ES2265569T3

ES2265569T3 - Composicion farmaceutica que mejora la transferencia de genes in vivo.

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Publication number: ES2265569T3
Application number: ES03718854T
Authority: ES
Inventors: Bruno Pitard
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2003-02-07
Publication date: 2007-02-16
Anticipated expiration: 2023-02-07
Also published as: JP2005522433A; US8367631B2; FR2835749A1; EP1471944A2; DE60305443D1; ATE326986T1; WO2003066104A2; EP1471944B1; US20100179212A1; CA2473212A1; JP4613011B2; US20050152870A1; CA2473212C; WO2003066104A3; DE60305443T2; FR2835749B1; AU2003222896A8; AU2003222896A1; US7709452B2

Abstract

Composición farmacéutica, caracterizada porque asocia a por lo menos un ácido nucleico por lo menos una sal mineral del copolímero tetrafuncional de fórmula (I) utilizado en forma catiónica en la que x e y representan independientemente el uno del otro un número entero comprendido entre 1 y 500, y presentando x un valor tal que dicha molécula comprende por lo menos 30% en peso de grupos óxido de etileno, estando dicha composición formulada en medio Tyrode, es decir NaCl 140 mM, KCl 6 mM, CaCl2 3 mM, MgCl2 2 mM, Hepes 10 mM pH 7, 4 y glucosa 10 mM.

Description

Composición farmacéutica que mejora la transferencia de genes in vivo.

La presente invención se refiere en particular a una composición farmacéutica que facilita la transferencia celular de ácido(s) nucleico(s) y más particularmente a unas células musculares o cardíacas in vivo.

La problemática considerada en el marco de la presente invención es la de la transferencia de una información genética a una célula y más particularmente a su núcleo, para que el gen considerado sea traducido en proteína.

Actualmente se utilizan en particular dos técnicas para la transferencia celular de un gen. La primera utiliza un virus adenoasociado, AAV, que es un virus recombinante. En cuanto a la segunda, se trata de la electrotransferencia que consiste en aplicar un campo eléctrico a nivel de las células consideradas después de inyectarles el ADN. A pesar de que dichas dos técnicas permiten obtener unos niveles satisfactorios de eficacia de transferencia de genes, adolecen por otro lado de un inconveniente en cuanto a la toxicidad. Y además, el AAV plantea hoy en día numerosas dificultades técnicas para su preparación, purificación y/o caracterización y el riesgo potencial de integración en el genoma de la célula huésped podría dar lugar a fenómenos de cancerización. Por último, la transferencia de genes en el músculo cardíaco no es accesible utilizando la técnica de electrotransferencia debido a razones de supervivencia.

En este caso, la presente invención resulta precisamente ventajosa para la transfección en unas células musculares esqueléticas, lisas y cardíacas.

En lo que se refiere a los vectores sintéticos, en cuanto a los lípidos catiónicos por ejemplo, se muestran ineficaces in vivo. Sólo el ADN desnudo es capaz de conducir a la expresión de una proteína después de la inyección en el músculo esquelético y cardíaco. Desgraciadamente, la cantidad de proteína sintetizada, después de la inyección intramuscular de ADN desnudo, permanece insuficiente para prever unas aplicaciones clínicas. En efecto, uno de los mayores problemas de la utilización del ADN desnudo para la transferencia del gen en los tejidos musculares es su baja eficacia, que no mejora con el aumento de las cantidades de ADN inyectadas. Ahora bien, por unas razones de comodidad, en particular en términos de accesibilidad, resultaría particularmente interesante fomentar la expresión de proteínas de interés terapéutico local o sistémico a nivel de dichos músculos.

En consecuencia, existe hoy en día una necesidad real de un vector ideal para terapia génica, es decir un vector no tóxico, que no induce ninguna reacción inmunitaria y que permite obtener una expresión óptima en una proteína de la cual se investiga el efecto terapéutico.

La presente invención tiene precisamente como objetivo proponer la utilización de moléculas químicas específicas para aumentar significativamente la eficacia de transfección del ADN al cual están asociadas.

Más precisamente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica caracterizada porque asocia a por lo menos un ácido nucleico, por lo menos una sal mineral del copolímero tetrafuncional de fórmula (I):

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en la que x e y representan independientemente el uno del otro un número entero comprendido entre 1 y 500, y presentando x un valor tal que dicha molécula comprende por lo menos el 30% en peso de grupos óxido de etileno,

estando dicha composición formulada en un medio Tyrode, es decir NaCl 140 mM, KCl 6 mM, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 2 mM, Hepes 10 mM pH 7,4 y glucosa 10 mM (Tyrode Pharmacology, Philadelphia 1908, 2ª edición, 1912).

