
本发明所述的pH敏感遮蔽体系，每一个聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）的链节都会引入两个带电基团,即带正电的2-氨基乙硫醇（MEA）和带负电的巯基乙酸（MAA），因此具有pH值敏感性，同时每个聚（γ-丙炔基-L-谷氨酸酯）单元引入的这两个可用于电荷翻转的带电基团，使pH敏感遮蔽体系带电量增加，大大提高了翻转能力，有效的提高了转染效率，减少pH敏感遮蔽材料的用量，降低基因载体系统在体内或体外应用时因遮蔽体系而产生的细胞毒性。
本发明所述基因载体系统中，所述阳离子载体的作用为担载基因物质，优选为聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺的数均分子量优选为500～40000，更优选为15000～30000；本发明对所述阳离子载体的来源没有特殊限制，可以由市场购买。
本发明所述基因载体系统中，所述基因载体系统中的所述基因物质优选为质粒DNA或siRNA；所述质粒DNA更优选为荧光素酶质粒DNA；所述siRNA更优选为沉默荧光素酶的Luc siRNA；本发明对所述基因物质的来源没有特殊限制，可以由市场购买。
本发明所述基因载体系统中，所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比优选为(2～100)：1，更优选为（2～60）：1；所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比优选为(5～80)：1，更优选为（5～40）：1；所述聚谷氨酸酯中，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比优选为（1.5～50）：1，更优选为（2～40）：1；所述聚谷氨酸酯中，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比优选为（2～200）：1，更优选为（5～150）：1；所述pH敏感遮蔽体系中，聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇中所含巯基和巯基乙酸所含巯基的摩尔数之和的比例优选为1：（2～20），更优选为1：（3～18）；所述2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇与巯基乙酸的摩尔比优选为1：（0.1～10），更优选为1：（0.5～8）；所述阳离子载体与基因物质的质量比为（0.5～50）：1，更优选为（2.5～20）：1。
本发明提供了一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤：
（A）将基因物质与阳离子载体混合孵育，得到二元复合物；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA；；
（B）将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合，得到基因载体系统；
所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；
所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2～100)：1；
所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5～80)：1；
本发明所述基因载体系统中，首先将基因物质与阳离子载体混合孵育；所述阳离子载体的作用为担载基因物质，优选为聚乙烯亚胺;所述混合孵育的溶剂优选为水，为了混合孵育的效果更好，优选首先将基因物质与阳离子载体分别溶于水，形成水溶液后再将两者的水溶液进行混合孵育，所述基因物质水溶液的浓度优选为0.02～2mg/mL；更优选为0.05～1.5mg/mL；所述阳离子载体水溶液的浓度优选为0.02～2mg/mL；更优选为0.05～1.5mg/mL。所述混合孵育的时间优选为10～30分钟，更优选为15～25分钟。本发明对水的来源没有特殊限制，以本领域技术人员熟知的常规方法获得即可。本发明对混合孵育的方式没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规方法孵育即可。
然后将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合，得到基因载体系统；所述混合时所用的溶剂优选为水。为了保证混合均匀，优选将pH敏感遮蔽体系溶于水，形成水溶液后再与二元复合物进行混合。所述pH敏感遮蔽体系水溶液的浓度优选为0.02～2mg/mL；更优选为0.05～1.5mg/mL；所述pH敏感遮蔽体系水溶液的pH值优选为7.0～7.8，更优选为7.2～7.6；所述混合的时间优选为10～30分钟；更优选为15～25分钟；所述混合的温度优选为0～40℃，更优选为室温。本发明对水的来源没有特殊限制，以本领域技术人员熟知的常规方法获得即可。本发明对混合的方式没有特别限制，以本领域技术人员熟知的常规方法混合即可。
本发明对所述原料的来源没有特别限制，可以由市场上购买，也可以按照本领域常规的技术方法制备。
本发明所述基因载体系统的制备方法中的pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质与本发明所提供的基因载体系统中的pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质其结构、来源、比例和制备方法等条件均一致，此处不再赘述。
实验结果表明，本发明所提供的基因载体系统在酸性条件下对Huh7细胞（人肝癌细胞）的转染效率与相同条件下不含pH敏感遮蔽体系的基因载体系统的转染效率进行对比，最高时转染效率能提高40倍；本发明所提供的基因载体系统在酸性条件下的转染效率相对于中性条件下，最高能提高的200余倍。本发明提供的基因载体系统在搭载siRNA用于基因沉默时也有良好的表现，其沉默效率最高可达80%。本发明所提供的基因载体系统用于体内试验时，在搭载基因物质为p-DNA时，有良好的转染效果；在搭载基因物质为VEGF-siRNA时，能够有良好的抑制肿瘤生长的效果。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的基因载体系统及其制备方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1-8
