ES2290952T3 - Composicion que contiene acidos nucleicos y polimeros cationicos, preparacion y utilizacion. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LAS COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN AL MENOS UN ACIDO NUCLEICO Y UN POLIMERO CATIONICO, Y SU UTILIZACION EN LA TERAPIA GENICA, SOBRE TODO PARA EL TRASLADO IN VIVO DE ACIDOS NUCLEICOS.
Description
Composición que contiene ácidos nucleicos y
polímeros catiónicos, preparación y utilización.
La presente invención se refiere a unas
composiciones a base de ácidos nucleicos, a su preparación y su
utilización. Más particularmente, se refiere a unas composiciones
que comprenden al menos un ácido nucleico y ciertos polímeros
catiónicos, y a su utilización para la transferencia de ácidos
nucleicos en las células, en particular en terapia génica.
La terapia génica consiste en corregir una
deficiencia o una anomalía (mutación, expresión aberrante, etc.) o
en asegurar la expresión de una proteína de interés terapéutico
mediante la introducción de una información genética en la célula o
en el órgano afectado. Se puede introducir esta información genética
o bien in vitro en una célula extraída del órgano, siendo
entonces reintroducida la célula modificada en el organismo, o bien
directamente in vivo en el tejido apropiado. Se han descrito
diferentes técnicas para la transferencia de esta información
genética, entre las que se encuentran técnicas diversas de
transfección que implican unos complejos de ADN y de
DEAE-dextrano (Pagano et al., J.
Virol. 1 (1967) 891), de ADN y de proteinas nucleares (Kaneda
et al., Science 243 (1989) 375), de ADN y de lípidos (Felgner
et al., PNAS 84 (1987) 7413), de ADN y de polilisina, el
empleo de liposomas (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980)
10431), etc. Más recientemente, como alternativa prometedora a
estas técnicas fisicoquímicas de transfección, ha aparecido el
empleo de virus como vectores para la transferencia de genes. A este
respecto, se han testado diferentes virus por su capacidad de
infectar ciertas poblaciones celulares. En particular, los
retrovirus (RSV, HMS, MMS, etc.), el virus HSV, los virus
adenoasociados, y los adenovirus.
Sin embargo, las técnicas desarrolladas hasta la
actualidad no permiten resolver de forma satisfactoria las
dificultades asociadas a la transferencia de genes en las células
y/o el organismo. En particular, los problemas asociados a la
penetración del ácido nucleico en las células no están resueltos en
su totalidad. En efecto, la naturaleza polianiónica de los ácidos
nucleicos, en particular, previene su paso a través de las membranas
celulares. Si bien se ha demostrado que los ácidos nucleicos
desnudos son capaces de atravesar la membrana plasmática de ciertos
tipos de celulares in vivo (véase en particular la solicitud
WO 90/11092), la eficacia de transfección resulta bastante baja.
Además, los ácidos nucleicos desnudos tienen una semivida plasmática
corta, debido a su degradación por las enzimas y a su eliminación
por las vías urinarias. Por otra parte, si bien los virus
recombinantes permiten mejorar la eficacia de la transferencia de
los ácidos nucleicos, su empleo presenta ciertos riesgos tales como
la patogenicidad, la transmisión, la replicación, la recombinación,
la transformación, la inmunogenicidad, etc. Además, su producción
según las normas de la Buena Práctica de fabricación, adolece de
ciertas dificultades.
La solicitud de patente WO A 93 20090 da a
conocer unos conjugados polímeros
catiónicos-oligonucleotídicos acoplados entre sí
por enlace covalente mediante un agente de acoplamiento, estando la
relación entre cationes y aniones de dicho conjugados comprendida
entre 0,8 y 2.
La solicitud de patente EPA 0424688 da a conocer
un procedimiento para modificar unas células vegetales con la
finalidad de incorporar un ADN extraño. Este procedimiento comprende
una etapa de pretratamiento de las células con un policatión, y
después el tratamiento de dicha célula pretratada con una suspensión
que comprende ácido nucleico y liposomas catiónicos.
La presente invención aporta una solución
ventajosa a estos diferentes problemas. El solicitante ha demostrado
en efecto que ciertos polímeros catiónicos poseen unas propiedades
particularmente ventajosas para la transferencia de ácidos
nucleicos en las células, tanto in vitro como in vivo.
Además, estos polímeros presentan la ventaja de ser fácilmente
accesibles y poco costosos. La utilización de los polímeros
catiónicos según la invención permite también evitar los
inconvenientes asociados al empleo de vectores virales (peligros
potenciales, tamaño límite del gen transferido, precio elevado,
etc.).
Más particularmente, la presente invención
reside en la puesta en evidencia de las propiedades transfectantes
de los polímeros de fórmula (I):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
\newpage
- R puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo
de fórmula
- n es un número entero comprendido entre 2 y
10;
- p y q son unos números enteros,
entendiéndose que la suma p + q es tal que el
peso molecular medio del polímero está comprendido entre 100 y
10^{7} Da, y las proporciones respectivas del polímero y del ácido
nucleico son seleccionadas de tal manera que la relación R aminas
del polímero/fosfatos del ácido nucleico esté comprendida entre 5 y
30.
Se entiende que, en la fórmula (I) el valor de n
puede variar entre los diferentes motivos p. Así, la fórmula (I)
agrupa a la vez los homopolímeros y los heteropolímeros.
Un primer objeto de la invención consiste por lo
tanto en una composición constituida por un ácido nucleico y una
solución de un polímero catiónico reunidas y homogeneizadas, siendo
el polímero catiónico de formula general (I) tal como ha sido
definida anteriormente.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de los polímeros catiónicos de fórmula (I) para la
transferencia de ácidos nucleicos en las células.
Más preferentemente, en la fórmula (I), n está
comprendido entre 2 y 5. En particular, los polímeros de
polietilenimina (PEI) y polipropilenimina (PPI) presentan unas
propiedades totalmente ventajosas.
Los polímeros preferidos para la puesta en
práctica de la presente invención son aquéllos cuyo peso molecular
está comprendido entre 10^{3} y 5.10^{6} Da. A título de
ejemplo, se puede citar la polietilenimina de un peso molecular
medio de 50.000 Da (PEI50K) o la polietilenimina de un peso
molecular medio de 800.000 Da (PEI800K).
Los polímeros utilizados en el marco de la
presente invención pueden ser obtenidos de diferentes maneras. En
primer lugar, pueden ser sintetizados químicamente a partir del
monómero correspondiente, en condiciones de polimerización aniónica
(por ejemplo polimerización de la etilenimina), o por reducción de
poliamidas obtenidas por policondensación de diácidos con unas
diaminas, o también por reducción de iminas obtenidas por
policondensación de dialdehídos con unas diaminas. Por otra parte,
un cierto número de estos polímeros son accesibles comercialmente,
tales como en particular el PEI50K o el PEI800K.
Para obtener un efecto óptimo de las
composiciones de la invención, las proporciones respectivas del
polímero y del ácido nucleico son determinadas preferentemente de
tal manera que la relación molar R = aminas del polímero/fosfatos
del ácido nucleico esté comprendida entre 0,5 y 50; más
preferentemente entre 5 y 30. Se han obtenido unos resultados muy
particularmente ventajosos utilizando de 5 a 15 equivalentes de
aminas del polímero por carga de ácido nucleico. Esta relación
puede ser obviamente adaptada por el experto en la materia en
función del polímero utilizado, de la presencia de un adyuvante
(véase a continuación), del ácido nucleico, de la célula diana y del
modo de administración utilizado.
En las composiciones de la presente invención,
el ácido nucleico puede ser tanto un ácido desoxirribonucleico
como un ácido ribonucleico. Puede tratarse de secuencias de origen
natural o artificial, y en particular de ADN genómico, de ADNc, de
ARNm de ARNt, de ARNr, de secuencias híbridas o de secuencias
sintéticas o semisintéticas. Además, el ácido nucleico puede tener
un tamaño muy variable, que va del oligonucleótido al cromosoma.
Estos ácidos nucleicos pueden tener un origen humano, animal,
vegetal, bacteriano, viral, etc. Pueden ser obtenidos mediante
cualquier técnica conocida por el experto en la materia, y en
particular por cribado de bancos, por síntesis química, o incluso
por procedimientos mixtos que incluyen la modificación química o
enzimática de secuencias obtenidas por cribado de bancos. Por otra
parte pueden ser incorporados en unos vectores, tales como unos
vectores plasmídicos.
