JP6774878B2 - Rnaの細胞内送達のための、キャップされた及びキャップされていないrna分子およびブロックコポリマー - Google Patents

Rnaの細胞内送達のための、キャップされた及びキャップされていないrna分子およびブロックコポリマー Download PDF

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Description

本発明は、遺伝子治療の分野に、そしてより特別にはメッセンジャーRNA(mRNA)のようなRNA分子のベクター化に関する。特に、mRNAのためのビヒクルとしての四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの使用に、本発明は関する。
より具体的には、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーによる、キャップされた及びキャップされていないmRNAのベクター化に、本発明は関する。
本発明は、遺伝子治療の分野に、そしてより特別にはメッセンジャーRNA(mRNA)のようなRNA分子のベクター化に関する。特に、メッセンジャーRNAのためのビヒクルとしての四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの使用に、本発明は関する。
化合物そしてより特別にはRNA分子の細胞内送達の技術分野において、種々の戦略が提案されてきた。
特に、多数の非ウイルスカチオンベクターまたはカチオントランスフェクション剤が合成されてきており、今日では培養細胞中へと核酸を送達するために利用されている。非ウイルス遺伝子送達の原理は、静電気力を通した、核酸とベクター上に存在するカチオン残基との相互作用に依存する。
WO2003018603A1は、トランスフェクションのためのアミノグリコシドの脂質誘導体に関する。この文献は、核酸送達のためのナノキャリアとして、リポアミノグリコシドの使用を教示している。アミノグリコシドである極性の先端部、1つのスペーサ、及びジオレイル鎖および/またはコレステロールから成ることができる疎水性末端部から、このようなリポアミノグリコシドは一般に構成される。このようなトランスフェクション試薬の例は、DOSP、DOST、DOSK、DOSN、CHOLP、CHOLT、CHOLK、およびCHOLNを含む。それらのトランスフェクション試薬は、薄層状複合体を形成する傾向がある。それらはin vitroではトランスフェクション試薬として有効であると証明されたが、in vivoまたはin situにおいては、比較的効率が小さい傾向がある。
WO2010026537A1は細胞内送達のための安定化されたマルチモジュラーの自己組織体に関し、それは少なくとも一つのカチオントランスフェクション剤、少なくとも一つの負に荷電する巨大分子、そして立体的コロイドスタビライザーとして作用する少なくとも一つの両親媒性ブロックコポリマーから構成されている。
より最近では、グリコシル化された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーも、WO2013128423A1中で免疫アジュバントとして報告された。
しかしながら、RNA分子およびより特にはメッセンジャーRNAのトランスフェクションは、生体内での満足なタンパク質生産に必ずしもつながらず、これは、劣ったトランスフェクション効率および/またはトランスフェクションされたRNA分子が一旦内在化されると、それらの安定性の不足に、一部起因し得る。
その上、それらのシステムは多くは、DNAタイプの核酸のために、今までは用いられていた。
このように、RNA分子についての、そしてヒトの使用および治療に適している良好な安全性プロフィールを有する、新規トランスフェクション試薬の必要性が依然としてある。
細胞内送達、およびより具体的には遺伝子治療および/または遺伝子サイレンシングを改良する新規方法の必要性もある。
特に、メッセンジャーRNAのような核酸の効率的な細胞内送達だけでなく、in vivoでの効率的なタンパク質発現および/または制御された免疫応答を更に提供できる方法および試薬を提供する必要性が残っている。
宿主にRNA分子をトランスフェクションするための新規戦略の必要性もあり、そしてそれは遺伝子治療および/または遺伝子サイレンシングの場面において、長時間持続する効果を更に提供できる。
本発明の目的は、それらの必要性を満たすことである。
このように、本発明の第1の目的は、遺伝子治療のための細胞内送達のための、キャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルとして、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを使用する方法に関する。
特に、下記の実施例において、詳述されているように、(i)キャップされていないRNA分子、より特別にはキャップされていないmRNA分子と、(ii)本発明のブロックコポリマーの組み合わせが、in vivoタンパク質発現を導くことを、発明者らは予想外に観測した。
ビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーとともにトランスフェクションされたメッセンジャーRNA分子が、特定の免疫反応の誘導がほとんどなしにin vivoトランスフェクション効率をもたらしたことを彼らは観察した。
C57Bl6マウス骨格筋中のβ−ガラクトシダーゼ発現及びβ−ガラクトシダーゼに対する免疫反応への、mRNAキャッピングおよび/またはヌクレオチド修飾の影響を示すグラフである。 C57Bl6マウス骨格筋中のβ−ガラクトシダーゼ発現及びβ−ガラクトシダーゼに対する免疫反応への、mRNAキャッピングおよび/またはヌクレオチド修飾の影響を示すグラフである。 培養中の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現への、mRNAキャッピングおよび/またはヌクレオチド修飾の影響を示すグラフである。 ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリットを示すグラフである。 ブロックコポリマー/RNA製剤および704/DNA製剤(B)を筋肉内注射されたマウス中のヘマトクリットの変化を示すグラフである。 ブロックコポリマー/RNA製剤および704/DNA製剤(B)を筋肉内注射されたマウス中のヘマトクリットの変化を示すグラフである。 20.10−4%の704によって製剤化されたmRNAの筋肉内注射後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 種々の濃度の704によって製剤化されたmRNAの筋肉内注射後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 裸の、又は14463g/molの四官能性PEO−PPO両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 裸の、又は7423g/molの四官能性PPO−POE両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 裸の、又は8996g/molの四官能性PLA−POE両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 裸の、又は7332g/molの四官能性POE−PPO両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現を示すグラフである。 ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット及びEPOのレベルを示すグラフである。 ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット及びEPOのレベルを示すグラフである。 本発明のブロックコポリマーと組み合わされたキャップされていずかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のβ−ガラクトシダーゼ発現を示すグラフである。 ブロックコポリマー904および10257存在下で、第0および21日目にキャップされかつ修飾されていないmRNAの2回の筋肉内注射後の第35日目のマウスの体液応答を示すグラフである。
このように、 mRNAのようなRNA分子と本発明のブロックコポリマーとの特定の組み合わせが、遺伝子治療のための細胞内送達の為に特別に効率的であることを、発明者らは本明細書において示す。
RNA一次転写物が成熟RNAに成るためには、複数の同時転写修飾を経なければならないことが当分野で知られていたので、この結果は予想外であった。特に、未成熟RNA転写物のいわゆる「キャッピング」工程が、効率的な遺伝子発現およびRNA安定性にとって重要であることが長年知られていた( Hocine et al.;"RNA Processing and Export"; Cold Spring Harb Perspect Biol.; 2010.参照。 Schoenberg et al.;"Re-capping the message";Trends Biochem Sci.; 2009参照。)。
より驚くべきことに、ビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーでRNA分子をトランスフェクションさせることによって、前記トランスフェクションが、非自己認識および/または先天性免疫刺激および抗ウイルス性先天性免疫をトリガーしないか、又は少なくとも非常に限られた様式でトリガーすることがいま示された。
RIG−I(配列番号SEQ ID No 4)は、最初1997年にレチノイン酸誘導性遺伝子として報告され(GenBank:AF038963)、そしてパターン認識受容体(PRR)ファミリーに属する。それは、ウイルスRNAを検出すると、1型インターフェロン発現をトリガーすることでも公知である。
理論に束縛されることなく、本発明の組合せがいかなるRIG−I依存性応答をもトリガーしない、または少なくとも非常に限られた様式でトリガーし、これはトランスフェクションされたRNA分子のより高い安定性をもたらすと考えられる。
ウイルス由来のRNAのような、外在性(非宿主)RNA分子の先天性免疫認識に大きく関連する、RIG−I(レチノイン酸誘導性遺伝子I)レセプターが、キャップされていないRNA分子と特異的に相互作用することが当技術分野で公知であるので( Kolakofsky et al.;"A structure-based model of RIG-I activation";RNA; 2012参照)、この別の結果も予想外であった。
より驚くべきことに、mRNAのようなキャップされていない又はキャップされた、かつ修飾されたRNA分子は、細胞内送達のために、そして本発明のブロックポリマーと組み合わされてin vivoでのタンパク質発現をトリガーするために効率的でもあることが本明細書中に示されている。
特に、(i)キャップされていずかつ修飾された、またはキャップされていずかつ修飾されていないRNA分子と、(ii)ビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーの組合せが特別に効率的な組合せであり、かつ遺伝子治療のための細胞内送達だけのためではない、有望なツールであることも本願明細書において、示されている。
理論に捕らわれることなく、この組合せはRNAとTLR3、TLR7及びTLR8のようなToll様レセプターとの相互作用( Kormann et al.;"Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice";Nature Biotechnology; 2010参照)を排除することに関しても効率的であると考えられる。
換言すれば、(i)RNA分子および(ii)本発明のブロックコポリマーの特定の組み合わせが、効率的な細胞内伝達、並びに免疫系の活性化の減少を、おそらくパターン認識レセプターへのin vivoでの結合の驚くほどの減少により、提供すると考えられる。
特に、RIG−Iに依存する、及びToll様レセプター(TLR)に依存する経路の活性化の驚くほどの減少が、両方とも(i)キャップされていないmRNAと(ii)本発明のブロックコポリマーの、in vivoタンパク質発現効率についての(Katze et al.;"Innate immune modulation by RNA viruses: emerging insights from functional genomics"; Nature Reviews Immunology; 2008)相乗効果の原因であり得ると提唱される。アミノ酸配列すなわちRIG−I(SEQ ID No 3)は、単に参考のために本願明細書において示されている。
実施例から示さているように、この驚くほど高いin vivoでのタンパク質発現効率は、ビヒクルとして本発明のブロックコポリマー(例えば四官能性ブロックコポリマー704)を含むナノキャリアに特有である。
所定の核酸の真核細胞へのトランスフェクションに対応する免疫系の活性化の減少は、EPOまたはβ−ガラクトシダーゼに関して材料と方法の個所に記載されているプロトコ−ルのいずれか一つを使用して、評価されることができる。
この活性化の減少は、以下の両方に伴うタイプIまたは液性免疫応答の減少に対応し得る:
(i) 全脾臓CD8+細胞のうちのCD8+IFNγ+セルのパーセンテージの低いか中程度の変化、および/または
(ii)
トランスフェクションされたRNA分子によってコードされた組換えタンパク質に向けられた抗体の低いか中程度の産生。
さらに、本発明のブロックコポリマーが低濃度であってさえ、発現の効率が観察されるということを、発明者らは予想外に発見した。このように、DNAの最適なin vivo送達のために使用されるより75倍低い濃度である20.10−4%(w/v)のような低い濃度でブロックコポリマーを使用できる。
所定のタンパク質の発現に適しているメッセンジャーRNAと組み合わされた本発明のブロックコポリマーの投与の後の、前記タンパク質の発現レベルに基づいて、発現の効率を評価できる。次に該発現レベルは、裸のmRNA(前記ブロックコポリマーを有さない)の投与の後に決定された対照値と比較される。
mRNAとともに投与されたブロックコポリマーの量がタンパク質の発現レベルに影響を及ぼすかも知れないので、前記タンパク質の発現レベルと投与量の間の比(すなわち所定の投与量の総体積に対する重量パーセンテージとして表される)として、発現の効率は評価されることもできる。
発現レベルを決定する方法は、特にβ−gal、EPO、およびルシフェラーゼ発現に関して、材料と方法の個所において更に詳述される。
例えば、所定のブロックコポリマーに関する発現効率は、マウスにおいて、in vivoで以下により評価されることができる:
(i) 前記β−gal、EPOおよび/またはルシフェラーゼをコードするmRNAと組み合わせて所定のブロックコポリマーを、マウスに、好ましくは筋肉内注射で投与すること、
(ii) 前記マウスにおける前記β−gal、EPOおよび/またはルシフェラーゼの発現レベルを測定すること、
(iii) 工程(ii)で測定された発現レベルを対照値と比較するか、あるいは前記発現レベルと投与量との比を対照値と比較すること。
