CN101897975B - 壳聚糖-Math1基因纳米微粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种壳聚糖和/或壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒、其制备方法及其应用，该基因纳米微粒通过将壳聚糖与含Math1基因的质粒进行复凝聚而制备。该基因纳米微粒的粒径可控、尺寸均一、利于表面修饰、可提高Math1基因的表达和递送能力，可以用于由于噪声、药物中毒等原因引起的毛细胞缺失而导致的感音神经性耳聋。

Description

壳聚糖-Math1基因纳米微粒及其制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体而言，涉及壳聚糖-Math1基因纳米微粒、其制备方法及其在治疗耳聋上的应用。 

背景技术

基因的输送通常需要载体来完成，理想的基因载体能把目的基因安全且高效地输送到特定的病变细胞或组织中，从而达到治疗的目的。目前常用的基因载体主要有病毒和脂质体两类。病毒载体如逆转录病毒、腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)、慢病毒和单纯疱疹病毒(HSV)等表达水平高，但没有特异选择性、副作用较多，如致癌性、体内野生型病毒生成、细胞病理改变等，并且能装载的基因长度有限。脂质体载体能运载更多数量的基因，但其分子量较大、不稳定、在体内易被清除、组织特异性较差、且阳离子脂质体达到一定浓度时会产生严重的细胞毒性，因而在体内使用时具有局限性。 

近年来，以非病毒材料为基因载体的基因治疗研究引起了广泛的重视，其中用阳离子聚合物和基因复合形成纳米微粒来模拟类似病毒的结构作为基因载体就是一个重要方面。纳米微粒(nanoparticle，NP)基因载体是由高分子材料合成的一种固态胶体纳米级微粒载体，其能将DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)、dsRNA(双链RNA)等基因治疗分子包裹在纳米微粒之中或吸附在纳米微粒表面，通过细胞胞吞使纳米微粒进入细胞内，经高分子材料的降解逐渐释放出基因治疗分子，从而发挥其基因治疗的效能。 

与病毒载体和阳离子脂质体相比，由于具有适宜特性的纳米微粒可以进入细胞，所以将聚合物纳米微粒用于基因载体以进行基因转导具有一些显著的优点：聚合物纳米微粒尺寸小、无毒、无抗原性、有生物相容性、表面能极高；纳米微粒具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性；纳米微粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭机体血浆或组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏；纳米微粒使核苷酸缓慢释放，有效地延长 作用时间，并维持有效的核苷酸浓度，提高转导效率和转导产物的生物利用度；纳米微粒代谢产物少、副作用少、无免疫排斥反应等；对特殊细胞受体的靶向性和副反应少；使外源基因在宿主细胞染色体DNA中整合，从而获得长期稳定的表达等。因此，纳米微粒基因载体是一种比较理想的用于基因治疗的载体(Lee，K.Y.，Kwon，I.C.，Kim，Y.H.，Jo，W.H.，& Jeong，S.Y.Preparation ofchitosan self-aggregates as a gene delivery system.Journal of Controlled Release，1998.25，340-341；Koki Wada，Hidetoshi Arima，Toshihito，“Improvement of genedelivery mediated by mannosylated dendrimer/a-cyclodextrin conjugates”，Journalof Controlled Release，2005，104397-413；Joon Sig Choi，Kihoon Nam，Jong-yeunPark，“Enhanced transfection efficiency of PAMAM dendrimer by surfacemodification with L-arginine”，Journal of Controlled Release，2004，99445-456；Henryk，Bayele，T.sakthivel，Martino’donell，Versatile Peptide Dendrimers forNucleic Acid Delivery；Journal of Pharmaceutical Sciences，2005，94，446-457)。 

