CN104356199B - 一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及其制备方法与应用 - Google Patents
一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，本发明提供了一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及其制备方法和应用。本发明所述的基因载体是由硬脂酰修饰的多肽经二硫键桥连而成的；本发明还涉及上述基因载体的制备方法，以及上述基因载体在基因治疗中的应用。本发明的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体具有转染细胞效率高且细胞毒性低的特点，为基因治疗中的基因递送提供了一种有效的手段。
Description
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及其制备方法与应用。
背景技术：
基因治疗是将基因(主要为DNA或RNA)传递到病人特定细胞中，从而促进或抑制目标蛋白的表达，达到治疗人类疾病的目的。在基因治疗实际应用过程中，由于基因片段容易被核酸酶降解，且带负电荷，分子量较大，本身很难通过带负电荷的细胞膜，这就需要利用基因载体来保护并传递基因片段进入到细胞内。基因载体既要保证高的转染效率，又要有较低的细胞毒性。因此，发展低毒高效的基因传递载体是基因治疗成功应用的重要前提。
基因载体分病毒载体和非病毒载体两大类。病毒类基因载体是将病毒中的致病基因以治疗基因替代，由于控制病毒进入细胞、胞内运输以及编码进入细胞核部分的基因还在病毒载体上，所以病毒载体的优点是靶基因表达效率高，但同时也有免疫原性、可能激活原癌基因引发肿瘤及难以大量制备等缺点，从而限制了病毒载体的临床应用。非病毒基因载体的优势在于免疫原性弱，制备方便，对基因材料的要求限制少。非病毒基因载体分为聚合物和脂质体两大类，前者有聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖(CS)、聚氨基酸(PAA)、树枝状大分子(PAMAM)、多肽等，后者有阳离子脂质体、DNA脂质涂层复合物、类脂质体等。
多肽类载体主要是指细胞穿透肽(CPP)，由于容易制备，毒性低，同时还具有穿透细胞膜的特性，近年来受到了很大的关注。细胞穿透肽能够与基因片段形成载体/基因复合物，从而有效地引导基因片段进入细胞，研究发现细胞穿透肽中的带正电的氨基酸如精氨酸在引导基因片段进入细胞中发挥了主要作用(van Asbeck AH,Beyerle A,McNeill H,Bovee-Geurts PH,Lindberg S,Verdurmen WP,et al.Molecular parameters of siRNA--cell penetrating peptide nanocomplexes for efficient cellular delivery.ACSnano.2013；7:3797-807.)。
载体/基因复合物通过内吞作用进入细胞后首先富集在内吞体中，之后内吞体与溶酶体融合，基因片段进入溶酶体，在溶酶体中降解。因此基因片段必须从内吞体和溶酶体中释放，进入到细胞质中才能够发挥作用。研究发现组氨酸具有“质子海绵”作用，可以在内吞体和溶酶体中溶液的PH降低时与氢离子结合，从而阻止内吞体中溶液的PH值下降，引起Cl-内流，导致内吞体和溶酶体渗透性肿胀，最后内吞体和溶酶体破裂从而将基因片段释放到细胞质中。
硬脂酰基是一种亲脂性基团，与细胞膜脂质双分子层有很高的亲和力，利用硬脂酰修饰基因载体可以增加载体与细胞膜的亲和力，从而提高载体引导基因片段进入细胞的能力。
基于上述理论，本发明提供了一种富含精氨酸和组氨酸并修饰有硬脂酰基团的可降解多肽基因载体，克服了当前多肽类载体还存在引导基因片段进入细胞的能力不强、基因转染效率不高、不可降解的缺陷。
目前尚无有关硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的文献报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种可生物降解的，且引导基因片段进入细胞的能力强、基因转染效率高的多肽类基因载体；本发明的另一目的是提供该多肽类基因载体的制备方法；本发明的第三目的是提供该多肽类基因载体在制备基因治疗药物中的应用。