例示的実施形態に従い、ブロックコポリマーは20.10−4%(w/v)という低濃度で投与される。
前記例示的実施形態に従い、ブロックコポリマーは約50μLの体積でマウスに投与されることができる。
また、そして一般的な方法において、所定のmRNAのための発現の増加が、その対応する「担体」の量の増加を、必ずしも直線的関係で厳密にたどるというわけではなく、換言すれば、それらの2つの値の間に厳密な相関が必ずしもあるというわけではなく、このことはつまり、飽和現象、あるいは真核宿主中の不十分な又は遅延された所定のタンパク質の発現を導き得る。
他方で、高濃度でさえ、発現の最大効率が著しく増加し得る(図7および8参照)ということも、本発明者らは予想外に発見した。
RNA分子と組み合わされた場合、このようにビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーは以下の理由により、細胞内送達および遺伝子治療に対して特に効率的である:
(i) 少量で使われる場合でさえの発現の高い効率、
(ii) 発現の最大効率、
(iii) 低い免疫原性。
その局面の1つに従い、少なくとも一つのRNA分子、および特に少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAの為のビヒクルとしての、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー(それ自体または細胞内伝達の為の)に、本発明は関する。
その局面の他の1つに従い、少なくとも一つのRNA分子、および特に少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAの為のビヒクルとしての、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含有する医薬組成物および/またはトランスフェクション試薬に、本発明は関する。
その局面のもう一つに従い、真核宿主中でのタンパク質の発現を増加、改善、または維持する治療的なおよび/または非治療的な方法に本発明は関し、そしてそれは前記宿主内で前記タンパク質をコードするのに適している少なくとも一つのRNA分子、特に少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルとして、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを前記宿主にトランスフェクションする工程を有する。
本発明に従い、「真核宿主」は、任意のヒトまたはヒト以外の哺乳類、ならびに細胞又は組織試料のような任意のイン・ビトロ(in vitro又はエクス・ビボ(ex vivoの試料を包含できる。
本発明の方法および試薬は、遺伝子治療にも適している。このように、細胞内送達のための使用のための、及び遺伝子治療の文脈において、(i)少なくとも一つのブロックコポリマー、特に少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーと、(ii)mRNAのような少なくとも一つのRNA分子との組合せに、本発明が更に関することは明白である。
遺伝子治療のために、本発明のブロックコポリマーは、少なくとも一つのRNA分子、特に1つのメッセンジャーRNA(例えばキャップされていないメッセンジャーRNA)のためのビヒクルとして役立つことができる。
その局面の他の1つに従い、遺伝子治療のための細胞内送達のために使われることを意図される薬物の製造のために、少なくとも一つのRNA分子、特に少なくとも一つのキャップされていないRNA分子の為のビヒクルとして、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを使用することに、本発明は関する。
本発明に従い、「〜を有する(comprising)」は、「〜から成る(consisting of)」を包含する。
RNA分子
これらは、天然由来又は人工の配列、そして特にmRNA(メッセンジャーRNA)、tRNA(トランスファーRNA)、rRNA(リボソームRNA)、siRNA(サイレンシングRNA)、miRNA(ミクロRNA)、mtRNA(ミトコンドリアRNA)、shRNA(短ヘアピンRNA)、tmRNA(トランスファー−メッセンジャーRNA)、vRNA(ウイルスRNA)、一本鎖,二本鎖、および/または塩基対合したRNA(それぞれssRNA、dsRNA、およびbpRNA)、平滑端またはそうでないRNA、成熟したおよび未成熟のmRNA、コーディングおよびノンコーディングRNA、オリゴヌクレオチドのハイブリッド配列または合成または半合成配列、及びそれらの修飾されたもの、混合物であっても良い。
したがって、これらはメッセンジャーRNA(mRNA)でもよく、それは成熟したおよび未成熟のmRNA、例えば前駆体mRNA(プレmRNA)又はヘテロ核mRNA(hnRNA)および成熟mRNAを包含する。このように、本発明のRNA分子は、モノシストロンおよびポリシストロン性メッセンジャーRNAも包含する。
明確の為に言うと、mRNAは任意のコーディングRNA分子を包含し、それは真核宿主によってタンパク質へと翻訳されることができる。
コーディングRNA分子は一般に、対象のタンパク質をコードする配列を含みかつ真核宿主により翻訳され得るRNA分子を指し、ここで前記配列は開始コドン(ATG)で開始し、かつ好ましくは終止コドン(すなわちTAA、TAG、TGA)により停止される。
一般的な実施形態に従い、本発明のmRNAは、以下の一般式を含むかまたはそれから成る:
[5´UTR]−[対象の遺伝子]−[3´UTR]−[PolyA]
ここで[5´UTR]及び[3´UTR]は翻訳されない領域(UTR)であり、
ここで[5´UTR]はコザック配列を有し、
ここで[対象の遺伝子]は対象のタンパク質をコ−ドする任意の遺伝子であり、
ここで[PolyA]はポリ(A)末端部であり、そして
ここで、x、y、およびzは同一であるか異なっており、0又は1に等しい。
好ましくは本発明のmRNAは、以下の一般式から成る:
[5´UTR]−[対象の遺伝子]−[3´UTR]−[PolyA]
ここで[5´UTR]及び[3´UTR]は翻訳されない領域であり、
ここで[5´UTR]はコザック配列を有し、
ここで[対象の遺伝子]は対象のタンパク質をコ−ドする任意の核酸であり、及び
ここで[PolyA]はポリ(A)末端部である。
コザック配列は、真核mRNA上に生じる一般にコンセンサス塩基配列であり、かつ翻訳プロセス開始において大きな役割を果たすところの配列を言うことに留意すべきである。コザック配列およびコザックコンセンサス塩基配列は、周知技術である。
ポリ(A)末端部が周知技術である複数のアデノシン一ホスフェートから成ることも思い起こされる。成熟したmRNAの生成の間に一般的に生じる翻訳後修飾の一つであるポリアデニル化と呼ばれている工程の間に、ポリ(A)末端部が一般に生成され、このようなポリ(A)末端部は、前記mRNAの安定性および半減期に貢献し、様々な長さであり得る。
特に、ポリ(A)末端部は10A以上のヌクレオチドであることができ、それは20A以上のヌクレオチドを含み、そして100A以上のヌクレオチド、および例えば約120Aのヌクレオチドを含む。
[3´UTR]はいかなるタンパク質も発現しない。[3´UTR]の目的は、mRNAの安定性を増大させることである。特定の実施形態に従い、不安定性がないことが公知であるので、α−グロビンUTRが選択される。
有利には、考慮される宿主内で満足なタンパク質生産を得るために、対象の遺伝子に対応する配列がコドン最適化されることができる。
本発明のRNA分子は、様々な長さでもよい。このように、それらは、例えば約100ヌクレオチド未満のRNA分子のような短いRNA分子、または約100ヌクレオチド超又は約300ヌクレオチドさえ超える長いRNA分子であってもよい。
例示的実施形態に従い、対象の遺伝子は、レポータータンパク質、例えばルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼをコ−ドしても良い。ルシフェラーゼの核酸配列(SEQ ID No 5)は、本願明細書において、もっぱら参照の為に提供されている。β−ガラクトシダーゼの核酸配列(SEQ ID No 1)およびβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸配列(SEQ ID No 2)は、本願明細書において、もっぱら参照の為に提供されている。
これらの核酸は、真核または原核由来でもよく、そしてより特別にはヒト、動物、植物、細菌、酵母、またはウイルス由来等であっても良い。当業者に公知の任意の技術によって、そして特にライブラリのスクリーニングによって、化学合成によって、あるいはライブラリのスクリーニングによって得られた配列の化学的又は酵素的修飾を含む混合された方法によって、それらは得られることが可能である。それらは、化学修飾されていてもよい。
このように、例えばmRNAのような本発明のRNA分子は、合成であるか人工のRNA分子ばかりでなく、天然に生じるRNA分子も含むことができる。
本発明に従い、例えばメッセンジャーRNA(またはmRNA)のようなRNA分子は、以下の種類を含む:
(i) キャップされかつ修飾されていないRNA分子
(ii) キャップされかつ修飾されたRNA分子
(iii) キャップされていずかつ修飾されていないRNA分子
(iv) キャップされていずかつ修飾されたRNA分子
上記の語は、更に以下に詳述される。
キャップされた及びキャップされていないRNA分子
最も一般的な実施形態に従い、「キャップされたRNA分子」は、その5´末端がグアノシンまたは修飾されたグアノシン、好ましくは5´−5´三ホスフェート結合に結合された7−メチルグアノシン(mG)に連結されたRNA分子または類似体を指す。この定義は5´キャップ、特に天然に生じるおよび/または生理学的なキャップの最も広く認められた定義に相応している。
本発明の意味において、「キャップ類似体」は、5’−5’三ホスフェート結合に結合された7−メチルグアノシン(mG)に生物学的に等しく、かつこのように真核宿主中の対応するメッセンジャーRNAのタンパク質発現を損なわずに置換されることもできるキャップを含む。
このように、「キャップされていないRNA分子」は、「キャップされたRNA分子」の定義に属さない、いかなるRNA分子をも指す。
このように、一般的で好ましい実施形態に従って、「キャップされていないmRNA」は、その5’末端が5’−5’三ホスフェート結合を介して7−メチルグアノシンに連結されていないmRNA、又は前に定義された類似体を指すことができる。
メッセンジャーRNAのようなキャップされていないRNA分子は、(5’)ppp(5’)、(5’)pp(5’)、(5’)p(5’)、または(5’)OH末端さえを有する、キャップされていないRNA分子でもよい。このようなRNA分子は、5´pppRNA、5´ppRNA、5´pRNA、5´OHRNAとそれぞれ略記されることができる。好ましくは、本発明のキャップされてないRNA分子は、メッセンジャー5´pppRNAである。
同様に、RNA分子が一本鎖RNA分子である場合は、それは5´pppssRNA、5´ppssRNA、5´pssRNA、5´OHssRNAとそれぞれ略記されることができる。
同様に、RNA分子が二本鎖RNA分子である場合は、それは5´pppdsRNA、5´ppdsRNA、5´pdsRNA、5´OHdsRNAとそれぞれ略記されることができる。
好ましくは、本発明のキャップされていないmRNAは、キャップされていない一本鎖mRNAである。
さらに好ましい実施形態によれば、キャップされていない一本鎖mRNAは、キャップされていないメッセンジャー5´pppssRNAでもよい。
非制限的であるが、前記キャップされていないRNA分子の第一の塩基は、アデノシン、グアノシン、シトシンまたはウリジンであってもよい。
このように、キャップされていないRNA分子は、(5’)ppp(5’)、(5’)pp(5’)、(5’)p(5’)、または平滑端の5’グアノシン末端さえをするキャップされていないRNA分子でもよい。
合成キャップおよび/またはキャップ類似体の例は、以下からなるリストにおいて、選択されることができる:グリセリル、逆方向デオキシ無塩基残基(部分)、4’、5’メチレンヌクレオチド、1−(β−D−エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4'−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、1 ,5−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、L−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾された塩基ヌクレオチド、スレオ−ペントフラノース−1−ヌクレオチド、非環式3',4'−セコヌクレオチド、非環式3,4−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式3,5ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、3’−3’逆方向ヌクレオチド部分、3’−3’逆方向無塩基部分、3'−2’−逆方向ヌクレオチド部分、3’−2’−逆方向無塩基部分、1 ,4−ブタンジオールホスフェート、3'−ホスホルアミダート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、3'−ホスフェート、3´ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋または非架橋メチルホスホナート部分。
合成キャップまたはキャップ類似体の他の例は、ARCAキャップ類似体、N1−メチルグアノシン、2'−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジドグアノシンを含む。
注目すべきは、合成キャップのうちで、上記キャップのいくつかは類似体として適切であり、しかし逆にタンパク質発現を妨げ得る他のものは適切ではない。このような区別は、当業者により理解される。
参考のために、そして非制限的であるが、抗逆方向キャップ類似体(Anti Reverse Cap Analog:ARCA)3´−O−Me−mG(5’)ppp(5’)G キャップ類似体の構造は、以下に示される:
Figure 0006774878
ARCAキャップ類似体は、例えば、in vitro転写の間に使用されるキャップ類似体の例であり:それは、3´OH基(mGに近接する)が−OCHで置き換えられた修飾されたキャップである。しかしながら、5’末端でARCAにより合成される転写物の100%は翻訳可能であり、翻訳に対する強い刺激効果を導く。
本発明に従い、「PRRの活性化」は、前記PRRに結合すると、先天性免疫の刺激、そしてより特別には1型インターフェロンの発現の刺激として理解される。
前記実施形態に従い、RIG−I活性化の要件は、平滑端付近にミスマッチがなく、5´三ホスフェートを有する10−20bp長の、平滑端を持ち、塩基対合しているRNA(bpRNA)であり得る。
他の実施形態に従い、RIG−I活性化の要件は、短い、平滑端5´OHbpRNAであり得る(Kolakofsky et al.; "A structure-based model of RIG-I activation";RNA; 2012参照)。
