CN108553650A - 一种仿生纳米红细胞基因载体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种仿生纳米红细胞基因载体及其制备方法与应用。所述的仿生纳米红细胞基因载体，包括红细胞膜和包覆于红细胞膜中的可电荷反转的内核。本发明还提供了该仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，通过酰胺反应合成可电荷反转的基因载体；再通过挤压法将可电荷反转的基因载体内核包覆于红细胞膜中。本发明首次运用生物膜包裹治疗基因用于疾病治疗，不仅可以保证内核的负电性，成功被红细胞膜包裹，实现了基因药物在体内的长循环，并在病灶微环境下可实现电荷反转从而释放核酸药物。同时该基因载体无细胞毒性，并可在体内完成无毒化的代谢，为基因治疗提供了一类全新的安全、高效的基因载体，具有广阔的应用前景。

Description

一种仿生纳米红细胞基因载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种仿生纳米红细胞基因载体及其制备方法与应用。

背景技术

基因治疗作为一种能治疗遗传疾病、恶性肿瘤、病毒感染以及神经性疾病的潜在治疗方法得到了广泛的研究[1]。在基因治疗中，基因载体能否有效地引导和控制基因被病灶细胞内吞与表达是临床应用的关键。相比病毒型基因载体，非病毒型基因载体有着相对较高的生物相容性和较低的免疫原性，载基因能力强，易于制备修饰等优点，但普遍存在的血液循环时间短、细胞毒性与转染效率较低等问题。目前报道较多的非病毒型基因载体有阳离子脂质体，壳聚糖，聚乙烯亚胺(PEI)，聚赖氨酸(PLL)，多胺树枝状大分子(PAMAM)等。这些阳离子基因载体容易在血液中吸附蛋白，血液相容性有待改善，易被免疫细胞较快地捕获清除，这使得达到靶细胞的纳米粒的量极少，导致体内转染时效率低，限制了其治疗效果和临床应用。

Zhang[2]首次报道了红细胞膜包裹PLGA聚合物核，采用红细胞仿生实现了体内长循环，更有效地转运到靶器官或组织。该报道被美国科学院院报《PNAS》收录后，生物膜隐身载体引起了研究人员的广泛关注，其优势体现在优良的生物相容性，体内免疫逃逸和长循环能力，最终能安全高效地进入靶细胞[3～5]。目前报道的载体隐身衣有红细胞膜[6]，白细胞膜[7]，血小板膜[8]，微生物膜[9]等等，其应用则主要集中在药物载体(现有的生物膜载药系统主要针对化疗药物的递送)和免疫方面的研究，以及促进细胞增殖和功能化[10]。

然而目前采用生物膜隐身的基因载体尚未见报道。其中的原因之一是由于生物膜带负电，需要包裹的内核也带负电。负电内核虽然能被生物膜完全包裹达到仿生效果，但其无法实现溶酶体逃逸并在胞浆内将基因释放；传统的阳离子基因载体为了保证稳定性和载基因效率，形成载基因复合物后均带正电，生物膜不能完全包裹，难以做到真正的隐身。要想获得生物膜包裹的仿生细胞基因载体，必须保证内核的负电性。电荷反转型载体其在血液循环中的负电性满足了生物膜包裹的条件，并且达到病灶处由于微环境的改变可将基因释放。如何得到具有生物相容性好，无免疫原性，能体内长循环和特异性靶向的基因载体已成为当前生物医学工程材料领域亟待解决的重要课题。迄今为止，肿瘤基因治疗(如siRNA治疗)缺少一类安全高效的基因载体，将细胞仿生与电荷反转理念相结合，构建红细胞仿生型纳米基因载体及其应用尚未报道。

参考文献

[1]Davis ME,Zuckerman JE,Choi CHJ,Seligson D,Tolcher A,Alabi CA,etal.Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA viatargeted nanoparticles.Nature.2010；464:1067-U140.

[2]Wang S,Huang P,Chen XY.Hierarchical Targeting Strategy forEnhanced Tumor Tissue Accumulation/Retention and CellularInternalization.Advanced Materials.2016；28:7340-64.