由聚乙烯亚胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯，再与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，即聚合物α，其制备方法如下：
①PLG的制备：将20g L-谷氨酸分散于30mL的丙炔醇中，冰浴搅拌下逐滴滴加8mL的浓硫酸。反应半小时后转入28℃室温下反应12h。产物以28g的碳酸氢钠于冰水中中和，搅拌直至析出固体。过滤，干燥。优化的实验需重结晶纯化：一次水加热溶解后冷却析出，抽滤，干燥。得到γ-丙炔基-L-谷氨酸酯（PLG）。
②将7.4g的PLG及3.9g的三光气一起置于反应瓶中，将100mLTHF注入到反应瓶中，50℃下反应15分钟溶液变清，继续反应10分钟左右，停止加热，通入N2以除去反应产物HCl。通气30分钟后，以冰石油醚在烧杯中沉降，有油状液滴析出。油状物置于-20℃冰箱中静置过夜。将上层清液倒掉，保留烧杯底部粘稠状液体。加入约200mL的乙酸乙酯溶解。先后以50mL的冰水及50mL的质量分数为0.5%的碳酸氢钠溶液洗涤，以100g左右的无水硫酸镁干燥>6h,过滤保留滤液，并将滤液以真空泵抽干，得到粘稠状样品γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐（PLG-NCA）。
③称取2g的PLG-NCA，0.22g的PEI,分别溶解于DMF中。将二者在无水无氧下混合，室温下反应72h。产物以乙醚沉降，过滤抽干得PEI-PPLG。
④取200mg的PEI-PPLG溶于20mL的DMF中，加入0.877mL的MEA-BOC，0.364mL的MAA。通N2气除氧后置于石英圆底烧瓶中，紫外灯照射反应1.5小时，所得产物以冰乙醚沉降，过滤，抽干，得PEI-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA）。优选的采用截留量为3000-10000KDa的透析袋用水透析5天，每12小时换水一次，后冻干得对应产物PEI-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA）。
⑤取PEI-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA），按照样品（g）:溶剂（mL）：酸（mL）=1:20:15的比例，加入到反应瓶中，室温反应4h。产物沉降，抽干。优选的采用截留量为3000-10000Kda的透析袋用水透析5天，每12小时换水一次，经透析干燥后得到pH敏感遮蔽体系PEI-PPLG-g-（MEA/MAA）。
根据不同比例的投料比，得到系列的样品如下表：
表1：PEI-PPLG涉及的投料比及数均分子量，平均链段数均分子量
注：①该表格中的数均分子量为理论平均值，并不表示实际链段长度
②PPLG的每个重复单元数均分子量为175，平均数均分子量小于该值表示PEI上的伯胺并没有完全反应。
经筛选，当投料质量比为1:9时，所得产物能较好的在所采用的有机溶剂中溶解，为优选组。
表2：不同投料比所得的PEI-PPLG-g-（MEA/MAA）
经测试，N三键：N（MEA-BOC+MAA）（摩尔比）为1:3时能够使三键完全反应，因此选择所对应的实施例1-4做其他测试。
实施例9-16
由小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到聚谷氨酸酯，再与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，即聚合物β，其制备方法如下：
①PLG的制备：将20g L-谷氨酸分散于30mL的丙炔醇中，冰浴搅拌下逐滴滴加8mL的浓硫酸。反应半小时后转入28℃室温下反应12h。产物以28g的碳酸氢钠于冰水中中和，搅拌直至析出固体。过滤，干燥。优化的实验需重结晶纯化：一次水加热溶解后冷却析出，抽滤，干燥。得到γ-丙炔基-L-谷氨酸酯（PLG）。
②将7.4g的PLG及3.9g的三光气一起置于反应瓶中，将100mLTHF注入到反应瓶中，50℃下反应15分钟溶液变清，继续反应10分钟左右，停止加热，通入N2以除去反应产物HCl。通气30分钟后，以冰石油醚在烧杯中沉降，有油状液滴析出。油状物置于-20℃冰箱中静置过夜。将上层清液倒掉，保留烧杯底部粘稠状液体。加入约200mL的乙酸乙酯溶解。先后以50mL的冰水及50mL的质量分数为0.5%的碳酸氢钠溶液洗涤，以100g左右的无水硫酸镁干燥>6h,过滤保留滤液，并将滤液以真空泵抽干，得到粘稠状样品γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐（PLG-NCA）。
③称取2g的PLG-NCA，溶于约30mL的DMF中，搅拌下加入1.5mL1×10-4mol/L的正己胺的DMF溶液。室温搅拌下反应72h。产物以乙醚沉降，过滤抽干得R-PPLG。
④取200mg的R-PPLG溶于20mL的DMF中，加入0.303mL的MEA-BOC，0.125mL的MAA。通N2气除氧后置于石英圆底烧瓶中，紫外灯照射反应1.5小时，所得产物以冰乙醚沉降，过滤，抽干，得R-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA）。优选的采用截留量为3000-10000Kda的透析袋用水透析5天，每12小时换水一次，后冻干得对应产物R-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA）。
⑤取R-PPLG-g-（MEA-BOC/MAA），按照样品（g）:溶剂（mL）：酸（mL）=1:20:15的比例，加入到反应瓶中，室温反应4h。产物沉降，抽干。优选的采用截留量为3000-10000Kda的透析袋用水透析5天，每12小时换水一次，经透析干燥后得到pH敏感遮蔽体系R-PPLG-g-（MEA/MAA）。