修飾された及び修飾されていないRNA分子
本発明の範囲内で、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基、例えば修飾されたプリンまたは修飾されたピリミジンを含有するRNA分子を、「修飾されたRNA分子」は指す。修飾されたヌクレオシドまたは塩基は、A、U、C、またはG(それぞれ、ヌクレオシドに関してはアデノシン、ウリジン、シチジン、またはグアノシン、及び糖部分を専ら指す場合にはアデニン、ウラシル、シトシン、またはグアニン)ではない、いかなるヌクレオシドまたは塩基であることもできる。
本発明に従い、例えば「少なくとも一つの修飾された塩基」中の表現「少なくとも1つ...」は、一つ以上の修飾された塩基を有するとして理解されるべきである。このように、この文脈において、このような語は、二つ以上の修飾された塩基を有するいかなるRNA分子、または修飾された塩基のみを包含することができる。
従って、「修飾されていないRNA分子」は、修飾されたRNA分子の定義に相応しないいかなるRNA分子も指す。
本発明の意味において、「キャップされたおよびキャップされていない」がRNA分子の5'末端の塩基に特に関係するので、本発明の意味において、語「修飾されたおよび修飾されていない」は語「キャップされたおよびキャップされていない」からはっきりと区別される。
最も好ましい実施例に従い、上記の少なくとも一つの塩基または糖の修飾、好ましくは上記の少なくとも1つの塩基の修飾を含むRNA例えばmRNAを、「修飾されたRNA分子」は指す。
非制限的であるが、修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、および塩基の例は、WO2015024667A1中に開示されている。
このように、修飾されたRNA分子は、骨格構造修飾、糖修飾、または塩基修飾を含む、修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基を含むことができる。
本発明に関連して骨格構造修飾は、本明細書で定義されるようなRNA分子中に含まれるヌクレオチドの骨格構造のホスフェートが化学修飾さるところの修飾を包含する。
本発明に関連して糖修飾は、本明細書で定義されるようなRNA分子のヌクレオチドの糖の化学修飾を包含する。
本発明に関連して塩基修飾は、RNAのヌクレオチドの塩基部分の化学修飾を包含する。この文脈において、真核細胞中のRNA分子の転写および/または翻訳に適しているヌクレオチド類似体から、ヌクレオチド類似体または修飾体は好ましくは選択される。
糖修飾は、2’ヒドロキシ(OH)基の置換または修飾において存在することができ、それは多くの様々な「オキシ」又は「デオキシ」置換基により置換または修飾されることができる。
「オキシ」−2’ヒドロキシル基修飾の例は、下記に限定されないが、アルコキシまたはアリールオキシ(−OR、例えば、R=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖)、ポリエチレングリコール(PEG)、−O(CHCHO)nCHCHOR、2’ヒドロキシルが例えばメチレン架橋により同じリボース糖の4’炭素に結合された、ロックされた核酸(LNA)、及びアミノ基(−O−アミノ、ここでアミノ基、例えばNRRは、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロサイクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノでありえる)又はアミノアルコキシを包含する。
「デオキシ」修飾は、水素、アミノ(例えばNH、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロサイクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸)を包含し、またはアミノ基はリンカーを介して糖に結合されることができ、ここでリンカーは原子C、N、およびOの一つ以上を有する。
糖基は、リボース中の対応する炭素のそれとは逆の立体配置を有する一つ以上の炭素を含むこともできる。このように、修飾されたRNAは、例えば、糖としてアラビノースを有しているヌクレオチドを含むことができる。
本願明細書において記載されているように、ホスフェート骨格構造は更に修飾されることができ、修飾されたRNA分子に組み込まれることができる。一つ以上酸素原子を異なる置換基で置き換えることによって、骨格構造のホスフェート基は、修飾される。更に、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、修飾されていないホスフェート部分が、本願明細書に記載されている修飾されたホスフェートで完全に置換されることを含むことができる。
修飾されたホスフェート基の例は、下記に限定されるものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホナート、ホスホロアミダート、アルキルまたはアリールホスホナート、およびホスホトリエステルを含む。ホスホロジチオエートは、硫黄で置き換えられた2つの非結合の酸素を有する。結合酸素を窒素で(架橋されたホスホロアミダート)、硫黄で(架橋されたホスホロチオエート)、および炭素で(架橋されたメチレンホスホネート)の置換によって、ホスフェートリンカーは修飾されることもできる。
修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは本願明細書において、記載されているように、修飾されたRNA分子中へ組み込まれることができ、核酸塩基部分において、さらに修飾されることができる。例えば、本願明細書において記載されているヌクレオシドおよびヌクレオチドは、主溝表面上で化学修飾されることができる。いくつかの実施形態において、主溝の化学修飾は、アミノ基、チオール基、アルキル基、またはハロ基を含むことができる。
例えば、以下からなるリストにおいて選択される塩基修飾から、ヌクレオチド類似体/修飾体は選択される:2−アミノ−6−クロロプリンリボシド−5´−三ホスフェート、2−アミノプリン−リボシド−5’−三ホスフェート、2−アミノアデノシン−5’−三ホスフェート、2´−アミノ−2´−デオキシシチジン−三ホスフェート、2−チオシチジン−5’−三ホスフェート、2−チオウリジン−5’−三ホスフェート、2´−フルオロチミジン−5´−三ホスフェート、2’−0−メチルイノシン−5’−三ホスフェート、4−チオウリジン−5’−三ホスフェート、5−アミノアリルシチジン−5’−三ホスフェート、5−アミノアリルウリジン−5’−三ホスフェート、5−ブロモシチジン−5’−三ホスフェート、5−ブロモウリジン−5’−三ホスフェート、5−ブロモ−2’−デオキシシチジン−5’−三ホスフェート、5−ブロモ−2’−デオキシウリジン−5’−三ホスフェート、5−ヨードシチジン−5’−三ホスフェート、5−ヨード−2’−デオキシシチジン−5’−三ホスフェート、5−ヨードウリジン−5’−三ホスフェート、5−ヨード−2’−デオキシウリジン−5´−三ホスフェート、5−メチルシチジン−5’−三ホスフェート、5−メチルウリジン−5’−三ホスフェート、5−プロピニル−2’−デオキシシチジン−5’−三ホスフェート、5−プロピニル−2'−デオキシウリジン−5’−三ホスフェート、6−アザシチジン−5’−三ホスフェート、6−アザウリジン−5’−三ホスフェート、6−クロロプリンリボシド−5’−三ホスフェート、7−デアザアデノシン−5´−三ホスフェート、7−デアザグアノシン−5'−三ホスフェート、8−アザアデノシン−5’−三ホスフェート、8−アジドアデノシン−5’−三ホスフェート、ベンズイミダゾール−リボシド−5’−三ホスフェート、N1−メチルアデノシン−5’−三ホスフェート、N1−メチルグアノシン−5'−三ホスフェート、N6−メチルアデノシン−5’−三ホスフェート、06−メチルグアノシン−5’−三ホスフェート、シュードウリジン−5’−三ホスフェート、またはピューロマイシン−5’−三ホスフェート、キサントシン‐5’‐三ホスフェート。
いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオシドは、以下からなるリストから選択されることができる:ピリジン−4−オン−リボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン、4−チオ−シュードウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシウリジン、3−メチルウリジン、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−シュードウリジン、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タウリノメチルウリジン、1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−2−チオウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン、1−メチル−シュードウリジン、4−チオ−1−メチル−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、および4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン。
いくつかの実施形態において、5−アザシチジン、シュードイソシチジン、3−メチル−シチジン、N4−アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメチルシチジン、1−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、2−チオ−シチジン、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−シュードイソシチジン、及び4−メトキシ−1−メチル−シュードイソシチジンを、修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは含む。
他の実施態様において、2−アミノプリン、2、6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノプリン、7−デアザ−2、6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2、6−ジアミノプリン、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イソペンテニルアデノシン、N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリシニルカルバモイルアデノシン、N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、および2−メトキシ−アデニンを、修飾されたヌクレオシドは含む。
他の実施態様において、イノシン、1−メチルイノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7−デアザグアノシン、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグアノシン、N2−メチルグアノシン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、およびN2,N2−ジメチル−6チオ−グアノシンを、修飾されたヌクレオシドは含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、主溝表面で修飾されることができ、ウラシルのC−5上の水素をメチル基またはハロ基で置換することを含むことができる。
更なる実施形態によれば、本明細書で定義されている修飾されたRNAは、脂質修飾を包含できる。
修飾された塩基および/または修飾されたRNA分子は、当技術分野において、公知であり、例えば、さらにWarrenらにより教示されている("Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA"; Cell Stem Cell; 2010)
上記からみて、修飾された塩基は、修飾されたプリン塩基または修飾されたピリミジン塩基でもよい。
非制限的であるが、修飾されたプリン塩基の例は、修飾されたアデノシンおよび/または修飾されたグアノシン、例えばヒポキサンチン、キサンチン、7−メチルグアニン、イノシン、キサントシン、および7−メチルグアノシンを含む。
いくつかの実施形態に従い、ウリジン、シチジン、アデノシン及び/またはリボチミジンに対応するそれぞれのヌクレオシドが修飾されているところのRNAに、修飾されたRNA分子またはmRNAは相当する。
非制限的であるが、修飾されたピリミジン塩基の例は、修飾されたシチジンおよび/または修飾されたウリジン、例えば5,6−ジヒドロウラシル、シュードウリジン、5−メチルシチジン、5−ヒドロキシメチルシチジン、ジヒドロウリジン、および5−メチルシチジンを含む。
好ましくは、本発明の修飾された塩基は、修飾されたウリジンまたはシチジン、例えばシュードウリジンおよび5−メチルシチジンでもよい。
いくつかの実施形態に従い、U(ウラシル)、C(シトシン)、A(アデニン)、および/またはT(チミン)に対応するそれぞれの塩基が修飾されているところのRNAに、修飾されたRNA分子またはmRNAは相当する。
いくつかの例示的実施形態に従い、U(ウラシル)、C(シトシン)に対応するそれぞれの塩基が修飾されているところのRNAに、修飾されたRNA分子またはmRNAは相当する。
参考のために、シュードウリジン−5´−三ホスフェート、又はシュード−UTP、又は5−リボシルウラシルの構造は、以下で表される:
Figure 0006774878
参考のために、5−メチルシチジン−5´−三ホスフェート、または5−メチル−CTP、又は5−Me−CTPの構造は、以下で表される:
Figure 0006774878
修飾された又は修飾されていない、キャップされた及びキャップされていないmRNAは、商業的に得られることもできる。
非制限的であるが、本願明細書において記載されてきたmRNAは、TriLink Biotechnologies社から注文することができ、以下からなるリストにおいて、選択されることができる:
- L-6309 β-gal mRNA unmodified ARCA cap (Batch#T1-APG01A)
- L-6109 β-gal mRNA fully substituted with Pseudo-U and 5-Methyl-C, ARCA cap (Batch#T1-AOL03A)
- L-6309 β-gal mRNA unmodified, NO Cap(Batch#I9-B01A)
- L-6109 β-gal mRNA fully substituted with Pseudo-U and 5-Methyl-C, No Cap (Batch#I9-B02A)
- L-6007 Fluc mRNA unmodified ARCA cap (I99-A01A), 及び
- L-6007 EPO mRNA unmodified ARCA cap (I9-A01A).