Haciendo referencia más particularmente a los
ácidos desoxirribonucléicos, éstos pueden ser de rama simple o
doble. Estos ácidos desoxirribonucléicos pueden llevar unos genes
terapéuticos, unas secuencias reguladoras de la transcripción o de
la replicación, unas secuencias antisentido, unas zonas de enlace a
otros componentes celulares, etc.
En el sentido de la invención, se entiende por
gen terapéutico en particular cualquier gen que codifica para un
producto proteico que tiene un efecto terapéutico. El producto
proteico codificado de esta manera puede ser una proteína, un
péptido, etc. Este producto proteico puede ser homólogo con respecto
a la célula diana (es decir un producto que es normalmente
expresado en la célula diana cuando ésta no presenta ninguna
patología). En este caso, la expresión de una proteína permite por
ejemplo paliar una expresión insuficiente en la célula o la
expresión de una proteína inactiva o poco activa debido a una
modificación, o incluso sobrexpresar dicha proteína. El gen
terapéutico también puede codificar para un mutante de una proteína
celular, que tiene una estabilidad mejorada, una actividad
modificada, etc. El producto proteico puede ser asimismo heterólogo
respecto a la célula diana. En este caso, una proteína expresada
puede, por ejemplo, completar o aportar una actividad deficiente en
la célula, permitiéndole luchar contra una patología, o estimular
una respuesta inmunitaria. El gen terapéutico puede codificar
asimismo para una proteína secretada en el organismo.
Entre los productos terapéuticos en el sentido
de la presente invención, se pueden citar más particularmente las
enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfoquinas:
interleucinas, interferones, TNF, etc (FR 9203120), los factores de
crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de
síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF,
bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina, etc.; las apolipoproteínas:
ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), la distrofina o una
minidistrofina (FR 911 1947), la proteína CFTR asociada a la
mucoviscidosis, los genes supresores de tumores: p53, Rb, Rap1A,
DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), los genes que
codifican para unos factores implicados en la coagulación: Factores
VII, VIII, IX, los genes que intervienen en la reparación del ADN,
los genes suicidas (timidina quinasa, citosina desaminasa), etc.
El gen terapéutico puede ser también un gen o
una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula diana
permite controlar la expresión de genes o la transcripción de los
ARNm celulares. Se pueden, por ejemplo, transcribir dichas
secuencias en las células diana en ARN complementarios de ARNm
celulares y bloquear así su traducción en proteína, según la
técnica descrita en el documento EP 140 308. También se puede tratar
de oligonucleótidos sintéticos, eventualmente modificados (EP 92
574). Los antisentido comprenden asimismo las secuencias que
codifican para unas ribozimas, que son capaces de destruir
selectivamente unos ARN diana (EP 321 201).
Como se ha indicado más arriba, el ácido
nucleico puede comprender asimismo uno o varios genes que codifican
para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o en el
animal una respuesta inmunitaria. En este modo particular de
realización, la invención permite por lo tanto la realización o bien
de vacunas o bien de tratamientos inmunoterapéuticos aplicados al
hombre o al animal, en particular contra unos microorganismos, unos
virus o unos cánceres. Puede tratarse en particular de péptidos
antigénicos específicos del virus de Epstein Barr, del virus HIV,
del virus de la hepatitis B (EP 185 573), del virus de la
pseudorrabia, o incluso específicos de tumores (EP 259 212).
Preferentemente, el ácido nucleico comprende
asimismo unas secuencias que permiten la expresión del gen
terapéutico y/o del gen que codifica para el péptido antigénico en
la célula o en el órgano deseado. Puede tratarse de las secuencias
que son naturalmente responsables de la expresión del gen
considerado cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar
en la célula infectada. También puede tratarse de secuencias de
origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas,
o incluso sintéticas). En particular, puede tratarse de secuencias
promotoras de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede
tratarse de secuencias promotoras producidas por el genoma de la
célula que se desea infectar. Asimismo, puede tratarse de secuencias
promotoras producidas por el genoma de un virus. A este respecto,
se pueden citar por ejemplo los promotores de los genes E1A, MLP,
CMV, RSV, etc. Además, estas secuencias de expresión pueden ser
modificadas mediante la adición de secuencias de activación, de
regulación, o que permiten una expresión tisular específica.
Por otra parte, el ácido nucleico puede
comprender asimismo, en particular corriente arriba del gen
terapéutico, una secuencia señal que dirige el producto terapéutico
sintetizado en las vías de secreción de la célula diana. Esta
secuencia señal puede ser la secuencia señal natural del producto
terapéutico, pero también puede tratarse de cualquier otra
secuencia señal funcional, o de una secuencia señal artificial.
Incluso por otra parte, el ácido nucleico puede
comprender asimismo, en particular corriente arriba del gen
terapéutico, una secuencia que dirige el producto terapéutico
sintetizado hacia un compartimiento celular preferido, como una
secuencia de localización nuclear.
Las composiciones según la invención pueden ser
utilizadas tal cual o en asociación con otros compuestos. Así, en
un modo particular de realización, las composiciones según la
presente invención comprenden además un adyuvante capaz de
asociarse al complejo polímero/ácido nucleico y de mejorar el poder
de transfección, siendo dicho adyuvante seleccionado de entre los
lípidos, las proteínas, las lipopoliaminas y los polímeros
sintéticos, capaces de asociarse al complejo polímero/ácido
nucleico. Como lo muestran los ejemplos de la presente solicitud,
esta mejora se manifiesta tanto in vitro como in
vivo.
Los adyuvantes utilizados preferentemente en las
composiciones según la invención son unos lípidos catiónicos (que
comprenden una o varias cargas catiónicas en su parte polar) o unos
lípidos neutros.
Haciendo referencia a los lípidos catiónicos,
puede tratarse más particularmente de lipopoliaminas, es decir de
cualquier molécula anfífila que comprende al menos una región
hidrófila poliamina y una región lipófila enlazadas covalentemente
entre sí mediante un brazo químico. Ventajosamente, la región
poliamina de las lipopoliaminas utilizadas en el marco de la
invención responde a la fórmula general
H_{2}N-(-(CH)_{m}-NH-)l-H en la
que m es un número entero superior o igual a 2 y l es un
número entero superior o igual a 1, pudiendo variar m entre los
diferentes grupos de carbono comprendido entre dos aminas.
Preferentemente, m está comprendido entre 2 y 6 inclusive y
l está comprendido entre 1 y 5 inclusive. Todavía más
preferentemente, la región poliamina está representada por la
espermina o un análogo de la espermina que haya conservado sus
propiedades de enlace con el ADN.
La región lipófila puede ser una o varias
cadenas hidrocarbonadas, saturadas o no, colesterol, un lípido
natural o un lípido sintético capaces de formar unas fases
laminares o hexagonales.
Ventajosamente, se utilizan en el marco de la
presente invención unas lipopoliaminas tales como las definidas en
la solicitud de patente EP 394 111. Esta solicitud describe también
un procedimiento que se puede utilizar para la preparación de estas
lipopoliaminas. De forma particularmente ventajosa, se utilizan en
el marco de la invención la dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS)
o la 5-carboxiespermilamida de la
palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES).
Se representan por unos lípidos neutros otros
adyuvantes particularmente preferidos para la realización de las
composiciones de la invención. La utilización de lípidos neutros es
particularmente ventajosa cuando la relación de cargas R
(aminas/fosfatos) es baja. Más preferentemente, los lípidos neutros
utilizados en el marco de la presente invención son unos lípidos
con 2 cadenas grasas.
De manera particularmente ventajosa, se utilizan
unos lípidos naturales o sintéticos, zwiteriónicos o desprovistos
de carga iónica en las condiciones fisiológicas. Puede ser
seleccionados más particularmente de entre la
dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), la
oleoil-palmitoilfosfatidiletanolamina (POPE), el
di-estearoil, -palmitoil, -miristoil
fosfatidiletanolamina así como sus derivados
N-metilados 1 a 3 veces; los fosfatidilgliceroles,
los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, los
cerebrósidos (tales como en particular los galactocerebrósidos), los
esfingolípidos (tales como en particular las esfingomielinas) o
incluso los asialogangliósidos (tales como en particular los
asialoGM1 y GM2).