本发明所要解决的主要技术问题是：如何提高多肽类基因载体引导基因片段进入细胞的能力，以及如何提高多肽类基因载体所载基因的转染效率，同时保证材料具有可生物降解特性。
本发明基于：一是细胞膜由磷脂双分子层构成，基因载体经亲脂性基团硬脂酰基修饰后可以增加与细胞膜亲和力，从而增加基因载体引导基因片段进入细胞的能力。二是同一类基因载体的转染效率和细胞毒性往往与分子量有关，一般来说多肽载体分子量较低，基因转染效率比较低，将多肽载体聚合起来，可以增加分子量载体的基因转染效率，但同时也可能会增加载体的细胞毒性。由于细胞内富含谷胱甘肽，细胞内的内质网中也含有二硫键异构酶，这两种物质都能够迅速的将二硫键打开，多肽载体经过二硫键桥连聚合后，可以在不增加细胞毒性的情况下，增加基因转染效率。
本发明设计了一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，由精氨酸、组氨酸、硬脂酰基和半胱氨酸组成的多肽，精氨酸带正电可以与带负电的基因片段结合并具有穿膜作用，组氨酸可以促进基因片段进入细胞后迅速的释放到细胞质中，硬脂酰基可以增加载体与细胞膜的亲和力，半胱氨酸的巯基氧化形成二硫键，从而使多肽聚合起来，形成高分子的聚合物。
本发明的第一个方面，是提供了一种硬脂酰修饰的多肽，所述的多肽的氨基酸序列如下所示：
HHHCRRRRRC(SEQ ID NO:1)；氨基酸之间以肽键相连，多肽可简写为H3CR5C，缩写为HR；
所述的硬脂酰修饰，是指硬脂酰基与组氨酸的氨基以酰胺键连接。
本发明所述的硬脂酰基修饰的多肽可以简写为：stearyl-H3CR5C，可简写为SHR，其中stearyl-为硬脂酰基，H为组氨酸，C为半胱氨酸，R为精氨酸，stearyl-H3CR5C缩写为SHR。
进一步地，本发明提供了一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，所述的基因载体为上述的硬脂酰修饰的多肽的聚合物，所述的聚合物的化学结构式如式(Ⅰ)所示，其中的n为≥3的整数：
所述的硬脂酰修饰的多肽的通过半胱氨酸经二硫键连接形成聚合物。
本发明的H组氨酸，C半胱氨酸，R精氨酸组成10肽，氨基酸之间以肽键连接，英文缩写为HR；在10肽的N端，硬脂酰基与氨基以酰胺键连接，硬脂酰基修饰的多肽英文缩写为SHR；半胱氨酸的巯基之间经过氧化后以二硫键连接，形成聚合物，聚合物的英文缩写为SHRss。
本发明所述的一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，聚合物的分子量优选为5000-50000Da，该分子量之外的聚合物不适宜，会降低基因载体材料的转染效率；最优为10000-30000Da。
本发明的第二个方面，是提供了上述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
(A)硬脂酰修饰的多肽的合成：合成stearyl-H3CR5C；
(B)硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备：将步骤(A)合成的硬脂酰修饰的多肽溶于水，加入半胱氨酸盐酸盐，使stearyl-H3CR5C与半胱氨酸的摩尔比在2.5-15:1之间，调节溶液的pH为7-8之间；在搅拌下加入过氧化氢H2O2，至过氧化氢的终浓度为0.02％-0.5％，搅拌反应6-24小时。
在本发明的一个优选实施例中，步骤(B)具体为：取硬脂酰基修饰的多肽SHR与半胱氨酸盐酸盐溶解在水中，使得SHR与半胱氨酸盐酸盐的摩尔比在2.5-15:1之间，加入氢氧化钠溶液将pH调节至7.0，在搅拌下向溶液中加入H2O2，至过氧化氢的终浓度为0.02％-0.5％，搅拌反应6-24小时，反应温度为室温。
反应后的溶液移入截留分子量为1000的透析袋中，透析液为蒸馏水，透析6小时。
为维持基因载体材料较高的活性，将透析后的溶液低温冻干，并保持在-20℃，冻干后的基因载体材料复溶后可在4℃以下长期保持活性。
本发明的第三个方面，是提供了上述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体在制备基因治疗药物中的应用。
所述的应用，是指基因载体中的精氨酸带正电可以与带负电的基因进行结合。
所述的应用，优选为本发明的基因载体与RNA形成的复合物。
所述的RNA，为小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA)。