核酸をコードするEPO(SEQ ID No 4)は、単に参考のためだけに本願明細書において提供されている。
キャップされていないRNA分子は修飾されたRNA分子でも修飾されていないRNA分子でもよいと理解される。
従って、キャップされたRNA分子は、修飾されたRNA分子でも修飾されていないRNA分子でもよい。
好ましくは、本発明のRNA分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)である。
本発明のRNA分子は、修飾された型であっても修飾されていない型であっても、好ましくはキャップされていないメッセンジャーRNAである。
最も好ましい実施例に従い、キャップされていないmRNAは、キャップされていずかつ修飾されていないmRNAまたはキャップされていずかつ修飾されたmRNAである。
非制限的であるが、メッセンジャーRNAのようなキャップされていないRNA分子は、天然にのみ生じる塩基を有するキャップされていないRNA分子でもよい。
本発明に従い、宿主によって、in vivoで、 メッセンジャーRNAのようなRNA分子中に天然に組み込まれることができる塩基に、「天然に生じる塩基」は関する。このように、前記宿主内で天然の等価物がないところの合成塩基とは、「天然に生じる塩基」は異なっている。しかしながら、「天然に生じる塩基」は修飾された塩基であってもなくてもよい。なぜなら両方の語が本発明の意味において混乱を招くべきではないからである。
キャップされていないメッセンジャーRNAは、キャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーRNAでよく、即ち、少なくとも一つの修飾された塩基を有していてもよい。
このように、キャップされていないメッセンジャーRNAは、(5’)ppp(5’)グアノシン末端を有しかつ少なくとも一つの修飾された塩基を有する、キャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーRNAでもよい。
キャップされていないメッセンジャーRNAは、(5’)ppp(5’)グアノシン末端を有しかつ少なくとも一つのシュードウリジンと少なくとも一つの5−メチルシトシンを有する、キャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーRNAでもよい。
キャップされたメッセンジャーRNAは、その5´末端が5’−5’三ホスフェート結合に結合された7−メチルグアノシンに連結されかつ天然に生じる塩基、またはシュードウリジンまたは5−メチルシトシンのような修飾された塩基を有するところのメッセンジャーRNAでもよい。
修飾されたおよび修飾されていないRNA分子の両方が本発明の一つの実施形態の中で用いられる場合、それらは混合物として及び/または精製された形において使われることができるとも理解される。
四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー
四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、当技術分野、例えばWO2010026537A1および/またはWO2013128423A1において、前に報告されていた。
本発明の範囲内で、特徴「ブロックコポリマー」は、重合した単量体単位の少なくとも2セットまたはブロックを有するポリマーを指すことを意図している。1「ブロック」は、モノマーの重合によって得られ、そしてポリマー中で繰り返されることができるモチーフを指す。ブロックコポリマーは必らず、重合したモノマーのブロックの少なくとも2つの異なった種類を有する。
本発明の範囲内で、特徴「非イオン性両親媒性ブロックコポリマー」は、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有し、ここで該ブロックが非イオン性である、すなわちそれらがイオンを形成している部分を含まないところのブロックコポリマーを指すことを意図する。
本発明の範囲内で、「ブロックコポリマー」との関係において、特徴「四官能性」は、四官能性結合部分によって運ばれる4つの反応性基に結合された4つのブロックコポリマーを有する化合物を指す。別の表現では、「四官能性ブロックコポリマー」は、中心の四官能性結合部分に結合されたブロックコポリマーの4本の枝を有する。
4つのブロックコポリマーは、互いに独立して、同一でも異なってもよく、好ましくは同一である。
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、各々、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有しているブロックコポリマーの4つの枝を有する。
本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーにおいて、親水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(2−メチル−2−オキサゾリン)、または糖からなる群において選択されることができ、そして疎水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテル先端を有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群において選択されることができる。
特に、親水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(2−メチル−2−オキサゾリン)、ポリテトラヒドロフランからなる群において選択されることができ、そして疎水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテル先端を有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群において選択されることができる。
より特には、親水性ブロックはポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(2−メチル−2−オキサゾリン)からなる群において選択されることができ、そして疎水性ブロックは、ポリオキシプロピレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテル先端を有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群において選択されることができる。
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの親水性ブロックは、ポリエチレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成る。
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリプロピレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成る。
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリプロピレンオキシド単位、ポリカプロラクトン単位、およびポリ乳酸単位からなる群において選択されることができる。
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの親水性ブロックは、ポリエチレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成り、及び本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリカプロラクトン単位を有し、好ましくはそれらから成る。
一実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーの親水性ブロックは、ポリエチレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成り、及び本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリプロピレンオキシド単位、ポリカプロラクトン単位、およびポリ乳酸単位から選択される単位を有し、好ましくはそれらから成る。
好ましい実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成る親水性ブロック、及びポリプロピレンオキシド単位を有し、好ましくはそれらから成る疎水性ブロックを有する。
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも一つの末端の親水性又は疎水性ブロックを有し、それは少なくとも二つ、三つ、または四つの末端の親水性または疎水性ブロックを含む。
好ましい実施態様において、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも一つの末端の親水性ブロックを有する。「末端の親水性ブロック」は、コポリマーの一端、特に本発明の四官能性ポリマーの枝の遠位端にあるブロックである。好ましくは、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも二つ、好ましくは三つ、および好ましくは四つの末端の親水性ブロックを有する。
好ましい実施形態によれば、本発明のブロックコポリマーは、ポリマーの各枝の一端の各々に、少なくとも一つ、好ましくは二つ、さらに好ましくは三つ、および好ましくは四つの末端のオキシエチレン単位を有する。
好ましくは、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、約0.5〜約1.5の親水性ブロック/疎水性ブロックの比で親水性ブロックと疎水性ブロックを有する。
一実施形態に従い、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、40%のポリエチレンオキシドを有する。
一実施形態に従い、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、ポリプロピレンオキシド(PPO)に対するポリエチレンオキシド(PEO)の比率50/56でこれらを有する。
一実施形態に従い、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、ポリプロピレンオキシド(PPO)に対するポリエチレンオキシド(PEO)の比率61/68でこれらを有する。
本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、(A−B)Lである枝分れされたブロックコポリマーでもよく、ここでAは親水性ブロックを表し、Bは疎水性ブロックを表し、Lは結合部分を表し、及びnは4でありかつLに結合された(A−B)基の数を表す。
別の実施形態に従い、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、(B−A)Lである枝分れされたブロックコポリマーでもよく、ここでAは親水性ブロックを表し、Bは疎水性ブロックを表し、Lは結合部分を表し、及びnは4でありかつLに結合された(B−A)基の数を表す。
一実施例に従い、親水性ブロックAは、ポリオキシエチレンブロックであり、及び疎水性ブロックBは、ポリオキシプロピレンブロックまたはポリカプロラクトンブロックまたはポリ乳酸ブロックである。
好ましくは、親水性ブロックAはポリオキシエチレンブロックであり、そして疎水性ブロックBはポリオキシプロピレンブロックである。
四価の結合部分Lは、以下から選択されることができる:
− アルキレンジアミノ部分、特にC〜CまたはさらにC〜Cアルキレンジアミノ部分であり、及び、好ましくはエチレンジアミノ部分であり、又は
−アルキレンまたは5〜8炭素のシクロアルキレンまたはフェニレンであり、特に5または6炭素のシクロアルキレン、又は
−式(Y)の基であり:
Figure 0006774878
ここで、n’は、1、2、3、4、5、または6であり、最も好ましくは1である。
特定の実施形態に従い、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、以下の式(Ia)、(Ib)、または(Ic)のコポリマーでもよく:
Figure 0006774878
ここでR、R、R、Rは、互いに独立して
*−[B]−[A]−Re又は
*−[A]−[B]−Re、
を表し、
ここで
Aは親水性ブロックであり、好ましくはポリエチレンオキシド単位を有し又それらから成り、
Bは上記に定義された疎水性ブロックであり、
Reは、水素原子、グリコシル残基、メチルまたはメトキシ基、C−Cアルキルまたはアルコキシ基、酸、ジカルボン酸残基(例えばエタン二酸残基またはプロパン二酸残基またはブタン二酸残基)、アミン残基、アミノグリコシド残基、またはアミド残基を意味し、
iは約3〜約125の値を有し、それは60以下を包含し、
jは3〜約85の値を有し、それは50以下を包含し、及び
Yは上記に定義された通りであり、
は、1〜6の炭素のアルキレン、5〜8の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレン、特にアルキレンジアミン部分、及び好ましくはエチレンジアミン部分である。
特定の実施形態によれば、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、このようにの式(1a)又は(1b)のコポリマーでもよく:
Figure 0006774878
Figure 0006774878
ここでR、R、R、R、R、およびYは上記に定義された通りである。
好ましくはR、R、R、Rは、互いに独立して以下を表し:
Figure 0006774878
ここで
- Reは、水素原子、グリコシル残基、メチル、酸、アミン、アミノグリコシド、またはアミドを意味し、
- iは約3〜約125、特に約10〜約100、及び特に約10〜約60の値を有し、及び
- jは3〜約85、特に約10〜約50、特に約10〜約20、およびより特には13以上の値を有し、
- RおよびRに関して、(a)両方とも水素であるか、または(b)一方が水素であり他方はメチルであり、
- RおよびRに関して、(a)両方とも水素であるか、または(b)一方が水素であり他方はメチルであり、及び
- RおよびRの両方とも水素である場合、RおよびRの一方が水素であり他方はメチルであり、またはRおよびRの1つがメチルである場合、RおよびRの両方とも水素である。
もっとも好ましくは、上記に定義されたR、R、R、Rは同一である。
好ましくは、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、式(Ia)のコポリマーであり、ここで:
- iは約3〜約125、特に約10〜約100、及び特に約10〜約60の値を有し、及び
- jは3〜約85、特に約10〜約50、特に約10〜約20、およびより特には13以上の値を有する。
好ましくは、Rは2、4、または6炭素のアルキレン、5〜8の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、及び最も好ましくは、2、4、または6炭素のアルキレンである。
それらのポリマーの合成のためのプロトコールは、当技術分野、例えばWO2010026537A1および/またはWO2013128423A1にすでに記載されている(Schmola, I.R.; J.Am. Oil Chem.; Soc. 54:110;1977 & Schmolka, I.R., Surf. Sci. Ser. 1967, 1, 300-371も参照)。他のブロックコポリマーは、商品として入手できる。このようなブロックコポリマーの例はP10321、P10257、P3848、P3152参照の下で商業的に入手可能であり、そしてPolymer Source(商標)社(Dorval(モントリオ―ル)― カナダ)から販売されている。