Las moléculas citadas anteriormente, que son unas poloxaminas particulares, están constituidas por unos segmentos hidrófobos (óxido de propileno, que presenta los índices y), unos segmentos hidrófilos (óxido de etileno, que presenta los índices x) y por una parte central etileno-diamina cargada positivamente (NCH_{2}-CH_{2}N).

Los inventores han puesto en evidencia más particularmente que dichas poloxaminas, que hasta ahora eran presentadas como unos polímeros no iónicos (documento WO 00 /47 186) pueden de hecho presentar una forma catiónica.

De forma sorprendente, la aparición de dichas cargas positivas a nivel de la parte central etileno-diamina no reduce para nada la eficacia de la transferencia celular, sino al contrario. En efecto, las moléculas químicas catiónicas del tipo lípidos catiónicos, proteínas y péptidos catiónicos no mejoran, en relación con el ADN desnudo la transferencia del gen en los tejidos musculares (Lluis M.M. et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 96, págs. 4262-4267).

Las solicitudes de patente WO 01/65911 A, WO 93/15745 A, 00/51645 A, WO 96/21470 A, así como Prokop et al., (J. Pharm. Sci, 2002, vol. 91, nº 1, págs. 67-76) dan a conocer la utilización de poloxámeros y/o de poloxaminas, tales como los Tetronics® para la transferencia intracelular in vitro o in vivo de genes y de ácidos nucleicos, que presentan eventualmente una biodisponibilidad mejorada, en particular con fines terapéuticos.

Klebe et al., (Teratogenesis, Carcinogenesis, Mutagenesis 1986, vol. 6 nº 3, pp 245-250) describe la utilización de derivados del polietilenglicol tal como el Tetronics® 304 poliol en combinación con una solución tampón TES para la transferencia genética de células mediante un ARN vírico.

La solicitud de patente WO 96/15778 y la patente US 6221959 B dan a conocer unas composiciones que comprenden unas poloxaminas del tipo Tetronic® a título de agentes activos para estabilizar unos polinucleótidos para la transfección de células.

Un objetivo particular de la invención es por lo tanto una composición farmacéutica caracterizada porque asocia a por lo menos un ácido nucleico, por lo menos una sal mineral del copolímero tetrafuncional de fórmula (I):

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utilizado en forma catiónica

en la que x e y representan independientemente el uno del otro un número entero comprendido entre 1 y 500 , y presentando x un valor tal que dicha molécula comprende por lo menos el 30% en peso de grupos óxido de etileno,

estando dicha composición formulada en medio Tyrode, es decir NaCl 140 mM, KCl 6 mM, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 2 mM, Hepes 10 mM pH 7,4 y glucosa 10 mM. La presencia de medio Tyrode permite en particular el control de la composición iónica de la formulación y del pH y , por consiguiente, de la utilización en forma catiónica del compuesto de la fórmula (I).

Los inventores han establecido además el interés de controlar el pH y/o la composición iónica de la formulación, con el fin de asegurar que el copolímero de la fórmula (I) esté en forma catiónica.

Se prefiere un pH de 6,5 a 8, preferentemente de 7 a 7,8, más preferentemente de 7,4.

Sin intención de vincularse a cualquier mecanismo de acción, los inventores observan de hecho que las poloxaminas utilizadas en forma catiónica en presencia de Tyrode, permiten condensar el ADN.

De forma inesperada, los inventores además han puesto en evidencia que los compuestos de fórmula general (I), en la que los grupos óxido de etileno están presentes a razón de por lo menos el 30% en peso, se muestran particularmente eficaces para la transferencia de un gen asociado in vivo. Dicha eficacia está particularmente ilustrada en el ejemplo 1 siguiente. Según una variante preferida, los compuestos según la invención comprenden más del 85% en peso de grupos óxido de etileno. Más preferentemente, presentan entre el 35 y el 50% y preferentemente el 40% en peso de grupos óxido de etileno.

Según una variante preferida de la invención, las moléculas de los compuestos de fórmula general (I) presentan además un peso molecular de por lo menos 800 g/mol y más preferentemente comprendido entre 1000 y 25000 g/mol.

Según una forma de realización preferida de la invención, los compuestos de fórmula general presentan una relación de grupos OE/OP comprendida entre 0,5 y 1,5 y preferentemente del orden 1 \pm 0,2.