Se pueden obtener estos diferentes lípidos o
bien por síntesis, o bien por extracción a partir de órganos
(ejemplo: el cerebro) o de huevos, mediante unas técnicas clásicas
bien conocidas por el experto en la materia. En particular, se
puede realizar la extracción de los lípidos naturales mediante
solventes orgánicos (véase también Lehninger, Biochemistry).
Preferentemente, las composiciones de la
invención comprenden, además del polímero catiónico en las
proporciones citadas anteriormente, de 0,1 a 20 equivalentes
molares de adyuvante por 1 equivalente molar de fosfato del ácido
nucleico, y, más preferentemente, de 1 a 5.
En un modo de realización particularmente
ventajoso, las composiciones de la presente invención comprenden un
elemento de apuntado que permite orientar la transferencia del ácido
nucleico. Este elemento de apuntado puede ser un elemento de
apuntado extracelular, que permite orientar la transferencia del
ácido nucleico hacia ciertos tipos celulares o ciertos tejidos
deseados (células tumorales, células hepáticas, células
hematopoieticas, etc.). También puede tratarse de un elemento de
apuntado intracelular, que permite orientar la transferencia del
ácido nucleico hacia ciertos compartimentos celulares privilegiados
(mitocondrias, núcleo, etc.)
Más preferentemente, el elemento de apuntado
está unido, de forma covalente o no covalente, al polímero de
fórmula (I). El enlace puede en particular ser obtenido por
interacción iónica con los amonios, o por ataque nucleófilo de las
aminas del polímero sobre unos elementos de apuntado que comprenden
un grupo nucleófugo (halógeno, tosilato, etc.), un éster activado
(hidroxisuccinimida, etc.) o incluso un isotiocianato. El elemento
de apuntado puede también ser enlazado al ácido nucleico.
Entre los elementos de apuntado que se pueden
utilizar en el marco de la invención, se pueden citar los azúcares,
los péptidos, los oligonucleótidos o los lípidos. Preferentemente,
se trata de azúcares y/o de péptidos tales como unos anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos, de unos ligandos de receptores celulares
o de fragmentos de éstos, de receptores o fragmentos de receptores,
etc. En particular, se puede tratar de ligandos de receptores de
factores de crecimiento, de receptores de citoquinas, de receptores
de lecitinas celulares o de receptores de proteínas de adhesión.
También se pueden citar el receptor de la transferina, de los HDL y
de los LDL. El elemento de apuntado puede también ser un azúcar que
permite apuntar a los receptores asialoglicoprotéicos, o incluso un
fragmento Fab de anticuerpo que permite apuntar el receptor del
fragmento Fc de las inmunoglobulinas.
Las composiciones según la invención pueden ser
formuladas con vistas a su administración por vía tópica, cutánea,
oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa,
intramuscular, subcutánea, intraocular, transdérmica, etc.
Preferentemente, las composiciones farmacéuticas de la invención
contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable para una
formulación inyectable, en particular para una inyección directa a
nivel del órgano deseado, o para una administración por vía tópica
(sobre la piel y/o la mucosa). Se puede tratar en particular de
soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones secas, en
particular liofilizadas, que, por adición según el caso de agua
esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de
soluciones inyectables. Las dosis de ácido nucleico utilizadas para
la inyección así como el número de administraciones pueden ser
adaptadas en función de diferentes parámetros, y en particular en
función del modo de administración utilizado, de la patología
interesada, del gen a expresar, o incluso de la duración buscada del
tratamiento.
Como se ha indicado anteriormente, las
composiciones según la invención pueden ser utilizadas para la
transferencia de ácidos nucleicos en las células in vivo,
in vitro o ex vivo. En particular, los ejemplos
muestran que los polímeros catiónicos de la invención pueden ser
utilizados para transferir de manera muy eficaz unos ácidos
nucleicos en numerosos tipos celulares, y en particular en ciertos
tipos celulares habitualmente difíciles de transfectar. Entre los
tipos celulares testados se pueden citar en particular los
fibroblastos, las células hepáticas, los carcinomas, las células
renales y las neuronas. Además, los ejemplos presentados a
continuación ilustran asimismo la eficacia de los polímeros de la
invención para la transferencia de genes in vivo. Los
resultados obtenidos con los vectores de la invención son superiores
a los observados en las mismas condiciones con otros agentes de
transfección, y demuestran así las potencialidades elevadas de las
composiciones de la invención.
La solicitud describe un procedimiento
particularmente ventajoso para el tratamiento de enfermedades, que
comprende la administración in vivo de un ácido nucleico apto
para corregir la mencionada enfermedad asociado a un polímero
catiónico tal como se ha definido anteriormente. Más
particularmente, este procedimiento es aplicable a las enfermedades
que resultan de una deficiencia en un producto proteico o nucleico y
el ácido nucleico administrado codifica para dicho producto
proteico o contiene dicho producto nucleico.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
constituyen así unas herramientas particularmente ventajosas para
la administración y la transferencia de ácidos nucleicos in
vivo.
La presente invención se pondrá más claramente
de manifiesto a partir de los siguientes ejemplos, que deben ser
considerados como ilustrativos.
Figura 1: Eficacia de transfección del PEI800K a
pH 7 en función de la relación R (aminas del polímero/fosfatos del
ácido nucleico).
Figura 2: Eficacia de transfección del PEI800K a
pH 6 en función de la cantidad de ADN.
Figura 3: Eficacia de transfección del PEI800K a
pH 6 en función de la relación R.
Figura 4: Eficacia de transfección del PEI800K
en función del pH.
Figura 5: Comparación entre el PEI800K y la
polilisina.
Figura 6: Test de citotoxicidad del PEI50K.
Figura 7: Eficacia de transfección del PEI50K en
presencia de adyuvantes.
Figura 8: Eficacia del PEI para la transfección
de las células HeLa.
Figura 9: Eficacia del PEI para la transfección
de las células hepáticas y renales.
Figura 10: Eficacia del PEI para la
transferencia de ADN plasmídico en las neuronas embrionarias.
Figura 11: Eficacia del PEI para la
transferencia de oligonucleótidos en las neuronas embrionarias.
Figura 12: Eficacia del PEI para la
transferencia de ADN in vivo.
Se han utilizado tres tipos de construcciones
para poner en evidencia la actividad de las composiciones de la
invención: unos plásmidos que comprenden el gen que codifica para la
luciferasa (Luc), unos plásmidos que comprenden el gen que codifica
para la \beta-galactosidasa (gen LacZ) y unos
plásmidos que comprende el gen que codifica para la
cloranfenicolacetiltransferasa (CAT).
El plásmido pCMV-luc comprende
el promotor del Citomegalovirus (CMV), extraído del plásmido vector
pcDNA3 (Invitrogen) por escisión con las enzimas de restricción Mlu
I y Hindlll, situado corriente arriba del gen que codifica para la
luciferasa, insertado en los sitios MluI y Hindlll en el vector pGL
basic Vector (Promega).
El plásmido pGL2-Luc es de
origen comercial (Promega).
El plásmido T3RE-Luc contiene un
oligonucleótido sintético que corresponde a un elemento de respuesta
palindrómica a la hormona tiroidea (Glass et al., Cell 56
(1989) 697).
El plásmido pCMV-\betaGal
(Clontech) comprende el promotor CMV situado corriente arriba del
gen LacZ que codifica para la \beta-galactosidasa
de Escherichia coli. El vector pSV-nls LacZ
(pAOnLslacZ) comprende el mismo promotor, una secuencia de
localización nuclear (salida del virus SV40) localizada en fase y
corriente arriba del gen LacZ. Esta construcción permite la
expresión de la proteína de fusión
nls-\beta-galactosidasa en el
núcleo de las células (Cf De Luze et al., PNAS 90 (1993)
7322).
Los plásmidos que tienen como gen informador el
gen que codifica para la cloranfenicolacetiltransferasa (CAT) bajo
control de los promotores RSV (pRSV-CAT) y SV40
(pSV40-CAT) han sido publicados (Boutiller et
al., Prog. Neuro-PhychoPharmacol. et Biol.
Psychiat. 16 (1992) 959; de Luze et al. PNAS 90
n(1993) 7322).