同样，选取R与PLG-NCA投料质量比为1:9时，作为优选组。
表3：不同投料比所得的R-PPLG-g-（MEA/MAA）
经测试，N三键：N（MEA-BOC+MAA）（摩尔比）为1:3时能够使三键完全反应，因此选择所对应的实施例9-12做其他测试。
实施例17-80
pH敏感基因转染载体系统粒径和电位的表征
分别取实施例1-4制备的PEI-PPLG-g-（MEA/MAA）和9-12制备的R-PPLG-g-（MEA/MAA）加二次水溶解，配置浓度为0.02-2mg/mL的水溶液，调节pH值至7.4，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。取数均分子量为25k的聚乙烯亚胺（PEI）,加二次水溶解，配置浓度为0.02-2mg/mL的水溶液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌、待用。取质粒pGL-3，用二次水溶解配置成浓度为0.02mg/mL的水溶液;取Luc siRNA，用二次水溶解配置成浓度为0.02mg/mL的水溶液。
将1mg/mL PEI25K的水溶液和浓度为0.02mg/mL质粒pGL-3的水溶液混合，此时PEI与质粒pGL-3的质量比为2.5:1。混合后的水溶液在室温下孵育20分钟，得到二元复合物。分别加入实施例1-4及9-12配制的水溶液，混合30分钟得到基因载体系统。
将1mg/mL PEI25K的水溶液和浓度为0.02mg/mLLuc siRNA的水溶液混合，此时PEI与质粒pGL-3的质量比为2.5:1。混合后的水溶液在室温下孵育20分钟，得到二元复合物。分别加入实施例1-4及9-12配制的水溶液，混合30分钟得到基因载体系统。
比较例1
将聚乙烯亚胺PEI25k溶于二次水中，得到浓度为0.1mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液，用孔径为0.45μm的微孔膜过滤除菌；
将质粒pGL-3溶于二次水中，得到浓度为0.02mg/mL的水溶液；
取所述聚乙烯亚胺水溶液与质粒水溶液混合，使PEI25k与pGL-3的质量比为2.5:1，混合孵育10分钟，得到基因载体系统。
比较例2
将聚乙烯亚胺PEI25k溶于二次水中，得到浓度为0.1mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液，用孔径为0.45μm的微孔膜过滤除菌；
将Luc siRNA溶于二次水中，得到浓度为0.02mg/mL的水溶液。
取所述聚乙烯亚胺水溶液与质粒水溶液混合，使PEI25k与LucsiRNA的质量比为2.5:1，混合孵育10分钟，得到基因载体系统
比较例3
将聚乙烯亚胺PEI25k溶于二次水中，得到浓度为0.1mg/mL的聚乙烯亚胺水溶液，用孔径为0.45μm的微孔膜过滤除菌；
将阴性对照Rev siRNA溶于二次水中，得到浓度为0.02mg/mL的水溶液。
取所述聚乙烯亚胺水溶液与质粒水溶液混合，使PEI25k与阴性对照Rev siRNA的质量比为2.5:1，混合孵育10分钟，得到基因载体系统。
表4不同原料、比例及载DNA的基因转染复合体系粒径和表面电位
表5不同原料、比例及载RNA的基因转染复合体系粒径和表面电位
数据显示，所述载体系统在正常pH值（pH=7.4）时，当pH敏感遮蔽材料的引入能够有效的降低体系的正电荷，而在低pH值（小于6.8）下则能很好的实现反转而使载体系统所带电荷翻转为正电。
实施例81
载DNA转染效率测试
(1)Huh7细胞的培养
细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中连续培养24小时。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔（DMEM）培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80-90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次后，将培养液更换为pH值分别为7.4和6.8的无血清培养液.将基因转染复合系统及比较例1加入到96孔板中,调培养基至终体积200μL/孔.转染后2小时弃除全部培养液，更换为含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基。继续培养至48小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率。
表6实施例17-48及比较例在不同pH时所对应的转染效率
实施例82
介导沉默荧光素酶的Luc siRNA和阴性对照Rev siRNA对恒定表达荧光素酶的Huh7细胞（人肝癌细胞）的体外转染
(1)Huh7细胞的培养
细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的培养液中，在37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中连续培养24小时。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔（DMEM）培养基稀释，按每孔1×104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37℃含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80-90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次后，将培养液更换为pH值分别为7.4和6.8的无血清培养液.将基因转染复合系统及比较例2,3加入到96孔板中,调培养基至终体积200μL/孔.转染后2小时弃除全部培养液，更换为含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基。继续培养至48小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，用PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率。