A título de compuestos de fórmula general (I) que convienen muy particularmente en la presente invención, se pueden citar más particularmente las moléculas que presentan respectivamente un peso molecular de 1650 g para una relación OE/OP 15:16 (por ejemplo la poloxamina 304), de 5500 g/mol, para una relación OE/OP 50:56 (por ejemplo la poloxamina 704) y de 6700 g/mol, para una relación OE/OP 61:68 (por ejemplo la poloxamina 904).

En el sentido de la presente invención, el término ácido nucleico abarca tanto un ácido desoxirribonucleico como un ácido ribonucleico.

En este caso, se puede tratar de secuencias de origen natural o artificial y en particular de ADN genómico, de ADNc, de ARNm, de ARNt, de ARNr, de ARN de interferencia (ARNi o small interference ARN), de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semi-sintéticas de oligonucleótidos modificados o no. Dichos ácidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, vírico, etc. Se pueden obtener mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia y en particular mediante el cribado de bancos, por síntesis química o incluso por unos procedimientos mixtos que incluyen la modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas por cribado de bancos. Se pueden modificar químicamente.

En referencia más particularmente a los ácidos desoxirribonucleicos, pueden ser de hebra simple o de doble hebra, así como unos oligonucleótidos de cadena corta o bien unas secuencias más largas. Dichos ácidos desoxirribonucleicos pueden transportar unos genes terapéuticos, unas secuencias reguladoras de la transcripción o de la replicación, unas secuencias antisentido modificadas o no modificadas, unas regiones de unión a otros componentes celulares, etc. Se pueden dirigir en particular a la síntesis de un polipéptido específico de un agente infeccioso o ser capaces de corregir una deficiencia genética o adquirida.

En el sentido de la invención, por gen terapéutico se entiende en particular cualquier gen que codifica para un producto proteico que presenta un efecto terapéutico. El producto proteico codificado de este modo puede ser una proteína, un péptido, etc. Dicho producto proteico puede ser homólogo con respecto a la célula diana (es decir, un producto que normalmente se expresa en la célula diana cuando ésta no presenta ninguna patología). En tal caso, la expresión de una proteína permite, por ejemplo, paliar una expresión insuficiente en la célula o la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa debido a una modificación, o incluso de sobreexpresar dicha proteína. El gen terapéutico puede asimismo codificar para un mutante de una proteína celular, que presenta una estabilidad aumentada, una actividad modificada, etc. El producto proteico puede asimismo ser heterólogo con respecto a la célula diana. En tal caso, una proteína expresada puede, por ejemplo, completar o aportar una actividad deficiente en la célula, lo que permite luchar contra una patología o simular una respuesta inmunitaria.

De entre los productos terapéuticos en el sentido de la presente invención, se pueden citar más particularmente las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfoquinas como las interleuquinas, interferones, TNF, etc., los factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento vascular endotelial, el factor de crecimiento insulin-like y los factores de crecimiento de fibroblasto, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos tales como BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 y HARP/pleiotrofina, la distrofina o una minidistrofina, la utrofina, la proteína CFTR asociada a la mucoviscidosis, los genes supresores de tumores como p53, Rb, Rap1A, DCC y k-rev, los genes que codifican para unos factores implicados en la coagulación del tipo factores VII, VIII y IX, los genes que intervienen en la reparación del ADN, los genes suicidas (timidina quinasa, citosina desaminasa), los genes de la hemoglobina u otros transportadores proteicos, los genes que corresponden a las proteínas implicadas en el metabolismo de los lípidos, del tipo apolipoproteína seleccionada de entre las apolipoproteínas A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J y Apo(A), las enzimas del metabolismo como, por ejemplo, la lipoproteína lipasa, la lipasa hepática, la lecitina-colesterol acetiltransferasa, la 7 \alpha colesterol hidroxilasa, la fosfatasa ácida o incluso unas proteínas de transferencia de lípidos como la proteína de transferencia de los ésteres de colesterol y la proteína de transferencia de los fosfolípidos, una proteína de unión de las HDL o incluso un receptor seleccionado, por ejemplo, de entre los receptores LDL, receptores de los quilomicrones remanentes y los receptores scavenger, la eritropoyetina , la proteínquinasa C3, etc.

El ácido nucleico terapéutico puede asimismo ser un gen o una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula diana permite controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm celulares. Tales secuencias pueden, por ejemplo, transcribirse en la célula diana en ARN complementarios de los ARNm celulares y bloquear de este modo su traducción en proteínas. Los genes terapéuticos comprenden asimismo las secuencias que codifican para los ribozimas, que son capaces de destruir selectivamente unos ARN diana.