[3]Li JG,Yu XS,Wang Y,Yuan YY,Xiao H,Cheng D,et al.A Reduction and pHDual-Sensitive Polymeric Vector for Long-Circulating and Tumor-Targeted siRNADelivery.Advanced Materials.2014；26:8217-24.

[4]Wang Y,Xiao H,Fang J,Yu XS,Su ZW,Cheng D,et al.Construction ofnegatively charged and environment-sensitive nanomedicine for tumor-targetedefficient siRNA delivery.Chem Commun.2016；52:1194-7.

[5]Tseng SJ,Zeng YF,Deng YF,Yang PC,Liu JR,Kempson IM.Switchabledelivery of small interfering RNA using a negatively charged pH-responsivepolyethylenimine-based polyelectrolyte complex.Chem Commun.2013；49:2670-2.

[6]Lee Y,Miyata K,Oba M,Ishii T,Fukushima S,Han M,et al.Charge-conversion ternary polyplex with endosome disruption moiety:A technique forefficient and safe gene delivery.Angewandte Chemie-InternationalEdition.2008；47:5163-6.

[7]Yang XZ,Du JZ,Dou S,Mao CQ,Long HY,Wang J.Sheddable TernaryNanoparticles for Tumor Acidity-Targeted siRNA Delivery.Acs Nano.2012；6:771-81.

[8]Mizuhara T,Saha K,Moyano DF,Kim CS,Yan B,Kim YK,etal.Acylsulfonamide-Functionalized Zwitterionic Gold Nanoparticles forEnhanced Cellular Uptake at Tumor pH.Angewandte Chemie-InternationalEdition.2015；54:6567-70.

[9]Wang SJ,Teng ZG,Huang P,Liu DB,Liu Y,Tian Y,et al.ReversiblyExtracellular pH Controlled Cellular Uptake and Photothermal Therapy byPEGylated Mixed-Charge Gold Nanostars.Small.2015；11:1801-10.

[10]Hu CMJ,Zhang L,Aryal S,Cheung C,Fang RH,Zhang LF.Erythrocytemembrane-camouflaged polymeric nanoparticles as a biomimetic deliveryplatform.P Natl Acad Sci USA.2011；108:10980-5.

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种仿生纳米红细胞基因载体。

本发明的另一目的在于提供所述的仿生纳米红细胞基因载体的制备方法。通过酰胺反应合成可电荷反转的基因载体；然后通过挤压法将可电荷反转的基因载体内核包覆于红细胞膜中，制备得到仿生纳米红细胞基因载体。

本发明再一目的在于提供所述的仿生纳米红细胞基因载体在纳米医学中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种仿生纳米红细胞基因载体，包括红细胞膜和包覆于红细胞膜中的可电荷反转的内核；所述的可电荷反转的内核包括可电荷反转的基因载体与核酸药物组成的纳米复合物。该仿生纳米红细胞基因载体不仅可以保证内核的负电性，实现红细胞膜的包裹，并且在病灶微环境下可实现电荷反转从而释放核酸药物。

所述的可电荷反转的基因载体优选为阳离子化的天然蛋白。

所述的天然蛋白优选为人血清白蛋白，胶原蛋白和牛血清白蛋白中的至少一种。

所述的阳离子化优选为通过在所述的天然蛋白上接枝质子缓冲能力的结构单元实现。

所述的质子缓冲能力的结构单元优选为含仲胺和叔胺的聚醚酰亚胺(PEI)，N’N-二异丙基乙二胺(DIPEA)和壳聚糖中的至少一种；进一步优选为聚醚酰亚胺(PEI)与N’N-二异丙基乙二胺(DIPEA)的组合。

所述的仿生纳米红细胞基因载体表面还可以连接靶向分子，进一步实现靶向。

所述的靶向分子优选为RGD多肽、叶酸、整合素、转铁蛋白、新生血管靶向肽中的至少一种。

所述的仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)可电荷反转的基因载体的制备

将天然蛋白质材料和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC·HCl)溶于超纯水中进行活化反应，以活化天然蛋白质材料上的反应基团；加入具有质子缓冲能力的结构单元，调节pH，反应，超滤除杂，冷冻干燥，得到可电荷反转的基因载体；

