JP7126287B2 - 核酸導入用組成物及びその利用 - Google Patents
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Description
[2]前記核酸は、ネイキッド核酸である、[1]に記載の組成物。
[3]カチオン性キャリアを含有しない、[1]又は[2]に記載の組成物。
[4]前記核酸と前記アニオン性成分を含む多孔質粒子を含む、[1]~[3]のいずれかに記載の組成物。
[5]前記アニオン性成分は、ヒアルロン酸又はその塩である、[1]~[4]のいずれかに記載の組成物。
[6]さらに、1又は2以上の疎水性アミノ酸を含有する、[1]~[5]のいずれかに記載の組成物。
[7]前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される、[6]に記載の組成物。
[8]実質的に水を利用しないで細胞に供給するための組成物である、[1]~[7]のいずれかに記載の組成物。
[9]固相である、[1]~[8]のいずれかに記載の組成物。
[10]哺乳類細胞に対する遺伝子導入用である、[1]~[9]のいずれかに記載の組成物。
[11]核酸導入用組成物の製造方法であって、
核酸と、アニオン性ポリマー又はその塩であるアニオン性成分と、を含有する溶液を、凍結乾燥する乾燥工程、
を備える、製造方法。
[12]前記乾燥工程は、噴霧凍結乾燥による工程である、[11]に記載の製造方法。
[13]生体外の細胞に対して、[1]~[10]のいずれかに記載の核酸導入用組成物を用いて、前記核酸を導入する工程、
を備える、核酸導入方法。
本組成物は、固体物質としての核酸と、アニオン性ポリマー又はそれらの塩であるアニオン性成分と、を含有することができる。以下、本組成物の成分について説明し、その後、本組成物の各種態様について説明する。
核酸は、天然に存在するデオキシリボクレオチド及び/又はリポヌクレオチドの重合体である天然核酸及び少なくとも一部に非天然構造を有するデオキシリボヌクレオチド及び/又はリボヌクレオチドを含む重合体である非天然核酸を含むことができる。天然のデオキシリボヌクレオチド及びリポヌクレオチドは天然塩基を備えている。天然塩基は、天然のDNA及びRNAにおける塩基であって、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルが挙げられる。また、天然のデオキシリボヌクレオチド及び/又はリポヌクレオチドは、その2-デオキシリボース及び/又はリポースの5位のリン酸と隣接するデオキシリボース及び/又はリボースの3’の水酸基とがリン酸ジェステル結合で連結した骨格を有している。本明細書において、天然核酸としては、DNA/RNA及びデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとのキメラ(以下、DNA/RNAキメラともいう。)であってもよい。また、DNA/RNAはそれぞれ一本鎖であってもよいし、同種の二本鎖であってもよいし、DNAとRNAとがハイプリダイズしたハイプリッドであってもよい。さらには、DNA/RNAキメラが、DNA/RNA又はDNA/RNAキメラとハイプリダイズしたハイプリッドであってもよい。
本組成物は、アニオン性ポリマー又はその塩であるアニオン性成分を有している。ア二オン性成分は、必ずしも明らかではないが、固体物質としての核酸と併存させることで、核酸の細胞への導入効率を高めることができると推論される。また、核酸を噴霧凍結乾燥などで乾燥するときにおいて併存させることで、核酸の生物活性の維持に寄与することが推論される。
本組成物は、アニオン性ポリマー等であるアニオン性成分を含有するが、カチオン性ポリマーなどの非ウイルス性であっても、細胞障害性等を発現する可能性があるため、カチオン性キャリアを含有しないことが好ましい。かかるカチオン性キャリアとしては、特に限定するものではないが、カチオン性基を有するカチオン性ポリマーやカチオン性脂質が挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、カチオン性基を有する多糖類、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチド、カチオン性基を有する人工ポリマー若しくはこれらの塩等が挙げられる。