Tal como se ha indicado anteriormente, el ácido nucleico puede presentar también uno o varios genes que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o en el animal una respuesta inmunitaria. En esta forma de realización particular, la invención permite por lo tanto la preparación o bien de vacunas o tratamientos de inmunoterapia aplicados a humanos o a animales, en particular contra microorganismos, virus o cánceres. Se puede tratar en particular de péptidos antigénicos específicos del virus de Epstein Barr, del virus VIH, del virus de la hepatitis B, del virus de la pseudo-rabia, del "syncitia forming virus", de otros virus o incluso específicos de tumores.

Preferentemente, el ácido nucleico comprende asimismo unas secuencias que permiten la expresión del gen terapéutico y/o del gen que codifica para el péptido antigénico en la célula u órgano deseado. Se puede tratar de unas secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del gen considerado cuando dichas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada. Se puede asimismo tratar de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas o incluso sintéticas). En particular, se puede tratar de unas secuencias promotoras de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras obtenidas del genoma de la célula que se desea infectar. Asimismo, se puede tratar de secuencias promotoras obtenidas del genoma de un virus. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los promotores de genes E1A, MLP, CMV, RSV y los promotores tisulares específicos como los promotores de las cadenas de miosina por ejemplo, etc. Además, dichas secuencias de expresión se pueden modificar por adición de secuencias de activación, de regulación, etc. Se puede tratar también de un promotor, inducible o represible.

Por otra parte, el ácido nucleico puede asimismo presentar, en particular corriente arriba del gen terapéutico, una secuencia señal que dirige el producto terapéutico sintetizado en las vías de secreción de la célula diana. Dicha secuencia señal puede ser una secuencia señal natural del producto terapéutico, pero también puede tratarse de cualquier otra secuencia señal funcional, o de una secuencia señal artificial. El ácido nucleico puede asimismo presentar una secuencia señal que dirige el producto terapéutico sintetizado hacia un compartimiento particular de la célula.

Además del compuesto de fórmula general (I), las composiciones reivindicadas pueden comprender uno o varios adyuvantes y en particular un agente tensioactivo.

A título representativo de dichos adyuvantes, se pueden citar más particularmente las celulosas, como la carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, las sales hialuronato o alginato, las pectinas, los polietilenglicoles, los dextranos, las polivinilpirrolidonas, los quitosanos, los alcoholes polivinílicos, los propilenglicoles, los acetatos de polivinilo, las lecitinas, los ácidos polilácticos y polihidroxibutíricos y los poloxámeros de la serie Pluronic® (POE-PPO-POE) y Pluronic® inversos (PPO-POE-PPO).

Las composiciones según la invención pueden asimismo utilizar uno o varios elementos de marcado que permiten dirigir los complejos nucleicos hacia sus receptores o a unos ligandos en la superficie de la célula. A título de ejemplo, la composición de la presente invención puede comprender uno o varios anticuerpos dirigidos contra unas moléculas de la superficie celular, o incluso uno o varios ligandos de los receptores de membrana como la insulina, la transferrina, el ácido fólico o cualquier otro factor de crecimiento, citoquinas o vitaminas. De forma ventajosa, la composición puede utilizar unas lectinas, modificadas o no, con el fin de marcar unos polisacáridos particulares en la superficie de la célula o sobre la matriz extracelular cercana. También se pueden utilizar unas proteínas con unos radicales RGD, unos péptidos que contiene un tándem de radicales RGD, cíclico o no, así como unos péptidos polilisina o unos péptidos ligandos, naturales o sintéticos.

El compuesto de fórmula general (I) se puede incorporar a razón de 0,005% a 15% en peso/volumen de dicha composición y más preferentemente entre 0,01% y 10% en peso/volumen.

Las composiciones reivindicadas se obtienen mediante una mezcla del ácido nucleico considerado con por lo menos un compuesto de fórmula general (I) en el seno de una solución compatible con una administración in vivo. A título ilustrativo, dichas composiciones se pueden preparar con la ayuda del protocolo siguiente: mezcla, volumen a volumen, de una solución que contiene ácido nucleico (en particular ADN) dos veces concentrado en 300 mM de NaCl o medio Tyrode 2X (dos veces concentrado) y de una solución acuosa que contiene un compuesto de fórmula general (I) dos veces más concentrado. Se agita el conjunto, preferentemente con la ayuda de un vortex.

Asimismo, se ha observado que los compuestos de fórmula general (I) reivindicados permiten aumentar la cantidad de proteína sintetizada por el músculo en un factor que varía de 5 a 20 comparativamente con el ADN desnudo. Por otra parte, con la composición según la invención no se ha observado la expresión de un transgen en unas células en cultivo in vitro, utilizando los métodos clásicos de cultivo celular.