大量研究表明，在一定条件下，聚阳离子可与基因在水溶液中复合形成纳米微粒。同时，可以在聚阳离子链上引入具有特殊功能的基团(如半乳糖、转铁蛋白)从而使聚阳离子/基因纳米微粒具有类似病毒的功能，如受体调节内化、进入细胞核等。聚阳离子作为基因载体在血浆的电解质环境中仍是稳定的纳米微粒，且在冷冻干燥储存过程中并不失活。

甲壳素(chitin)是地球上含量仅次于纤维素的天然聚合物，壳聚糖(chitosan)作为甲壳素的部分脱乙酰化产物，是一种由β-(1，4)糖苷键连接的D-葡聚糖胺与含量不等的N-乙酰葡聚糖无序排列的线性聚糖，它是自然界来源第二大丰富的亲水性多糖，具有生物可降解性、生物相容性、生物粘附性和促渗透作用，且几乎无毒副作用，其理化特性和生物学性质使它非常适合作为药物控释系统的载体材料(Calvo，P.，Remunan-Lopez，C.，Vila-JATO，J.L.，Alonso，M.J.Novel hydrophilic chitosan-polyethylene oxide nanoparticles asprotein carriers.Journal ofApplied Polymer Science，1997，63，125-132；Suh H，Hwang Y-S，Lee J-E，Han CD，Park J-C.Behavior of osteoblasts on a typeatelocollagen grafted ozone oxidized poly(L-lactic acid)membrane.Biomaterials，2001，22，219-230；Yan Wu，Wuli Yang，Changchun Wang，Jianhua Hu，ShoukuanFu，“Chitosan nanoparticles as a novel delivery system for ammonium glycyrrhizinate”International Journal of pharmaceutics”，2005，295，235-245；Haliza Katas，H.Oya Alpar“Development and characterisation of chitosannanoparticles for siRNA delivery”，Journal of Controlled Release，115(2006)216-225)。 

壳聚糖含有大量的阳离子，当它与某些带负电荷的阴离子化合物、生物大分子等在水相条件下相遇时，壳聚糖分子压缩并包裹带负电荷的物质，形成疏水颗粒并生成纳米微粒悬浮液(Aspden T J，Mason J D，Jones N S，et al.J PharmSci，1997，86(4)，509-513)；壳聚糖能特异性地黏附于黏膜表面，因而可用于靶向黏膜的药物传递系统中，此外，壳聚糖还能打开上皮细胞间紧密的连接，携所运载的药物穿过组织严密的上皮层(Mao Hai-quan，Krishnendu R，Troung V L等人，J Control Rel，2001，399-421)。研究表明，壳聚糖由于毒性较低且生物相容性良好，而逐渐被用作基因的非病毒载体。一方面，壳聚糖与DNA间通过静电作用等而复合，从而增加DNA的稳定性；另一方面，壳聚糖在增强与细胞膜的作用及保护DNA不被溶酶体降解等方面起着重要作用。壳聚糖作为基因载体材料的制备比较方便，壳聚糖/基因纳米微粒可以保护部分目的基因不被核酸酶降解，并可通过内吞作用进入靶细胞(Mohamed M.Issa，Magnus 

Kristoffer 

等人，“Targeted gene delivery withtrisaccharide-substituted chitosan oligomers in vitro and after lung administrationin vivo”，Journal of Controlled Release 115(2006)103-112；Mi-Kyung Lee，Soo-Kyung Chun，Woo-Jeong Choi，“The use of chitosan as a condensing agent toenhance emulsion mediated gene transfer”，Biomaterials，2005，26，2147-2156；Tina Kiang，Jie Wen，Huay Wen Lim，“The effect of the degree of chitosandeacetylation on the efficiency of gene transfection”，Biomaterials，2004，25，5293-5301；Tae Hee Kima，Jong Eun Ihma，Yun Jaie Choia等人，“Efficient genedelivery by urocanic acid-modified chitosan”，Journal of Controlled Release，2003，93，389-402)。在体内生物酶的作用下，壳聚糖可降解为小分子物质，最后分解为水和二氧化碳，避免了载体材料的体内蓄积。聚乳酸(PLA)、聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)已经被美国FDA批准用作临床药物的辅助材料，它们作为化疗和基因药物载体展现出良好的临床应用前景。为了更好地提高转染率，需要开发出壳聚糖/基因纳米微粒。 