(2)仿生纳米红细胞基因载体的制备

将步骤(1)制备得到的可电荷反转的基因载体与核酸药物混合，调节混合物的pH后进行孵育，通过静电作用形成可电荷反转的内核；加入红细胞膜，通过挤压法得到所述的仿生纳米红细胞基因载体。

步骤(1)中所述的天然蛋白质材料优选为含羧基的人血清白蛋白，胶原蛋白和牛血清白蛋白中的至少一种。

步骤(1)中所述的反应基团为羧基。

步骤(1)中所述的质子缓冲能力的结构单元指含仲胺和叔胺的聚醚酰亚胺(PEI)，N’N-二异丙基乙二胺(DIPEA)和壳聚糖中的一种或至少两种；进一步优选为聚醚酰亚胺(PEI)与N’N-二异丙基乙二胺(DIPEA)的组合。

当所述的质子缓冲能力的结构单元多于一种时，优选在每次加入所述的质子缓冲能力的结构单元前，均先通过N-羟基琥珀酰亚胺对天然蛋白质材料的反应基团进行活化。

所述的PEI优选为PEI600。

所述的天然蛋白质材料、N’N-二异丙基乙二胺与PEI600的摩尔比为1:(5～20):(6～12)；进一步优选为1:(14～18):(7～9)；更优选为1:15:8。

所述的可电荷反转的基因载体优选为同时接枝N’N-二异丙基乙二胺与PEI600的可电荷反转的基因载体。

步骤(1)中所述的调节pH指调节溶液pH值至4～6。

步骤(1)中所述的反应的条件优选为在搅拌速率300～600rpm下反应2～3h，反应温度20～30℃；进一步优选为在搅拌速率300～600rpm下反应2～3h，反应温度25～27℃；

步骤(1)中所述的超滤所使用的超滤管的截留分子量为20000～50000，离心速率3000～6000rpm；进一步优选截留分子量为30000～40000的超滤管，离心速率4000～5000rpm。