Preferentemente, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, en particular para la inyección directamente a nivel del órgano deseado o para una administración por vía tópica, por ejemplo en la piel y/o mucosas. Se puede tratar en particular de soluciones estériles, isotónicas o unas composiciones secas, en particular liofilizadas, que por adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables.

Resulta evidente que las dosis de ácido nucleico utilizadas para la inyección así como el número de administraciones se pueden adaptar a diferentes parámetros y en particular en función del modo de administración considerado, de la patología referida, de la naturaleza del gen a expresar o incluso de la duración del tratamiento investigado.

En lo que se refiere más particularmente al modo de administración, se puede tratar o bien de una inyección directa en los tejidos o en las vías circulatorias, o bien de un tratamiento de la célula en cultivo seguido de la reimplantación in vivo por inyección o trasplante.

La composición reivindicada se manifiesta particularmente ventajosa para una administración interna.

En el sentido de la presente invención, administración interna significa que las composiciones reivindicadas son compatibles con una administración en el tejido de un organismo, por ejemplo un músculo, por vía intradérmica o subcutánea. Por otra parte, las vías tópicas, oral, pulmonar, nasal y en mucosas tales como la bucal, vaginal o rectal son susceptibles de ser utilizadas.

Las composiciones según la invención son particularmente ventajosas en el plano terapéutico.

De este modo, las aplicaciones potenciales se encuentran en el campo de la terapia génica y en particular en la producción por un tejido muscular de una proteína de interés terapéutico, local o sistémica.

En efecto, después de la transferencia de genes en el músculo, en presencia de por lo menos una molécula de fórmula general (I), este órgano puede servir de reservorio de síntesis de proteínas heterólogas que van a reaccionar o bien a nivel local (factor angiogénico …) o sistémico (factor de coagulación, de crecimiento, insulina…).

Además, la composición reivindicada puede permitir abolir el efecto meseta obtenido con el ADN desnudo. En efecto, cuando la cantidad de ADN inyectada en el músculo aumenta, la transfección aumenta linealmente hasta una dosis determinada, y después la cantidad de proteína expresada llega a un nivel límite. Por el contrario, con unas formulaciones según la invención, la cantidad de proteína expresada aumenta exponencialmente con el aumento de la cantidad de ADN inyectada en el músculo.

Otra aplicación apunta al campo de la vacunación. En este caso, se inyecta en unas células preferentemente musculares, un ADN que codifica para un antígeno bacteriano, vírico u otro. En la medida en la que las composiciones reivindicadas resultan particularmente ventajosas para aumentar la cantidad de proteína sintetizada por las células transfectadas, es posible, gracias a ello, obtener unas concentraciones más importantes de anticuerpos y de linfocitos T citotóxicos.

La presente invención tiene asimismo por objeto la utilización de un compuesto de fórmula general I o de una de sus sales orgánica o mineral a título de vector para la transferencia celular in vivo de por lo menos un ácido nucleico definido según la invención.

Está asimismo comprendida en el alcance de la invención la utilización de un compuesto de fórmula general I tal como se ha definido anteriormente para la preparación de una composición destinada a asegurar la transferencia celular in vivo de por lo menos un ácido nucleico.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento de transfección celular in vivo de por lo menos un ácido nucleico caracterizado porque se administra dicho ácido nucleico conjuntamente con por lo menos un compuesto de la fórmula general I tal como se ha definido anteriormente o una de sus sales orgánica o mineral.

La administración se puede realizar por vía tópica, directamente en las células consideradas o según una de las vías de administración presentadas anteriormente.

Según una variante privilegiada de la invención, las células diana son unas células musculares o cardíacas.

Según una forma de realización preferida, se utiliza poloxamina 304, a título de vector para transferir un ácido nucleico in vivo en las células musculares, o sobre todo cardíacas.

La poloxamina 304 se formula en el seno de una composición que contiene medio Tyrode.

La presente invención se describirá mejor con la ayuda de los ejemplos y figuras siguientes, que deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos.

Las formulaciones formuladas con NaCl no forman parte de la invención patentada y se han mencionado en los ejemplos a título comparativo.

Figuras

Figura 1: Expresión de la luciferasa después de la inyección intramuscular de ADN formulado según la invención.

Figura 2: Observación macroscópica de la actividad \beta-galactosidasa después de la inyección, en el tibial anterior de un ratón, del ADN formulado según la invención.

Figura 3: Observación al microscopio de fluorescencia de la expresión de GFP en una célula muscular.

Figura 4: Representación de la expresión de \beta-galactosidasa en el tibial anterior después de la inyección por electrotransferencia de dicho ADN o formulado según la invención.