Este ejemplo describe la transferencia del
plásmido pGL2-luc en unos fibroblastos 3T3 mediante
polietilenimina 800.000 Da.
Protocolo: se ha preparado una solución 5,375
\muM de PEI 800 K y el pH es ajustado a 7 gracias a una solución
de ácido clorhídrico 1 N. Esta solución es utilizada para los
experimentos de transferencia de genes.
Protocolo de transfección: los fibroblastos 3T3
son inseminados en una caja de 24 pocillos 24 horas antes de la
transfección (50.000 células por pocillo). Son tranfectadas con 2
\mug de plásmido pGL2-Luc por pocillo según el
siguiente protocolo:
Se diluyen 2 \mug de plásmido y diferentes
volúmenes de la solución 5,375 \muM de PEI800K (en función de la
relación equivalente de cargas deseada) separadamente en
50 \mul de NaCl 150 mM y se mezclan. Después de 10 minutos, las
dos soluciones son reunidas y homogeneizadas. Después de un nuevo
periodo de 10 minutos, se añaden 900 \mul de DMEM. La
solución obtenida de esta manera es homogeneizada y después de 10
minutos, es repartida sobre las células previamente aclaradas con
medio DMEM sin suero. Al cabo de 2 horas de transfección, se han
añadido por pocillo 100 \mul de SVF (suero de ternera fetal). La
expresión es parada 24 horas después.
Dosificación de la luciferasa. Para ello, el
sobrenadante ha sido incubado en presencia de un tampón que
comprende luciferina, coenzima A y ATP, y la luz emitida
(generalmente durante 10 segundos) ha sido medida con un luminómetro
(Wood K. (1990) Promega Notes, 28).
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 1. Muestran que el PEI permite transferir eficazmente el
plásmido pGL2-Luc en los fibroblastos. Muestran
también que la actividad en unidades luz relativas (RLU =
"relative light unit") es particularmente buena cuando se
utilizan entre 5 y 20 equivalentes de aminas del PEI respecto a los
fosfatos del ADN. En un experimento control, el plásmido solo da una
señal de 100 RLU aproximadamente.
Este ejemplo describe el efecto de la cantidad
de ácido nucleico sobre la eficacia de la transferencia en los
fibroblastos 3T3 por el PEI800K.
Los fibroblastos 3T3 son inseminados en una caja
de 24 pocillos durante 24 horas antes de la transfección (50.000
células por pocillo). Éstas son transfectadas con unas cantidades
crecientes de plásmido pCMV-Luc por pocillo y una
relación de cargas constante (9 equivalentes) según el protocolo
descrito anteriormente. Dos puntos se han realizado completando la
cantidad de plásmido a dos \mug por pocillo con plásmido pGEM
(PROMEGA) que no contiene el gen estudiado. Al cabo de 3 horas de
transfección, se añaden 100 \mul de suero SVF por pocillo. La
expresión es parada 24 horas después.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 2.
La eficacia de transfección crece con la
cantidad de plásmido utilizada durante la transfección. La adición
de ADN portador no transcrito (pGEM) no aporta nada a la
transfección.
Este ejemplo describe la transferencia de ácidos
nucleicos en los fibroblastos a pH 6 mediante una composición
según la invención que comprende el ácido nucleico y el PEI800K en
diferentes relaciones R (aminas/fosfatos).
\newpage
Protocolo: Se ha preparado una solución de 5,375
\muM de PEI800K y se ha ajustado el pH a 6 gracias a una solución
de ácido clorhídrico 1 N. Esta solución es utilizada para los
experimentos de transferencia de genes.
Los fibroblastos 3T3 son inseminados en una caja
de 24 pocillos 18 horas antes de la transfección (50.000 células
por pocillo). Éstas son transfectadas con 2 \mug de plásmido
pGL2-Luc por pocillo según el protocolo utilizado en
el ejemplo 2.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 3. Muestran que las composiciones según la invención son
particularmente eficaces en toda una gama de relaciones R
comprendida entre 6 y 22.
Este ejemplo describe la transferencia de ácidos
nucleicos en los fibroblastos mediante una composición según la
invención que comprende el ácido nucleico y el PEI 800K, en
diferentes condiciones de pH.
El protocolo utilizado es idéntico al descrito
en el ejemplo 2. Se ha ajustado el pH por adición de ácido
clorhídrico 1 N.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 4. Muestran que las composiciones según la invención
pueden ser utilizadas a diferentes pH y en particular en unas zonas
de pH fisiológico (pH 5-8).
Este ejemplo describe los resultados
comparativos obtenidos con una composición según la invención y con
otro polímero catiónico, la polilisina, para la transferencia de
ácidos nucleicos en los fibroblastos.
Protocolo: la polilisina (PLL) utilizada en este
experimento es la polilisina, HBr de peso medio 50 K. La
concentración final en cloroquina es de 100 \muM. El PEI está a pH
6.
Protocolo: los fibroblastos 3T3 son inseminados
en una caja de 24 pocillos 18 horas antes de la transfección
(50.000 células por pocillo). Éstas son transfectadas con plásmido
pCMV-Luc según el protocolo utilizado en el ejemplo
2. Las células transfectadas con la PLL en presencia de cloroquina
son aclaradas al cabo de 2 horas y puestas en un medio con 10% de
suero. La expresión es parada 24 después.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 5. Demuestran claramente que las composiciones según la
invención permiten transferir ácidos nucleicos en los fibroblastos
con una eficacia muy superior a los vectores poliméricos catiónicos
anteriores tales como la polilisina.
Este ejemplo describe la utilización y la
comparación de dos polímeros PEI (PEI 50K y PEI 800K), para la
transferencia de ácidos nucleicos en las células.
Protocolo: las células son inseminadas 24 horas
antes de la transfección con 50.000 células por pocillo de 16 mm.
Éstas son transfectadas con el plásmido pCMV-Luc
complejado con el PEI. La relación de equivalente molar amina de
PEI/fosfato de ácido nucleico varía de 6 a 45 equivalentes. Para
cada pocillo, se diluyen separadamente el PEI y 2 \mug de ADN en
50 \mul de NaCl (150 mM). Las soluciones son mezcladas a
continuación, y después homogenizadas. Después de 10 minutos, este
volumen es añadido a las células. Después de 24 horas, las células
son lisadas, la solución de lisis es centrifugada, y el
sobrenadante utilizado para dosificar la actividad luciferasa. La
dosificación de proteína es realizada sobre un alicuota de este
sobrenadante mediante el test de BCA. La actividad luciferasa es
expresada en unidad de luz (RLU)/10 segundos de integración/mg de
proteína.
Los resultados obtenidos están representados en
la siguiente tabla.
Estos resultados indican claramente que el PEI
50K posee unas propiedades transfectantes tan ventajosas como las
del PEI 800K.
Se ha querido estudiar la citotoxicidad eventual
del PEI 50K sobre unos fibroblastos NIH3T3. Para este estudio, se
ha seleccionado el test MTT que permite evaluar la capacidad de las
células para reducir el MTT tetrazolio, en MTT formazan, mediante
la enzima mitocondrial, succinato de deshidrogenasa. El protocolo de
transfección es el mismo que en el ejemplo 7 (la cantidad de ADN
por pocillo permanece fija (2 \mug), el número de equivalente
molar amina de PEI/fosfato del ADN varía entre 9 y 24). Después de
24 horas de transfección, las células son lavadas tres veces con
PBS, después incubadas durante 90 minutos con 0,05 mg/ml de MTT. Al
término de esta incubación, el medio de las células es eliminado,
las células son lavadas tres veces con PBS, y después disueltas en
1 ml de SDS 10%, durante 10 minutos. La densidad óptica de las
muestras es leída a 540 nm.
Los resultados están representados en la figura
6. Muestran que en las condiciones de nuestro estudio el PEI 50K no
provoca una mortalidad significativa para los fibroblastos NIH
3T3.
Este ejemplo describe la utilización de
composiciones según la invención que comprende un polímero catiónico
y un adyuvante. El adyuvante utilizado es o bien un lípido neutro
(la DOPE); o bien una lipoliamina (el DOGS).
Protocolo: Adición de la DOPE:
Se han estudiado cuatro relaciones equivalentes
molares de amina de PEI/fosfato de ADN: 6, 9, 18 y 21. Para cada
pocillo, se han añadido a la mezcla de PEI y ADN 12 nanomoles de
DOPE. Esta solución ha sido utilizada a continuación para la
transfección como se ha descrito en el ejemplo 7.