本組成物は、さらに、1又は2以上の疎水性アミノ酸を含有していてもよい。かかるアミノ酸を含有していると、本組成物を細胞に供給する際の、分散性、吸入投与に際しての吸入特性などを向上させることができると考えられる。疎水性アミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン等が挙げられる。なかでも、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンを用いることが好ましい。好適な疎水性で固相として存在する核酸及びアニオン性成分の分散性等を向上させることができると考えられる。例えば、フェニルアラニンは、好適な細胞導入効率に寄与しているものと考えられる。
本組成物は、核酸の細胞への導入用である。さらには、本組成物は、核酸を細胞に導入して当該核酸による種々の効果、例えば、遺伝子発現(タンパク質の合成)、遺伝子の発現抑制を意図するものである。
本組成物の製造方法は、核酸と、アニオン性成分と、を含有する溶液を、凍結乾燥する乾燥工程、を備えることができる。本製造方法によれば、核酸とアニオン性成分とを均一に混合された組成物を得ることができる。核酸とアニオン性成分とを含み、必要に応じて疎水性アミノ酸を含んだ溶液(水溶液等)を凍結乾燥用溶液として準備する。凍結乾燥用溶液を調製する際の、核酸、アニオン性成分の混合順序は特に限定しない。また、疎水性アミノ酸の混合も特に限定するものではなく、核酸及びアニオン成分溶解後であってもよいし、これらの成分の溶解前及び同時であってもよい。凍結乾燥用溶液に用いる媒体は、特に限定するものではないが、蒸留水や純水等を用いることができる。
本明細書に開示される核酸の導入方法は、生体外の細胞に対して、本組成物を用いて、前記核酸を導入する工程、を備えることができる。本導入方法によれば、既に説明したよ )うに、固体物質としての核酸をアニオン性成分とともに用いるため、高い導入効率を得ることができる。本組成物の細胞の対する適用方法は、既に説明した各種態様を採ることができる。
本実施例では、固体物質としての核酸に対して賦形剤として用いる各種のアニオン成分について検討するために、各種組成物を調製した。
(1)核酸
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼをコードするpDNA(pCpG-△Luc)を用いた。
賦形剤として高分子量ヒアルロン酸(M.W.; 50~110 kDa、ヒアルロン酸FCH-SU: 以下、HHAともいう。)及び低分子量ヒアルロン酸 (M.W.; < 5 kDa、マイクロヒアルロン酸FCH: 以下、LHAともいう。)の各ナトリウム塩(ともにキッコーマンバイオケミファ株式会社)、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩(CMC、シグマアルドリッチ)、コンドロイチン硫酸ナトリウム塩(CS、シグマアルドリッチ)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC、シグマアルドリッチ)、β-シクロデキストリン(β-CyD、和光純薬工業株式会社)、イヌリン(Inu、(from chicory;Inu、シグマアルドリッチ)、メチルセルロース(MC、シグマアルドリッチ)、D(-)-マンニトール(Man、和光純薬工業株式会社)を使用した。
pDNA水溶液と各種アニオン性成分水溶液を混合して試料溶液とした。溶媒には全て超純水 (UltraPureTMDNase/RNAse-Free Distilled Water、invitrogenTM)を用いた。試料溶液の最終濃度はpDNA濃度として200 μg/mLとした。各試料溶液の組成を以下に示す。
導入用組成物は、SFD法により調製した。噴霧乾燥機(SD-1000、東京理化器械株式会社)に付属の2流体噴霧ノズルを用いて、試料溶液をノズル先端から15cm下の液体窒素 (500 mL)中に150 kPaで噴霧することにより急速凍結した。詳細な条件を以下に示す。試料溶液は5 mL/minで送液し、1.5 min噴霧を続けた。得られた氷滴を凍結乾燥機 (FDU-210東京理化器械株式会社)を接続した角形ドライチャンバー (DRC-1000東京理化器械株式会社)に入れ、真空条件下で24 h乾燥することにより目的の組成物を得た。
本実施例では、実施例1で調製した各組成物をマウス肺内に投与して、遺伝子発現効果を評価した。マウスへの投与及び評価は以下のようにして行った。