步骤(2)中所述的核酸药物为DNA、siRNA或microRNA中的至少一种。

步骤(2)中所述的可电荷反转的内核中核酸药物的含量为20～60wt.％。

步骤(2)中所述的可电荷反转的基因载体与核酸药物优选按质量比2:1配比。

步骤(2)中所述的调节pH指调节溶液pH值至5～8，孵育时间优选为20～30分钟。

步骤(2)中所述的可电荷反转的内核的粒径为100～700纳米。

当所述的仿生纳米红细胞基因载体表面还连接靶向分子时，则在步骤(2)中加入红细胞膜时同时加入所述的靶向分子，通过挤压法得到所述的仿生纳米红细胞基因载体。

所述的靶向分子优选为RGD多肽、叶酸、整合素、转铁蛋白、新生血管靶向肽中的至少一种。

步骤(2)中所述的加入的红细胞膜与所述的可电荷反转的内核的质量比优选为0.1～0.3，更优选为0.15～0.25。

步骤(2)中所述的挤压法的具体操作为：将混合物反复挤压通过聚碳酸酯多孔膜。

所述的反复挤压的次数优选为5～20次；进一步优选为10～15次。

所述的挤压优选通过挤出机实现；所述的挤出机优选为Avanti mini挤出机。

所述的聚碳酸酯多孔膜的孔径为100～400纳米；优选孔径为200～300纳米的聚碳酸酯多孔膜。

所述的仿生纳米红细胞基因载体在纳米医学中的应用。

所述的应用优选为所述的仿生纳米红细胞基因载体作为载体材料或制备靶向药物中的应用。

本发明首次将细胞仿生与电荷反转理念相结合，成功构建红细胞仿生型纳米基因载体。该仿生纳米红细胞基因载体利用接枝在天然蛋白质材料上的叔胺、仲胺基团在低pH下结合H⁺，表现出正电性，从而实现电荷反转；通过阳离子化的天然蛋白与基因形成复合物即可实现电荷反转，而无需再引入第三组分。该基因载体接枝了两种阳离子基团，其中一种的作用为通过静电作用与基因紧密结合，另一种的作用为在低pH下结合H⁺实现电荷反转。同时，利用红细胞包裹可电荷反转的基因载体内核实现了基因药物在体内长循环，并在病灶处将基因药物释放。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)首次运用生物膜包裹治疗基因用于疾病治疗，并成功解决了现有技术中基因载体很难实现长循环的技术难题。

(2)该基因载体粒径200纳米左右，可通过电荷反转将治疗基因释放，从而达到治疗效果。

(3)该基因载体在细胞毒性实验没有表现出毒性。

(4)该基因载体还可以进一步接枝如RGD等特异性靶向分子，实现病灶靶向，因此能被黑色素瘤细胞大量摄取。

(5)巨噬细胞对该基因载体的摄取明显减少。

(6)该基因载体使用内源性物质构建，自身可在体内完成无毒化的代谢，因此可通静脉注射用于多种疾病的基因治疗，为基因治疗提供了一类全新的安全、高效的基因载体。

(7)本发明材料成分简单、原料易得、生物相容性好，特异性靶向病灶为其在制备生物医药工程材料的应用提供支持，有望在生物医学工程材料领域得到广泛应用。

附图说明

图1是实施例2中阳离子化牛血清蛋白(cBSA)的高分辨质谱图。

图2是实施例3中cBSA与siRNA纳米复合物的粒径和电位结果分析图。

图3是实施例5中不同质量比的cBSA与siRNA纳米复合物的琼脂糖凝胶电泳图。

图4是实施例7中不同浓度的cBSA对黑色素瘤细胞毒性结果分析图。

图5是实施例8中仿生纳米红细胞基因载体的体外细胞摄取结果分析图；依次为质量比为0.5、2、5的cBSA-siRNA纳米复合物，RBC-RP表示仿生纳米红细胞基因载体，RGD-RBC-RP是RGD靶向的仿生纳米红细胞基因载体。

图6是实施例9中仿生纳米红细胞基因载体的免疫原性试验结果分析图；依次为质量比为0.5、2、5的cBSA-siRNA纳米复合物，RBC-RP表示仿生纳米红细胞基因载体，RGD-RBC-RP是RGD靶向的仿生纳米红细胞基因载体。

图7是实施例10中黑色素瘤细胞凋亡实验结果分析图。

图8是实施例11中VEGF蛋白的表达量结果分析图；依次为质量比为0.5、2、5的cBSA-siRNA纳米复合物，RBC-RP表示仿生纳米红细胞基因载体，RGD-RBC-RP是RGD靶向的仿生纳米红细胞基因载体。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1电荷反转型阳离子化牛血清蛋白(cBSA)的制备

称取50mg牛血清蛋白(BSA)解溶于5mL pH＝4.75的水中，得到A溶液。称取3.6mgEDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)解溶于2mL pH＝4.75的水中，将其滴加入A溶液中，得到B溶液。称取2.17mg DIPEA(N’N-二异丙基乙二胺)解溶于2mL pH＝4.75的水中，将其滴加入B溶液中，在25℃下反应2小时，得到C溶液。称取70mg EDC解溶于2mL pH＝4.75的水中，将其滴加入C溶液中，得到D溶液。称取3.6mg PEI600解溶于2mL pH＝4.75的水中，在冰水浴下将其滴加入D溶液中，在25℃下反应2小时，得到E溶液。通过加入醋酸缓冲液终止反应。将溶液超滤四次，转速4000rpm下通过截留分子量30000的超滤管除去未反应的EDC，DIPEA和PEI600。冷冻干燥，得到可电荷反转的基因载体cBSA。

所述牛血清蛋白、N’N-二异丙基乙二胺与PEI600的摩尔比为1:15:8；调节溶液pH值至4.75；反应的搅拌速率为600rpm，每次的时间为2小时，反应温度为25℃；超滤所使用的超滤管的截留分子量为30000～40000的超滤管，离心速率4000rpm。