Figura 5: Observación al crio-microscopio electrónico. La poloxamina 904 al 10% se mezcla con el ADN a 0,15 mg/ml o bien en NaCl (a,B) 150 mM o bien en medio Tyrode (NaCl 140 mM , KCl 6 mM, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 2 mM, Hepes 10 mM pH 7,4 y glucosa 10 mM) (C,D,E), Barra de escala 100 nm.

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Materiales

Los compuestos de fórmula general (I) ensayados se presentan a continuación en la tabla 1 que recoge sus características fisico-químicas:

TABLA 1

Molécula	MW (g/mol)	% óxido de	Número de	Número de	OE/OP
Poloxamina		etileno	óxido de	óxido de
			etileno	propileno
304	1650	40	15	16	0,93
704	5500	40	50	56	0,89
904	6700	40	61	68	0,89
908	25000	80	454	85	5,3

Ejemplo 1 Transfección in vivo en el músculo en presencia de un compuesto de fórmula general (I) - Preparación de las muestras

Se han considerado dos concentraciones optimizadas para cada uno de los productos ensayados.

Cada ensayo utiliza 15 \mug de ADN en 50 \mul de NaCl 150 mM asociados a dos concentraciones diferentes de un compuesto de fórmula general (I) ensayado.

Las concentraciones ensayadas son para el compuesto 904 respectivamente 0,01% y 0,1% para el compuesto 704: 0,25% y 0,5% para el compuesto 304: 5% y 10%.

Se formula una muestra control de ADN en ausencia de compuestos de fórmula general (I).

Cada muestra formulada de este modo se inyecta en el tibial anterior de ratones Swiss de siete semanas de edad. Después de siete días, se sacrifican los ratones y se diseca el tibial anterior inyectado y después se tritura en un tampón de lisis en presencia de una mezcla de inhibidores de proteasas de Roche Diagnostics. Se mide la actividad de la luciferasa en el sobrenadante por luminometría (Vector 2 de Perkin Elmer, Les Ulls, Francia) utilizando un estuche de medición Luciferase Assay System ® suministrado por Promega (Charbonières, Francia).

La figura 1 resume los resultados obtenidos.

Señalamos que la presencia de un compuesto de fórmula general (I) permite mejorar significativamente la expresión de la actividad luciferasa en un factor que varía de 10 a 15.

Ejemplo 2 Transferencia del gen codificante para la \beta-galactosidasa en un músculo esquelético

De la misma forma que en el ejemplo 1, se inyecta en el tibial anterior del ratón: ADN desnudo (A), unas formulaciones según la invención que contienen 5% (B) o 10% del compuesto 304 (C), 0,01% (D) y 0,01 del compuesto 904 (E).

Siete días después de las inyecciones, se comprueba la expresión de la \beta-galactosidasa por observación macroscópica de los músculos que han recibido las formulaciones según la presente invención. Presentan unas zonas de fibras que expresan \beta-galactosidasa y que se vuelven azules después del revelado al sumergir los músculos en una solución que contiene MgCl_{2} 2 mM, ferricianuro potásico, ferrocianuro potásico, PBS 5 mM, a pH 7 y en presencia de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-\beta-d-galactopiranósido a 1 mg/ml. Se fotografían los músculos 24 horas después de la incubación en dicha solución a una temperatura de 37ºC. Los músculos que no han recibido el ADN desnudo no permiten visualizar una expresión de la \beta-galactosidasa.

La figura 2 ilustra dichos resultados.

Ejemplo 3 Análisis histológico de la expresión de la Green-Fluorescent Protein (GFP) 7 días después de la inyección de 50 \mug de ADN desnudo (A) o de 50 \mug de ADN formulado según la invención

Las formulaciones según la invención probadas son:

- el compuesto 304 al 5% (peso/v) (B);

- el compuesto 705 al 0,25% (peso/v) (C);

- el compuesto 904 al 0,1% (peso/v) (D) y

- el compuesto 908 al 10^{-3} % (peso/v).

La expresión de la GFP se comprueba siete días después de la inyección de las formulaciones para la observación de un corte de tejido montado entre una lámina y un cubreobjetos, y posteriormente examinado al microscopio de fluorescencia. La figura 3 permite comprobar que el número de fibras musculares que expresan la GFP es mucho más importante que cuando el ADN se formula con el compuesto 304 al 5% (B), 704 al 0,25% (C) y 904 al 0,1% (D). En el caso particular del ADN formulado con el 908 al 10^{-3}% (E), se ha observado que el número de fibras transfectadas es equivalente al obtenido con el ADN desnudo.