Adición del DOGS: se han añadido, para cada
pocillo, 4 equivalentes molares de amina de DOGS/fosfato de ADN (es
decir 6 nanomoles de DOGS por 6 nanomoles de fosfatos) a la solución
de PEI antes de la etapa de complejado con el ADN. A continuación,
se realiza la transfección como se ha descrito en el ejemplo 7.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 7. Muestran claramente que la adición de la DOPE o del
DOGS permite aumentar aún las propiedades de transfección, en
particular para unas relaciones de equivalentes molares de amina de
PEI/fosfatos de ADN bajas.
Este ejemplo demuestra que las composiciones
según la invención pueden ser utilizadas para la transferencia de
genes en diferentes tipos celulares, y en particular en las células
del carcinoma uterino Hela.
Protocolo: Las células Hela son inseminadas 24
horas antes de la transfección con 50.000 células por pocillo de
16 mm. Éstas son transfectadas a continuación con el plásmido
pCMV-Luc complejado o bien con el PEI o bien con la
lipopoliamina (DOGS). Se han estudiado cuatro relaciones de
equivalentes molares de amina de PEI 50K o de PEI 800K/fosfato de
ADN: 6, 9, 18, 21. La lipopoliamina es utilizada a 8 equivalentes
molares de amina/fosfato (12 nanomoles de DOGS).
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 8. Muestran claramente que las composiciones según la
invención que comprenden un polímero catiónico eventualmente
asociado a un adyuvante, permiten transfectar las células Hela de
manera mucho más eficaz que los sistemas anteriores (en particular
la lipopoliamina, DOGS,).
Este ejemplo muestra también que las
composiciones según la invención pueden ser utilizadas para la
transferencia de genes en unos tipos celulares muy variados, tales
como los fibroblastos, los carcinomas uterinos, los hepatocitomas o
células del riñón. Más particularmente, este ejemplo describe la
transfección de las células HepG2, K 562 y de cultivos primarios de
músculo liso de conejo por el PEI a 9 equivalentes de cargas y a un
pH de 6.
\newpage
Las células HepG 2 son inseminadas en unas cajas
de 24 pocillos 24 horas antes de la transfección (50.000 células
por pocillo). Éstas son transfectadas con el plásmido
pCMV-Luc según el protocolo descrito en el ejemplo
2. Al cabo de 4 horas de transfección, se añaden 100 \mul de suero
SVF por pocillo. La expresión es parada 30 horas más tarde.
Las células K 562 son inseminadas en unas cajas
de 24 pocillos, en 0,5 ml de medio RPMI sin suero una hora antes de
la transfección. Éstas son transfectadas con plásmido
pCMV-Luc según el siguiente protocolo: la cantidad
de plásmido deseada y el PEI son diluidos separadamente en 50 \mul
de NaCl 150 mM y mezclados. Después de 10 minutos, las dos
soluciones son reunidas y homogeneizadas. Después de un nuevo
periodo de 10 minutos se añaden 400 \mul de RPMI. La solución así
obtenida es homogeneizada y después de 10 minutos es repartida
sobre las células. Al cabo de 4 horas de transfección se añaden 100
\mul de suero SVF. La expresión es parada 30 horas después.
Se han preparado los cultivos primarios de
músculo liso de conejo tal como lo ha descrito
Fallier-Becker. Las células han sido transfectadas
a continuación o bien con 1 \mug o bien con 2 \mug de plásmido
pCMV-Luc complejado con el PEI (según el protocolo
descrito en el ejemplo 7). La expresión de la luciferasa es parada
24 ó 48 horas después de la transfección.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 9. Muestran claramente que las composiciones según la
invención permiten una transfección eficaz de tipos celulares muy
variados y diferentes.
Los cultivos primarios de neuronas han sido
preparados como han descrito Lezoualc'h et al. Después de 36
h, los cultivos son transfectados con 2 \mug de plásmido
TRE-Luc (que comprende el gen Luc bajo el control de
un elemento de respuesta a la hormona tiroidea T3) y 0,5 \mug de
ADN portador por pocillo.
Se han estudiado dos condiciones
experimentales:
- 9 equivalentes de aminas respecto a los
fosfatos: se ha introducido 1 \mug de plásmido en 2,28 \mul de
una solución acuosa de PEI800K 100 mM, pH 7.
- 13 equivalentes de aminas respecto a los
fosfatos: se ha introducido 1 \mug de plásmido en 3,33 \mul de
una solución acuosa de PEI800K 100 mM, pH 7.
Previamente al complejado, el plásmido ha sido
diluido en 50 \mul de NaCl 150 mM, y el PEI ha sido también
diluido en un segundo alicuota de 5 \mul de NaCl 150 mM. A
continuación, las soluciones son mezcladas y aplicadas sobre las
células durante 1 h. El medio de transfección es retirado y
reemplazado a continuación por medio de cultivo fresco, con o sin
T3 (1 nM). Después de 24 h, las células son lisadas, la solución de
la lisis centrifugada, y el sobrenadante utilizado para dosificar la
actividad luciferasa.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 10. Muestran claramente que las composiciones según la
invención permiten transferir ADN en las células neuronales, y que
el ADN así transferido es funcional puesto que su actividad es
amplificada en presencia de T3. En el experimento de control
realizado en presencia de plásmido sólo no se ha detectado ninguna
actividad de la luciferasa.
Los experimentos han sido realizados sobre unos
cultivos primarios de neuronas preparados como en el ejemplo 12.
Después de 36 h, los cultivos han sido transfectados con 2 \muM de
oligonucleótido antisentido 18mer (ODN) complejado con 9
equivalentes de aminas respecto a los fosfatos de PEI800K.
El ODN utilizado es dirigido contra una región
del gen que codifica para el receptor alfa de las hormonas
tiroideas. Su secuencia es la siguiente:
- 5'-GCTGGGCTTCTGTTCCAT-3'
Para 4 pocillos de 250 \mul de medio de
cultivo, se han utilizado los siguientes productos:
- 8 \mul de una solución de ODN a 0,25 mM
diluidos en 10 \mul de NaCl 150 mM, y,
- 20,8 \mul de una solución acuosa de PEI800K
12 mM, pH 7, previamente diluidos en un segunda alicuota de 51,2
\mul de NaCl 150 mM.
Las soluciones son mezcladas a continuación 20
\mul de la mezcla aplicados sobre las células durante 45 min. El
medio de transfección es retirado después y reemplazado por medio de
cultivo fresco. Las células son seguidamente fijadas en una
solución de paraformaldehido al 4%, aclaradas, montadas en Mowiol, y
examinadas al microscopio de fluorescencia.
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 11. Muestran claramente que las composiciones según la
invención permiten transferir unos oligonucleótidos antisentido en
las células neuronales. En el experimento de control realizado en
presencia únicamente del oligonucleótido no se ha detectado ninguna
fluorescencia.
Este ejemplo describe la transferencia del
plásmido pCMV-Luc in vivo, en el cerebro de
ratones recién nacidos. Demuestra las propiedades particularmente
ventajosas de las composiciones según la invención, en particular
para aplicaciones de terapia génica.
30 \mug de plásmido pCMV-Luc
(7,5 \mul de una solución stock a 4 \mug/\mul) han sido
diluidos en 22,5 \mul de glucosa al 5% estéril (concentración
final 1 \mug/\mul). A continuación, se añaden 8,5 \mul de
PEI800K 100 mM (preparado en agua y tamponado a pH 6,9). La
composición obtenida de esta manera contiene por lo tanto 9
equivalentes de aminados con respecto a los fosfatos.
La mezcla ha sido agitada rápidamente y
utilizada para unas inyecciones intracerebrales en unos ratones
recién nacidos. Para ello, los ratones han sido anestesiados con
frío (colocados sobre una hoja de aluminio en contacto con hielo),
y después se han inyectado 2 \mul de mezcla (2 \mug de ácido
nucleico) por ratón. Las inyecciones han sido realizadas en el
cortex, con ayuda de un micromanipulador y una microjeringuilla
conectados a un microelectrodo.
Se han extraído los cerebros 48 horas más tarde,
han sido homogeneizados, centrifugados y el sobrenadante ha sido
utilizado para la dosificación de la luciferasa, Para ello, el
sobrenadante ha sido incubado en presencia de un tampón que
comprende luciferina, coenzima A y ATP, y se ha medido la luz
emitida (generalmente durante 10 segundos) con un luminómetro
(Wood. (1990) Promega Notes, 28).
Los resultados obtenidos están representados en
la figura 12. Muestran claramente que las composiciones permiten
transferir eficazmente el plásmido en el cerebro de los ratones
mientras que no se ha observado ninguna actividad luciferasa
significativa cuando la transferencia es realizada mediante el
plásmido solo.
Claims (30)
1. Composición constituida por una solución de
un ácido nucleíco y por una solución de un polímero catiónico
reunidas y homogeneizadas, siendo el polímero catiónico de fórmula
general (I):
en la
que
- R puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo
de fórmula
- n es un número entero comprendido entre 2 y
10;
- p y q son números enteros
entendiéndose que la suma p + q es tal que el
peso molecular medio del polímero esté comprendida entre 100 y
10^{7} Da, y
- las proporciones respectivas del polímero y
del ácido nucleico son seleccionadas de manera que la relación R
aminas del polímero/fosfatos del ácido nucleico esté comprendida
entre 5 y 30.
2. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque en la fórmula (I), n está comprendido
entre 2 y 5.
3. Composición según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizada porque el polímero posee un peso molecular
medio comprendido entre 10^{3} y 5.10^{6} Da.
4. Composición según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizada porque el polímero se selecciona de
entre la polietilenimina (PEI) y la polipropilenimina (PPI).
5. Composición según la reivindicación 4,
caracterizada porque el polímero es seleccionado de entre
una polietilenimina de peso molecular medio de 50.000 (PEI50K) y la
polietilenimina de peso molecular medio de 800.000 (PEI800K).
6. Composición según la reivindicación 5,
caracterizada porque la relación R está comprendida entre 5 y
15.
7. Composición según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque comprende además uno o
varios adyuvantes capaces de asociarse al complejo polímero/ácido
nucleico y de mejorar el poder de transfección, siendo seleccionado
dicho adyuvante de entre los lípidos, las proteínas, las
lipopoliaminas y los polímeros sintéticos.
8. Composición según la reivindicación 7,
caracterizada porque el adyuvante es un lípido
catiónico.
9. Composición según la reivindicación 8,
caracterizada porque el lípido catiónico es una o varias
lipoliaminas.
10. Composición según la reivindicación 9,
caracterizada porque la lipopoliamina responde a la fórmula
general H_{2}N-(-CH)_{m}-NH-)l-H
en la que m es un número entero comprendido entre 2 y 6 y l
es un número entero comprendido entre 1 y 5, pudiendo m variar
entre los diferentes grupos de carbono comprendidos entre dos
aminas.
11. Composición según la reivindicación 10,
caracterizada porque la lipopoliamina es seleccionada de
entre la dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS) o la
5-carboxiespermilamida de la
palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES).
12. Composición según la reivindicación 7,
caracterizada porque el adyuvante es uno o varios lípidos
neutros.
13. Composición según la reivindicación 12,
caracterizada porque el o los lípidos neutros son
seleccionado de entre los lípidos sintéticos o naturales,
zwiteriónicos o desprovistos de carga iónica en las condiciones
fisiológicas.
14. Composición según la reivindicación 13,
caracterizada porque el o los lípidos neutros son unos
lípidos con 2 cadenas grasas.
15. Composición según la reivindicación 13,
caracterizada porque el o los lípidos neutros son
seleccionados de entre la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), la
oleoil-palmitoil-fosfatidiletanolamina
(POPE), la di-estearoil,
-palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces; los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, los cerebrósidos (tales como en particular los galactocerebrósidos), los esfingolípidos (tales como en particular las esfingomielinas) y los asialogangliosidos (tales como en particular los asialoGM 1 y GM2).
-palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolamina así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces; los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, los cerebrósidos (tales como en particular los galactocerebrósidos), los esfingolípidos (tales como en particular las esfingomielinas) y los asialogangliosidos (tales como en particular los asialoGM 1 y GM2).
16. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido
desoxirribonucleico.
17. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido
ribonucleico.
18. Composición según la reivindicación 16 ó 17,
caracterizada porque el ácido nucleico es modificando
químicamente.
19. Composición según la reivindicación 16 a 18,
caracterizada porque el ácido nucleico es un
antisentido.
20. Composición según una de las
reivindicaciones 16 a 19, caracterizada porque el ácido
nucleico comprende un gen terapéutico.
21. Composición según una de las
reivindicaciones 16 a 19, caracterizada porque el ácido
nucleico codifica para una proteína antigénica.
22. Composición según la reivindicación 21,
caracterizada porque el ácido nucleico codifica para una
proteína viral.
23. Composición según la reivindicación 7,
caracterizada porque comprende de 0,1 a 20 equivalentes
molares de adyuvante para 1 equivalente molar de fosfatos del ácido
nucleico, y, más preferentemente, de 1 a 5.
24. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende
además un elemento de apuntado constituido por un azúcar y/o un
péptido, tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, un
ligando de receptor celular o un fragmento de éste, o un receptor o
un fragmento de receptor.
25. Composición según la reivindicación 22 ó 25,
caracterizada porque el elemento de apuntado está enlazado
de forma covalente al polímero de fórmula (I).
26. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende
además un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación
inyectable.
27. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende
un vehículo farmacéuticamente aceptable para una aplicación sobre
la piel y/o las mucosas.
28. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 para su utilización como medicamento.
29. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27 para su utilización como vacuna.
30. Utilización de un polímero catiónico tal
como el definido en la reivindicación 1 para la transferencia in
vitro de ácidos nucleicos en las células.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9408735A FR2722506B1 (fr) | 1994-07-13 | 1994-07-13 | Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations |
| FR9408735 | 1994-07-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| ES2290952T3 true ES2290952T3 (es) | 2008-02-16 |
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ID=9465376
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95925026T Expired - Lifetime ES2290952T3 (es) | 1994-07-13 | 1995-07-07 | Composicion que contiene acidos nucleicos y polimeros cationicos, preparacion y utilizacion. |
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Families Citing this family (125)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2730637B1 (fr) | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
| CA2222328C (en) * | 1995-06-07 | 2012-01-10 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
| US7422902B1 (en) | 1995-06-07 | 2008-09-09 | The University Of British Columbia | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
| FR2739292B1 (fr) * | 1995-09-28 | 1997-10-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique utile pour la transfection d'acides nucleiques et ses utilisations |
| GB2324534B (en) * | 1996-01-06 | 2000-05-10 | Danbiosyst Uk | Composition for delivery of nucleic acid to a cell |
| DE19746362A1 (de) * | 1996-10-23 | 1998-04-30 | Sueddeutsche Kalkstickstoff | Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Polymernanopartikel-Nucleinsäure-Konjugaten |
| EP0956001B1 (en) * | 1996-11-12 | 2012-09-12 | The Regents of The University of California | Preparation of stable formulations of lipid-nucleic acid complexes for efficient in vivo delivery |
| US6884430B1 (en) * | 1997-02-10 | 2005-04-26 | Aventis Pharma S.A. | Formulation of stabilized cationic transfection agent(s) /nucleic acid particles |
| WO1998040510A1 (en) | 1997-03-11 | 1998-09-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Dna-based transposon system for the introduction of nucleic acid into dna of a cell |
| US5912225A (en) | 1997-04-14 | 1999-06-15 | Johns Hopkins Univ. School Of Medicine | Biodegradable poly (phosphoester-co-desaminotyrosyl L-tyrosine ester) compounds, compositions, articles and methods for making and using the same |
| US6524613B1 (en) | 1997-04-30 | 2003-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Hepatocellular chimeraplasty |
| DE19726186A1 (de) * | 1997-06-20 | 1998-12-24 | Boehringer Ingelheim Int | Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen |
| US20020022034A1 (en) * | 1997-09-15 | 2002-02-21 | Julianna Lisziewicz | Therapeutic DNA vaccination |
| EP1024836B1 (en) | 1997-09-15 | 2006-12-13 | Genetic Immunity, LLC | Compositions for delivering genes to antigen presenting cells of the skin |
| DE19743135A1 (de) * | 1997-09-30 | 1999-04-01 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Biologisch verträgliche niedermolekular Polyethylenimine |
| EP1096957A1 (en) | 1998-06-18 | 2001-05-09 | Johns Hopkins University School of Medicine | Methods and reagents for intramuscular delivery of nucleic acids |
| US6916490B1 (en) | 1998-07-23 | 2005-07-12 | UAB Research Center | Controlled release of bioactive substances |
| US6562371B1 (en) * | 1998-11-02 | 2003-05-13 | Terumo Kabushiki Kaisha | Liposomes |
| US7160682B2 (en) * | 1998-11-13 | 2007-01-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Nucleic acid transfer vector for the introduction of nucleic acid into the DNA of a cell |
| CA2368185A1 (en) * | 1999-04-02 | 2000-10-12 | Research Development Foundation | Polyethyleneimine:dna formulations for aerosol delivery |
| US6770740B1 (en) | 1999-07-13 | 2004-08-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Crosslinked DNA condensate compositions and gene delivery methods |
| FR2797402B1 (fr) | 1999-07-15 | 2004-03-12 | Biomerieux Stelhys | Utilisation d'un polypeptide pour detecter, prevenir ou traiter un etat pathologique associe a une maladie degenerative, neurologique ou autoimmune |
| DE19960206A1 (de) * | 1999-12-14 | 2001-07-19 | Frank Czubayko | Komplexierung von RNS mit Polyethyleniminen zur deren Stabilisierung und zellulären Einschleusung |
| AU782912B2 (en) | 1999-12-28 | 2005-09-08 | Association Francaise Contre Les Myopathies | Use of lithium (Li+) for the preparation of a composition for transfection of a polynucleotide into a cell and compositions useful in gene therapy |
| EP1242609A2 (en) * | 1999-12-30 | 2002-09-25 | Novartis AG | Novel colloid synthetic vectors for gene therapy |
| FR2805271B1 (fr) * | 2000-02-18 | 2002-04-26 | Aventis Pharma Sa | Procede de preparation de polyalkylenimines fonctionnalises, compositions les contenant et leurs utilisations |
| ATE312088T1 (de) * | 2000-09-05 | 2005-12-15 | Centelion | Säureempfindliche verbindungen, deren herstellung und verwendungen |
| FR2813605B1 (fr) * | 2000-09-05 | 2002-10-18 | Aventis Pharma Sa | Composes acidosensibles, leur preparation et utilisations |
| FR2814370B1 (fr) * | 2000-09-22 | 2004-08-20 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation d'un complexe acide nucleique/pei pour le ciblage de cellules souches du cerveau |
| CA2424967A1 (en) * | 2000-10-09 | 2003-04-04 | Bayer Aktiengesellschaft | Complexes for transferring nucleic acids into cells |
| DE10145134A1 (de) * | 2000-10-09 | 2002-05-16 | Bayer Ag | Komplexe zur Einführung von Nukleinsäuren in Zellen |
| US20020091242A1 (en) | 2000-10-11 | 2002-07-11 | Michel Bessodes | Acid-sensitive compounds, their preparation and uses |
| JP2004537501A (ja) * | 2001-02-01 | 2004-12-16 | ボード オブ リージェンツ， ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | 肺への遺伝子送達のための安定化ポリマーエアロゾル |
| US6652886B2 (en) | 2001-02-16 | 2003-11-25 | Expression Genetics | Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents |
| WO2002100435A1 (en) * | 2001-06-11 | 2002-12-19 | Centre Hospitalier Universitaire De Montreal | Compositions and methods for enhancing nucleic acid transfer into cells |
| ATE447967T1 (de) | 2001-09-14 | 2009-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Verpackung von immunstimulierendem cpg in virusähnlichen partikeln: herstellungsverfahren und verwendung |
| AU2002348163A1 (en) * | 2001-11-02 | 2003-05-19 | Intradigm Corporation | Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles |
| PT1479985T (pt) | 2002-01-17 | 2017-08-03 | Alfa Laval Corp Ab | Evaporador submerso compreendendo um permutador de calor de placas e um compartimento cilíndrico onde está disposto o permutador de calor de placas |
| US8227432B2 (en) * | 2002-04-22 | 2012-07-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Transposon system and methods of use |
| WO2003099225A2 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Mirus Corporation | Compositions for delivering nucleic acids to cells |
| DK1519714T3 (da) | 2002-06-28 | 2011-01-31 | Protiva Biotherapeutics Inc | Fremgangsmåde og apparat til fremstilling af liposomer |
| US20050196382A1 (en) * | 2002-09-13 | 2005-09-08 | Replicor, Inc. | Antiviral oligonucleotides targeting viral families |
| EP2330194A3 (en) * | 2002-09-13 | 2011-10-12 | Replicor, Inc. | Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides |
| AU2003254755B2 (en) | 2002-10-16 | 2007-12-20 | Streck, Inc. | Method and device for collecting and preserving cells for analysis |
| US7153905B2 (en) * | 2003-03-21 | 2006-12-26 | The General Hospital Corporation | Hyperbranched dendron and methods of synthesis and use thereof |
| EP2567693B1 (en) | 2003-07-16 | 2015-10-21 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Lipid encapsulated interfering RNA |
| US7803397B2 (en) | 2003-09-15 | 2010-09-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof |
| US20060058255A1 (en) * | 2004-03-01 | 2006-03-16 | Jianzhu Chen | RNAi-based therapeutics for allergic rhinitis and asthma |
| WO2005089123A2 (en) * | 2004-03-04 | 2005-09-29 | Massachusetts Institute Of Technology | Therapeutic anti-cancer dna |
| US20060026699A1 (en) * | 2004-06-04 | 2006-02-02 | Largaespada David A | Methods and compositions for identification of genomic sequences |
| AU2005252273B2 (en) | 2004-06-07 | 2011-04-28 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid encapsulated interfering RNA |
| ATE537263T1 (de) | 2004-06-07 | 2011-12-15 | Protiva Biotherapeutics Inc | Kationische lipide und verwendungsverfahren |
| CA2572439A1 (en) | 2004-07-02 | 2006-01-12 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Immunostimulatory sirna molecules and uses therefor |
| US8101741B2 (en) | 2005-11-02 | 2012-01-24 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
| US7915399B2 (en) | 2006-06-09 | 2011-03-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
| US20080312174A1 (en) * | 2007-06-05 | 2008-12-18 | Nitto Denko Corporation | Water soluble crosslinked polymers |
| US8003621B2 (en) * | 2007-09-14 | 2011-08-23 | Nitto Denko Corporation | Drug carriers |
| EP2047858A1 (en) | 2007-10-10 | 2009-04-15 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Combination products for treating cancer |
| CN101918566A (zh) | 2007-11-22 | 2010-12-15 | Biontex实验室有限公司 | 通过影响先天性免疫系统改进非病毒输送系统的转染结果 |
| DE102007056488A1 (de) | 2007-11-22 | 2009-07-23 | Biontex Laboratories Gmbh | Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems |
| DE102008016275A1 (de) | 2008-03-28 | 2009-11-19 | Biontex Laboratories Gmbh | Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems |
| DE102008023913A1 (de) | 2008-05-16 | 2009-11-19 | Biontex Laboratories Gmbh | Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems |
| GB0724253D0 (en) | 2007-12-12 | 2008-01-30 | Fermentas Uab | Transfection reagent |
| ES2535419T3 (es) | 2007-12-27 | 2015-05-11 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Silenciamiento de expresión de quinasa tipo polo usando ARN interferente |
| US7687027B2 (en) * | 2008-02-27 | 2010-03-30 | Becton, Dickinson And Company | Cleaning compositions, methods and materials for reducing nucleic acid contamination |
| FR2928373B1 (fr) * | 2008-03-05 | 2010-12-31 | Centre Nat Rech Scient | Polymere derive de la polyethylenimine lineaire pour le transfert de gene. |
| HUE034483T2 (en) | 2008-04-15 | 2018-02-28 | Protiva Biotherapeutics Inc | New lipid preparations for introducing a nucleic acid |
| WO2009129319A2 (en) | 2008-04-15 | 2009-10-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Silencing of csn5 gene expression using interfering rna |
| DK2631297T3 (en) * | 2008-05-15 | 2017-08-07 | Nat Res Council Canada | PROCEDURE, VECTORS AND MANIPULATED CELL LINES TO IMPROVE LARGE SCALE TRANSFECTION |
| EP2350043B9 (en) | 2008-10-09 | 2014-08-20 | TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation | Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids |
| US20100167271A1 (en) * | 2008-12-30 | 2010-07-01 | Streck, Inc. | Method for screening blood using a preservative that may be in a substantially solid state form |
| US11634747B2 (en) * | 2009-01-21 | 2023-04-25 | Streck Llc | Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma |
| DE102009006606A1 (de) | 2009-01-29 | 2010-08-05 | Philipps-Universität Marburg | Nicht-virales Transfektionsmittel |
| DK2398912T3 (en) | 2009-02-18 | 2017-10-30 | Streck Inc | Conservation of cell-free nucleic acids |
| EP2623117A1 (en) | 2009-04-30 | 2013-08-07 | Genetic Immunity Kft. | Immunogenic nanomedicine composition and preparation and uses thereof |
| US9018187B2 (en) | 2009-07-01 | 2015-04-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents |
| US8569256B2 (en) | 2009-07-01 | 2013-10-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents |
| WO2011000107A1 (en) | 2009-07-01 | 2011-01-06 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors |
| AU2010306940A1 (en) | 2009-10-12 | 2012-06-07 | Smith, Larry | Methods and compositions for modulating gene expression using oligonucleotide based drugs administered in vivo or in vitro |
| US9856456B2 (en) | 2009-10-12 | 2018-01-02 | Thermo Fisher Scientific Baltics Uab | Delivery agent |
| GB0917792D0 (en) | 2009-10-12 | 2009-11-25 | Fermentas Uab | Delivery agent |
| EP3103883A1 (en) | 2009-11-09 | 2016-12-14 | Streck, Inc. | Stabilization of rna in and extracting from intact cells within a blood sample |
| US9247720B2 (en) | 2010-03-24 | 2016-02-02 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Primate model from the family cercopithecidae infected by a HBV strain of human genotype |
| WO2011120953A1 (en) | 2010-03-29 | 2011-10-06 | Universite De Strasbourg | Polymers for delivering molecules of interest |
| AU2011268146A1 (en) | 2010-06-17 | 2013-01-10 | Actogenix Nv | Compositions and methods for treating inflammatory conditions |
| EP3372248B1 (en) | 2010-06-22 | 2020-03-11 | Onxeo | Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates |
| WO2012000104A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Non-liposomal systems for nucleic acid delivery |
| WO2012151391A2 (en) | 2011-05-04 | 2012-11-08 | Streck, Inc. | Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions |
| US20140234373A1 (en) | 2011-09-16 | 2014-08-21 | Georfia Regents University | Methods of Promoting Immune Tolerance |
| CA2856116A1 (en) | 2011-11-17 | 2013-05-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Therapeutic rna switches compositions and methods of use |
| SI2782997T1 (en) | 2011-11-24 | 2018-04-30 | Genethon | A rolling lentiviral vector manufacturing system compatible with industrial pharmaceutical applications |
| US9035039B2 (en) | 2011-12-22 | 2015-05-19 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing SMAD4 |
| US20150126589A1 (en) * | 2012-06-08 | 2015-05-07 | Ethris Gmbh | Pulmonary Delivery of Messenger RNA |
| CN103059295B (zh) * | 2012-09-26 | 2016-01-13 | 上海交通大学 | 疏水修饰的聚乙烯亚胺及其作为蛋白质载体的用途 |
| EP2903652B1 (en) | 2012-10-05 | 2022-04-20 | BioNTech Delivery Technologies GmbH | Hydroxylated polyamine derivatives as transfection reagents |
| CN104703629B (zh) | 2012-10-08 | 2020-12-01 | 生物技术传送科技有限责任公司 | 作为转染试剂的羧化多胺衍生物 |
| DE102012111891A1 (de) * | 2012-12-06 | 2014-06-12 | Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät | Verbesserung der Zielfindungskapazität von Stammzellen |
| EP3024323B1 (en) | 2013-07-24 | 2022-10-19 | Streck, Inc. | Compositions and methods for stabilizing circulating tumor cells |
| US20160296632A1 (en) | 2013-11-13 | 2016-10-13 | Aequus Biopharma, Inc. | Engineered glycoproteins and uses thereof |
| EP3201338B1 (en) | 2014-10-02 | 2021-11-03 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression |
| EP3034539A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Ethris GmbH | Compositions for introducing nucleic acid into cells |
| US11168351B2 (en) | 2015-03-05 | 2021-11-09 | Streck, Inc. | Stabilization of nucleic acids in urine |
| CN107735079A (zh) | 2015-05-05 | 2018-02-23 | 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 | 核酸‑阳离子聚合物组合物及其制备和使用方法 |
| US20180245074A1 (en) | 2015-06-04 | 2018-08-30 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Treating hepatitis b virus infection using crispr |
| EP3329003A2 (en) | 2015-07-29 | 2018-06-06 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression |
| US20170145475A1 (en) | 2015-11-20 | 2017-05-25 | Streck, Inc. | Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative |
| US10010627B2 (en) | 2016-06-03 | 2018-07-03 | International Business Machines Corporation | Modified polycationic polymers |
| US11506655B2 (en) | 2016-07-29 | 2022-11-22 | Streck, Inc. | Suspension composition for hematology analysis control |
| CA3044074A1 (en) | 2016-11-16 | 2018-05-24 | Immunomic Therapeutics, Inc. | Nucleic acids for treatment of allergies |
| EP3570814B1 (en) | 2017-01-19 | 2023-11-29 | Universiteit Gent | Molecular adjuvants for enhanced cytosolic delivery of active agents |
| CN110799529A (zh) | 2017-04-22 | 2020-02-14 | 免疫治疗有限公司 | 改良lamp构建物 |
| BR112019023014A2 (pt) | 2017-05-02 | 2020-05-19 | Immunomic Therapeutics Inc | constructos de lamp aperfeiçoados compreendendo antígenos de câncer |
| JP2021523185A (ja) | 2018-05-15 | 2021-09-02 | イミュノミック セラピューティックス， インコーポレイテッドＩｍｍｕｎｏｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． | アレルゲンを含む改善されたｌａｍｐ構築物 |
| CN113573729A (zh) | 2019-01-10 | 2021-10-29 | 詹森生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
| CN114641306A (zh) | 2019-10-18 | 2022-06-17 | 免疫治疗有限公司 | 包含癌抗原的改良lamp构建物 |
| IL293051A (en) | 2019-11-18 | 2022-07-01 | Janssen Biotech Inc | calr and jak2 mutant-based vaccines and their uses |
| WO2022009051A1 (en) | 2020-07-06 | 2022-01-13 | Janssen Biotech, Inc. | A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment |
| EP4175664A2 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
| US20230024133A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-01-26 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate Neoantigens And Their Uses |
| CN112237633B (zh) * | 2020-10-22 | 2023-06-27 | 林君玉 | 一种pei/on复合物及其制备方法和用途 |
| EP4251170A1 (en) | 2020-11-25 | 2023-10-04 | Akagera Medicines, Inc. | Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use |
| GB202108176D0 (en) | 2021-06-08 | 2021-07-21 | Touchlight Ip Ltd | Vector |
| KR20240024807A (ko) | 2021-06-08 | 2024-02-26 | 터치라이트 아이피 리미티드 | 렌티바이러스 벡터 |
| AU2023254186A1 (en) | 2022-04-10 | 2024-10-17 | Immunomic Therapeutics, Inc. | Bicistronic lamp constructs comprising immune response enhancing genes and methods of use thereof |
| WO2023230587A2 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Akagera Medicines, Inc. | Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and methods of use thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5286634A (en) * | 1989-09-28 | 1994-02-15 | Stadler Joan K | Synergistic method for host cell transformation |
| US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| US5283185A (en) * | 1991-08-28 | 1994-02-01 | University Of Tennessee Research Corporation | Method for delivering nucleic acids into cells |
| AU3945493A (en) * | 1992-04-06 | 1993-11-08 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Paired-ion oligonucleotides and methods for preparing same |
| US6172208B1 (en) * | 1992-07-06 | 2001-01-09 | Genzyme Corporation | Oligonucleotides modified with conjugate groups |
| US5334761A (en) * | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
-
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