季铵化的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖是壳聚糖的水溶性衍生物，其阳离子化程度更强，与黏膜的黏附性更强，同时能更好地增强黏膜通透性(Kotze AF，Thanou MM，Lueben HL，Boer BG，Verhoef JC，Junginger HE.EuJ Pharm Biopharm，1999，47：269-274)。此外，由于它是水溶性的壳聚糖，可以增强药物的吸收率。 

耳蜗是人类感受外界声音刺激的唯一器官，同时也是一种高度分化的功能特化器官，其内部的毛细胞是感受声音振动的机械-电感受器，对维持听觉及平衡觉有重要作用。任何原因导致的内耳毛细胞的变性、坏死均可引起听觉和平衡功能障碍。传统观点认为鸟类及哺乳类动物的耳蜗毛细胞在胚胎期完成分化，且不能自发再生，一旦发生由于耳蜗毛细胞损失而导致的耳聋就很难自然恢复听力，必须通过人为的治疗才有可能恢复，而这一直是个世界性的难题。近年来有研究表明，耳毒性药物和噪声损伤哺乳动物内耳毛细胞后，毛细胞可以经诱导再生。许多生长因子在毛细胞再生中起重要作用，如转化生长因子(TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等等。 

Math1(Mammalian atonal homolog 1)是一种碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)基因，其是果蝇Atoh1基因的小鼠同源基因。Mathl基因全长1.18kb，含一个外显子，mRNA长1065bp，编码由354个氨基酸组成的蛋白，即转录因子Math1，分子量为38.2kDa。Math1基因是毛细胞分化成熟的必需基因，在毛细胞再生过程中有重要作用(Bermingham NA，Hassan BA，Price SD等人，Math1：anessential gene for the generation of inner ear hair cells.Science，1999，284：1837-1841)。Gao等人发现Math1基因过表达可以使大上皮嵴区的细胞转化为具有毛细胞表型的细胞，这些细胞表达肌球蛋白VIIa(毛细胞的标记抗体)(Overexpression of Math1 induce robust production of extra hair cells in postnatalrat inner ears.Nat Neurosci，2000，3：580-586)。最新的研究证明该基因的过表达可使庆大霉素致聋的成年豚鼠毛细胞再生并伴有听功能的部分恢复(Izumikawa M，Minoda R，Kawamoto K等人，Auditory hair cell replacement andhearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals.Nat Med，2005，11：271-276)。 

目前，主要利用病毒载体在动物体内进行内耳毛细胞再生的研究，但由于 病毒载体的局限性，使得毛细胞再生无法应用于临床。纳米微粒作为一种新型基因载体，以其无免疫原性，低毒、装载容量大、制备容易且结构稳定、利于改造和修饰等优势，更有利于毛细胞再生的进一步研究及临床应用。 

目前，纳米微粒基因载体的内耳导入途径主要是鼓阶打孔和圆窗膜注射，通过直接注射和微渗透泵将该载体导入外淋巴液。这两种方式虽有效，但都是侵袭性操作，破坏耳蜗鼓阶，存在诱发炎症、外淋巴漏、损坏听力的危险。由于圆窗膜具有半透膜的特性：分泌和吸收功能，而纳米微粒基因载体具有靶向性和通透性，作为一种新技术，有望实现圆窗膜跨膜导入。 

然而，至今未见壳聚糖-Math1基因纳米微粒的制备以及用壳聚糖-Math1基因纳米微粒转染体外培养细胞并且表达Math1基因的报导。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种壳聚糖-Math1基因纳米微粒，实现基因的递送。 