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも一つの末端のブロックをさらに有することができ、それ(ら)は任意的にグリコシル化及び/又は官能化されている。
このように、そして非制限的であるが、少なくとも一つの末端のブロックは、グリコシル残基、アルキル鎖(例えばC−Cアルキルまたはメチルでさえある)、酸、ジカルボン酸、アミン、アミノグリコシド、またはアミドによって、グリコシル化および/または官能化されていても良い。本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、上記および以下に定義されたように、少なくとも一つの末端ブロック、及び好ましくは一つの末端親水性ブロックを有し、それはアミノグリコシド、例えばトブラマイシン、パロモマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、マンノース、グルコース、グルコサミンから成る群により、任意的にグリコシル化および/または官能化される。
特に、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、上記に定義されたように、少なくとも一つの末端ブロックを任意的に有することができ、それは、少なくとも一つのグリコシル部分により結合された、一つの末端親水性又は疎水性ブロック、好ましくは一つの末端親水性ブロックを包含できる。
非制限的であるが、本発明のグリコシル化された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、および前記ブロックコポリマーを生成するための方法は、WO2013128423A1において、開示されている。
本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、このように式(IIa)または(II'a)のコポリマーでもよく:
Figure 0006774878
Figure 0006774878
ここで
−Rは、2〜6の炭素のアルキレン、5〜8の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、
−iは約3〜約125の値を有し、及び
−jは3〜約85の値を有し、
−ここで、R、R一対ごとに、一方は水素であり、他方はメチル基であり、
−ここで、各末端ブロックは任意的に更にグリコシル化および/または官能化される。
このように、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、このように式(I1a)のコポリマーでもよく:
Figure 0006774878
ここで
- Rは、2〜6の炭素のアルキレン、5〜8の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、及び好ましくは2、4、または6の炭素のアルキレンであり、
- iは約3〜約125、特に約10〜約100、及び特に約10〜約60の値を有し、及び
- jは約3〜約85、特に約10〜約50、特に約10〜約20の値を有し、
- 及びここで、R、R一対ごとに、一方は水素であり、他方はメチル基である。
あるいは、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、式(I1’a)のコポリマーであり:
Figure 0006774878
ここで
- Rは、2〜6の炭素のアルキレン、5〜8の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、及び好ましくは2、4、または6の炭素のアルキレンであり、
- iは約3〜約125、特に約10〜約100、及びより特には約10〜約60、及び好ましくは約10〜約30の値を有し、
- jは約3〜約85、特に約10〜約50、より特には約10〜約30、及び好ましくは約20〜25の値を有し、
- 及びここで、R、R一対ごとに、一方は水素であり、他方はメチル基である。
特に、本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、式(I1b)のコポリマーでもよく:
Figure 0006774878
ここで
- iは約3〜約125、特に約10〜約100、及び特に約10〜約60の値を有し、及び
- jは約3〜約85、特に約10〜約50、特に約10〜約20、あるいは約30〜約50の値を有し、
- 及びここで、R、R一対ごとに、一方は水素であり、他方はメチル基である。
本発明に有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、このように式(I1’b)のコポリマーでもよい。
Figure 0006774878
好ましくは、iは約3〜約125、特に約10〜約100、及びより特には約10〜約60でありえ、及びjは約5〜約50、特に約10〜約25、特に約10〜約20でありえる。
iおよびj値が定義されている本発明のすべての四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、iおよびjの可能な組み合わせごとに、明文で考慮されている。
本発明のすべての四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーおよびそれらの薬学的に許容される塩は、単独でまたは混合物の形で、および/または少なくとも一つの末端ブロックまたは各末端ブロックでさえも、任意的に更にグリコシル化されおよび/または官能化されているものが更に考慮されている。
本発明のブロックコポリマーは1000〜35000の分子量を有することができ、そしてそれは1000〜20000、及び4000〜35000、特に1000〜10000g/molを包含する。
本発明のブロックコポリマーは、約40〜約80%、特に約40%〜70%、及びより特には約40%〜約60%のエチレンオキシド単位含有量を有し、好ましくはそれから成る。
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、特に非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーの多数が、「ポロキサミン(poloxamine)」という一般的な商品名の下で商業的に入手可能である。
特に、本発明の非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、商品名Tetronic(商標)の下でBASF(Wyandotte, Mich.)から入手できる。
本発明のための適切なポロキサミンに関するさらなる詳細は、Surfactant Systems, Eds. Attwood and Florence, Chapman and Hall, London 1983, p 356-361中;The Condensed Encyclopaedia of Surfactants, Ed.Ash and Ash, Edward Arnold,London, 1989中,Non-ionic Surfactants, pp. 300-371, Ed.Nace, Dekker, New York, 1996中,Santon,Am. Perfumer Cosmet. 72(4):54-58 (1958); (Dekker, N.Y.,1967)中,又はUS 6,353,055中において、見い出されることができる。
式(Ib)に属する四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーも、以下で開示される。
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、以下で開示される四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー(以下で開示される304, 414, 616, 618, 704, 904, 1014, 1107を包含する)から成る群およびそれらの混合物、好ましくは704又は904、最も好ましくは704から選ばれることができる。
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー304(1600g/mol)は、以下の配列を有し:
Figure 0006774878
ここで、PEOはポリエチレンオキシドを意味し、そしてPPOはポリプロピレンオキシドを意味する。
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー414(3880g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー616は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー618は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー704(5500g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー904(6700g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー1014(8100g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー606(5829g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー608(5528g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー1614(14463g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー7426(7423g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー704−NH(5568g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー704−Me(5624g/mol)は、以下の式を有し:
Figure 0006774878
ここで、Meは(−CH)である。
参考として述べると、本発明の官能化された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー704−Oox(5808グラム/モル)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の官能化された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー704−Nox(5900グラム/モル)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
参考として述べると、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー704−パロモマイシン(7700g/mol)は、以下の式を有する:
Figure 0006774878
式(Ib)に属する四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーも、以下で開示される。
参考として述べると、本発明の四官能性PLA−POE非イオン性両親媒性ブロックコポリマー「3648」(8996g/mol)は、以下の式を有し:
Figure 0006774878
ここで、POEはポリエチレンオキシドを意味し、そしてPLAはポリ乳酸を意味する。
参考として述べると、本発明の四官能性POE−PCL非イオン性両親媒性ブロックコポリマー「10321」(4332のg/mol)は、以下の式を有し:
Figure 0006774878
ここで、POEはポリエチレンオキシドを意味し、そしてPCLはポリカプロラクトンを意味する。なお、値「6.5」は、その値が6または7であるブロックコポリマー、およびそれらの混合物を指す。
参考として述べると、本発明の四官能性POE−PPO非イオン性両親媒性ブロックコポリマー「10257」(7332g/mol)は、以下の式を有し:
Figure 0006774878
ここで、POEはポリエチレンオキシドを意味し、そしてPPOはポリプロピレンオキシドを意味する。
例示的実施形態によれば、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、以下から選択され又はその薬学的に許容される塩の一つであり、及びそれらの混合物であり:
Figure 0006774878
Figure 0006774878
Figure 0006774878
Figure 0006774878
Figure 0006774878
Figure 0006774878
ここで、各末端ブロックは任意的に更にグリコシル化および/または官能化される。
前述のように、DNAをトランスフェクションさせるために検討される通常の濃度と比較して、RNAを効率的にトランスフェクションさせるために非常に低い濃度において、本発明のブロックコポリマーが予期されず用いられる。実際にここで、ブロックコポリマーの最適濃度が、DNAのin vivoでの送達における最適のために使用される濃度より75倍低いことが観察された。
特に、そして実施例から示されるように、20.10−4%(w/v)、または10.10−4%(w/v)以下でさえ、および/または5. 10−4%(w/v)のような低い濃度で、mRNAのようなRNA分子はトランスフェクションされることができる。
本発明の意味において、RNA分子の濃度に関連したパーセンテージは(w/v)で表現され、そして上記に記載された通りである。
医薬組成物および処置の方法
上記に定義された四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー自体、およびそれらの薬学的に許容される塩、およびそれらの混合物に、本発明は関する。
上記に定義されている少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの少なくとも有効量を含有する組成物、特に医薬組成物に、本発明は更に関する。
このように、少なくとも一つのRNA分子、例えばキャップされたまたはキャップされていないmRNAのためのビヒクルとして少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの少なくとも有効量を含有する組成物、及びより特には医薬組成物にも、本発明は関する。
このように、少なくとも一つのRNA分子、例えばキャップされたまたはキャップされていないmRNA、及び好ましくは少なくとも一つのキャップされていないmRNAのためのビヒクルとして四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含有する医薬組成物に、本発明は関する。
このように、細胞内送達および遺伝子治療のための使用のための組成物を包含する薬物および/または医薬組成物の調製のための、上記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーのいずれにも、本発明は関する。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され、任意の投与様式(腸内および腸管外投与を包含し、そして局所投与、針注入および針使わない注射を包含する)に適しているビヒクルを含有できる。
本発明の意味において、針を使わない注射はジェットインジェクションを含むことができる。例えばWO2015024667A1に示されるように、ジェットインジェクションは当技術分野において公知である。