实施例2阳离子化牛血清蛋白(cBSA)的高分辨质谱表征

将实施例1得到的接枝不同阳离子单元的阳离子化牛血清蛋白溶解于超纯水(1mg/mL)中进行高分辨质谱表征。如图1所示，BSA的最大峰值为66820Da；只接枝N’N-二异丙基乙二胺的BSA的最大峰值为68802Da；阳离子化牛血清蛋白(cBSA)(同时接枝了DIPEA和PEI600)的最大峰值为72402Da。图1结果证明该步反应成功的合成了阳离子化牛血清蛋白(cBSA)。

实施例3 cBSA-siRNA纳米复合物的制备

称取10mg cBSA溶于10mL超纯水中，将siRNA(VEGF-siRNA，购自苏州吉玛基因股份有限公司)，其序列为5’-GGAUCAAACCUCACCAAAGTTCUUUGGUGAGGUUUGAUCCTT-3’(SEQ IDNO.1)配置成1mg/mL的备用液。分别在pH值为5或7.4的环境下，制备cBSA-siRNA纳米复合物，按照设定的一系列质量比，将cBSA溶液快速加入siRNA备用液中，25℃下孵育30分钟，得到一系类在中性环境下表面电荷性质不同的纳米复合物，其中，cBSA与siRNA的质量比分别为0.5，2，5，8。

实施例4 cBSA-siRNA纳米复合物在不同pH值下的粒径和Zeta电位的测试

按照实施例3的cBSA-siRNA纳米复合物的制备方法来配制不同质量比的纳米颗粒复合物溶液，所需cBSA与siRNA的质量比分别为0.5，2，5。样品量为1mL。在室温条件下，首先预热纳米激光粒度仪20分钟，再吸取l mL纳米颗粒溶液加入微量样品池，然后将微量样品池放入粒度分析仪的测试槽中，设置测试温度为25℃，介质为水。对于纳米颗粒的粒径分布测试，每个样品测试3次，每次运行时间为2分钟，记录每个样品粒径的平均值及其多分散性。对于纳米颗粒的Zeta电位测试，每个样品测试3次，每次自动运行12次，记录每个样品Zeta电位的平均值及其迁移率。

图2结果发现：不同质量比的cBSA-siRNA纳米复合物的粒径在pH值为7.4下稳定在100～700纳米，纳米颗粒的Zeta电位分布在-20～10Mv；在pH值6.8下稳定在100～700纳米，纳米颗粒的Zeta电位分布在-20～25Mv；在pH值5下稳定在100～700纳米，纳米颗粒的Zeta电位分布在-20～30Mv；图2的结果证实，cBSA与siRNA质量比为2的纳米复合物是可电荷反转的内核。

实施例5 cBSA-siRNA纳米复合物在不同pH值下的琼脂糖凝胶电泳

称取1g琼脂糖，加入到100mL 1×TAE缓冲液中，在微波炉中加热使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至50～60℃时，加入溴化乙锭(EB)溶液，轻轻摇晃，混匀。待凝胶液冷至50℃左右时，倒入凝胶槽，凝胶厚度一般为5～8mm。在凝胶槽中放入梳子，待凝胶成形后，小心拔出梳子小心取出凝胶，放入盛有电泳缓冲液的电泳槽中。使电泳缓冲液液面高出凝胶2～3mm，等待上样。参照实施例3的方法，在不同pH值下制备不同质量比的cBSA-siRNA纳米复合物，cBSA与siRNA的质量比分别为0.5，2，5，8。用移液枪取5μL待测样品，与上样缓冲液混合均匀，小心地加入到凝胶上样孔中。打开电泳仪，电压100V，电泳30min。电泳完成后，取出凝胶，置于紫外透射仪上观察电泳结果。