根据本发明的一方面，该壳聚糖-Math1基因纳米微粒包括壳聚糖和如图4所示的质粒，其粒径为100-250nm，分散指数为0.15-0.26，zeta电位约为20-40mV，包封率为90-95％。该壳聚糖-Math1基因纳米微粒的粒径可控、尺寸均一、利于表面修饰、可提高Math1基因的表达和递送能力。 

本发明的另一目的在于提供一种壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒，实现基因的递送。 

根据本发明的一方面，该壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒，包括壳聚糖衍生物和如图4所示的质粒，其粒径为100-250nm，分散指数为0.15-0.26，zeta电位约为20-40mV，包封率为90-95％。该壳聚糖的衍生物是壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐，优选壳聚糖季铵盐，更优选季铵化的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖。 

本发明的又一目的在于提供一种壳聚糖-Math1基因纳米微粒和/或壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒的制备方法。该方法简单易行，原料易得，无须使用有机溶剂和醛类作为交联剂，反应迅速，反应条件温和，重复性好，稳定性高，实用性强，具有广泛的应用性。 

根据本发明的一方面，所述壳聚糖-Math1基因纳米微粒通过将壳聚糖与 如图4所示的含Math1基因的质粒进行复凝聚而制备。其在室温下，将壳聚糖以浓度比为50∶1至1∶2加入到含硫酸钠的含Math1基因的质粒中，在硫酸钠对壳聚糖的脱水作用和壳聚糖与含Math1基因的质粒的静电作用下，壳聚糖分子包裹含Math1基因的质粒而生成纳米微粒混悬液。具体地，该方法包括下述步骤： 

(1)制备浓度为100-500μg/ml，pH＝5.5的壳聚糖的醋酸钠缓冲溶液； 

(2)制备浓度为10-200μg/ml的含Math1基因的质粒的Na₂SO₄溶液； 

(3)等体积混合步骤(1)、(2)的溶液以进行复凝聚反应得到壳聚糖-Math1基因纳米微粒混悬液。 

其中，壳聚糖的分子量是10000Da～300000Da。 

其中，壳聚糖的脱乙酰度是80％～95％。 

其中，Na₂SO₄的含量是5-50mM。 

其中，含Math1基因的质粒是如图4所示的质粒。 

根据本发明的另一方面，以与制备壳聚糖-Math1基因纳米微粒类似的方法制备壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒，只是在步骤(1)中制备浓度为100-500μg/ml的壳聚糖衍生物的PBS缓冲溶液。 

其中，壳聚糖的衍生物是壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐，优选壳聚糖季铵盐，更优选季铵化的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖。 

与现有技术相比，本发明制备的壳聚糖(衍生物)-Math1纳米微粒至少具有以下特点： 

(1)选用天然可生物降解的原料，制得的纳米微粒生物相容性好，无毒副作用。 

(2)制得微粒的粒径大小可以调节，尺寸较均一。 

(3)制得微粒的表面带有正电荷，利于进行表面修饰。 

(4)壳聚糖或其衍生物与含Math1基因的质粒通过静电作用复合制备纳米微粒，一方面能增加Math1基因的稳定性，使Math1基因最终被递送到细胞内，另一方面，增强与细胞膜的作用及保护Math1基因免遭核酸酶的降解破坏。 

(5)通过调节各种成分的比例很容易实现对基因传递的控制。 

本发明的又一目的在于提供壳聚糖-Math1基因纳米微粒和/或壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒在转染体外培养的HEK293细胞中的应用。 

本发明的又一目的在于提供壳聚糖-Math1基因纳米微粒和/或壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒在转染离体培养的耳蜗组织中的应用。 

本发明的又一目的在于提供壳聚糖-Math1基因纳米微粒和/或壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒在转染在体耳蜗中的应用。 

本发明的又一目的在于提供壳聚糖-Math1基因纳米微粒和/或壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒在耳聋方面的应用，该纳米微粒可以用于由于噪声、药物中毒等原因引起的毛细胞缺失而导致的感音神经性耳聋。 