ジェットインジェクションは上記の医薬組成物(任意的にさらなる補剤を含む)にオリフィスを通過させることを包含し、それにより、哺乳類の皮膚を、および、注入設定に依存して、皮下組織または筋肉組織を透過できる高圧の超微細液体流を生成する。原理において、液体流は皮膚中に穴を形成し、そこを通って液体流が標的組織に押し込まれる。好ましくは、ジェットインジェクションは、本発明に従う核酸の皮内、皮下、又は筋肉内投与のために用いられる。
薬学的に許容され、注射可能な製剤の為の、特に全身注射、所望の組織へ直接注射の為の、又は局所投与、例えば皮膚および/または粘膜への投与の為のビヒクルを、本発明の医薬組成物は含有できる。それらは、無菌の等張液、乾燥、特に凍結乾燥された組成物でもよく、後者はまたは場合により滅菌水のまたは生理的食塩液の添加によって、注射可能な溶質を構成することを可能にする。
種々のパラメータによって、そして特に検討中の投与方法、関連する症状、投与される予定の負に荷電する巨大分子の性質、達成されるべき処置のまたは予防の効果、処置される個体、および処置又は予防されるべき症状の関数として、注射の為の投与量、及び投与回数も調整されることができることは明白である。
例えば遺伝子治療の分野において、発現され又は抑制されるべき遺伝子、又はメッセンジャーRNAの性質に依存して、投与量は決まるであろう。
本発明の意味の範囲内で、疾患に関して語「予防する」は、前記疾患の発生危険を低下させる意味として理解されるべきである。
より特には投与方法については、組織または循環系への直接注射、又は培養中の細胞の処置とその後の注射又は移植によるin vivo再移植を包含できる。
本発明の目的のために、本発明の組成物が、生体組織、例えば筋肉(筋肉内)、皮内、または皮下への投与に適合することを、語「体内投与」は意味する。さらに、局所、口、肺、鼻、および粘膜、例えば口内、膣、または直腸への投与が、使用されることができる。
本発明に従う組成物は、治療的な観点、特に遺伝子治療の観点から、及び薬物としての使用の為に特別に有利である。
このように調製された組成物は、細胞、好ましくは筋細胞または樹状細胞にその後注射される。
従って、トランスフェクションされた細胞により合成されるタンパク質の量を増加させるために、本発明の組成物は、特に有利である。
局所的に直接に検討中の細胞に、又は上記で検討された投与経路の1つの手段によって、投与を実施できる。
1つの好ましい実施形態に従い、本発明のブロックコポリマーは、Tyrode液(CaCl2 3 mM, MgCl2 2 mM, KCl 6 mM, NaCl 140 mM, グルコース10 mM, 及び Hepes 10 mM, pH 7.4; Tyrode Pharmacology. Philadelphia, 1908, 2nd Edition,1912)または等価の媒体中で製剤化される。
しかしながら、他の等価な媒体(特にHEPESがNAHCOにより置換された媒体)が検討されることもできる。実際、トランスフェクションの効率がこのような緩衝液により増加されることを、結果は示した(図6参照)。
このように、本発明は、少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルとして四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含有する医薬組成物にも関し、ここで前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーとmRNAはTyrode液または等価の媒体中で製剤化される。
以下を有する、細胞内送達のためのおよび/または遺伝子治療のための使用に適しているキットに、本発明は更に関する:
(i) 上記に定義された少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、およびそれらの混合物、および
(ii) 少なくとも一つのRNA分子、特に少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNA。
真核宿主中のタンパク質の発現を増加、改善、または維持する為の方法に、本発明は関し、そしてそれは上記で定義されたように、少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルとして、少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを前記宿主にトランスフェクションする工程を有する。
例示的実施形態に従い、少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルとしての上記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、真核宿主中のエリスロポエチン(EPO)の発現の増加、改善、および/または維持の為に特に効率的である。
このように、赤血球形成障害、または赤血球産生障害、例えば貧血および腎不全から選択される疾患に関連された疾患の発生の可能性の処置または予防、および/または減少のための薬物としておよび/または医薬組成物において、少なくとも一つのRNA分子、特にキャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルとして本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは特に効率的である。
いくつかの実施形態に従い、RNA分子は、個体中のエリスロポエチンの発現に適しているmRNAである。
いくつかの実施形態に従い、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、個体中のEPOの発現に適しているRNA分子のためのビヒクルとして、前記個体中のヘマトクリットのパーセンテージを改善、回復、又は安定化するために特に効率的である。
40%以上(40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、52、54、および55%を包含する)を包含する生理学的レベルで、個体中のヘマトクリットのパーセンテージを改善、回復、又は安定化させるために、上記の組合せは特に効率的である。
例示的であり制限的でないと考えられるべき以下の実施例及び図の助けにより、本発明はより完全に記載されるであろう。

[図1]C57Bl6マウス骨格筋中のβ−ガラクトシダーゼ発現及びβ−ガラクトシダーゼに対する免疫反応へのmRNAキャッピングおよび/またはヌクレオチド修飾の影響。(A)裸の又は20.10−4%の704により調製された20μgのキャップされていずかつ完全に修飾された又は修飾されていないmRNAの筋肉内注射の1日後のβ−ガラクトシダーゼ活性。(B)裸の又は20.10−4%の704により調製された20μgのキャップされた完全に修飾された又は修飾されていないmRNAの筋肉内注射の1日後のβ−ガラクトシダーゼ活性。(C)裸の又は20.10−4%の704により調製された、20μgのキャップされた又はキャップされていずかつ修飾されたおよび/または修飾されていないmRNAの0及び21日目の筋肉内1回注射から成るワクチン接種の42日後の体液反応。各カラムは、少なくとも8匹の個々のマウスのELISAにより測定された平均抗体価を表す。(D)特定のCD8+IFNγ+β−ガラクトシダーゼ細胞のパーセンテージ。ICAFectin(商標)441およびβ−ガラクトシダーゼをコードするプラスミドDNA又は対照としてα-フェトプロテインをコードするプラスミドDNAによってトランスフェクションされたネズミ樹状細胞株(Jaws)で一晩刺激されて42日目に、脾細胞は準備された。洗浄後、細胞は抗CD8抗体および抗IFNγで染色された。各カラムは、少なくとも6匹の個々のマウスの総脾臓CD8++/−SEMにおけるCD8+IFNγ細胞のパーセンテージを表す。
[図2]培養中の細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現へのmRNAキャッピングおよび/またはヌクレオチド修飾の影響。Hela(図2の上部)、C2C12(図2の中央)、及びJAWII細胞(図2の一番下)は、βガラクトシダーゼをコードする調製されたmRNA又は調製されたDNAの0.5μgと5(+/−)の電荷比率のアミノグリコシド脂質誘導体DOSTによって、トランスフェクションされた。RNA分子は、シュード−U又は5−メチル−シトシンにより完全に修飾されたUおよびC、または修飾されていないUおよびCによって、キャップされたか又はされなかった。24時間後、細胞は集められ、そしてβガラクトシダーゼ発現が測定された。結果は、細胞タンパク質のmg当たりのβガラクトシダーゼのpg(pg/mg prot)により表される。データは、トランスフェクションされた細胞のβガラクトシダーゼ(pg/mg prot)の平均値±SEMとして示される。対照として、RNA単独またはDNA単独によってトランスフェクションされた細胞は、βガラクトシダーゼの有意な発現を示さなかった。
[図3]ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。(A)ネズミEPOをコードする20μgのmRNAと、10 x 10-4% (白抜き円), 20 x 10-4% (白抜き四角)、又は 100 x 10-4% (白抜き三角)の 704を含有している704/RNA製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。対照として、ネズミEPOをコードする20μgの裸のRNAを、マウスは注射された(黒塗り円)。対照として、一つのマウス群は注射をされなかった(黒塗り四角)。(B)ネズミEPOをコードする10μgのプラスミドDNAおよび0.15%の704を含有している704/DNA製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット(白抜き円)。対照として、ネズミEPOをコードする10μgの裸のRNAを、マウスは注射された(黒塗り円)。対照として、一つのマウス群は注射をされなかった(黒塗り四角)。(C)ネズミEPOをコードする20μgのmRNAと、10 x 10-4%4 (白抜き円), 20 x 10-4% (白抜き四角)、又は 100 x 10-4% (白抜き三角)の 904を含有している904/RNA製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。対照として、ネズミEPOをコードする20μgの裸のRNAを、マウスは注射された(黒塗り円)。対照として、一つのマウス群は注射をされなかった(黒塗り四角)。
[図4]ブロックコポリマー/RNA製剤および704/DNA製剤(B)を筋肉内注射されたマウス中のヘマトクリットの変化。(A)6匹のマウスが1週間の間隔の2回連続注射により0および42日目に2回処置された。裸の(白抜き三角)又は100x10−4%の904(黒塗り四角)および20×10−4%の704(黒塗り円)で製剤化された、ネズミEPOをコードする20μgのメッセンジャーRNAから、処置は構成された。処置の開始の後の100日目に、裸の(白抜き三角)又は100x10−4%の904(黒塗り四角)および20×10−4%(w/v)の704(黒塗り円)で製剤化された、EPOをコードする20μgのメッセンジャーRNAから構成される単回注射を、マウスは受けた。処置の開始の後の134日目に、100x10−4%の904と共に、ネズミEPOをコードする20μgのメッセンジャーRNAの単回投与をマウスは受けた(黒塗り四角)。対照として、マウスは、注射をされなかった(白抜き四角)。点線は、健康な注射されなかったマウスのヘマトクリット変動を表す。(B)6匹のマウスは、0、56、および100日目に、10μgの裸のDNA(白抜き菱形)、又は0.15%の704(黒塗り菱形)によって製剤化された10μgのDNAで処置された。対照として、マウスは、注射もされなかった(白抜き四角)。点線は、健康な注射されなかったマウスのヘマトクリット変動を表す。(C)135日目において、裸の又は100x10−4%の904で製剤化されたネズミEPOをコードする20μgのRNA及び、裸の又は0.15%の704によって製剤化されたEPOをコードする10μgのプラスミドDNAの注射の24時間後にマウスの血清中で第135日に測定されたネズミEPOの発現。各バーは、6個体の平均値+/−SEMを表す。(D)四官能性ブロックコポリマーによって製剤化された、ネズミEPOをコードするDNAまたはmRNAでの処置の開始から作られた170日における体液応答。種々の組成物を注射されたマウスの血清中で測定されたネズミEPOに対する平均抗体量(商業的に入手可能なネズミEPOに対する抗体の既知量から構成される標準曲線を用いたELISAで測定された)を、各カラムは表す。
[図5]20.10−4%の704によって製剤化されたmRNAの筋肉内注射後のマウス骨格筋のルシフェラーゼ発現。それぞれpH7.4、7.4、および6.7に対応するHepes、NaHCO、又は乳酸ナトリウムで緩衝された種々の媒体中において、704で製剤化された10μgのmRNAの筋肉内投与24時間後のルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼ発現に対する1〜5mMのCaClの濃度の影響も、HepesまたはNaHCOにより緩衝される2つの異なる媒体において測定された。対照として、一つのマウス群は150mMのNaClのみからなる媒体を注射された。各カラムは、少なくとも6個体の値の平均値+/−SEMを表す。
[図6]種々の濃度の704によって製剤化されたmRNAの筋肉内注射後のマウス骨格筋のルシフェラーゼ発現。10.10−4〜1000.10−4%(w/v)の種々の濃度の704によって製剤化された10μgのmRNAの筋肉注射の24時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも6個体の値の平均値+/−SEMを表す。
[図7]裸の又は14463g/molの四官能性PEO−PPO両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現。5〜1000.10−4%(w/v)の種々の濃度のブロックコポリマーによって製剤化された5μgのmRNAの筋肉注射の24時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも6個体の値の平均値+/−SEMを表す。カラム「裸の」は、ブロックコポリマーがない以外は他と同じmRNAの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。カラム「参照」は、約20.10−4%(w/v)の濃度で投与された場合の四官能性ブロックコポリマー704と組み合わされた、同じmRNAの投与後の、ルシフェラーゼの発現に関する。
[図8]裸の又は7423g/molの四官能性PPO−POE両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現。5〜1000.10−4%(w/v)の種々の濃度のブロックコポリマーによって製剤化された5μgのmRNAの筋肉注射の24時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも6個体の値の平均値+/−SEMを表す。カラム「裸の」は、ブロックコポリマーがない以外は他と同じmRNAの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。カラム「参照」は、約20.10−4%(w/v)の濃度で投与された場合の四官能性ブロックコポリマー704と組み合わされた、同じmRNAの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。