进一步地，本发明还提供了硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体在制备基因治疗药物中的应用，所述的应用具体为：
将可基因载体与RNA混合，制得基因转染体系。
所述的基因载体与RNA的氮磷比为5:1～15:1，在这一比例范围内，所述基因载体材料能够引导RNA进入细胞内，有较高的转染效率。
所述的基因载体与RNA在缓冲液中混合，缓冲液pH为5.0～7.0，室温孵育20～60分钟，合理的pH值和孵育时间确保了基因转染体系的形成。
本发明提供的基因转染体系可加入到细胞培养体系中，在无血清或有血清的情况下，完成目的基因在细胞内的转染。
本发明提供的基因转染载体材料适用于实验所需的功能性小干扰RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)等RNA片段。
本发明优点在于：
(1)本发明的基因载体材料采用二硫键作为交联基团，所形成的的寡肽多聚物可在细胞内迅速被降解，不会在细胞内蓄积，寡肽中的精氨酸和半胱氨酸均为体内存在的氨基酸，对细胞和人体没有潜在的毒副作用，CCK-8法测试表明，制备的基因载体材料具有非常低的细胞毒性，同时又有比较高的基因转染效率，因此非常适用于体内外的基因转染研究和应用。
(2)本发明的制备方法操作简单，反应试剂和得到的产物无毒性，不会对环境产生污染，反应条件温和，反应后得到的基因载体材料纯化简便，成本低廉，并且该制备方法可以通过控制多肽与半胱氨酸的比例来控制基因载体材料的聚合度，利于大规模推广于研究和应用领域。
附图说明：
图1为SHRss2的核磁共振氢谱图；
图2为SHRss/siRNA纳米复合物的电位；
图3为SHRss/siRNA纳米复合物的粒径；
图4为载体/Cy3-siRNA复合物处理后荧光信号阳性细胞的比例；
图5为载体/Cy3-siRNA复合物与细胞孵育3小时后的激光共聚焦显微镜照片；
图6为载体/Cy3-siRNA复合物与细胞孵育24小时后的激光共聚焦显微镜照片；
图7为载体/siLuc对Luc-Hela中虫荧光素酶基因表达的干扰作用；
图8为载体对Hela细胞的毒性；
图9为Luc-Hela细胞裸鼠移植瘤中的虫荧光素酶的活体生物发光成像图；
图10为Luc-Hela细胞裸鼠移植瘤中的虫荧光素酶被干扰前后的表达情况。
具体实施方式：
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1：硬脂酰修饰的10肽的合成
硬脂酰修饰的10肽氨基酸序列:His His His Cys Arg Arg Arg Arg Arg Cys(SEQ ID NO:1，stearyl-H3CR5C),由上海吉尔生化有限公司采用多肽固相合成法合成并命名为SHR，利用制备高效液相色谱纯化合成的SHR，使其纯度达到95％以上。stearyl-为硬脂酰基，C为半胱氨酸，R为精氨酸，H为组氨酸，氨基酸之间以肽键连接形成10肽。
实施例2：硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体SHRss的制备
取50mg硬脂酰基修饰的多肽SHR与不同量的半胱氨酸溶解在9.5ml水中，加入氢氧化钠溶液将PH调节至7.0，在搅拌下向溶液中加入0.5ml1.0％的H2O2溶液，搅拌反应12小时，反应温度为室温(10～30℃)。半胱氨酸的量分别为：SHR与半胱氨酸的摩尔比为2.5、5.0、10.0、15.0。
如表1所示，根据SHR与半胱氨酸的比例不同，制得了不同分子量的SHRss。反应后的溶液移入截留分子量为1000的透析袋中，透析液为蒸馏水，总共透析6小时，每3小时更换一次透析液。透析后的溶液低温冻干，并保持在-20℃，冻干后的基因载体材料复溶后可在4℃以下长期保持活性。合成的载体利用核磁共振氢谱1H-NMR(600M)检测(图1)，分子量利用凝胶渗透色谱(GPC)测定。
表1 不同分子量的SHRss的合成
a由凝胶渗透色谱(GPC)测得
实施例3：SHRss载RNA纳米复合物的制备
将载体(SHRss)和干扰虫荧光素酶表达的siRNA(siLuc)分别溶于水中制得水溶液，按氮磷比(N/P)分别为1，2.5，5，7.5，10，15将两溶液混匀并漩涡震荡10秒，即得SHRss载siRNA纳米粒子。纳米复合物的平均粒径与N/P有关，在N/P＝10时得到最优粒径，粒径在190-300之间，具体见图2。纳米复合物的zeta电位随N/P的增大而升高，在N/P高于5之后稳定在0-40 mV之间，具体见图3。
实施例4：SHRss载RNA纳米复合物的入胞研究