附图说明

图1示出壳聚糖-Math1纳米微粒的形成示意图； 

图2示出壳聚糖-Math1纳米微粒的透射电镜图； 

图3示出壳聚糖纳米颗粒的粒径分布； 

图4示出质粒PRK5-Math1-EGFP的图谱； 

图5示出Math1基因的核苷酸序列； 

图6示出电泳图谱，其中泳道1：标记；1：未经转染对照组；2：利用根据实施例9的转染组；3：利用根据实施例10的转染组；4：利用根据实施例4的转染组； 

图7示出EGFP在转染有壳聚糖-Math1纳米颗粒的293T细胞中的表达； 

图8示出耳后入路圆窗膜显微注射导入，a：耳后入路寻找听泡的解剖标志，黑箭头示面神经、蓝星示胸锁乳突肌；b：将胸锁乳突肌向上分离牵开，可见听泡后壁(蓝色箭头)及二腹肌后腹(蓝星)；c：二腹肌后腹(蓝星)向后分离后暴露听泡后上骨壁(黑箭头指示方向)；d：磨除此处听泡后上、面神经入听泡处后方骨壁；e：打开听泡后可见圆窗龛(黑箭头示)、镫骨动脉(蓝箭头示)；f：刺破圆窗膜显微注射(黑箭头示针头)；以及 

图9示出表达了Math1-EGFP蛋白的内耳组织，1：内毛细胞区域；2：柱细胞区域；3：外毛细胞区域。 

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作详细阐述。 

除非特别指出，否则下面实例中的试剂药品材料均为市售可得，方法参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，2001)。 

实施例1：PRK5-Math1质粒的构建 

用Trizol法提取胚胎小鼠16天脑组织总RNA，反转录合成cDNA，利用PCR法合成含有E盒的Math1基因，且5’和3’末端加入ECOR1和BamH1酶切位点。将PCR扩增产物经ECOR1和BamH1酶切，纯化后与经ECOR1和BamH1酶切的PRK5质粒(Clontech公司)连接，构建PRK5-Math1质粒。其中的Math1基因具有图5所示序列。 

扩增引物如下： 

F：5’-GGAATTAAAATAGTTGGGGGACC-3’， 

R：5’-TGGACAGCTTCTTGTTGGCTT-3’， 

扩增条件为：94℃5min；94℃1min；58℃40sec；72℃40sec；35个循环，72℃延伸5min。 

实施例2：PRK5-Math1-EGFP质粒的构建 

用Hpa1和Xbal1酶对含有EGFP基因的质粒pEGFP-C2(Invitrogen公司)和实施例1的PRK5-Math1质粒分别进行双酶切，纯化回收，经T4连接酶连接构建PRK5-Math1-EGFP质粒。 

实施例3：PRK5-Math1-EGFP的扩增和纯化 

取5μl质粒PRK5-Math1-EGFP，加入100μl感受态大肠杆菌DH5α细菌，混匀，冰浴30分钟，42℃热休克1分钟，冰浴2分钟，加入800μl LB培养基，37℃培养1小时。取100μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的平板，37℃倒置培养16小时。挑取平板中的单菌落，接种于5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃恒温振荡过夜，使细菌生长至对数晚期。按照质粒提取试剂盒(QIAGEN)说明书提取质粒。 

取质粒0.5～1μg，加入内切酶5U(不超过总反应体积1/10)，反应体积20μl，适温水浴2h，取少量样品进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。 

实施例4： 

将100μg/ml，pH＝5.5的壳聚糖(分子量为30000Da，脱乙酰度95％)的醋酸钠缓冲溶液和10μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液分别置于37℃水浴恒温20分钟。配制100μl含有5mM硫酸钠的PRK5-Math1-EGFP质粒，向其中加入100μl上述壳聚糖的醋酸钠溶液，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0.5小时得到壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为250nm，分散指数为0.15；zeta电位分析仪测定其zeta电位为29.01±1.26(mV)，包封率为91.6％。 