[図9]裸の又は8996g/molの四官能性PLA−POE両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現。10および100.10−4%(w/v)の濃度のブロックコポリマーによって、製剤化された5μgのmRNAの筋肉注射の24時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも6個体の値の平均値+/−SEMを表す。カラム「裸の」は、ブロックコポリマーのない以外は他と同じmRNAの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。
[図10]裸の又は7332g/molの四官能性POE−PPO両親媒性ブロックコポリマーによって製剤化された、キャップされかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のマウス骨格筋中のルシフェラーゼ発現。10および100.10−4%(w/v)の濃度のブロックコポリマーによって製剤化された5μgのmRNAの筋肉注射の24時間後のルシフェラーゼ活性。各カラムは、少なくとも6個体の値の平均値+/−SEMを表す。カラム「裸の」は、ブロックコポリマーがない以外は他と同じmRNAの投与後のルシフェラーゼの発現に関する。
[図11]ブロックコポリマー製剤注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット及びEPOのレベル。(A)ネズミEPOをコードする20μgのmRNAと、10 x 10-4% (白抜き円), 20 x 10-4% (白抜き四角)、又は 100 x 10-4% (白抜き三角)の 704を含有している704/RNA製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。対照として、ネズミEPOをコードする20μgの裸のRNAを、マウスは注射された(黒塗り円)。対照として、一つのマウス群は注射もされなかった(黒塗り四角)。(B)ネズミEPOをコードする20μgのmRNAと、10 x 10-4%4 (白抜き円), 20 x 10-4% (白抜き四角)、又は 100 x 10-4% (白抜き三角)の 904を含有している904/RNA製剤の筋肉内注射後の時間の関数としてのマウスヘマトクリット。対照として、ネズミEPOをコードする20μgの裸のRNAを、マウスは注射された(黒塗り円)。対照として、一つのマウス群は注射をされなかった(黒塗り四角)。(C)20x10−4%の704および1(白抜き円)、5(白抜き菱形)、10(白抜き三角)および50μg(白抜き八角)を包含する種々の量の、ネズミをコードするmRNAを含有している704/RNA製剤の筋肉内投与後の時間の関数としてのマウスEPO。対照として、1(黒塗り円)、5(黒塗り菱形)、10(黒塗り三角)、および50μg(黒塗り八角)の、ネズミEPOをコードする裸のRNAを、マウスは注射された。(D)(C)に記載されているのと同一の時間の関数としてのヘマトクリットレベル。10時間後に、704によって製剤化されたネズミEPOをコードするプラスミドDNA(黒塗りの印)によって、または、704によって製剤化されたmRNA(白抜きの印)によって、筋肉内に注射されたマウスの血清中(E)及び筋肉中(F)で、マウスEPOレベルは測定された。各印は、少なくとも6個体のマウスの平均値+/−SEMを表す。
[図12]本発明のブロックコポリマーと組み合わされた、キャップされていずかつ修飾されたmRNAの筋肉内注射の後のβ−ガラクトシダーゼ発現。y軸は、cps(カウント/秒)単位のβ−ガラクトシダーゼ発現量を表す。x軸は、左から右へ、ブロックコポリマー704、10257、3648、1614、および7426に対応するデータセットを表す。
[図13]ブロックコポリマー904および10257の存在下での、0および21日目におけるキャップされかつ修飾されていないmRNAの2回の筋肉内注射後の35日目のマウスの体液反応。y軸は、ELISAにより測定された少なくとも6個体のマウスの平均抗体価を表す。x軸は、左から右へ、裸のmRNA、ブロックコポリマー704、及び10257に対応するデータセットを表す。データセットごとに、左のカラムはDNA、そして右のカラムはRNAを表す。
実施例
材料と方法
核酸分子
β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エリスロポエチン(EPO)をコードしている、キャップされた又はされていない、それぞれのU又はCがそれぞれシュード−Uおよび5−メチル−Cで完全に置換されているかされてないmRNAは、Trilink(サン ジエゴ、米国)から購入された。サイトメガロウイルス(CMV)IE1プロモータ/エンハンサの制御下のネズミEPOcDNAを有しているプラスミドは、プラスミドpTetO−mEPO(Richard et al., Human Gene Therapy 2005)からPCRによりmEPOcDNAをリカバーすることにより構築され、pcDNA−3ベクター(Invitrogen, Cergy Pontoise, France)へ導入された。ヒトサイトメガロウイルス即初期遺伝子プロモータにより制御されるβ−ガラクトシダーゼをコードするpCMV−bGalプラスミド(Clontech, St Germain en Laye, France)が、抗原として使われた。プラスミドは、EndoFreeプラスミド精製カラム(Qiagen、Chatsworth、CA、米国)によって、形質転換された組換え型大腸菌から精製された。
動物実験および核酸の調製
すべての動物実験は、フランス国立保健医学研究所のガイドラインに従って実施された。8週齢の雌のスイスおよびC57bl/6マウスは、Janvier(Le Genest Saint Isle、France)から得られた。少なくとも6〜8匹のマウスが、各実験群において、注射された。筋肉内投与のために、マウスは麻酔された。一個所の毛が剃られた前脛骨筋内に、極小シリンジ(U100、Becton Dickinson、Rungis、France)を使用して50マイクロリットルの合成製剤は注射された。ブロックコポリマーの原液は、水中の2%(w/v)濃度で調製され、4°Cで保管された。バッファ中の所望の濃度のプラスミドDNA溶液と、水中の所望の濃度のブロックコポリマーを等容量で混合することによって、ブロックコポリマーを有するDNAおよびmRNAの製剤は調製された。
細胞培養
ペニシリン、ストレプトマイシン、Lグルタミン及び10%のウシ胎仔血清を補充されたダルベッコ改変イーグル培地中で、Hela、C2C12、JAW IIは生育された。トランスフェクションの1日前に、細胞がトランスフェクション時にコンフルエントの70−80%(1ウェルあたり0.5 〜 2×10細胞)に到達するように、細胞は1mLの完全な細胞生育培地中に置かれた。トランスフェクションの1日後に、細胞は収集され、そしてプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche Diagnostics)を補充されたReporter Lysis Buffer(Promega)がそれぞれのウェルに加えられた。10,000rpm、4分間の遠心分離の後、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を使用して、Victor(PerkinElmer)で上澄の一部から、ルシフェラーゼ活性は決定された。上澄10μlにルシフェラーゼアッセイの基質100μlの添加した後、発光を測定することによって、ルシフェラーゼ活性は決定された。
EPO発現分析
ヘマトクリット値は、ミクロキャピラリ遠心分離で測定された。筋肉内注射後の複数の時点で、眼窩後空洞からマウス血液は集められ、そして遠心分離(1000gで3分)によって、血清が得られた。血漿試料のために、血液はヘパリナイズされたチューブ中に眼窩後洞から集められ、1000gで3分間遠心分離された。製造業者(R&D Systems)により提供された説明書に従って、マウス血清のEPOレベルは、酵素結合免疫吸着法(ELISA)で測定された。
抗ネズミEPO特異的免疫応答
液性免疫応答は、ELISAで測定された。簡潔に言うと、96ウェルプレート(NuncMaxisorp)は、 pH 9.5である50mMのNaHCO中の組換えネズミEPOで、4°Cで一晩コートされ、その後、希釈された血清を三分配する前に、PBS、0.05%Tween−20、1%ウシ血清アルブミン(BSA)で室温で1時間ブロックされた。プレートは37°Cで90分間インキュベートされ、その後PBS、0.05%Tween−20、1%BSA中で1/5000に希釈されたペルオキシダーゼ結合ヤギマウス抗IgG(Jackson Immunoresearch、Newmarket、英国)を用いて、EPO特異的IgGは検出された。プレートは工程の間にPBS、0.05%のTween−20で3回洗われ、そしてペルオキシダーゼ活性はpH5のクエン酸塩緩衝液中の1mg/mLのOPDによって、明らかにされた。反応は1MのHSOの添加によって止められ、そして吸収が492ナノメートルで測定された。血清は1/100、1/1000、および1/10000でテストされ、そして各ELISAプレートに存在する商業的に入手可能な抗ネズミEPOの固定された複数の既知量から成る標準曲線に対して、抗ネズミEPO抗体量は算出された。
ルシフェラーゼ発現
PhotonIMAGER Optimaシステム(http://www.biospacelab.com)を使用する、動物のライブ画像化によって、ルシフェラーゼタンパク質発現は評価された。簡潔に言うと、2mgのin vivoルシフェラーゼ基質(ビートルルシフェリン基質、Promega)がマウスの腹膜内に注射され、そして10分後に、マウスは麻酔され、そしてベースラインが安定するまで発光信号は測定されるであろう。発光信号の安定化後、発光の測定は、30秒間実行された。
β−gal発現
製造業者のプロトコールに従ってBetaGlo Assayシステム(Promega、Charbonnieres、France)を使用して、筋肉抽出物中において、β−gal発現は定量化された。
抗−β−gal特異的免疫応答
液性免疫応答は、ELISAで測定された。簡潔に言うと、96ウェルプレート(NuncMaxisorp)は、 pH 9.5である50mMのNaHCO中の組換えbGalで、4°Cで一晩コートされ、その後、希釈された血清を三分配する前に、PBS、0.05%のTween−20、および1%のウシ血清アルブミン(BSA)で1時間ブロックされた。プレートは37°Cで90分間インキュベートされ、その後PBS、0.05%Tween−20、1%BSA中で1/5000に希釈されたペルオキシダーゼ結合ヤギマウス抗IgG(Jackson Immunoresearch、Newmarket、英国)を用いて、bGal特異的IgGは検出された。プレートは工程の間にPBS、0.05%のTween−20で3回洗われ、そしてペルオキシダーゼ活性はpH5のクエン酸塩緩衝液中の1mg/mLのOPDによって、明らかにされた。反応は1MのHSOの添加によって止められ、そして吸収が492ナノメートルで測定された。血清は1/100、1/1000および1/10000でテストされ、そして各ELISA中に存在するコントロール血清の二倍希釈液に対して、力価は算出された。
脾臓CD8細胞の総数におけるIFNg発現CD8細胞のパーセンテージを測定するために、脾細胞は完全培地中で5x106 細胞/mLで培養された。b−ガラクトシダーゼまたはネズミアルファFetoproteinをコードするプラスミドDNAを有するICAFectin(商標)441でネズミ樹状細胞株(JAWS)はトランスフェクションされ、そして細胞は5%COのもと37°Cでインキュベートされた。24時間後に細胞は採取され、その後、抗CD8抗体および抗IFNγで染色され、FACSによって定量化された。
末端ブロックでのブロックコポリマー704の官能基化のためのプロトコール
I -704−Meの調製
704(1.07g、0.19mmol、1当量)は真空下で30分間乾燥され、そして乾燥THF(25mL)中に溶解された。0°CでNaH(95%、56mg、2.33mmol、12当量)が加えられ、そして混合物は室温で30分間撹拌された。ヨードメタン(0.14mL、2.33mmol、12当量)がその後加えられ、そして混合物は一晩室温で攪拌された。濃縮後、残渣はフラッシュクロマトグラフィ(DCM/MeOH)により精製されて、704−Meが与えられた(0.93g、88%)。
II−704−NHの調製
DCM(120mL)中の704(4.7g、0.85mmol、1当量)の溶液に、p−トルエンスルホニルクロライド(1.95g、10.25mmol、12当量)が加えられた。粉末状のKOH(0.77g、13.67mmol、16の式)はその後30分にわたって少しづつ加えられ、そして混合物は2日間室温で撹拌された。DCM(100mL)が加えられ、そして混合物は水、塩水により洗浄され、MgSOで乾燥され、濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ(DCM/MeOH)により精製されて、704−Tosが与えられた(4.37g、84%)。
参考のために述べると、704Tosは、以下の式を有し:
Figure 0006774878
ここで、TsOはトシル基を指す。
EtOH(100mL)中の704Tos(4.37g、0.71mmol、1当量)の溶液に、アジ化ナトリウム(1.16g、17.85mmol、25当量)が加えられた。混合物は、20時間間還流された。室温に冷却後、揮発物は蒸発された。残渣はDCM(100mL)に溶解され、NaHCO飽和溶液、水、塩水により洗浄され、MgSOで乾燥され、そして濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ(DCM/MeOH)により精製されて、704−Nが与えられた(3.30g、82%)。
参考のために述べると、704Nは、以下の式を有する:
Figure 0006774878
EtOH(60mL)中の704−N(3.30g、0.58mmol、1当量)の溶液に、Pd/C(10%、0.75g、0.11mmol、0.2当量)が加えられた。
減圧/Nが3サイクル適用され、続いて減圧/Hが3サイクル適用された。混合物は室温で2日間撹拌され、その後セライトのパッドを通して濾過され、MeOHで洗浄され、そして濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ(DCM/MeOH)により精製されて、704−NHが与えられた(2.81g、88%)。
III−704−NOの調製
DCM(20mL)中の704−NH(0.2g、0.036mmol、1当量)の溶液に、EtN(0.06mL、0.36mmol、10当量)および無水コハク酸(0.036g、0.36mmol、10当量)が順次加えられた。混合物は、室温で一晩撹拌され、その後1MHCl、水で洗浄され、MgSOで乾燥され、濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ(DCM/MeOH)により精製されて、704−NOが与えられた(0.185g、87%)。
15−704−Paromoの調製
DMF(15ml)中の704−NO(0.185g、0.031mmol、1当量)の溶液に、Paromo(Teoc)−NH(0.224g、0.188mmol、6当量)、HBTU(0.083g、0.220mmol、7当量)、およびDMAP(0.053g、0.440mmol、14当量)が順次加えられた。混合物は50°Cで48時間撹拌され、その後濃縮され、フラッシュクロマトグラフィ(DCM/MeOH)により精製されて、704−Paromo(Teoc)が与えられた(0.149g、48%)。
参考のために述べると、704Paromo(Teoc)は、以下の式を有する。