表7实施例49-80及比较例在不同pH时所对应的转染抑制效率
实验显示：酸性条件下本基因载体对转染的抑制效率较高，其中PEI-PPLG-g-（MEA/MAA）系列最高可达82%，R-PPLG-g-（MEA/MAA）系列最高可达76%。
实施例83
模拟体内环境的载DNA体外转染
(1)Huh7细胞的培养
取Huh7细胞在含有质量体积百分数为10%的小牛血清的培养液中，5%CO2、37℃孵箱中连续培养24小时。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期Huh7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔培养板，置于5%CO2、37℃孵箱中继续培养至80～90%融合。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，分别加比较例1及实施例19,23,27,31,35,39,43,47制备的基因载体系统以及含有10%热灭胎牛血清）（FBS）的DMEM培养基至终体200μL，向每孔200μl培养液中分别添加5μg、10μg、20μg、40μg、80μg的硫酸葡聚糖（Dextran sulfate），继续培养48小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。表9为基因载体系统的转染效率。
表8本发明实施例和比较例提供的基因载体系统的体外转染效率
实验证明，所述的pH敏感遮蔽材料可以有效的增强基因载体在体内的稳定性，保证所制备的pH敏感基因转染遮蔽系统保持较高的转染效率。
实施例84
模拟体内环境的载RNA的体外转染
(1)Huh7细胞的培养
取Huh7细胞在含有质量体积百分数为10%的小牛血清的培养液中，5%CO2、37℃孵箱中连续培养24小时。
(2)体外转染
转染前24小时内，取对数生长期Huh7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔培养板，置于5%CO2、37℃孵箱中继续培养至80～90%融合。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用PBS洗涤两次后，分别加入实施例51、55、59、63、67、71、75、79比较例2和比较例3制备的基因载体系统以及含有10%热灭胎牛血清）（FBS）的DMEM培养基至终体200μL，向每孔200μl培养液中分别添加5μg、10μg、20μg、40μg、80μg的硫酸葡聚糖（Dextran sulfate），继续培养48小时。
(3)体外转染效率的测定
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，然后加入荧光素底物，用光度计测定转染效率。
表9基因载体系统的转染抑制效率
实验证明，所述的pH敏感遮蔽材料可以有效的增强基因载体在体内的稳定性，保证所制备的pH敏感基因转染遮蔽系统保持较高的转染抑制效率。
实施例85
敏感体系基因载体系统在体内pDNA转染中的应用
(1)CT26细胞培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10%（质量/体积百分数）的牛血清的培养液中，在含5%（体积百分数）CO2、温度为37℃的孵箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103离心5min，PBS洗涤三次后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，10天后，瘤径长大至10mm时进行体内转染。
(3)体内转染
基因组转染的复合物颗粒在含有5%（质量/体积百分数）的葡萄糖溶液中至终体积0.2mL，尾静脉注射。分别注射比较例1及实施例19,23,27,31,35,39,43,47对应样品。
(4)体内转染效率的测定
体内转染48h后，处死小鼠，取出肿瘤，PBS洗涤2次，加入裂解液裂解，匀浆，然后加入荧光素底物，测定转染效率。
表10pH敏感体系基因载体系统介导荧光素酶质粒体内转染效率
| 实施例 | 转染效率，RLU/mg Protein |
| 比较例1 | 1.3×107 |
| 19 | 3.6×107 |
| 23 | 4.5×107 |
| 27 | 9.2×107 |
| 31 | 8.6×107 |
| 35 | 4.3×107 |
| 39 | 3.2×107 |
| 43 | 6.7×107 |
| 47 | 8.1×107 |
实验证明，所述的pH敏感遮蔽材料可以有效的增强基因载体在体内的稳定性，保证所制备的pH敏感基因转染遮蔽系统保持较高的转染抑制效率。
实施例86
pH敏感体系基因载体系统在体内siRNA转染中的应用
(1)CT26细胞的培养
取小鼠结肠癌CT26细胞，在含有10%（质量/体积百分数）的牛血清的培养液中，在含5%（体积百分数）CO2、温度为37℃的孵箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买重量在20g的Balb/C小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的CT26细胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103转/min离心5min，PBS洗涤三次后，用PBS重悬细胞，按每只小鼠2×106细胞的密度接种于腋下，8天后，瘤径长大至7mm时进行体内siRNA的转染。
(3)体内转染
基因物质选用沉默血管内皮生长因子的VEGFsiRNA，通过抑制VEGF的表达实现抑制肿瘤生长的目的，基因组转染的复合物颗粒在含有5%（质量/体积百分数）的葡萄糖溶液中至终体积50μL，尾静脉注射给药。分别注射比较例2,3及实施例51、55、59、63、67、71、75、79及比较组单纯5%葡萄糖液和单纯的VEGFsiRNA。