实施例5： 

将500μg/ml，pH＝5.5的壳聚糖(分子量为24000Da，脱乙酰度80％)的醋酸钠缓冲溶液和200μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液分别置于37℃水浴恒温20分钟。配制100μl含有50mM硫酸钠的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液，向其中加入100μl上述壳聚糖的醋酸钠溶液，迅速混合60秒后，室温下继续孵育0.5小时得到壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为146nm，分散指数为0.21；zeta电位分析仪测定其zeta电位为23.23±1.66(mV)；包封率为90.1％。 

实施例6： 

将300μg/ml，pH＝5.5的壳聚糖(分子量为10000Da，脱乙酰度85％)的醋酸钠缓冲溶液和50μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液分别置于37℃水浴恒温20分钟。配制200μl含有5mM硫酸钠的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液，向其中加入200μl上述壳聚糖的醋酸钠溶液，迅速混合40秒后，室温下继续孵育0.5小时得到壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为116nm，分散指数为0.16；zeta电位分析仪测定其zeta电位为23.36±2.34(mV)，包封率为92.5％。 

实施例7： 

将300μg/ml，pH＝5.5的壳聚糖(分子量为20000Da，脱乙酰度90％)的 醋酸钠缓冲溶液和100μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液分别置于37℃水浴恒温20分钟。配制100μl含有30mM硫酸钠的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液，向其中加入100μl上述壳聚糖的醋酸钠溶液，迅速混合50秒后，室温下继续孵育0.5小时得到壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP质粒纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为120nm，分散指数为0.25；zeta电位分析仪测定其zeta电位为19.6±0.83(mV)，包封率为95.1％。 

实施例8： 

将300μg/ml，pH＝5.5的壳聚糖(分子量为21000Da，脱乙酰度90％)的醋酸钠缓冲溶液和150μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液分别置于37℃水浴恒温20分钟。配制200μl含有30mM硫酸钠的PRK5-Math1-EGFP质粒，向其中加入200μl上述壳聚糖的醋酸钠溶液，迅速混合60秒后，室温下继续孵育0.5小时得到壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为210nm，分散指数为0.21；zeta电位分析仪测定其zeta电位为20.01±1.46(mV)，包封率为92.7％。 

实施例9： 

将400μg/ml的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖PBS缓冲溶液和100μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液分别置于37℃水浴恒温20分钟。配制200μl含有30mM硫酸钠的PRK5-Math1-EGFP质粒，并向其中加入200μl的上述N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖PBS溶液，迅速混合60秒后，室温下继续孵育0.5小时得到N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为123nm，分散指数为0.18；zeta电位分析仪测定其zeta电位为22.15±1.32(mV)，包封率为93.4％。 

实施例10： 

将300μg/ml的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖PBS缓冲水溶液和100μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液分别置于37℃水浴恒温20分钟。配制200μl含有5mM硫酸钠的PRK5-Math1-EGFP质粒，并向其中加入 200μl的上述N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖PBS溶液，迅速混合60秒后，室温下继续孵育0.5小时得到N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为165nm，分散指数为0.16；zeta电位分析仪测定其zeta电位为21.31±1.46(mV)，包封率为94.1％。 

实施例11： 

将400μg/ml的壳聚糖盐酸盐溶液和100μg/ml的PRK5-Math1-EGFP质粒分别置于37℃水浴恒温20分钟。配制200μl含有30mM硫酸钠的PRK5-Math1-EGFP质粒溶液，并向其中加入200μl上述壳聚糖盐酸盐溶液，迅速混合60秒后，室温下继续孵育0.5小时得到壳聚糖盐酸盐-PRK5-Math1-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为142nm，分散指数为0.15；zeta电位分析仪测定其zeta电位为30.12±1.32(mV)，包封率为92.1％。 