前処置としてペントバルビタール (50 mg/kg、i.p.)麻酔下、雌性ICRマウス (5 週齢)の前歯を自作の固定板に設置し、胸部を垂直にした。ライト (MegaLight100(商標)、ショット日本株式会社)を用いて、胸部に局所的に光を当てながら、マウスの口を開放してピンセットで舌を引き出した。口内で白色の穴として見える気管を確認し、挿管補助器具 (Liquid MicroSprayer (商品名、PennCentury, Inc))のスプレーチップ部分を使用)に装着したマウス肺内投与用カニューレ(総長4.0cmのPE-60ポリエチレンチューブ)を3.0cm気管に挿入した。
ルシフェラーゼ活性に基づく発光をIVIS(商標)を用いて検出・解析することにより評価した。測定時に用いたluciferin はPBSを用いて30 mg/mLに調整し、-80°Cで保存したものを使用した。Isoflurane (イソフル、商標、アボットラボラトリーズ)により麻酔し、マウス肺内投与6、12、24、48 h後に、発光基質であるluciferin (30 mg/mL、0.05 mL/ mouse; 300 mg/kg)を経鼻投与した。luciferin投与10 min後にisoflurane麻酔下、exposure time 1 minで発光を検出した。肺に相当するregion of interest (ROI; 縦1 cm、横3 cm)を作成して、その発光強度 (Total Flux (photon/sec))を遺伝子発現量として求め、遺伝子発現量-時間パターンを解析した。得られた遺伝子発現量-時間パターンより、遺伝子発現量-時間曲線下面積 (AUC)及び最大遺伝子発現量 (Luc(max))をそれぞれ求めた。これらの結果を、それぞれ図2~3に示す。
核酸の粉末化における最重要課題の1つとして、その工程で生じる熱、凍結、せん断などの種々のストレスに対して遺伝子の構造・機能を十分に保持することが挙げられる。pDNAは通常Supercoiled (S.C.)型の状態で存在しているが、外部からのストレスによりDNA鎖の切断等が生じてOpen-circular (O.C.)型、Linear型へと構造が段階的に変化し、特にLinear型では遺伝子発現効果が著しく低下する。一般的に、S.C.およびO.C.の位置にバンドが検出されれば、pDNAの構造安定性が維持されたと考えられる。
レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼをコードするpDNA (pCpG-△Luc)を用いた。
(2)賦形剤
賦形剤としては、実施例1で用いたHHA及びLHAの各ナトリウム塩を用いた。
(3)分散補助剤
分散補助剤としては、L-フェニルアラニン (SIGMA-ALDRICH: Phe)、L-ロイシン (SIGMA-ALDRICH: Leu)及びL-イソロイシン(SIGMA-ALDRICH: Ile)を用いた。
(4)試料溶液の調製
以下の表に示す組成に基づき、実施例に準じて、核酸と賦形剤を含む溶液に分散補助剤の溶液を添加して、各試料溶液を調製した。なお、賦形剤を含まない場合には、核酸溶液に分散補助剤溶液を添加して、SFDに用いる各試料溶液を調製した。
各試料溶液を、実施例1と同様の方法で噴霧凍結乾燥して各組成物を調製した。これらの組成物に、含有される各成分がSFD前と同じ濃度になるように超純水を添加し溶解して再溶解液を調製した。
SFD前の試料溶液及びSFD後の再溶解液について、アガロースゲル電気泳動に行って、構造安定性を評価した。すなわち、一検体あたり6 μL(pDNAとして0.1 μg)を、0.6%アガロースゲルを用いて100 V、30 mAで120 min電気泳動 (泳動槽AE-6530、電源AE-8270及びAE-8155、アトー株式会社)を行った。泳動緩衝液にはtris-acetate-EDTA (TAE) bufferを用いた。
実施例4で調製した各種賦形剤を含む粉末の導入用組成物を、実施例2の手順に準じてマウス肺内に投与し、得られた遺伝子発現量-時間パターンを測定し、AUC、Luc(max)について比較した。結果を、図5及び図6に示す。
本実施例では、ネイキッド核酸導入用組成物と吸入特性との関係について評価した。なお、評価の定量用ラベル剤としてfluorescein sodium (SIGMA-ALDRICH、FLNa)を使用した。吸入特性の評価は以下のようにして行った。