结果分析：图3电泳图表明：在pH值为5的环境下，当cBSA与siRNA的质量比为2时，siRNA在电场中的迁移受到阻滞。然而在pH值为7.4的环境下，cBSA与siRNA质量比为2的纳米复合物无法包裹住siRNA和阻止其迁移。图3的结果进一步证实，cBSA与siRNA质量比为2的纳米复合物是可电荷反转的内核。

实施例6仿生纳米红细胞基因载体的制备

1.仿生纳米红细胞基因载体的制备(RBC-RP)

按照实施例3的cBSA-siRNA纳米复合物的制备方法来配制质量比为2的纳米复合物。将其称为可电荷反转内核，为了使红细胞膜包裹可电荷反向内核，将1mL含量为25μg/mL的可电荷反转内核的与0.15mg的红细胞膜混合。随后使用Avanti mini挤出机将混合物通过200纳米的聚碳酸酯多孔膜挤出11次。最后，得到仿生纳米红细胞基因载体。

2.RGD靶向的仿生纳米红细胞基因载体的制备(RGD-RBC-RP)

按照实施例3的cBSA-siRNA纳米复合物的制备方法来配制质量比为2的纳米复合物，将其称为可电荷反转内核。将1.5μg PEG化RGD(RGD为西安瑞禧生物科技有限公司c(RGDfE)[cyclic(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Glu)]，PEG化RGD的制备参照文献Fang R H,Hu C M,Chen K N,et al.Lipid-insertion enables targeting functionalization oferythrocyte membrane-cloaked nanoparticles[J].Nanoscale,2013,5(19):8884.)加入15mL浓度为10μg/mL红细胞膜，室温孵育30分钟，得到靶向红细胞膜。将1mL含量为25μg/mL的可电荷反转内核的与0.15mg的靶向红细胞膜混合。随后使用Avanti mini挤出机将混合物通过200纳米的聚碳酸酯多孔膜挤出11次。最后，得到仿生纳米红细胞基因载体。

实施例7 cBSA的细胞毒性测定

采用CCK-8法测定cBSA的细胞毒性。经过滤灭菌后将实施例1制备得到的cBSA和对比样品分子量25000的PEI，用DMEM培养基按照一定的浓度梯度(0.001、0.01、0.1、1、5、10、50、100μg/mL)稀释后，加入到融合度达80％的鼠源黑色素瘤细胞B16F10中共培养，每孔加入100μL cBSA溶液，每个浓度3个复孔。24小时后，采用CCK-8法测定材料的细胞毒性。

cBSA的细胞毒性测试结果如图4所示。在cBSA达到100g/mL时，细胞仍保持了100％左右的存活率；而对比样品则表现出明显的细胞毒性，细胞存活率有明显的浓度依赖关系。可以得出以下结论：本发明制得的cBSA在工作浓度范围内对黑色素瘤细胞没有毒性，有良好的生物相容性。

实施例8测定黑色素瘤细胞对仿生纳米红细胞基因载体的摄取

选择黑色素瘤细胞B16F10作为仿生纳米红细胞基因载体细胞摄取的模型。

选用带有绿色荧光的FAM-siRNA作为核酸药物(购自苏州吉玛基因股份有限公司)其序列信息为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ ID NO.2)。分别制得如下各组产物：

(1)cBSA-siRNA纳米复合物：按照实施例3的方法制备得到质量比分别为0.5，2，5的cBSA与siRNA纳米复合物。

(2)取部分cBSA与siRNA质量比为2的纳米复合物按照实施例6的“1.仿生纳米红细胞基因载体的制备”方法来制备的到相应的仿生纳米红细胞基因载体。

(3)取部分cBSA与siRNA质量比为2的纳米复合物按照实施例6的“2.RGD靶向的仿生纳米红细胞基因载体的制备”方法来制备的到RGD靶向仿生纳米红细胞基因载体。

(4)以PBS为对照组。

将细胞接种于24孔板中培养24小时，分别加入上述4组产物(每孔500μL)，并确保其中含有的siRNA的量都为1.5μg，分别处理4小时，最后用流式细胞仪定量评价细胞摄取效率。结果如图5所示，黑色素瘤细胞对拥有RGD靶向的仿生纳米红细胞基因载体有很高的内吞率。这说明仿生纳米红细胞基因载体有特异性靶向的功能。