实施例12：壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP纳米微粒在体外培养HEK293细胞的转染及Math1蛋白的表达 

转染前一天将HEK 293T细胞接种于35mm培养皿，待细胞达80％融合时进行转染。转染时使用无血清的DMEM培养基冲洗两遍，每皿加入37℃预热的2ml无血清的DMEM培养基。将按上述实施例制备的纳米混悬液轻轻晃动以充分混匀(壳聚糖纳米浓度为4ng/μl)，然后向每培养皿加入300μl纳米溶液，轻轻晃动培养皿以充分混匀，于37℃，5％CO₂培养箱培养6小时。更换含10％FBS的DMEM培养基，继续转染24-48小时。 

收集于36.5℃±0.5℃培养72小时的293T细胞(约10⁷个)，用Trizol法提取RNA。加入30μl DEPC水溶解RNA，取2μl用紫外分光光度计测定RNA含量后，于-80℃的冰箱中冻存RNA。 

PCR扩增

模板变性：于65℃将上述步骤中制备的RNA加热5min以熔化二级结构，然后在冰上立即冷却。 

模板变性反应体系： 

反转录反应体系： 

充分混匀后进行下述反应：50℃反应60min，7℃反应5min，加入1μl的RNase H，于37℃反应20min。将获得的反转录产物作为模板进行下一步PCR扩增反应，或者于-20℃冻存。 

PCR扩增反应体系： 

PCR反应程序：95℃预变性5min后进入循环，95℃变性45sec，58℃复性45sec，72℃延伸1min，共40个循环，然后72℃延伸5min，将获得的PCR产物进行下一步反应或者于-20℃冻存。 

1％琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR反应产物。 

如图6可见，Math1基因能够在HEK293细胞中进行翻译，产生Math1蛋白。 

进一步地，如图7可见，经过壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP纳米颗粒转染的293T细胞能够表达Math1-EGFP基因，表明壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP纳米颗粒能够把目的基因运送到活细胞中去并获得表达。 

实施例13：壳聚糖-Math1基因纳米微粒转染体外培养的wistar大鼠耳蜗组织 

将出生后3天的Wistar大鼠迅速浸过酒精，断头，取出听泡；将取下的耳蜗组织迅速放入4℃Hank’s缓冲液中；分离耳蜗组织，去除螺旋韧带及血管纹；将基底膜分为基层、中层及顶层三段；24孔培养板上加入含10％FBS的DMEM；小心将基底膜组织平铺于培养板上；小心放置于37℃，5％CO₂培养箱中；隔日换液； 

培养6天后，基底膜组织贴壁良好，转染时用无血清的DMEM洗两遍，每皿加入37℃预热的3ml无血清的DMEM；将实施例制备的壳聚糖纳米溶液充分轻轻混匀(壳聚糖纳米浓度为4ng/μl)；每培养皿加入300μl纳米溶液轻轻晃动培养皿使充分混匀；37℃，5％CO₂培养箱培养，6小时后更换3ml含10％FBS的DMEM；继续转染24-48小时观察结果。 

实施例14：壳聚糖-Math1基因纳米微粒经圆窗膜穿刺纤维注射转染在体的C57小鼠耳蜗组织 

取健康的3周龄黑色C57小鼠，雌雄不限，体重25g～30g，耳廓反射灵敏，双耳鼓膜正常，无感染。使用动物用速眠新(846)(长春)按0.3ml/kg体重对小鼠进行麻醉，于37℃保温袋保温。麻醉后，在严格无菌条件下，左侧耳经背侧进路显露听泡，在手术显微镜下用电钻打开听泡，暴露圆窗龛。根据体外细胞转染水平的实验优化条件，制定活体转染最佳浓度；稀释液为人工外淋巴液；将1.5μl壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP基因纳米微粒溶液经圆窗膜穿刺缓慢(约5分钟)注入，然后取一小块肌肉填塞封闭听泡打孔处，分层缝合切口。经圆窗膜穿刺纤维注射给药，给药方法简便易行、转染可靠、高效、对内耳骚扰比较小。 