Figure 0006774878
DCM(3mL)中の704−Paromo(Teoc)(0.149g、0.014mmol)の溶液に、0°Cでトリフルオロ酢酸(4mL)が加えられた。0°Cで30分間後に、混合物は室温で1時間撹拌され、そして濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ(DCM/MeOH)により精製されて、704−Paromoが与えられた(0.042g、39%)。
V−704OOの調製
ピリジン(15mL)中の704(2g、0.36mmol、1当量)の溶液に、無水コハク酸(0.36g、3.63mmol、10当量)が加えられた。混合物は、55°Cで一晩撹拌され、そして濃縮された。残渣はDCM(100mL)に溶解され、1M HCl、 水、塩水により洗浄され、MgSOで乾燥され、そして濃縮された。残渣はフラッシュクロマトグラフィ(DCM/MeOH)により精製されて、704−OOが与えられた(1.78g、84%)。
種々のmRNA構造および配列を用いた骨格筋のin vivoでのトランスフェクションおよび免疫原性
目的:この実験は、C57BI6骨格筋におけるタンパク質発現に対するmRNAキャッピング及びヌクレオチド修飾の影響の比較研究、及び更に注射後の免疫応答の重要性の評価を提示する。
図1から示されるように、ビヒクルとして四官能性ブロックコポリマー704を使用している、β−ガラクトシダーゼをコードするメッセンジャーRNAのトランスフェクションは、(i)効率的なタンパク質発現および(ii)最小の免疫応答を可能にする。
種々のmRNA構造および配列を用いた培養細胞のin vitroトランスフェクション。
目的:アミノグリコシド脂質誘導体が3つの異なる細胞株においてmRNAトランスフェクションにとってそれほど満足でないという証拠を、この実験は提示する(図2参照)。
ネズミエリスロポエチンの分泌。
目的:この実験は、ビヒクルとしてブロックコポリマー704を使用したネズミEPOをコードするmRNAの注射の、20日にわたる追跡を提示する(図3参照)。
mRNAおよびDNAの反復注射およびマウスネズミEPOの発現。
目的:この実験は、ビヒクルとしてブロックコポリマー704又は904を使用して、ネズミEPOをコードするmRNAの注射の、180日にわたる追跡を提示する(図3参照)。RNAトランスフェクションのためのビヒクルとしてのブロックコポリマー704および904の効率を示す比較研究が、更に提示される(図4参照)。
ルシフェラーゼ発現に対する混合媒体の影響。
目的:レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを使用して、本発明のブロックコポリマーを用いたRNAトランスフェクションに関して、Tyrode媒体およびその等価媒体が優れた特性を与えられるという良い証拠を、この比較研究は提示する(図5参照)。
トランスフェクションの効率に対する704の濃度の影響。
目的:ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはRNA分子のトランスフェクションに対して非常に効率的であるという証拠を、この比較研究は提示する(図6参照)。
トランスフェクション効率における四官能性PEO−PPO非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの14463g/mol濃度の影響。
目的:この比較研究は、以下の一般式のブロックコポリマーの効率の証拠を提示する:
Figure 0006774878
実際、マウス骨格筋への筋肉内投与後に、ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはRNA分子のトランスフェクションの為に非常に効率的であることが観察されている(図7参照)。その上、この特定のブロックコポリマーの投与後のルシフェラーゼの発現が、四官能性ブロックコポリマー704の投与後の発現よりも著しく高いことが見出された。
トランスフェクション効率における四官能性PEO−PPO非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの7423g/mol濃度の影響。
目的:この比較研究は、以下の一般式のブロックコポリマーの効率の証拠を提示する:
Figure 0006774878
実際、マウス骨格筋への筋肉内投与後に、ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはRNA分子のトランスフェクションの為に非常に効率的であることが観察されている(図8参照)。その上、この特定のブロックコポリマーの投与後のルシフェラーゼの発現が、四官能性ブロックコポリマー704の投与後の発現よりも著しく高いことが見出された。
マウス骨格筋への筋肉内投与後に、トランスフェクション効率における四官能性PLA−POE非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの8996g/mol濃度の影響。
目的:この比較研究は、以下の一般式のブロックコポリマーの効率の証拠を提示する:
Figure 0006774878
実際、マウス骨格筋への筋肉内投与後に、ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはRNA分子のトランスフェクションの為に非常に効率的であることが観察されている(図9参照)。
トランスフェクション効率における四官能性POE−PPO非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの7332g/mol濃度の影響。
目的:この比較研究は、以下の一般式のブロックコポリマーの効率の証拠を提示する:
Figure 0006774878
実際、マウス骨格筋への筋肉内投与後に、ブロックコポリマーが低濃度であっても、本発明のブロックコポリマーはRNA分子のトランスフェクションの為に非常に効率的であることが観察されている(図10参照)。
マウス中のヘマトクリットのレベルにおける、EPOをコードするmRNAを伴うブロックコポリマー製剤の筋肉内注射のin vivoでの効果。

目的:マウスの筋肉内注射後の、マウス中のEPOおよびヘマトクリットの経時変化の証拠を、この研究は提示する(図11参照)。
キャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーRNAのためのビヒクルとしての本発明のブロックコポリマーの影響。
目的:真核宿主中でのキャップされていずかつ修飾されたメッセンジャーRNAの発現を促進することに対して、本発明のブロックコポリマーが特別には効率的であるという証拠を、この研究は、提示する(図12参照)。
対照としての20x10−4%の704、及び100x10−4%の10257、10x10−4%の3648、20x10−4%の1614、および100x10−4%の7426によって製剤化されたβ−ガラクトシダーゼをコードするキャップされていずかつ修飾されたmRNA15μgの筋肉内投与1日後の、β−ガラクトシダーゼ活性。
使用された修飾されたRNAは、すべてのウラシルおよびシトシン塩基において、それぞれシュードウリジン−5'−三ホスフェートおよび5−メチルシチジン−5'−三ホスフェートヌクレオチドを使用して修飾された。注射の24時間後に、筋肉は採取され、液体窒素中で凍結された。製造業者の説明書(Promega#E4720)に従い、β−Gloアッセイシステムの補助により、純粋な筋肉抽出物中で、βガラクトシダーゼ発現は評価された。704ブロックコポリマーと比較してさえ、ブロックコポリマー10257、3648、1614、および7426はビヒクルとして特別に効率的であることを、結果は示している。
目的:本発明のブロックコポリマーと組み合わされたRNA分子の投与後の免疫応答の欠如の証拠を、この研究は提示する(図13参照)。
プラスミドDNA、または裸の又は四官能性ブロックコポリマー904または10257によって製剤化されたβ‐ガラクトシダーゼをコードするキャップされかつ修飾されていないmRNA20μgを、マウスは注射された。各カラムは、少なくとも6匹の個々のマウスのELISAにより測定された平均抗体価を表す。RNA分子の細胞内送達のために、および遺伝子治療のために、前記ブロックコポリマーが特に効率的である事が観察される。
Figure 0006774878
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Figure 0006774878
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Figure 0006774878
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Figure 0006774878

Claims (16)

  1. 遺伝子治療のための細胞内送達のための、且つ少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルであって、以下の式(Ia)または(Ib)
    Figure 0006774878
    ここでR 、R 、R 、R は、互いに独立して、
    *−[B] −[A] −Re又は
    *−[A] −[B] −Re
    を表し、
    ここで
    Aは、ポリエチレンオキシド単位を有する親水性ブロックであり、
    Bは、ポリプロピレンオキシド単位、ポリカプロラクトン単位、およびポリ乳酸単位から選択される単位を有する疎水性ブロックであり、
    Reは、水素原子、グリコシル残基、メチルまたはメトキシ基、C −C アルキルまたはアルコキシ基、酸、ジカルボン酸残基、アミン残基、アミノグリコシド残基、またはアミド残基を意味し、
    iは約3〜約125の値を有し、
    jは3〜約85の値を有し、
    Yは、以下の式であり:
    Figure 0006774878
    ここでn'は1、2、3、4、5、または6に等しく、
    は、2〜6の炭素のアルキレン、5〜8の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンである、
    で表される少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含む上記ビヒクル。
  2. 前記mRNAがキャップされていないmRNAである、請求項1に記載のビヒクル。
  3. 前記mRNAがキャップされていずかつ修飾された、又はキャップされていずかつ修飾されていないmRNAである、請求項1又は2に記載のビヒクル。
  4. 前記mRNAがメッセンジャー5'pppRNA;5'ppRNA;5'pRNA;または 5'OHRNAである、請求項1〜3のいずれか一つに記載のビヒクル。
  5. 前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、少なくとも一つの末端の親水性又は疎水性ブロックを有する、請求項1〜4のいずれか一つに記載のビヒクル。
  6. 前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、約0.5〜約1.5の親水性ブロック/疎水性ブロックの比で親水性ブロックと疎水性ブロックを有する、請求項1〜5のいずれか一つに記載のビヒクル。
  7. 前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、以下の式(IIa)または(II´a)のコポリマーである、請求項1〜のいずれか一つに記載のビヒクル:
    Figure 0006774878
    Figure 0006774878
    ここで
    は、2〜6の炭素のアルキレン、5〜8の炭素のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、
    iは約3〜約125の値を有し、及び
    jは3〜約85の値を有し、
    ここで、各R、R対について、一方は水素であり、他方はメチル基であり、
    ここで、各末端ブロックは任意的に更に、グリコシル残基、アルキル鎖、酸、ジカルボン酸、アミン、アミノグリコシド、若しくはアミドによって、グリコシル化および/または官能化されていても良い。
  8. 前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、以下の物及びそれらの混合物から選択される、請求項1〜のいずれか一つに記載のビヒクル。
    Figure 0006774878
    Figure 0006774878
    Figure 0006774878
    Figure 0006774878
    Figure 0006774878
    Figure 0006774878
  9. 前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、少なくとも一つのグリコシル部分と結合されている少なくとも一つの末端の親水性または疎水性ブロックを有する、請求項1〜のいずれか一つに記載のビヒクル。
  10. ビヒクルとしての、請求項1〜9のいずれか一つに記載の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーと少なくとも一つのキャップされていないmRNAとの組み合わせ
  11. 少なくとも一つのキャップされていないmRNAと組み合わせられた、ビヒクルとしての、請求項1〜9のいずれか一つに記載の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含有する医薬組成物。
  12. 前記四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーおよびmRNAが、Tyrode媒体またはその等価媒体で製剤化された、請求項11に記載された医薬組成物。
  13. 真核宿主中でのタンパク質の発現を増加、改善、及び/または維持する為の方法であって、少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルとして、請求項1〜9のいずれか一つに記載の少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを前記宿主にトランスフェクションする工程を有し、前記真核宿主がイン・ビトロ又はエクス・ビボの試料であり、又は前記真核宿主がヒト以外の哺乳類である、上記方法。
  14. 真核宿主中でのタンパク質の発現を増加、改善、及び/または維持する為の、且つ少なくとも一つのキャップされた又はキャップされていないmRNAのためのビヒクルであって、請求項1〜9のいずれか一つに記載の少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含む上記ビヒクル。
  15. 細胞内送達のための又は遺伝子治療のためのキットであって、
    (i)請求項1〜9のいずれか一つに記載の少なくとも一つの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、及び
    (ii)少なくとも一つのキャップされていないmRNA分子
    を含む、上記キット。
  16. 以下の式の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー又はその薬学的に許容される塩の一つ:
    Figure 0006774878
    ここで、各末端ブロックは任意的に更に、グリコシル残基、アルキル鎖、酸、ジカルボン酸、アミン、アミノグリコシド、若しくはアミドによって、グリコシル化および/または官能化されていても良い。
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