Las formulaciones según la presente invención permiten por consiguiente una transfección por lo menos tan eficaz, preferentemente claramente superior, que el ADN desnudo. Dichos resultados confirman el interés de las formulaciones reivindicadas para la expresión de una proteína de interés terapéutico local o sistémico.

Ejemplo 4 Comparación de la eficacia de transfección en el músculo de las formulaciones según la presente invención con respecto a la electrotransferencia

En cuanto a la electrotransferencia, se inyectaron 50 \mug de ADN que codifica para la \beta-galactosidasa en el labial craneal de ratones Swiss de 8 semanas de edad, y después se sometió el músculo a las condiciones siguientes. En cuanto a las formulaciones, se mezclaron 50 \mug de ADN PCMV-\beta-gal con el 304, 704 y 904 y después se inyectaron en los labiales craneales de los ratones.

El procedimiento de electrotransferencia es uno de los procedimientos no virales que permite la mejora de la transfección in vivo en el músculo esquelético.

El procedimiento de electrotransferencia considerado en el marco del presente ensayo comparativo consiste en someter un músculo a un campo eléctrico de 200 V/cm con 8 impulsos de 20 ms a una frecuencia de 2 Hz. Dicho ensayo se valida mediante la expresión de la \beta-galactosidasa en el músculo.

La figura 4 presenta los resultados obtenidos. Se constata que la inyección de ADN desnudo en el músculo sometido a electrotransferencia permite obtener, 7 días después de la inyección, 10 \mug de \beta-galactosidasa sintetizada por el músculo. Las formulaciones de ADN 304 al 10% (peso/v) y de ADN 704 al 0,25% (peso/v) permiten obtener la síntesis respectivamente de 14 y 11 \mug de \beta-galactosidasa/músculo.

Las formulaciones de la presente invención permiten obtener por lo menos la misma eficacia de transfección, o incluso mejor, que la del ADN electrotransferido. Además, la presente invención tiene como ventaja clara el no necesitar ningún equipo particular y de ser mucho más simple de utilizar ya que es suficiente con mezclar el compuesto (I) con el ADN plasmídico. Por último, es importante destacar que la electrotransferencia no se puede aplicar para la transferencia de genes en el músculo cardíaco, contrariamente a las formulaciones según la presente invención.

La eletrotransferencia es además una técnica dolorosa y necesita una anestesia por lo menos local sino general.

Ejemplo 5 Morfología, observada por crio-microscopia electrónica, de las partículas poloxamina/ADN en función del medio de formulación

Se han formulado unas partículas de poloxamina 904/ADN o bien con NaCl (150 mM) o bien con medio Tyrode (medio que contiene CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 2 mM, KCl 6 mM, NaCl 140 mM , glucosa 10 mM y Hepes 10 mM pH 7,4).

Por ejemplo, la medición del potencial zeta de la poloxamina 904 en el medio Tyrode presenta un valor de + 9,5 mV lo que prueba la utilización catiónica de la poloxamina cuando se asocia con el ADN en presencia del medio Tyrode.

La morfología de las partículas se observa a continuación por crio-microscopia electrónica. La figura 5 resume la observación.

Cuando son formuladas con NaCl (150 mM), las moléculas de ADN se agregan unas contra las otras en presencia de poloxaminas 904 para formar unas estructuras bastante "sueltas" de gran tamaño, mientras que con el medio Tyrode, las moléculas de ADN forman unas pequeñas partículas esféricas con las poloxaminas 904 (figuras 5C, D y E). Se ha podido realizar la misma observación con la poloxamina 304.

De este modo, controlando el pH y la composición iónica del medio y en particular la presencia de CaCl_{2}, se generan unas pequeñas partículas esféricas y presentarían de forma verosímil un poder de difusión aumentado en los tejidos.

Ejemplo 6 Influencia del medio de formulación sobre la eficacia de transfección de las formulaciones poloxamina/ADN del NaCl y del medio Tyrode

Se inyectaron 50 \mul de formulaciones que contienen 15 \mug de ADN plasmídico que codifica para la luciferasa, en el tibial anterior de ratones Swiss de 8 semanas de edad. Se extrajeron los músculos 7 días más tarde, se trituraron y se cuantificó la actividad de la luciferasa.

La tabla siguiente muestra que la cantidad de proteína producida por el músculo esquelético es superior cuando las formulaciones se preparan en medio Tyrode.