实施例9测定巨噬细胞对仿生纳米红细胞基因载体的摄取

选择Raw264.7巨噬细胞(上海歌凡生物科技有限公司)作为细胞模型。将细胞种于24孔板中培养24小时，采用实施例8中的组(1)～(4)的产物分别处理4小时(分别加入上述4组产物(每孔500μL)，并确保其中含有的siRNA的量都为1.5μg)，同样以PBS作为对照组。最后用流式细胞仪定量评价巨噬细胞摄取效率。

结果如图6所示，流式细胞仪定量考察Raw264.7巨噬细胞细胞对仿生纳米红细胞基因载体的摄取明显少于对未包红细胞膜的载体的摄取。这说明红细胞膜包裹纳米粒子可以降低巨噬细胞的摄取，逃避肝脏的清除，降低了免疫原性。

实施例10仿生纳米红细胞基因载体运输VEGF-siRNA对黑色素瘤细胞(B16-F10)凋亡的影响

选择VEGF-siRNA(即实施例3的siRNA)作为核酸药物。分别制得如下各组产物：

(1)按照实施例3的方法制备得到cBSA与siRNA的质量比为2的cBSA-siRNA纳米复合物。

(2)利用组(1)的cBSA-siRNA纳米复合物，按照实施例6的“1.仿生纳米红细胞基因载体的制备”方法制备的到相应的仿生纳米红细胞基因载体。

(3)利用组(1)的cBSA-siRNA纳米复合物，按照实施例6的“2.RGD靶向的仿生纳米红细胞基因载体的制备”方法来制备的到RGD靶向仿生纳米红细胞基因载体。

(4)NC组：其中的核酸药物为没有任何功能的siRNA，按照实施例3的方法制备得到质量比为2的相应cBSA-siRNA纳米复合物，按照实施例6的“1.仿生纳米红细胞基因载体的制备”方法制备的到相应的仿生纳米红细胞基因载体。

将细胞接种在24孔板中培养24小时，然后分别与上述4组产物共培养24小时(分别加入上述4组产物(每孔500μL)，并确保其中含有的siRNA的量都为1.5μg)。以PBS为对照组，然后将细胞用胰蛋白酶消化，收集并重悬于凋亡结合缓冲液中。之后加入5μL的碘化丙啶和10μL的FITC-磷脂结合蛋白，并避光孵育15分钟。最后使用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

结果如图7所示，载有癌症治疗基因VEGF-siRNA的仿生纳米红细胞基因载体能引起黑色素瘤细胞的凋亡，克服了VEGF-siRNA本身特别容易降解、凋亡效果不好的问题，体现本发明的仿生纳米红细胞基因载体在治疗癌症方面有很好的临床应用前景。

实施例11仿生纳米红细胞基因载体运输VEGF-siRNA对黑色素瘤细胞(B16-F10)中VEGF蛋白的影响

选择VEGF-siRNA作为核酸药物。

制得如下各组产物：

按照实施例3的方法制备cBSA与VEGF-siRNA质量比分别为0.5，5的纳米复合物。

将黑色素瘤细胞分别与上述产物及实施例10中的组(1)～(3)的产物共培养24小时。之后将细胞用PBS洗涤三次，用SDS裂解缓冲液在冰上裂解30分钟使细胞裂解充分，然后通过在4℃下13000rpm离心15分钟，收集上清液。使用Bio-Rad蛋白质测定法，测定蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。然后在300mA下将蛋白转移到PVDF膜，用5％脱脂牛奶将膜封闭1小时。之后将膜与VEGF抗体(艾美捷科技有限公司货号5363-100)一起在4℃下孵育过夜。然后将膜与二抗在25℃下孵育1小时，用TBST溶液洗涤三次。之后，使用化学发光显影仪检测样品，GAPDH蛋白作为对照。实验结果图8表明，载有VEGF-siRNA的仿生纳米红细胞基因载体能很好地下调VEGF蛋白的表达。这证明仿生纳米红细胞基因载体能安全高效地将治疗基因运输到病灶处。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>暨南大学