实施例15：壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP基因纳米微粒转染C57小鼠内耳组织的 

免疫组化 

壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP基因纳米微粒转染7天后，对小鼠断头处理，然后迅速取出听泡，用4％的多聚甲醛固定1h，进行耳蜗基底膜铺片；免疫组化染色后于共聚焦荧光显微镜下观察结果，激发光488nm；表达Math1-EGFP的内外毛细胞为绿色荧光。如图9所示，内外毛细胞表达Math1-EGFP，显示绿色荧光，因此，壳聚糖-PRK5-Math1-EGFP基因纳米微粒可以有效的转染内耳包括内外毛细胞在内的不同细胞并表达，促进毛细胞再生，可以用于感音神经性耳聋的治疗。 

本发明不限于以上实施方式，本领域技术人员还可以做出多种改变和变形，在不脱离本发明精神的前提下，它们均在本发明的范围内。 

Claims (10)

1.一种壳聚糖-Math1基因纳米微粒，包括壳聚糖和图4所示的质粒，其粒径为100-250nm，分散指数为0.15-0.26，zeta电位为20-40mV，包封率为90-95％，所述壳聚糖的分子量是10000Da～30000Da，所述壳聚糖的脱乙酰度是80％～95％，所述壳聚糖与所述质粒的浓度比为50∶1至1∶2。

2.一种壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒，包括壳聚糖衍生物和图4所示的质粒，其粒径为100-250nm，分散指数为0.15-0.26，zeta电位为20-40mV，包封率为90-95％，所述壳聚糖的分子量是10000Da～30000Da，所述壳聚糖的脱乙酰度是80％～95％，所述壳聚糖的衍生物选自壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐，所述壳聚糖与所述质粒的浓度比为50∶1至1∶2。

3.根据权利要求2所述的壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒，其中所述壳聚糖的衍生物为壳聚糖季铵盐。

4.根据权利要求2所述的壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒，其中所述壳聚糖的衍生物为季铵化的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖。

5.一种壳聚糖-Math1基因纳米微粒或壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒的制备方法，其通过在室温下将壳聚糖的醋酸钠溶液或壳聚糖衍生物的PBS溶液与含Math1基因的质粒的硫酸钠溶液以浓度比为50∶1至1∶2进行复凝聚而获得纳米微粒混悬液，该含Math1基因的质粒为图4所示的质粒，其中所述壳聚糖的分子量是10000Da～30000Da，所述壳聚糖的脱乙酰度是80％～95％，所述壳聚糖的衍生物是壳聚糖季铵盐、羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于，包括：

(1)制备浓度为100-500μg/ml，pH＝5.5的壳聚糖的醋酸钠缓冲溶液或浓度为100-500μg/ml的壳聚糖衍生物的PBS缓冲溶液；

(2)制备浓度为10-200μg/ml的含Math1基因的质粒的Na₂SO₄溶液；

(3)等体积混合步骤(1)、(2)的溶液以进行复凝聚反应得到壳聚糖-Math1基因纳米微粒混悬液。

7.根据权利要求5或6的方法，其特征在于，所述Na₂SO₄的含量是5-50mM，所述含Math1基因的质粒为图4所示的质粒。

8.根据权利要求5或6所述的壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒，其中所述壳聚糖的衍生物为壳聚糖季铵盐。

9.根据权利要求5或6所述的壳聚糖衍生物-Math1基因纳米微粒，其中所述壳聚糖的衍生物为季铵化的N-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化铵壳聚糖。

10.权利要求5的方法制备的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为100-250nm，分散指数为0.15-0.26，zeta电位为20-40mV，包封率为90-95％。

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