Poloxamina	Medio de formulación	Luciferasa (ng/músculo)
704 0,5% (p/v)	NaCl	94
Poloxamina	Medio de formulación	Luciferasa (ng/músculo)
704 0,5% (p/v)	Tyrode	625
904 0,01% (p/v)	NaCl	74
904 0,01% (p/v)	Tyrode	971
904 0,1% (p/v)	NaCl	78
904 0,1% (p/v)	Tyrode	519

Ejemplo 7 Transferencia in vivo en el corazón de un gen que codifica para la \beta-galactosidasa en presencia de un compuesto de fórmula general (I) Preparación de las muestras

Cada ensayo utiliza 200 \mug de ADN plasmídico que contiene el gen que codifica para la \beta-galactosidasa y un polímero en 700 \mul de medio Tyrode.

Se ensayaron los polímeros PE 6400, para la muestra control y las poloxaminas 304, 704 y 904 a las concentraciones (en peso/volumen) de 0,5%, 2,5%, 0,75% y 0,1% respectivamente.

Se inyectó cada muestra, formulada de este modo, en el saco pericárdico de ratas adultas de aproximadamente 200 g después de haber atravesado el diafragma. Se extrajeron los corazones, 7 días después de la inyección, y se analizaron mediante histología para revelar la actividad \beta-galactosidasa. Sólo las formulaciones a base de poloxamina permiten transfectar unos cardiomiocitos en el ventrículo izquierdo y es en particular la poloxamina 304 la que proporciona mejores resultados. Con la poloxamina 304, se ha observado que unos cardiomiocitos que expresan la \beta-galactosidasa y por lo tanto se tiñen de azul, estaban presentes en 2/3 de la profundidad de la masa ventricular, lo que demuestra su importante poder de difusión.

Claims

1. Composición farmacéutica, caracterizada porque asocia a por lo menos un ácido nucleico por lo menos una sal mineral del copolímero tetrafuncional de fórmula (I)

102

utilizado en forma catiónica

en la que x e y representan independientemente el uno del otro un número entero comprendido entre 1 y 500, y presentando x un valor tal que dicha molécula comprende por lo menos 30% en peso de grupos óxido de etileno, estando dicha composición formulada en medio Tyrode, es decir NaCl 140 mM , KCl 6 mM, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 2 mM, Hepes 10 mM pH 7,4 y glucosa 10 mM.

2. Composición según la reivindicación anterior, caracterizada porque el compuesto de fórmula general (I) presenta por lo menos 85% en peso de grupos óxido de etileno.

3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el compuesto de fórmula general (I) presenta entre 35 y 50% en peso de grupos óxido de etileno.

4. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el compuesto de fórmula general (I) presenta un peso molecular de por lo menos 800 g/mol y más preferentemente comprendido entre 1.000 y 25.000 g/mol.

5. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la relación OE/OP está comprendida entre 0,5 y 1,5 y preferentemente del orden de 1 \pm 0,2.

6. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque dicha molécula se selecciona de entre las moléculas que presentan un peso molecular de 1.650 g/mol con una relación OE/OP de 15:16, un peso molecular de 5.500 g/mol para una relación OE/OP 50:56 y un peso molecular de 6.700 g/mol para una relación OE/OP 61:68.

7. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el compuesto de fórmula general (I) está presente a razón de 0,005% a 15% en peso/volumen y más preferentemente entre 0,01% y 10% en peso/volumen.

8. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el compuesto de fórmula general (I) comprende además por lo menos un grupo de marcado intra- o extracelular seleccionado de entre un anticuerpo, un ligando de receptor de membrana, una lectina, una proteína con un grupo RGD.

9. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucleico.

10. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido ribonucleico.

11. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque el ácido nucleico está modificado químicamente.

12. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el ácido nucleico es un antisentido.

13. Composición según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el ácido nucleico es un ARN de interferencia.

14. Composición según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el ácido nucleico presenta un gen terapéutico.

15. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 14 preparada mediante la mezcla volumen a volumen, de una solución dos veces concentrada que contiene el ácido nucleico y Tyrode y una solución acuosa dos veces concentrada que contiene el copolímero tetrafuncional.

16. Utilización de una composición según una de las reivindicaciones 1 a 15 para la preparación de una composición destinada a asegurar la transferencia celular in vivo de por lo menos un ácido nucleico.

17. Utilización según la reivindicación 16, en la que la transferencia in vivo es una transferencia en unas células musculares.

18. Utilización según la reivindicación 16, en la que la transferencia in vivo es una transferencia en unas células cardíacas.

19. Utilización según la reivindicación 18, caracterizada porque el compuesto de la fórmula (I) es la poloxamina 304 formulada con medio Tyrode, es decir NaCl 140 mM , KCl 6 mM, CaCl_{2} 3 mM, MgCl_{2} 2 mM, Hepes 10 mM pH 7,4 y glucosa 10 mM.