本実施例では、重量平均分子量が異なるヒアルロン酸ナトリウム(重量平均分子量5000未満(LHA)、重量平均分子量15,000~40,000)(MHA)、重量平均分子量50,000~110,000(HHA))、コンドロイチン硫酸(CS)(ヒアルロン酸に類似するグルコサミノグリカンである。)を賦形剤として用いるとともに、分散助剤としてのL-フェニルアラニン(Phe)を適宜用いて、ネイキッド核酸導入用組成物を調製し、ICRマウスを用いin vivoでの遺伝子発現効果を評価した。ネイキッド核酸導入用組成物は、以下に示す表の組成の溶液を用いて噴霧凍結乾燥する以外は、実施例1と同様にして行って調製した。
本実施例では、ネイキッド核酸として、ホタルルシフェラーゼ遺伝子(Luc+)をターゲットとするsiRNA(siGL3)を用いて、in vitroでsiRNAの遺伝子発現抑制効果を評価した。なお、このsiRNAは、実施例1で用いたプラスミドDNAのおおよそ300分の1程度の分子量である。
して、ルシフェラーゼの発光強度を調べた。なお、ネガティブコントロール組成物についても同様に投与してルシフェラーゼ発光強度を測定した。結果を図12に示す。
Claims (11)
- 固体物質としての核酸と、
ヒアルロン酸又はその塩と、
ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群から選択される1又は2以上の疎水性アミノ酸と、を含有し、
前記ヒアルロン酸又はその塩の含有量が全体の25質量%以上73質量%以下であり、
前記疎水性アミノ酸の含有量が全体の25質量%以上73質量%以下であり、
多孔質粒子である、核酸導入用組成物。 - 前記ヒアルロン酸又はその塩として、重量平均分子量が110,000以下であるヒアルロン酸又はその塩を含有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記ヒアルロン酸又はその塩として、重量平均分子量が分子量10,000以上、110,000以下であるヒアルロン酸又はその塩を含有する、請求項2に記載の組成物。
- 前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される、請求項1~3のいずれかに記載の組成物。
- 前記核酸は、ネイキッド核酸である、請求項1~4のいずれかに記載の組成物。
- カチオン性キャリアを含有しない、請求項1~5のいずれかに記載の組成物。
- 水を利用しないで細胞に供給するための組成物である、請求項1~6のいずれかに記載の組成物。
- 固相である、請求項1~7のいずれかに記載の組成物。
- 哺乳類細胞に対する遺伝子導入用である、請求項1~8のいずれかに記載の組成物。
- 核酸導入用組成物の製造方法であって、
核酸と、
ヒアルロン酸又はその塩と、
ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニンからなる群から選択される1又は2以上の疎水性アミノ酸と、
を含有する溶液を液体窒素中に噴霧することにより急速凍結する凍結工程と、
得られた氷滴を真空条件下で凍結乾燥する乾燥工程と、を備え、
前記溶液において、固形分として前記ヒアルロン酸又はその塩を前記固形分全体の25質量%以上73質量%以下、前記疎水性アミノ酸を前記固形分全体の25質量%以上73質量%以下含有する、製造方法。 - 生体外の細胞に対して、請求項1~9のいずれかに記載の核酸導入用組成物を用いて、前記核酸を導入する工程、を備える、核酸導入方法。
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Materials Science and Engineering C,Vol. 31,2011年,pp. 224-229 |
Pharm. Res.,2015年12月07日,Vol. 33,pp. 922-931 |
伊藤貴章、他,三元複合型遺伝子吸入粉末剤に添加するヒアルロン酸の分子量の影響,日本病院薬剤師会東海ブロック・日本薬学会東海支部合同学術大会 2014 講演要旨集,2014年,p. 83、D-19 |
伊藤貴章、他,吸入naked pDNA粉末剤開発に適した賦形剤の検討,日本薬剤学会年会講演要旨集,2015年,Vol. 30th,p. 114、21C5-1 |
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