将Hela细胞按照10万/孔接种于12孔板上，加入1ml含10％FBS(Gibco公司，美国)的DMEM培养基(Gibco，美国)培养24小时，使细胞汇合度达到70％～80％，将培养基更换为无血清DMEM培养基。将不同分子量的SHRss与Cy3荧光素标记的siRNA(Cy3-siRNA)按N/P为10:1制备成载体/siRNA复合物，将复合物溶液加入到上述12孔板的各细胞孔中，与细胞共同孵育3小时，吸去培养基，PBS缓冲液洗3遍，胰酶消化后利用流式细胞仪分析细胞对Cy3-siRNA的摄取情况。
结果如图4所示，细胞对不同分子量的SHRss与Cy3-siRNA形成的复合物均有较高的摄取，细胞显示Cy3荧光信号的阳性率均大大高于商品化转染试剂Lipofectamine 2000，也高于多肽单体SHR。
实施例5：HRss载RNA纳米粒子的细胞内分布研究
利用激光共聚焦显微镜对SHRss/Cy3-siRNA入胞后的分布情况进行研究。细胞铺板前取圆形盖玻片于75％乙醇中浸泡5分钟，无菌超净台内吹干。将盖玻片置于24孔板内，每孔种入3万个Hela细胞培养24小时，使细胞汇合度达到50％，更换培养基为无血清DMEM培养基。将分子量为15kDa的SHRss2与Cy3荧光素标记的siRNA(Cy3-siRNA)按N/P为10:1制备成载体/siRNA复合物，将复合物溶液加入到24孔板的细胞孔中，一组在孵箱中培养3小时后吸取培养基，多聚甲醛固定后DAPI染色，制备观察用玻片，另一组培养3小时后更换为正常培养基继续培养21小时，多聚甲醛固定后DAPI(sigma公司，美国)染色，制备观察用玻片。两组玻片均用激光共聚焦显微镜观察拍照。
结果如图5显示，培养3小时后SHRss组的细胞内的Cy3-siRNA(红色荧光)明显多于商品化转染试剂Lipofectamine 2000和单体SHR，并且SHRss组的Cy3-siRNA均匀地分散在细胞内，特别亮的红色小点比较少，说明载体/RNA复合物成功的从内吞体和溶酶体中释放了出来；结果如图6显示，在转染24小时后，SHRss组细胞质中仍然可以看出较亮的红色荧光，说明仍然存有较多量的Cy3-siRNA。
实施例6：SHRss载siRNA纳米粒子的体外干扰效率研究
将表达虫荧光素酶(luciferase)的Luc-Hela细胞按3万/孔接种于24孔板上，培养24 h使细胞汇合度达到50％后更换为无血清DMEM培养基。将SHRss与干扰虫荧光素酶表达的siRNA(siLuc)按氮磷比5:1、10:1、15:1制成载体/RNA复合物，加入到24孔板的细胞孔中，siLuc的终浓度为75nM，培养3h，替换为含血清培养基继续培养24h，利用生物发光法检测细胞中的虫荧光素酶表达，以商品化转染试剂Lipofectamine 2000和多肽单体SHR作为阳性对照，以对虫荧光素酶表达无影响的NC-siRNA为阴性对照。
结果如图7所示，在氮磷比为10时SHRss各组具备最高的基因表达干扰效率，这时的基因表达干扰效率高于商品化转染试剂Lipofectamine 2000和多肽单体SHR，其中分子量为15kDa的SHRss2组基因表达干扰效率最高。
实施例7：SHRss的细胞毒性研究
将Hela细胞按照1万/孔接种于96孔板上，培养24 h，使细胞汇合度达到50％。吸去培养基，每孔加入100μL含不同浓度SHRss的培养基(5，10，20，40，60，100,200μg/ml)，继续培养24h，CCK-8法检测细胞毒性，统计细胞存活率,用商品化的转染试剂BPEI(分子量25kDa)做为对照。
结果如图8所示，BPEI的细胞毒性很强，在40μg/ml时90％以上的细胞无法存活，而SHRss的细胞毒性较低，在100μg/ml时细胞存活几乎不受影响，细胞存活率大于90％，在200μg/ml时仍然有50％左右的存活，并且与单体SHR相比，SHRss的细胞毒性并没有明显增加。
实施例8：SHRss对裸鼠移植瘤细胞中基因表达的干扰作用研究
将1×107个Luc-Hela细胞与200ul培养基混合后，注射到裸鼠背部皮下，生长2周后，把移植瘤生长良好的裸鼠分成2组，按照siRNA 1.5mg/kg体重的剂量，一组经尾静脉给予SHRss2/siLuc复合物溶液，另一组给予SHRss2/NC-siRNA复合物溶液作为对照组，连续给药3天。第四天将裸鼠麻醉后，按照150 mg/kg的剂量向每只裸鼠腹腔注射D-luciferin钾盐，5分钟后利用小动物活体成像仪检测肿瘤部位的生物发光强度并拍照。之后将移植瘤取出，组织匀浆后10000 rpm离心10分钟，取上清液20ul利用生物发光法检测虫荧光素酶的表达。