<120>一种仿生纳米红细胞基因载体及其制备方法与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VEGF-siRNA核苷酸序列

<400> 1

ggaucaaacc ucaccaaagt tcuuugguga gguuugaucc tt 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA/RNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FAM-siRNA核苷酸序列

<400> 2

uucuccgaac gugucacgut tacgugacac guucggagaa tt 42

Claims (10)

1.一种仿生纳米红细胞基因载体，其特征在于：

包括红细胞膜和包覆于红细胞膜中的可电荷反转的内核；所述的可电荷反转的内核包括可电荷反转的基因载体与核酸药物组成的纳米复合物。

2.根据权利要求1所述的仿生纳米红细胞基因载体，其特征在于：

所述的可电荷反转的基因载体为阳离子化的天然蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的仿生纳米红细胞基因载体，其特征在于：

所述的仿生纳米红细胞基因载体表面还可以连接靶向分子。

4.权利要求1或2所述的仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)可电荷反转的基因载体的制备

将天然蛋白质材料和N-羟基琥珀酰亚胺溶于超纯水中进行活化反应，以活化天然蛋白质材料上的反应基团；加入具有质子缓冲能力的结构单元，调节pH，反应，超滤除杂，冷冻干燥，得到可电荷反转的基因载体；

(2)仿生纳米红细胞基因载体的制备

将步骤(1)制备得到的可电荷反转的基因载体与核酸药物混合，调节混合物的pH后进行孵育，通过静电作用形成可电荷反转的内核；加入红细胞膜，通过挤压法得到所述的仿生纳米红细胞基因载体。

5.根据权利要求4所述的仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的天然蛋白质材料为含羧基的人血清白蛋白，胶原蛋白和牛血清白蛋白中的至少一种；

步骤(1)中所述的质子缓冲能力的结构单元指含仲胺和叔胺的聚醚酰亚胺，N’N-二异丙基乙二胺和壳聚糖中的至少一种；

步骤(2)中所述的核酸药物为DNA、siRNA或microRNA中的至少一种；

当所述的仿生纳米红细胞基因载体表面还连接靶向分子时，则在步骤(2)中加入红细胞膜时同时加入所述的靶向分子，通过挤压法得到所述的仿生纳米红细胞基因载体。

6.根据权利要求5所述的仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，其特征在于：

所述的天然蛋白质材料为牛血清白蛋白；

所述的质子缓冲能力的结构单元为聚醚酰亚胺与N’N-二异丙基乙二胺的组合；

所述的PEI为PEI600；

所述的核酸药物为siRNA。

7.根据权利要求5所述的仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，其特征在于：

所述的天然蛋白质材料、N’N-二异丙基乙二胺与PEI600的摩尔比为1:(5～20):(6～12)；

步骤(2)中所述的可电荷反转的内核中核酸药物的含量为20～60wt.％；

步骤(2)中所述的加入的红细胞膜与所述的可电荷反转的内核的质量比为0.1～0.3。

8.根据权利要求5所述的仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，其特征在于：

所述的天然蛋白质材料、N’N-二异丙基乙二胺与PEI600的摩尔比为1:15:8；

步骤(2)中所述的可电荷反转的基因载体与核酸药物按质量比2:1配比；

步骤(2)中所述的可电荷反转的内核的粒径为100～700纳米；

所述的靶向分子为RGD多肽、叶酸、整合素、转铁蛋白、新生血管靶向肽中的至少一种。

9.根据权利要求4所述的仿生纳米红细胞基因载体的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的调节pH指调节溶液pH值至4～6；

步骤(1)中所述的反应的条件为在搅拌速率300～600rpm下反应2～3h，反应温度20～30℃；

步骤(2)中所述的调节pH指调节溶液pH值至5～8，孵育时间为20～30分钟。

10.权利要求1～3任一项所述的仿生纳米红细胞基因载体在纳米医学中的应用。