(4)体内肿瘤生长的测定
从第一次给药开始测量瘤径大小，实验共14天。
表11pH敏感体系基因载体系统介导VEGFsiRNA体内转染效率，瘤径大小
实验证明，所述的pH敏感遮蔽材料可以有效的介导治疗性siRNA的体内传递，保证所制备的pH敏感基因转染遮蔽系统保持较高的转染抑制效率，对肿瘤细胞有明显的抑制效果。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (12)
1.一种基因载体系统，包括：pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；
所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；
所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2～100)：1；
所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5～80)：1；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
2.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为（1.5～50）：1，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比为（2～200）：1。
3.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述pH敏感遮蔽体系中，聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇中所含巯基和巯基乙酸所含巯基的摩尔数之和的比例为1：（2～20）；所述2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇与巯基乙酸的摩尔比为1：（0.1～10）。
4.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述阳离子载体与基因物质的质量比为(0.5～50)：1。
5.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述阳离子载体为聚乙烯亚胺，其数均分子量为500～40000。
6.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述pH敏感遮蔽体系中，聚乙烯亚胺具有式I线性结构或式II支化结构，
其中，a为聚合度，a≥1；b为聚合度，b≥1；c为聚合度，c≥1。
7.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述pH敏感遮蔽体系中，聚乙烯亚胺的数均分子量为500～25000，小分子烷胺的分子量为50～500。
8.一种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤：
A）将基因物质与阳离子载体混合孵育，得到二元复合物；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA；
B）将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合，得到基因载体系统；
所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；
所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2～100)：1；
所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5～80)：1；
所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为（1.5～50）：1，γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比为（2～200）：1。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述混合孵育的时间为10～30分钟。
11.一种氨基酸聚合物，为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物；所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到。
12.根据权利要求11所述的氨基酸聚合物，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇中所含巯基和巯基乙酸所含巯基的摩尔数之和的比例为1：（2～20）；所述2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇与巯基乙酸的摩尔比为1：（0.1～10）；所述γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为（1.5～50）：1；所述γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比为（2～200）：1。
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| CN102816795A (zh) * | 2012-08-28 | 2012-12-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种基因载体系统及其制备方法 |
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2013
- 2013-09-25 CN CN201310442744.4A patent/CN103497961B/zh active Active
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