结果如图9和图10所示，SHRss2/siLuc组的裸鼠移植瘤生物发光强度在给药前和给药后有差别，给药后生物发光强度明显降低，而对照组的裸鼠移植瘤生物发光强度在给药前和给药后没有明显区别。SHRss2/siLuc组和对照组肿瘤组织中的虫荧光素酶的表达量明显降低。
综合以上各实施例，可见基因载体SHRss能有效地携带siRNA片段进入靶细胞，siRNA在体内外对相关基因表达均有明显的干扰作用，并且有较低的细胞毒性，说明SHRss适合作为siRNA基因载体。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (11)
1.一种硬脂酰修饰的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸之间以肽键相连；
所述的硬脂酰修饰，是指硬脂酰基与组氨酸的氨基以酰胺键连接。
2.一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，其特征在于，所述的基因载体为如权利要求1所述的硬脂酰修饰的多肽的聚合物，所述的聚合物的化学结构式如式(Ⅰ)所示，其中的n为≥3的整数：
所述的硬脂酰修饰的多肽的通过半胱氨酸经二硫键连接形成聚合物。
3.根据权利要求2所述的一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体，其特征在于，所述的聚合物的分子量为5000-50000Da。
4.一种如权利要求2所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(A)合成如权利要求1所述的一种硬脂酰修饰的多肽；
(B)硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备：将步骤(A)合成的硬脂酰修饰的多肽溶于水，加入半胱氨酸盐酸盐，使硬脂酰修饰的多肽与半胱氨酸的摩尔比为2.5-15:1，调节溶液的pH为7-8；在搅拌下加入过氧化氢H2O2，至过氧化氢的终浓度为0.02％-0.5％，搅拌反应6-24小时。
5.根据权利要求4所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备方法，其特征在于，步骤(B)具体为：
取步骤(A)合成的硬脂酰基修饰的多肽与半胱氨酸盐酸盐溶解在水中，使得硬脂酰基修饰的多肽与半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为2.5-15:1，加入氢氧化钠溶液将pH调节至7.0，在搅拌下向溶液中加入H2O2，至过氧化氢的终浓度为0.02％-0.5％，搅拌反应6-24小时，反应温度为室温。
6.根据权利要求4或5所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备方法，其特征在于，步骤(B)反应后的溶液移入截留分子量为1000的透析袋中，透析液为蒸馏水，透析6小时。
7.根据权利要求6所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体的制备方法，其特征在于，将透析后的溶液低温冻干，并在-20℃保存。
8.一种如权利要求2所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体在制备基因治疗药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体在制备基因治疗药物中的应用，其特征在于，所述的应用是指基因载体中的精氨酸带正电与带负电的基因进行结合。
10.根据权利要求9所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体在制备基因治疗药物中的应用，其特征在于，所述的带负电的基因是RNA。
11.根据权利要求10所述的硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体在制备基因治疗药物中的应用，其特征在于，所述的应用具体为：
将可降解基因载体与RNA在缓冲液中混合，缓冲液pH为5.0～7.0，室温孵育20～60分钟，制得基因转染体系；
所述的基因载体与RNA的氮磷比为5:1～15:1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |