CN101918566A - 通过影响先天性免疫系统改进非病毒输送系统的转染结果 - Google Patents
通过影响先天性免疫系统改进非病毒输送系统的转染结果 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101918566A CN101918566A CN200880117341XA CN200880117341A CN101918566A CN 101918566 A CN101918566 A CN 101918566A CN 200880117341X A CN200880117341X A CN 200880117341XA CN 200880117341 A CN200880117341 A CN 200880117341A CN 101918566 A CN101918566 A CN 101918566A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tlr
- cell
- transfection
- antibody
- immunity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/859—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from immunoglobulins
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
真核细胞的先天性免疫系统能通过Toll样受体识别外来遗传物质,且能起始信号转导级联,由此通过干扰素应答触发细胞群的抗病毒状态。所述抗病毒状态也是非病毒基因输送系统的屏障。如果信号转导级联在细胞内或者细胞间被中断,则可以增加非病毒基因输送系统的转染效率并可以避免表达谱的不希望的改变。由于RNA干扰有助于抗病毒状态,因此RNAi机构在先天性免疫系统活化后也被激活。在这种情况中,可以增加siRNA转染的敲低效率。
Description
现有技术
当机体对于感染性或者免疫学攻击呈现免疫应答时(Luke A.et al.;Spektrum der Wissenschaft,August 2005,pages 68-75),在先天性免疫应答(先天性免疫)与获得性免疫应答(抗原特异性获得性免疫)之间有区别。
获得性免疫仅在感染病原体的事件中发生。这是一种记忆性免疫,由此由相同病原体导致的二次感染通常不引起该疾病的发作。这是疫苗所基于的原理。如果仅存在获得性免疫,生物体则完全无对抗第一次感染的保护作用。然而不是这种情况,因为存在称作先天性免疫的非常原始的免疫,且在从果蝇至哺乳动物的范围内均发现这种免疫,甚至在植物中也发现此免疫。
先天性免疫是对抗病原体的第一道防线,且在进化期间是非常古老的系统。在先天性免疫的情况中,所谓的病原体相关的分子模式(PAMP)的疾病相关分子模式由所谓的Toll样受体(TLR)识别(Heine H.et al.,Int.Arch.Allergy Immunol.2003;130;180-192和Uematsu S.et al.,J.Biol.Chem.2007,May 25;282(21);15319-23)以及由RIG-I-样解旋酶(RLH)识别,且引发合适的炎症和免疫反应。结果,该生物体能区分自身和非自身物质。RLH在细胞溶质内遍在表达,在此其能识别在病毒感染情况下形成的dsRNA。TLR和RLH属于也称作模式识别受体(PRR)的受体。
Toll样受体(TLR)
Toll样受体最初在二十世纪九十年代中期发现(Zimmer A.et al.;PNAS,1999;96(10),5780-5785)。其名称得自由Christiane Nüsslein-Volhard在黑腹果蝇(Drosophila Melanogaster)中发现的蛋白质,她将其命名为Toll。TLR蛋白类似该类型,因此被称作“Toll-样”蛋白质。它们是这样的跨膜蛋白,具有细胞外“亮氨酸富集重复”结构域(LRR)以及与家族同源的细胞质结构域。不同的TLR与不同的分子病毒和细菌成分选择性反应,且通过信号转导级联控制相应的基因激活。在第一种情况中这通过所谓的适体(adapter)分子及随后通过最终激活转录因子(例如NF-κB及IRF家族)的激酶发生,所述激活转录因子通过其磷酸化或者那些转录因子的相应细胞内抑制剂而进行。最后,除了大量具有抗微生物作用的特定基因之外,产生所谓的细胞因子。细胞因子反过来是获得性免疫的必要刺激物,且因此也将先天性免疫与获得性免疫联系起来。然而,对于配体识别、信号转导以及信号传送仅有初步认知。
迄今为止已知13种不同的TLR(其中10种是人类TLR),其数目足以识别从细菌至真菌以及病毒的所有病原体。受体识别所有致病生物体共有的结构,此外,还偶尔同时识别许多组成成分,后者结构不相似。例如,TLR4识别脂多糖,但是也识别紫杉醇(taxol)。迄今为止还未知TLR怎样能做到如此。TLR在物种与物种之间仅略有不同。
迄今为止已知如下分子作为TLR的配体,其导致信号转导级联的触发:
TLR1:
与TLR2形成异源二聚体,是来自酵母的三酰基脂蛋白和酵母聚糖的受体。
TLR2:
是某些肽聚糖、脂肽、糖脂和各种细菌的受体。
TLR3:
识别长dsRNA,在感染的细胞中病毒复制情况中发生。
TLR4:
是脂多糖(LPS,也称作内毒素)、各种外壳糖蛋白(也包括病毒的外壳糖蛋白)以及紫杉醇的受体。LPS是细菌细胞壁的组成成分。TLR4受体发挥功能需要另外的膜结合蛋白(TLR辅助蛋白):CD14,例如其结合LPS并提供给TLR4受体,与单独CD14的结合不触发信号转导级联。
TLR5:
是鞭毛蛋白的受体,鞭毛蛋白是细菌借助其运动的纤毛(鞭毛)主要组成成分。
TLR6:
与TLR2形成异源二聚体,是二酰基脂蛋白和某些肽聚糖的受体。一种特殊的脂蛋白(MALP-2=巨噬细胞激活脂肽)通过膜结合蛋白CD36(TLR辅助蛋白)的辅助得以检测。
TLR7和TLR8:
是咪唑并喹啉和ssRNA/dsRNA的受体,例如RNA病毒的受体。
TLR9:
是细菌DNA或者非甲基化CpG基序的受体,其在许多细菌DNA中出现(比在哺乳动物细胞中出现多20倍)。哺乳动物细胞中的CpG基序是高度甲基化的,结果是其可以被区分。适用于细菌DNA的也适用于病毒DNA,其也通过TLR9检测。细菌DNA的免疫刺激性质早在二十世纪八十年代即由Dr.Tokunaga研究小组报道。由Dr.Shizuo Akira领导的小组鉴别TLR9受体是关联受体(通过基因靶向澄清Toll-受体的作用及其信号转导级联,Robert Koch lecture by Dr.Shizuo Akira,General Press Information 2002;www.robert-koch.stiftung.de)。
TLR10:
目前还未知的配体。
TLR11:
是导致泌尿道感染的大肠杆菌(uropathogenic bacterium Escherichia coli)和原生动物Toxoplasma gondii的profilin样蛋白质的受体。
TLR12:
功能和配体仍未知。
TLR13:
功能和配体仍未知。
TLR的位置:
TLR2、4、5和6特别位于单核细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞或者骨髓树突细胞的浆膜中,而TLR7、8和9特别位于免疫细胞的内涵体中(Siegmund-Schultze N.,www.aerzteblatt.de)。因此免疫应答的激活需要通过胞吞作用和内涵体的成熟而进行细胞内摄取。信号传送在内涵体区室内开始。在TLR 3的情况中,表明其位于浆膜中,但是也有文献描述推测其位于内涵体中。TLR通常成对起作用,且以各种组合出现在各种细胞类型中。
信号转导级联:
尽管各种TLR的信号转导途径(Perry A.K.et al.,Cell Research 2005;15(6);407-422 and Kawai T.et al.,J.Biochem.;2007;141;137-145)具有一些相似性,但是其也明确出现出相对较大的差异,最终导致不同的基因表达及因此不同的生物反应。除了TLR3之外,所有TLR传送其信号至适体蛋白MyD88。MyD88在信号传送中通过TLR/白细胞介素-1受体起关键作用。TLR的胞质结构域与白细胞介素-1受体的胞质结构域呈现出显著相似性,因此该结构域也被称作Toll/IR-1受体结构域(TIR)。例如,MyD88-缺陷的脾细胞呈现出与白细胞介素-1、LPS或者CpG-DNA无反应。此外,在MyD88-缺陷的细胞的情况中,在与TLR2、TLR7、TLR9配体的反应中观测到无信号分子如NF-κB或者MAP激酶激活。这显著表明TLR(除TLR3之外)的信号传送对MyD88的竞争依赖性。其它适体分子是例如TIRAP(含有适体蛋白(TLR1、TLR2、TLR4和TLR6)的Toll-白细胞介素-1受体(TIR)-结构域)、Mal(MyD88-适体样分子)、TRIF(TLR3和TLR4)和TRAM(TLR4)。
除了适体分子之外,哪些蛋白质也起作用依赖于所述TLR。简而言之,信号转导级联通常始于具有胞质结构域的在细胞表面的受体,该受体在具有合适配体时,通过胞质适体分子将其信号传送至激酶,由此通过级联激活转录因子。激活的转录因子位于细胞核,且触发蛋白质主要是细胞因子的表达。
通过TLR1/TLR2,TLR2/TLR2,TLR2/TLR6的信号转导级联
成对出现的受体在具有合适配体时,触发相同信号转导级联。最终激活转录因子NF-κB和AP-1,其特别导致参与信号传送的细胞因子、适体分子RAC-1、TIRAP、MyD88和TRAF6的表达。参与的激酶至少是IRAK1、IRAK4、TAK1、PI 3K、IKKα、IKKβ、IKKγ、JNK、p38MAPK和MKK。
通过TLR4的信号转导级联
受体需要膜结合蛋白CD14以充分发挥功能。CD14结合相应的激动剂,并提供给受体。所述受体在具有合适配体时,最终触发转录因子NF-κB、AP-1、IRF3和IRF7的激活,由此导致参与信号传送的细胞因子、适体分子TIRAP、MyD88、TRAM、TRIF、TRAF3、TRAF6、NAP1和RIP1的表达。参与的激酶至少是IRAK1、IRAK4、TAK1、IKKα、IKKβ、IKKγ、IKKε、TBK1、ERK1、ERK2、JNK、p38MAPK、MEK1、MEK2和MKK。
通过TLR5的信号转导级联
受体在具有合适配体时,最终触发转录因子NF-κB和AP-1的激活,由此导致参与信号传送的细胞因子、适体分子MyD88和TRAF6的表达。参与的激酶至少是IRAK1、IRAK4、TAK1、IKKα、IKKβ、IKKγ、JNK、p38MAPK和MKK。
通过TLR10、11、12、13的信号转导级联
受体在具有合适配体时,最终触发转录因子NF-κB和AP-1的激活,由此导致参与信号传送的细胞因子、适体分子MyD88和TRAF6的表达。参与的激酶至少是IRAK1、IRAK4、TAK1、IKKα、IKKβ、IKKγ和MKK。
通过TLR3的信号转导级联
受体在具有合适配体时,最终触发转录因子NF-κB、AP-1、IRF3和IRF7的激活,再次增加参与信号传送的细胞因子、适体分子TRIF、TRAF6、TRAF3、NAP1和RIP1的表达。参与的激酶至少是IRAK1、IRAK4、TAK1、IKKα、IKKβ、IKKγ、IKKε、TBK1、PKR、PI K3、JNK、p38MAPK和MKK。
通过TLR7、TLR8和TLR9的信号转导级联
受体在具有合适配体时,最终触发转录因子NF-κB、AP-1、IRF1、IRF5和IRF7的激活,再次增加参与信号传送的细胞因子、适体分子MyD88、TRAF6和TRAF3的表达。参与的激酶至少是IRAK1、IRAK4、TAK1、IKKα、IKKβ、IKKγ、JNK、p38MAPK和MKK。
TLR有非常大的治疗兴趣。例如使用TLR激动剂在免疫接种或者在癌症治疗中作为佐剂。例子包括通过TLR7/8激动剂咪喹莫特(imiquimod)/瑞喹莫德(resiquimod)治疗基底细胞癌,以及通过TLR2激动剂治疗膀胱癌。TLR9受体通过合成的含有CpG的寡核苷酸(CpG 7909和CpG 10101)激活,用以治疗自身免疫疾病、癌症和感染性疾病。基于TLR9的治疗策略可商购自Coley Pharmaceuticals。
TLR7和TLR8激动剂
TLR7和TLR8受体的已知可商购的激动剂一般是咪唑并喹啉(etal.,Oncogene,2008,27,190-199),如咪喹莫特(R837,1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)、瑞喹莫德(R848,4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a,a-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇)和Gardiquimod(1-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇);鸟苷类似物例如洛索立宾(loxoribine)(7-烯丙基-7,8-二氢-8-氧-鸟苷)及其它激动剂如溴匹立明(bropirimine)(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)。其它咪唑并喹啉在文献中已经有描述(Miller et al.,Drug News&Perspectives,2008,21(2),69-87;Gorden etal.,J.Immunol.,2005,174,1259-1268;Jurk et al.,Eur.J.Immunol.,36,1815-1826;2006;Gorden et al.,J.Immunol.,2006,177,8164-8170),所述文献在此并入作参考。一些同样可商购的其它激动剂是噻唑并喹啉如CL075(Gordon KB et al.,J.Immunol.,2005,174(3),1259-68)和CL097(Schindler U.et al.,Mol.Cell Biol.,1994,14(9),5820-5831)以及鸟苷类似物艾沙托立宾(isatoribine)(7-硫代-8-氧鸟苷)(Horsmans Y.et al.,Hepatology,42(3),724-731)。
TLR8的已知激动剂通常是ssRNA,特别是单链多尿苷以及具有富含U或者富含GU序列的ssRNA(Diebold et al.,Science,2004,303,1529-1531;Heil et al.,Science,2004,303,1526-1529;Lund et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2004,101,5598-5603),ssRNA也可以是硫代磷酸酯(phosphothioate)形式的。应特别提及的是序列基序UGUGU和GUCCUUCAA(Hornung et al.,Nat.Med.,2005,11,263-270;Judge et al.,Nat.Biotechnol.,2005,23,457-462),其在长度为16bp的ssRNA是特别刺激的。ssRNA必须被天然转运进内涵体中,以与TLR8反应。一般而言,这通过常规转染试剂完成。InvivoGen销售作为TLR8激动剂的与阳离子脂质(LyoVec)复合的ssRNA40。
然而,许多疾病也可以是由于先天性免疫的过度反应而触发,例如自身免疫疾病如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。在这种情况中,TLR与内源细胞的降解产物反应,并因此误导免疫。
甚至怀疑TLR与心血管疾病的发生相关。心脏的炎症反应可导致动脉硬化斑形成,最终由于血管阻塞而导致心肌梗塞。
细胞因子
细胞因子是多功能信号物质。其是含有具有调节机体细胞生长和分化功能的蛋白质的糖。因此将其中一些也称作生长因子。许多细胞因子在免疫反应中也起重要作用,且因此也被称作介体。细胞因子由细胞通过分泌释放至其周围介质中,并且当其它细胞具有合适受体时刺激该细胞。细胞因子被分为5种主要类型:
1.干扰素(IFN)
干扰素指导细胞形成防止病毒感染的蛋白质或者使这种感染更难以发生。干扰素也可以具有抗肿瘤活性。
2.白细胞介素(IL)
白细胞介素特别用于免疫系统细胞之间的通讯,且因此增加对抗病原体和治疗肿瘤的协同作用。
3.集落刺激因子
集落刺激因子在肾中形成。它们是血细胞生长因子。
4.肿瘤坏死因子(TNF)
TNF的最重要功能是调节各种免疫细胞的活性。它们主要由巨噬细胞分泌。TNF能刺激细胞死亡(凋亡)、细胞增殖、细胞分化及其它细胞因子的分泌。
5.趋化因子
趋化因子是化学引诱物,其通过趋化性使具有合适受体的细胞迁移至趋化因子的来源。
干扰素(IFN)、特别是I型干扰素,是特别重要的免疫过程介体。这种类型的第一种干扰素由Isaacs和Lindemann在1957年发现(Isaacs,A.et al.;J.Proc.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.147,258-267)。其名称源自该蛋白质干扰病毒复制。I型干扰素是触发细胞抗病毒应答、建立“抗病毒状态”以及刺激免疫系统细胞抗病毒应答的关键细胞因子。这组干扰素结合受体,即所谓的IFN-α受体(IFNAR),该受体由两条蛋白质链组成(IFNAR1和IFNAR2)。干扰素被分为许多亚型。这些亚型被称作IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ。在此特别重要的是α和β型干扰素由许多细胞分泌,例如淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和成骨细胞。
IFN-α蛋白具有13个亚型,将这些亚型称作IFNAX(x=1、2、4、5、6、7、8、10、13、14、16、17和21)。所有其基因均簇状位于染色体9上。
在IFN-β蛋白中,已经描述了其中两种干扰素。它们是IFNB1和IFNB3。描述为IFNB2的蛋白质随后被鉴别为已知的白细胞介素。
通过信号转导级联,即所谓的JAK/STAT途径,在与位于外细胞膜中的I型干扰素受体结合之后,转录因子“干扰素刺激基因因子3”(ISGF3)被诱导,其是转录因子STAT1、STAT2与“IFN调节因子9”(IRF9)的异源三聚体,其迁移至细胞核中,并在此诱导数百个效应分子的转录(通过所谓的IFN可诱导基因进行)。那些效应分子在建立所谓的“抗病毒状态”的过程中直接影响蛋白质合成、细胞生长和生存。在这个状态下,病毒的感染性被防护或者至少被降低,例如通过降低复制速度实现。
此外,适应性免疫系统通过触发树突状细胞的成熟以及激活抗体应答B细胞和T细胞应答而被激活。淋巴细胞和单核细胞通过诱导的趋化因子被募集至感染部位。
应激(Stress)也可以发起信号转导途径,其导致抗病毒状态。这些信号转导级联与TLR的信号转导级联交叉。
应激信号转导途径:
细胞应激可以由如下因素触发:
-热/冷
-UV
-机械应激/剪切力
-缺氧
-营养缺乏
-渗透性应激
-氧化应激/自由基
-炎症
-生物和化学物质(例如TNFα、化疗药物)。
细胞与应激复杂反应改变了信号链的活性,其中包含特异的MEK、MSK和MSAP激酶以及各种转录因子(例如NH-κB)、细胞凋亡调节物和细胞周期调节物。与膜结合的GTP结合蛋白(Ras/Rho家族)在细胞与细胞应激的反应中起特殊作用。
先天性免疫应答在细胞内和细胞间均发生。在细胞内应答的情况中,通过与病原体接触而受影响的细胞通过PRR如TLR和RLH触发信号转导级联,导致生理状态的细胞表达谱改变。除此之外,还有细胞间应答,其中通过与病原体接触而受影响的细胞“通知”未暴露于与所述病原体直接接触的其它细胞关于病原体的“感染”情况,通过与病原体接触而受影响的细胞释放细胞因子,该细胞因子由位于未与所述病原体接触的其它细胞上的细胞因子受体检测。细胞因子与细胞因子受体的结合在未暴露于与所述病原体直接接触的细胞中触发信号转导级联,结果是该细胞虽然未与所述病原体直接接触,但是其生理状态和表达谱也被改变。所述细胞的生理状态和表达谱的改变用以对抗病原性攻击起保护作用以及保证该细胞的存活。
所述细胞间应答与细胞内应答由于不同的受体和激动剂而有所不同。在细胞间应答的情况中是细胞因子受体,在细胞内应答的情况中PRR作为受体。细胞间应答的激动剂是细胞因子,在细胞内应答的情况中激动剂是致病模式。
基因输送方法
转染,即将遗传物质导入真核细胞、特别是哺乳动物细胞中,这是一种现代研究不可或缺的方法(Domb A.J.;Review in Molecules;2005;10;34 and Xiang G;Keun-Sik K.;Dexi L.;Review in The AAPS Journal;2007;9(1)Article 9;http://www.aapsj.org)。没有这种方法,事实上更难以阐明各个基因的功能。不能忘记的是使用这种方法可以制备真正(true-to-original)真核细胞源的蛋白质,因为真核细胞保证适当的翻译后修饰,与过去常用的原核细胞不同。此外,预期在不久的将来,将遗传物质导入人体细胞中即所谓的基因治疗将以临床检验程序和治疗成为现代医学的一部分。遗传物质的导入使得例如在真核细胞中置换被破坏的DNA区域及因此校正缺陷的功能成为可能。另外,可以插入自杀基因,其例如使癌细胞“自杀”。然而,基因的敲低(knock-down)也可以通过使用例如siRNA(小干扰RNA)、核酶或者反义分子而实现。接触细胞的遗传控制装置的可能性因此给人类提供了有价值的工具,用于增加对细胞中天然发生过程的了解以及影响。
在过去的几年里,对于可在体外和体内使用的所谓基因输送方法(基因输送系统)的研究已经获得巨大进展,因为其在基因治疗中提供了实现突破的极佳前景。一个感兴趣的基因治疗研究焦点是使用病毒作为载体系统。由于将DNA或者RNA导入外来细胞中是病毒复制周期的一个完整组成部分,这种能力已经在病毒的发展历史中通过天然的进化过程改进至目前不再有有效的基因载体的程度。天然发生的病毒通过遗传工程被操纵,由此其丧失再生能力及其致病性,但是能感染具有重组导入的遗传物质的细胞。因为病毒除了由遗传物质组成之外,主要是由蛋白质组成,其为免疫系统提供大的攻击靶位,且同时免疫系统在同样的进化适应过程中产生保护其自身抵御这种入侵者攻击的策略。因此,机体的免疫应答就失败的基因治疗研究而言被认为是特别显著的因素。
目前利用的基因输送方法可以分为主要两个组:病毒系统和非病毒系统。非病毒系统可以再分为化学方法和物理方法。
基于化学方法的非病毒系统应特别提及的方法是基于阳离子脂质(所谓的脂染)或者阳离子聚合物(所谓的polyfection)的那些方法。其效率通常远落后于病毒系统。
熟知的阳离子聚合物的例子是聚-L-赖氨酸(PLL)(EP 388758),聚乙烯亚胺(PEI)(J.P.Behr et al.;Proc.Natl.Acad.Sci.USA;1995;92;7297;WO 9602655),二乙基氨基乙基葡聚糖(DEAE)(S.C.De Smedt et al.,Phar.Res.;2000;17;113),Starburst dendrimers(PAMAM),(F.C.Szoka et al.,Bioconjug.Chem.;1996;7;703;WO 9502397),壳聚糖衍生物(W.GuangLiu et al.;J.Control.Release;2002;83;1)以及聚二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯(P.van de Wetering et al.;J.Gene Med.;1999;1;156;WO 9715680)。广泛使用的磷酸钙沉淀方法在广义范畴内也使用“阳离子聚合物”,且因此可包含在这个组中。
可商购的这种阳离子聚合物产品是例如Superfect,Polyfect(Qiagen),ExGen500(Biomol)和jetPEI(Qbiogene)。
相似已知的阳离子脂质(J.P.Behr;Bioconjugate Chem.;1994;5;382)是例如DOTMA(US 4946787)、DOTAP(Leventis et al.;Biochim.Biophys.Acta;1990;1023;124)、DOGS(EP 394111)、DOSPA(WO 9405624)、DOSPER(WO 97002419)、DMRIE(US 5264618)和DC-Chol(Huang et al;Biochem.Biophys.Res.Commun.;1991;179;280;WO 9640067)。那些或者相似的脂质是如此配制的或者组合所谓的共脂质(例如DOPE),通常以微团或者脂质体形式存在于乙醇缓冲水溶液中。它们可以这种形式或者以自配制的油脂或者固体物质形式获得,如可商购的试剂如Lipofectin、Lipofectamin、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Fugene(Roche)、Effectene(Qiagen)、Transfectam(Promega)、Metafectene(Biontex)等。
在存在DNA或者RNA的条件下,阳离子脂质和阳离子聚合物由于相反电荷的关系的结果而自然形成所谓的脂复合物(lipoplexes)或者聚合复合物(polyplexes)。DNA通过磷酸根上负电荷的补偿而被浓缩,也就是说使其大小最小化。通常地,脂复合物或者聚合复合物的转染效率依赖于许多参数。最重要的是在脂复合物/聚合复合物制备中遗传物质与阳离子成分的相对比例、在脂复合物/聚合复合物制备期间的离子浓度、每个细胞脂复合物/聚合复合物的绝对数量、细胞类型、细胞的增殖状态、细胞的生理状态、细胞分裂速度、保温时间等。这些影响因素是复杂的转染事件的表述,其中它们包含的脂复合物/聚合复合物或者遗传物质必须越过大量细胞屏障。
第一个屏障是外层带负电细胞膜。假定转染活性脂复合物需要具有净正电荷,其通过吸附性胞吞作用或者液相胞吞作用进入细胞内部。胞吞作用是细胞主动转运过程,由于胞吞作用的结果,细胞表面上的物质围绕在细胞膜周围并作为囊泡(内涵体)而内在化。通过与含有酶的复杂混合物的所谓溶酶体融合,内涵体中含有的物质被降解。由于低pH值是降解所必需的,因此内涵体具有质子泵,其将质子泵入内涵体中直至获得合适的pH值。为了保证电荷中性,氯离子流入内涵体至相同程度。
为此,许多现代阳离子脂质或者聚合物均具有缓冲性质。由此,未达到地pH值,且出现例子流入内涵体中,由于产生的渗透压而导致内涵体破裂。由此,这些脂复合物/聚合复合物进入细胞溶质中。由于也已知许多不具有缓冲性质的转染活性脂质和聚合物,因此必须存在使得脂复合物/聚合复合物进入细胞溶质中进一步机制。设想至少在脂质情况中,存在去稳定化包含及与其相关的膜融合。目前还不清楚在这个过程中脂复合物或者含有的DNA/RNA自身是否主要进入细胞溶质中。然而,因为通过将脂复合物直接显微注射进细胞核中以实现蛋白质表达的尝试失败,因此设想所述DNA在细胞溶质中从脂复合物中释放。看起来脂复合物中结合的DNA不易受转录机制的影响。
如果包含siRNA或者mRNA的反义分子,则达到作用的生物位点,且作用的持续时间基本依赖于细胞溶质RNase的浓度以及从脂复合物/聚合复合物中的释放速度。DNA不能渗入细胞核,这被称作“核屏障”。然而,在细胞分裂期间其到达作用位点,并因此导致蛋白质表达。
另一个基于化学方法的非病毒方法可以提及的是这样的系统,其具有DNA结合分子部分及能触发受体介导的胞吞作用的配体(Example transferinfection;Wagner et al.;Proc.Natl.Acad.Sci.;1990;87;3410)。
其它化合物由DNA-和/或RNA-结合结构域以能触发膜转移的配体组成,例如Penetratin,Derossi et al.;Trends in Cell Biology;1998;8;84 or HIVTat Petid,Gratton et al.;Nature Medicine;2003;9(3);357所述。膜转移应被理解为是指分子可以从膜的一侧转移至另一侧。作为DNA-和/或RNA-结合结构域,需要考虑的是能通过静电作用(例如阳离子)或者氢键(例如肽核酸,PNA)结合DNA和/或RNA的化合物的所有结构元件。也可以使用插入化合物(例如吖啶)以结合RNA/DNA。然而,能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移的化合物也能与所述遗传物质共价结合,条件是所述生物作用不因此被削弱或者仅略微削弱。
基于物理方法的非病毒方法的最显著的实例是电穿孔。在这种方法中,转染的细胞被导入两个电极之间,对其应用惯例的电压梯度。以此方式,对细胞进行强电流振荡(脉冲),导致细胞膜可逆的开放(孔)。由于这些孔的结果,例如与所述孔紧邻的遗传物质能进入细胞中。所述脉冲(即电压梯度)是成功的最重要参数,必须针对每种细胞类型加以优化。许多电穿孔仪可商购自供应商(例如Eppendorf/Multiporator,US 6008038,Biorad/Gene pulser,US 4750100,Genetronics Inc.,US 5869326,BTX/ECM series),这些电穿孔仪已经特别针对真核细胞开发,使得所述脉冲参数与所述细胞类型匹配。事实上,现在也可以获得可以在体内使用的装置。在体外应用的情况中,将悬浮于电穿孔悬浮液中的细胞与转染的DNA/RNA一起导入带有电极的电穿孔试管中,进行一或多次脉冲。除了电压梯度之外,另外的重要参数是缓冲液的性质、温度、细胞浓度以及DNA浓度。在对细胞进行脉冲之后,将其短时间静置以使细胞膜再生。然后将细胞播种于培养皿中,以常规方式培养。
可以提及的其它物理方法是显微注射、水动力方法、弹道方法(基因枪)或者使用超声方法,以及将裸DNA注射进不同器官中,导致基因极低表达。
组合物理方法和化学方法的方法也特别包括磁转染,其使用磁性纳米粒子上的DNA结合分子,通过磁场梯度增加细胞表面的DNA浓度以及触发胞吞作用。
针对各种方法的效率令人不满意的问题设定由将遗传物质导入真核细胞所提供的巨大机会。在目前存在的每种方法的情况中特别发生的缺点基本上涉及重要参数如效率、毒性、免疫原性、靶向、遗传物质大小的限制、体内/体外应用范围、高通量应用的范围、危害潜力、方法的简便性及方法的成本。没有一种方法能充分符合所有这些参数。事实是尽管取得相当可观的研究成果,但是目前还不能确定基于基因治疗的任何医学治疗可归因于合适的基因载体系统的缺失。
特别地,真核细胞的先天性免疫系统可以代表对非病毒基因输送系统的显著屏障。原因是真核细胞的先天性免疫系统能通过Toll样受体识别外来遗传物质并起始信号转导级联,由此触发细胞群的抗病毒状态。细胞的这种抗病毒状态也代表了对用非病毒基因输送系统进行转染的屏障,这个屏障不可能或者非常难以克服。
例如,在重复脂染实验中,首先进行特异性针对某一蛋白质的siRNA转染,然后使用报道基因进行质粒转染,这个实验示出尽管细胞看起来健康,但是未发生成功的质粒转染。仅在siRNA的量非常低的情况中,可能检测到少量报道蛋白质。
为了排除这是特异siRNA的脱靶效应的可能性,使用针对人遗传物质进行“比对(blasted)”的非特异性siRNA重复进行实验。然而获得相同结果。
因为已知细胞的增殖在脂染情况中也起作用,进行研究以探讨细胞的增殖行为是否由于siRNA预转染而被削弱。研究表明在相对存在大量siRNA的情况中,增殖速度降低,但是当在预转染失败后进行质粒转染时,在该实验中达到足够的增殖。令人惊奇地,看起来细胞似乎能保护其自身免于二次转染。
使用重复转染实验,其中相继进行两次质粒转染,尽管未明确提及,但是获得相似结果。二次转染步骤通常是非常低效或者是反效果的。在这种情况中,进行与上述那些相似的研究,以保证不包含毒性作用。进一步研究示出分泌干扰素。
触发RNA干扰的siRNA的转染
当mRNA与插入的dsRNA具有序列同源性时,通过将dsRNA导入细胞中而选择性关闭基因。
这个方法被称作RNA干扰(Fire et al.,Nature,1998,391,806-811),通常如下所述进行:通过dicer酶将插入细胞中的具有细胞固有mRNA的同源序列的dsRNA切割成大量具有21-25个核苷酸的小dsRNA片段(Bernstein etal.,Nature,2001,409,363-366)。
Dicer是ATP依赖性核糖核酸酶。所得核苷酸片段在3’末端具有2-3个核苷酸突出端。所述小RNA片段被称作“小干扰RNA(siRNA)”(Elbashiret al.,Nature,2001,411,494-498)。
双链siRNA是不卷绕(unwound)的,推测其借助于解旋酶消耗ATP(Dalmay et al.,EMBO,2001,J20,2069-2078)。然后单链被转变为蛋白质复合物RISC(RNA-诱导的沉默复合物)(Kuhlmann et al.,Biol.unserer Zeit,2004,3,142-150)。保持在RISC上的链可以与互补RNA(靶RNA)杂交。然后所述靶RNA被完整的核酸内切酶切割。由于基因仅能通过单链mRNA的迂回途径(circuitous route)起作用,因此该基因实际上被关闭。尽管其仍被转录,但是RNA干扰(RNAi)再次快速降解该mRNA。为此,RNA干扰也被称作“转录后基因沉默”(PTGS)。
RNA干扰在原生动物、真菌、植物和动物中发现,但是各个机制彼此略有不同。原始细菌和原核生物不具有该能力。
目前还不十分清楚所述功能。推测其对抗RNA病毒起保护作用。例如,病毒感染的植物能恢复以及在新生出的叶片中症状衰退。无症状的叶片可不再感染相关种类的病毒。入侵的病毒或其RNA的互补拷贝产生,其作为合成原始RNA的基质。病毒特异性dsRNA形成,其触发PTGS机制。由于最初dsRNA的浓度太低,因此植物能恢复且逐步控制病毒。推测细胞固有的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)识别单链病毒基因组,将其转变为dsRNA,然后开始RNAi进程。PTGS对抗病毒起保护作用的理论通过在病毒中发现PTGS抑制剂而得以支持。目前仍不十分清楚它们怎样工作以及植物是否产生对抗这些抑制剂的机制。
近年来RNA干扰方法已经取得重大进展,因为其赋予关闭不希望的基因或者蛋白质的可能性,因此控制病毒性疾病及其它疾病。此外,其在揭示基因功能关系的研究中不可或缺。
使用RNA干扰方法的最常用的变化方法是合成产生的siRNA分子的转染,即具有2-3个核苷酸的3’突出端的双链RNA。在哺乳动物细胞中,具有30bp以上的插入dsRNA使得所有mRNA被酶促破坏及终止蛋白质合成(Kaufmann,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1999,96,11693-11695)。在注射较长的dsRNA之后,一些高等真核细胞可以与干扰素产物反应,这样可抑制病毒基因的表达,并且操纵细胞凋亡。如果其被阻止,在哺乳动物细胞情况中所述siRNA的长度必须小于30bp(Tuschl et al.,Genes Dev.,2001,15,188-200)。作为转染方法,可利用从DNA转染方法中获知的方法。与DNA转染的唯一不同之处是插入的遗传物质的作用部位。在DNA转染中,作用部位是细胞核。在siRNA转染中,作用部位是细胞溶质。
最常用的方法是电穿孔、通过阳离子聚合物转染以及尤其是通过阳离子脂质转染。质粒转染的最佳试剂非必须也是siRNA转染的最佳试剂,反之亦然。适于siRNA转染的的具体试剂因此可商购。举例的试剂是Interferrin(Polyplus)、X-treme Gene siRNA(Roche)、siPort(Ambion)、S ilentfect(Biorad)、Dharmafect(Dharmacon)和Lipofectamin RNAiMax(Invitrogen)。
在siRNA转染情况中,成功转染的测量应理解为与未处理的样品或者用非特异性siRNA(无靶位的siRNA)转染的样品相比蛋白质或者基因的相对敲低。在siRNA转染中的一个问题是所谓的脱靶效应,其被理解为例如不是敲低靶位的基因的表达无意削弱。这例如可以在序列相似性情况中出现。为了尽可能低地保持这种脱靶效应以及由于毒性的原因,这是潜在的siRNA转染系统使用最小可能量的siRNA达到最高可能敲低所必需的。特别是在体内应用的情况中,另一优选的要求是除了靶蛋白质表达之外,所述细胞的表达谱尽可能小地改变。
发明描述
本发明提供了可以更有效转染的方法。所述方法适用于单次转染以及重复转染,即两或多次转染。本发明另一目的是尽可能小地影响细胞生理状态,即细胞群的蛋白质表达谱应理想地仅其基因已经插入细胞中的蛋白质或其表达通过插入的遗传物质而被降低或者阻断的蛋白质被改变。然而,在siRNA转染情况中,也可以有利地改变细胞的生理状态,以将细胞带入“抗病毒状态”,因为在这种情况中RNA干扰特别有效。此外,本发明提供了组合物和试剂盒,其含有使用非病毒输送系统更有效转染真核细胞的成分。
通过本发明的方法改进了非病毒基因输送系统的转染结果,所述方法特征在于:
a)将细胞在转染之前和/或转染期间用至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具(means)处理,以及在转染期间将遗传物质、特别是修饰的和/或未修饰的ssDNA、修饰的和/或未修饰的dsDNA、修饰的和/或未修饰的ssRNA、修饰的和/或未修饰的dsRNA和/或修饰的和/或未修饰的siRNA导入该细胞中;或者
b)将细胞在转染之前和/或转染期间和/或转染之后用至少部分激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理,以及在转染期间将修饰的和/或未修饰的siRNA导入细胞中。
本发明的改进转染结果的方法可以在体外和/或体内进行。
通过至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫,即先天性免疫的细胞内和/或细胞间信号转导级联之一被中断,转染结果可得以改进和/或可以避免转染的细胞中表达谱中不希望的改变。
也就是说,特别是通过适体分子、通过相应的激酶(其随之诱导细胞因子、特别是干扰素)、通过激活转录因子自TLR开始的细胞内信号转导级联以及膜转运过程可被负调节、中断或者削弱。此外,信号通过细胞之间的信使物质的传送可以被中断。因为其均是蛋白质,而根据本发明优选使用活性增加或者活性降低的效应物如所用蛋白质的抗体、适体、拮抗剂或者抑制剂。相应的活性物质可本身或者使用合适的辅助分子导入到细胞或细胞中,这取决于细胞通透性或者靶位点。例如,可以通过脂质体载体将活性物质导入内涵体中。如果靶位点是细胞溶质,可能使用的方法包括电穿孔或者能透过细胞壁的特殊肽序列。如果所述活性物质是肽或者蛋白质,根据本发明其可以通过合适遗传物质的转染而在细胞内形成,且如果需要可以使用定位序列定向到相应的细胞区室。如果通过编码信号转导结构关键的蛋白质的siRNA基因实现敲低,根据本发明可利用已知的转染系统。
可以使用本发明的方法,且本发明的方法可以在体外和体内使用。其可用于在转染期间或者甚至提前预防细胞“抗病毒状态”的发生。由于细胞在培养期间也可以与生物材料接触,例如与血清或者胰蛋白酶接触,所述生物材料可含有一或多种TLR应答的物质(例如DNA、RNA、LPS等),因此可以发生细胞在转染开始之前已经处于抗病毒状态。这也是为什么转染结果的再现难以实现的原因。转染结果的质量高度依赖于细胞的免疫学起始状态,这个状态依赖于预处理情况(例如传代培养)。
在本发明的方法中,所述非病毒基因输送系统可包含阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白;和/或可包含一种化合物,该化合物具有DNA-和/或RNA-结合结构域,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或可包含一种化合物,该化合物与DNA和/或RNA共价结合,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或可基于物理方法如电穿孔、显微注射、磁转染(magnetofection)、超声或者弹道或水动力方法。
此外,在本发明方法中,转染可以进行至少两次,即进行两或多次转染(3、4、5、6次等)。
另外,在本发明的方法中,优选阳离子脂质可以包含于非病毒基因输送系统中,特别优选如下式(I)所示阳离子脂质:
其中
R1可以是
其中
R2和R3独立地是其它十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、十八烯基或其它烷基,在所有可能的组合中,它们可以是饱和的、不饱和的、支链的、非支链的、氟化的或者非氟化的,并且可以由5-30个碳原子组成;
X可以是
其中m=0及n=0;或者m=0及n=1;或者m=0及n=2;或者m=1及n=1;或者m=1及n=2;或者m=2及n=2;以及
g可以是1,2,3,4,5,6,7或者8;a可以是0,1,2,3,4,5或者6;b可以是0,1,2,3,4,5或者6;c可以是0,1,2,3,4,5或者6;d可以是0,1,2,3,4,5或者6;e可以是0,1,2,3,4,5或者6;以及f可以是0,1,2,3,4,5或者6。
更优选地,在本发明的方法中,可以使用包含如化学式(I)所示阳离子脂质的非病毒基因输送系统,其中R2和R3独立地是十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、十八烯基;m和n可以是1;g可以是1,2,3,4,5,6,7或者8;a可以是0,1,2,3,4,5或者6;b可以是0,1,2,3,4,5或者6;c可以是0,1,2,3,4,5或者6;d可以是0,1,2,3,4,5或者6;e可以是0,1,2,3,4,5或者6;以及f可以是0,1,2,3,4,5或者6。
在本发明的方法中,先天性细胞内和/或细胞间免疫可以由至少一种抗体、胞内抗体、适体、拮抗剂、抑制剂和/或siRNA至少部分抑制,其阻断先天性免疫的细胞内和/或细胞间信号的传送。相应的抗体、胞内抗体、适体、拮抗剂和抑制剂可商购。
此外,在本发明的方法中,可以使用siRNA敲低以关闭编码信号转导必需的蛋白质的至少一个基因。例如针对TLR、激酶和转录因子的相应的siRNA或者质粒、shRNA(短发夹RNA)可以商购(Imgenex/Invivogen)。
在本发明的方法中,为了至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫,可以阻断至少TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12、TLR 13、CD14、CD38、RIG-I解旋酶和/或RIG-I-样解旋酶之一。特别优选阻断TLR 1、TLR 2、TLR 4和/或TLR 9。进一步可优选阻断多个上述受体或者蛋白质。根据本发明,合适的抗体是能阻断TL受体的那些抗体。例如已知且可商购Toll样受体TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9和CD14的抗体。举例的能阻断人TLR的抗体是:小鼠抗人-CD282抗体(=抗TLR2),单克隆抗体,AbD Serotec,Cat.No.:MCA2484EL;小鼠抗人-TLR3,抗体,单克隆抗体,Lifespan Biosciences Cat.No.:LS-C18685;小鼠抗人-CD284抗体(=抗TLR4),单克隆抗体,AbD Serotec,Cat.No.:MCA2061EL;小鼠抗人TLR1抗体(单克隆抗体,0.05%叠氮化钠,100μg lyophilisate),Invivogen,No.Mab-htlr1;兔抗人-TLR9抗体(=抗TLR9),多克隆抗体,0.5μg/μl于PBS、0.2%凝胶、0.05%叠氮化钠中,Lifespan Biosciences,Cat.No.:MCA2484EL。如果商购的抗体中含有不希望的物质如叠氮化钠,在将该抗体用于本发明方法中之前必须除去这些物质,例如通过透析除去。
能阻断TLR的抗体可以与触发胞吞作用的脂复合物或聚合复合物(本身或者包装于脂质体中)一起插入内涵体中,由此阻断所述受体。然而,通常加入细胞外空间也是足够的。根据本发明,待阻断的受体的选择当然也依赖于待转移的遗传物质的性质。此外,转染剂也可以确定待阻断的受体的选择。检测遗传物质的TLR,即TLR 3、TLR 7、TLR 8和TLR 9,通常位于内涵体中。其它TLR位于浆膜上。例如,如果DNA待转移,优选可阻断TLR 9。如果所述DNA是细菌源的,可优选除了阻断TLR 9之外还阻断TLR 4和/或TLR 5。
在优选的实施方案中,将浓度为0.01-100μg/ml的抗体加入培养基中。在进一步优选的实施方案中,抗体的浓度是0.01-10μg/ml培养基,最优选0.01-5μg/ml。
抗体可以整合进转染活性复合物如脂复合物中。在优选的实施方案中,抗体与遗传物质的比率是0.01∶1(μg/μg)-10∶1(μg/μg)。在更优选的实施方案中,所述量0.01-1μg/μg遗传物质,在最优选的实施方案中的量是0.01-0.3μg/μg遗传物质。
如下论述适用于根据本发明可以用于至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的所有抗体:使用的抗体通常必须针对待转染的细胞的待阻断的靶分子,例如受体如TLR、细胞因子受体、干扰素受体等。例如,如果涉及人细胞的TLR,则抗体必须针对待阻断的人TLR受体。在许多情况中,由于不同物种靶分子如TLR之间的大相似性,所述抗体对其存在交叉反应性;即尽管已经产生针对一个物种的靶分子的抗体,但是其对于另一物种的相似靶分子也呈现其性质。也优选使用待转染的相同物种细胞的抗体,因为在这种情况中其呈现较小或者无免疫原性。所述抗体也可以重组制备。如果其用于人体细胞,其可以是“人源化的”。优选所用抗体以高亲和性结合其靶分子。所用抗体可以是多克隆或者单克隆抗体,优选单克隆抗体。也可以使用修饰的抗体,例如在修饰的抗体情况中,Fc片段可以不存在,因为单独通过Fab片段结合表靶分子/抗原。修饰的抗体也可以用疏水性基团修饰,如脂质,以促进其在膜和/或脂质体中锚定。如果希望更简单地检测所用抗体,也可以用荧光染料标记。也可以对抗体进行多个修饰。此外,所用抗体必须没有禁用于活细胞的添加剂,例如某些防腐剂。
在本发明的方法中,也可以阻断如下至少一种激酶:IRF激酶、TBK1、MAP激酶、MAPK激酶、MAPK激酶、MAPKK激酶、MAPKKK激酶、MEK1、MEK2、MEK5、MKK4/SEK、MKK5、MKK6、MKK7、ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7、ERK8、JAK、JNK1、JNK2、p38MAP激酶、RK、p38/RK MAP激酶、p30/RK MAP激酶、磷脂酰肌醇3-激酶、IRAK-1、IRAK-4、IKK-α、IKK-β、IKK γ、IKK δ、IKK ε、TAK1、PKB激酶、PKD1、PKD2、MSK1或者PKR。优选阻断选自MEK1和MEK2的至少一种激酶。进一步优选阻断上述多种激酶。
此外,根据本发明,激酶MEK1和/或MEK2可以被IC50值低于100nM的化合物抑制。另外,根据本发明,激酶MEK1和/或MEK2可以由1,4-二氨基-2,3-二氰-1,4-二(o-氨基苯基巯基)丁二烯(U0126)阻断。在优选的实施方案中,使用1-500μM的浓度。在更优选的实施方案中,所述浓度为1-100μM,在最优选的实施方案中,浓度为1-30μM。
在本发明的方法中,可以阻断参与先天性细胞间免疫的至少一种细胞因子、至少一种肿瘤坏死因子(TNF)、至少一种白细胞介素和/或至少一种干扰素。
可以考虑的待阻断的干扰素例如是I型干扰素,特别是选自干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ和干扰素-ω的至少一种干扰素。作为待阻断的白细胞介素,可以考虑的是白细胞介素-1。
也可以阻断至少一种细胞因子受体,特别是至少一种干扰素受体、特别是I型干扰素受体,至少一种白细胞介素受体,和/或至少一种肿瘤坏死因子受体。举例的针对I型干扰素受体的合适抗体是针对人干扰素α/β受体第2链的小鼠单克隆抗体(CD118),克隆MMHAR-2,同种型Ig2a,浓度(C)=0.5mg/ml于含有1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中,PBLBiomedical Laboratories,Product No.21385。特别地,白细胞介素-1受体可以由抗体或者拮抗剂如IL-ra(人白细胞介素-1受体拮抗剂,Biomol.Cat.No.:54592)阻断。特别优选的靶是干扰素-γ受体。
如下论述适用于在本发明中可用作至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具的所有拮抗剂:所用拮抗剂通常必须针对待转染的细胞的待阻断的靶分子,例如受体如白细胞介素受体、细胞因子受体、干扰素受体等。例如,如果包含人细胞的受体,所述拮抗剂通常必须针对待阻断的人受体。在许多情况中,由于不同物种靶分子如TLR之间的大相似性,所述拮抗剂对其存在交叉反应性;即尽管已经产生针对一个物种的靶分子的拮抗剂,但是其对于另一物种的相似靶分子也呈现其性质。也优选使用待转染的相同物种细胞的拮抗剂,因为在这种情况中其呈现较小或者无免疫原性。所述拮抗剂也可以重组制备或者合成。优选地,所用拮抗剂以高亲和性结合其靶分子。根据本发明使用的拮抗剂也可以与抗体修饰相似地被修饰。
在本发明优选的安排中,可以阻断参与触发先天性细胞内和/或细胞间免疫的信号转导级联的上述多个受体和/或蛋白质。例如,可以组合多个TLR受体的抗体以利用其加合作用和/或协同作用。同样,例如也可以组合TLR受体和/或TLR辅助蛋白和/或适体分子和/或激酶和/或转录因子和/或细胞因子和/或细胞因子受体的抑制剂和/或抗体、和/或胞内抗体、和/或适体、和/或拮抗剂、和/或siRNA,以至少部分中断先天性免疫的信号传送级联。
本发明的方法也可用于通过一些方式改进使用非病毒基因输送系统的siRNA转染结果,所述siRNA是修饰或者未修饰的。
在本发明的方法中,激动剂可用作激活先天性免疫的工具。
首先,本发明的方法可用于通过刺激先天性免疫系统的细胞内部分而激活RNA干扰机制。所述激活通过将相应激动剂加样于各种TLR受体而实现,但特别通过加样(并因此激活)受体TLR7和TLR8进行。受体TLR7和TLR8位于内涵体中且检测ssRNA,如在RNA病毒感染的情况中所预期的那样。这些受体的激活导致特别高的“抗病毒状态”,由此活性RNA干扰机制可以分派于(allocated)该状态。RNA-干扰是对抗病毒起保护作用的机制的设想可以很容易适合整体构想。siRNA转染结果的改进不同于其它遗传物质的转染,良好的转染结果需要活性RNAi机制,其是先天性免疫系统的一部分,活性RNAi机制过度代偿先天性免疫系统对于siRNA吸收的不利作用。
优选地,在本发明的方法中,先天性细胞内和/或细胞间免疫可以由TL受体的至少一种激动剂、特别是TLR7和/或TLR8的至少一种激动剂至少部分激活。
根据本发明,TLR7和/或TLR8的至少一种激动剂可选自溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、鸟苷类似物和ssRNA。
优选地,在本发明方法中,所述至少一种激动剂可以是咪喹莫特(R837,1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)、瑞喹莫德(R848,4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a,a-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇)或者Gardiquimod(1-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇);或者CL075或CL097;或者洛索立宾(7-烯丙基-7,8-二氢-8-氧-鸟苷)或者艾沙托立宾(7-硫代-8-氧鸟苷);或者具有富含U的和/或富含GU的序列的ssRNA,特别是具有基序UGUGU和/或GUCCUUCAA的ssRNA。咪喹莫特的浓度可以是0.1-100μg/ml,优选浓度为0.1-20μg/ml,最优选浓度为0.1-10μg/ml。优选在转染同时和/或转染后加入。优选地,所述ssRNA长度为至少15个碱基。此外,ssRNA可具有硫代磷酸酯主链。例如,长度为20个核苷酸的ssRNA可以0.1-100μg/ml浓度使用,优选0.1-20μg/ml,最优选0.1-10μg/ml。优选在转染同时和/或转染后加入。优选地,所述免疫刺激性ssRNA可包含于转染活性复合物中,所述复合物包含非病毒基因输送系统以及在其上shRNA已经编码的siRNA或者质粒-DNA。
可透过细胞的激动剂可以在实际siRNA转染步骤之前、期间或者之后直接加入细胞培养基中,其是ssRNA及其类似物与合适的转染试剂复合所必需的,因为这些试剂不是天然可透过细胞的,因此不能到达位于内涵体中的TLR。也可以将激动剂与siRNA一起掺入脂复合物或者聚合复合物种,或者通过烷基链衍生化,将所述激动剂掺入脂质体或者脂复合物的脂质膜中,其由转染转染活性阳离子脂质及可能的共脂质如DOPE组成。激动剂也可以与阳离子聚合物共价结合。
其次,本发明的方法可用于通过刺激先天性免疫系统的细胞间部分而激活RNA干扰机制。所述激活通过加样抗病毒细胞因子的受体与合适的激动剂而实现。在优选的安排中,使用的干扰素-β和/或干扰素-γ的浓度是1-10000U/ml。在更优选的实施方案中,所述浓度是1-5000U/ml,在最优选的实施方案中,所述浓度是1-2000U/ml。所述添加优选在转染同时和/或在转染后进行。
另一方面,本发明的方法可用于刺激适于激活siRNA机制获得性免疫系统那部分,且同时阻断影响导入的siRNA量的其它部分,例如通过负调节胞吞作用进行,这可能是利用协同作用。
在本发明的方法中,可以将细胞在转染前用至少部分激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理直至4天,优选直至18小时,特别优选直至6小时。
此外,在本发明的方法中,将细胞在转染之后用至少部分激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理直至2天,优选直至12小时,特别优选直至6小时。
另外,在本发明的方法中,可以将细胞用至少部分抑制或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理,并且同时与非病毒基因输送系统接触。
本发明的方法也可用于防止不希望的先天性免疫系统的反应,及因此防止细胞修饰的基因表达。特别有意义的是在体内应用及在在复杂信号途径中通过siRNA转染澄清蛋白质功能。细胞的不同的信号转导途径通常也与先天性免疫系统的信号转导途径结合。在蛋白质敲低的情况中,其同时对于细胞的生理状态具有严重影响,更难以分派对蛋白质的功能。为了可以避免这个问题,本发明的方法可用于部分或者全部阻断先天性免疫系统的应答。
本发明的方法适于转染真核细胞。如果在体外转染真核细胞,则细胞可以贴壁或者悬浮于合适培养基中。优选地,如果包含DNA转染,则细胞在转染时处于增殖对数期。如果RNA待转染,则细胞在转染时优选处于延滞期或者对数期。如果转染针对表达蛋白质进行,需要考虑的是遗传物质是具有可表达为RNA或者肽/蛋白质的成分的dsDNA或者具有可表达为肽/蛋白质的成分的ssRNA(在每种情况中是修饰或未修饰的)。
如果为了通过RNA-干扰实现基因的敲低而进行转染,可以使用具有可表达为小发夹RNA成分的修饰的或未修饰的dsDNA或者修饰的或未修饰的siRNA;只有在后者的情况中,TLR 7和/或TLR 8的激活是可取的。然而,另外阻断TLR和/或细胞因子受体和/或通过阻断MEK1和/或MEK2中断信号转导是有利的,特别是尽可能不影响细胞的表达谱。
本发明的方法可优选具有如下步骤:
(a)提供第一种溶液,其含有靶分子的抗体、拮抗剂、抑制剂或者激动剂;提供第二种溶液,其含有非病毒基因输送系统;以及提供第三种溶液,其含有待转染的遗传物质;
(b)将含有靶分子的抗体、拮抗剂或者抑制剂的第一种溶液加入细胞培养基中待转染的细胞中;
(c)将含有非病毒基因输送系统的第二种溶液与含有待转染的遗传物质的第三种溶液混合;
(d)保温得自步骤(c)的混合物;
(e)将得自步骤(d)的保温的混合物加入得自步骤(b)的用第一种溶液预处理的待转染的细胞中。
根据本发明,第一种溶液可含有作为靶分子的细胞因子受体或者TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8或者TLR 9的拮抗剂或者抗体;靶分子MEK1和/或MEK2的抑制剂;或者TLR 7和/或TLR 8的激动剂;特别是上述那些之一。拮抗剂或者抗体可优选溶解于缓冲盐溶液中例如PBS、基本培养基等,生理pH值为6.8-7.45,生理克分子渗透压浓度为270-310mosmol/kgH2O,或者在水或者pH值为5-9的非缓冲盐溶液中。在存在溶解性问题的情况中,所述抑制剂也可以在合适的生理可接受的溶剂中稀释,例如乙醇/DMSO。第一种溶液中拮抗剂、抗体或者抑制剂的浓度可以是0.01-1μg/μl。
根据本发明,在步骤(b)中将第一种溶液加入细胞培养基中待转染的细胞中是在用转染复合物处理细胞(步骤(e))之前24小时至1秒钟期间进行,优选在从0.5-5小时期间进行。这特别适用于当第一种溶液含有MEK1-和/或MEK2-抑制剂或者TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5或TLR 6或者细胞因子受体的抗体或者拮抗剂时。将适量第一种溶液加入待转染的细胞培养基中。所得待转染的细胞培养基中抗体或者拮抗剂的浓度可以是0.01μg/ml-50μg/ml,优选0.05-12μg/ml,特别优选0.1-5μg/ml。所得待转染细胞培养基中抑制剂浓度可以是1nM-500μM,优选5-100μM,特别优选10-50μM。
在本发明方法中,通过移液混合含有非病毒基因输送系统的第二种溶液和含有待转染的遗传物质的第三种溶液(步骤(c))。对于每个待转染的细胞,待转染的遗传物质的量为0.1皮克/细胞-300皮克/细胞,优选0.2-50皮克/细胞,特别是1-10皮克/细胞,可以使用待转染的遗传物质。非病毒基因输送系统的量由遗传物质的量决定。在非病毒基因输送系统与遗传物质静电结合的情况中,所述量由基因输送系统与遗传物质之间的电荷比率(+/-)决定。基因输送系统:遗传物质的电荷比率(+/-)可以是0.1∶1至100∶1,优选1∶1至20∶1,特别优选4∶1至10∶1。在非静电结合的情况中,非病毒基因输送系统的量由与遗传物质的化学当量比率决定。非病毒基因输送系统:遗传物质的化学当量比率可以是0.1∶1至1000∶1,优选1∶1。
可以将含有非病毒基因输送系统的第二种溶液与含有待转染的遗传物质的第三种溶液的混合物保温1分钟至30分钟,优选10-15分钟。
优选地,在本发明的方法中,可以使用非病毒基因输送系统,其包含阳离子脂质,特别是如上述化学式(I)所示阳离子脂质。
根据本发明,在24小时后,可以重复进行步骤(a)-(e),以再次用遗传物质转染细胞。优选地,在第二次或者进一步转染之前,应用新鲜培养基置换其中待转染细胞位于其中的含有添加物的培养基。
在本发明的方法中,可以将含有TLR 3、TLR 7、TLR 8或者TLR 9的拮抗剂或抗体的第一种溶液与含有非病毒基因输送系统的第二种溶液及含有待转染的第三种溶液混合。优选地,将含有抗体/拮抗剂的第一种溶液加入含有非病毒基因输送系统的第二种溶液中并进行混合。抗体的使用量基于非病毒基因输送系统量为0.1%-50%(重量),优选0.1-10%(重量)。非病毒基因输送系统的量由使用的遗传物质的量决定。在非病毒基因输送系统与遗传物质静电结合的情况中,所述量由基因输送系统与遗传物质之间的电荷比率(+/-)决定。基因输送系统:遗传物质的电荷比率(+/-)可以是0.1∶1至100∶1,优选1∶1至20∶1,特别优选4∶1至10∶1。在非静电结合的情况中,非病毒基因输送系统的量由相对于遗传物质的化学当量比率决定。非病毒基因输送系统:遗传物质的化学当量比率可以是0.1∶1至1000∶1,优选1∶1。优选将第一种溶液与第二种溶液的混合物保温至少5分钟。然后将含有待转染的遗传物质的第三种溶液加入第一种和第二种溶液的保温混合物中并进行混合。对于每个待转染的细胞,待转染的遗传物质的量是0.1皮克/细胞至300皮克/细胞,优选0.2-50皮克/细胞,特别优选1-10皮克/细胞,可以使用转染的遗传物质,抗体/拮抗剂掺入包含非病毒基因输送系统和遗传物质的转染活性复合物中。优选使用已经用亲脂性分子成分修饰以促进抗体/拮抗剂结合进脂复合物中的抗体/拮抗剂。也可以使用已经通过抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白和生物素与非病毒基因输送系统连接的抗体。在这种情况中,基因输送系统和抗体需要预先适当修饰。也可以使用与非病毒基因输送系统共价连接的TLR 3、TLR 7、TLR 8和TLR 9的抗体。
本领域已知提供包含阳离子脂质或者脂复合物的脂质体的阳离子免疫脂质体即含有与抗体或者抗体片段共价结合的DNA和阳离子脂质的复合物的方法。已经发现所述方法以使得基因输送系统靶向机体中的靶细胞。大多数方法使用所谓的交联剂。交联剂是双功能分子,其在具有相应官能团的两个分子之间产生共价键连接。例如,Pierce提供了广泛选择的水溶性和不溶于水的异双功能(即适于连接两个不同官能团)和同双功能(适于连接两个相同官能团)交联剂。羧基基团和氨基基团可用于连接抗体;在Fab片段的情况中,可以使用硫醇基团连接。阳离子脂质和聚合物含有氨基用以连接。在阳离子肽的情况中,羧基和氨基基团可用于连接。
阳离子免疫脂质体可以通过与常规脂质体相同方式配制,通过在配制之前用脂质衍生化抗体以及将其加入阳离子脂质(可以是共脂质)中。对于通过同双功能交联剂共价连接,例如DSP(dithiobis[succinimidylpropionate])氨基官能团可用于连接具有与抗体共价连接的氨基官能团的脂质。对于Fab片段与脂质的共价连接,可以使用硫醇官能团和交联剂N-succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate(Martin et al.;J.Biol.Chem.;1982257(1),286)或者SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate).如果交联剂不溶于水,必须在有机溶剂中进行抗体与脂质之间的这些结合反应及纯化,即必须在转染之前除去所述有机溶剂。透析可用于纯化。如果加交联剂如DSP可溶于水,在水溶液中脂质与抗体之间通过例如氨基功能连接可以形成共价键,在转染之间纯化不是绝对必要的。
本领域技术人员已知制备这种脂复合物的方法,所述脂复合物具有与脂质共价结合的修饰的抗体。然后所述脂复合物吸收修饰的抗体(Lee et al.,J.Biomed.Sci.;2003;10;337)。技术人员也已知将阳离子聚合物例如PEI或者dendrimers或者阳离子蛋白质如聚赖氨酸与抗体或者抗体片段共价连接的方法(Chen et al.,FEBS Letters;1994;338;167;Suh et al.;J.ControlledRelease;2001;72;171);例如PEI与在DMSO中的DPS反应,加入于PBS中的抗体溶液中。在透析后,获得与抗体结合的非病毒基因输送系统(Chiu et al.,J.Controlled Release;2004;97;357)。
在本发明的方法中,第一种溶液可含有激动剂以激活TLR 7和/或TLR 8,特别是上述那些激动剂之一。激动剂可溶解于缓冲盐溶液中例如PBS、基本培养基等中,生理pH值为6.8-7.45,生理克分子渗透压浓度为270-310mosmol/kgH2O,在水或者未缓冲的盐溶液中pH值为5-9。激动剂的浓度可以是0.01-1μg/μl。含有TLR 7和/或TLR 8激动剂的第一种溶液可以在转染之前、期间或者之后加入培养基中待转染的细胞中。激动剂的处理时间应根据激动剂的性质加以选择,由此尽可能活性的先天性免疫系统遭遇尽可能高的大量siRNA。优选地,在将转染复合物加入待转染细胞的同时加入含有激动剂的第一种溶液,通过将相应量的第一种溶液加入培养基中进行。激动剂的量由细胞的量决定。优选使用0.1pg激动剂/细胞至25ng激动剂/细胞,特别是1-500pg激动剂/细胞,更优选10-250pg激动剂/细胞。
本发明的方法,即本发明的转染方法,也可以在体内实现,所述方法的步骤相应于在体外转染的各个步骤,除外的是通过如下途径加入各个溶液或者混合物:经口(p.o.)、经皮肤、舌下(s.l.)、经鼻、静脉内(i.v.)、关节内、动脉内(i.a.)、淋巴内、肌内(i.m.)、intra-ossally(i.o.)、皮下(s.c.)、皮内(i.c.)、经皮肤、经直肠、经阴道、吸入(p.i.=per inhalation)、经肺内、支气管内(e.b.)、腹膜内(i.p.)、心脏内、神经内、神经周围、硬脑膜周围、鞘内、胸膜内、玻璃体内、肠道外、经肠道或者经面颊给予。遗传物质的量由遗传物质的性质、靶位如血液、组织的细胞外液、细胞组织等、给予形式以及给予模式如注入、注射或者吸入等因素决定,所述量为0.01-500mg/kg体重。在将第一种溶液直接给予个体的情况中,抗体、拮抗剂或者激动剂的量可以是0.1mg/kg-500mg/kg体重,优选1-100mg/kg,特别优选5-10mg/kg。在将第一种溶液直接给予个体的情况中,抑制剂的量可以是0.1mg/kg-500mg/kg体重,优选10-300mg/kg,特别优选100-200mg/kg。加入第一种溶液的时间和持续时间由靶位决定,例如由血液、组织的细胞外液、细胞组织等、给予形式和给予模式如注入、注射、吸入等因素决定。
在体内应用的情况中,两次转染之间的时间间隔可以是直至6周。
本发明提供了包含至少两种如下成分的组合物:
a)非病毒基因输送系统,
c)遗传物质,以及
b)至少部分抑制或者激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具。
本发明还提供了包含至少两种如下成分的试剂盒:
a)非病毒基因输送系统,
c)遗传物质,以及
b)至少部分抑制或者激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具。。
根据本发明,所述非病毒基因输送系统包含阳离子脂质、阳离子聚合物、阳离子蛋白质;和/或包含一种化合物,该化合物具有DNA-和/或RNA-结合结构域,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或包含一种化合物,其与DNA和/或RNA共价结合,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移。
根据本发明,使用的遗传物质可以是例如修复基因缺陷的遗传物质,例如遗传物质,特别是修饰的或者未修饰的ssDNA、修饰的或者未修饰的dsDNA、修饰的或者未修饰的ssRNA、修饰的或者未修饰的dsRNA和/或修饰的或者未修饰的siRNA。
根据本发明,用于至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具可以是至少一种活性降低或者活性增加效应物。
此外,本发明用于至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具可以是抗体、胞内抗体、适体、拮抗剂、抑制剂和/或siRNA。
优选地,用作至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具的抗体、胞内抗体、适体、拮抗剂、抑制剂和/或siRNA能阻断先天性免疫系统的至少一个信号转导级联。
此外,根据本发明,用于至少部分激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具可以是激动剂。
优选地,用作至少部分激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具的激动剂能激活先天性免疫系统的至少一个信号转导级联。
本发明的至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具包含能实现先天性免疫系统的信号转导级联的蛋白质敲低的遗传物质。
另外,本发明的至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具可以包含可导致蛋白质表达的遗传物质,能阻断先天性免疫系统信号转导级联中蛋白质的活性。
优选地,本发明的用于转染的组合物可包含(a)非病毒基因输送系统以及(b)至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具,所述非病毒基因输送系统可以是:
(i)包含阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白质;和/或
(ii)包含一种化合物,该化合物具有DNA-和/或RNA-结合结构域,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或
(iii)包含一种化合物,该化合物与DNA和/或RNA共价结合,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;
对于至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具,其可以选自:
(i)TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗体;
(ii)细胞因子受体的抗体或者细胞因子受体拮抗剂;
(iii)激酶MEK1和/或MEK2的抑制剂;
(iv)TLR7和/或TLR8的激动剂,选自溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉和鸟苷类似物;以及
(v)其组合。
本发明的用于转染的试剂盒可优选包含(a)非病毒基因输送系统以及(b)至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具,对于非病毒基因输送系统,其可以是:
(i)包含阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白质;和/或
(ii)包含一种化合物,该化合物具有DNA-和/或RNA-结合结构域,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或
(iii)包含一种化合物,该化合物与DNA和/或RNA共价结合,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;
对于至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具,其可以选自:
(i)TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗体;
(ii)细胞因子受体的抗体或者细胞因子受体拮抗剂;
(iii)激酶MEK1和/或MEK2的抑制剂;
(iv)TLR7和/或TLR8的激动剂,选自溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉和鸟苷类似物;以及
(v)其组合。
更优选地,本发明的组合物或者试剂盒包含含有阳离子脂质的非病毒基因输送系统。
此外,本发明的组合物或者试剂盒可包含含有如下化学式所示阳离子脂质的非病毒基因输送系统:
其中
R1可以是
其中
R2和R3独立地是十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、十八烯基或其它烷基,在所有可能的组合中,它们可以是饱和的、不饱和的、支链的、非支链的、氟化的或者非氟化的,且可以由5-30个碳原子组成;
X可以是
其中
m=0及n=0;或者m=0及n=1;或者m=0及n=2;或者m=1及n=1;或者m=1及n=2;或者m=2及n=2;以及g可以是1,2,3,4,5,6,7或8;a可以是0,1,2,3,4,5或6;b可以是0,1,2,3,4,5或6;c可以是0,1,2,3,4,5或6;d可以是0,1,2,3,4,5或6;e可以是0,1,2,3,4,5或6;f可以是0,1,2,3,4,5或6。
优选地,在阳离子脂质中,R2和R3独立地是十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、十八烯基;m和n可以是1;g可以是1,2,3,4,5,6,7或8;a可以是0,1,2,3,4,5或6;b可以是0,1,2,3,4,5或6;c可以是0,1,2,3,4,5或6;d可以是0,1,2,3,4,5或6;e可以是0,1,2,3,4,5或6;f可以是0,1,2,3,4,5或6。
根据本发明,所述组合物或者试剂盒可含有修饰的或者未修饰的遗传物质,特别是修饰的或未修饰的ssDNA,修饰的或者未修饰的dsDNA,修饰的或者未修饰的ssRNA,修饰的或者未修饰的dsRNA和/或修饰的或者未修饰的siRNA。
优选地,本发明的组合物或者试剂盒可含有如下成分作为至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具:1,4-二氨基-2,3-二氰-1,4-二(o-氨基苯基巯基)丁二烯(U0126);咪喹莫特(R837,1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺);瑞喹莫德(R848,4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a,a-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇);Gardiquimod(1-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇);CL075;CL097;洛索立宾(7-烯丙基-7,8-二氢-8-氧-鸟苷);艾沙托立宾(7-硫代-8-氧鸟苷);溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮);或其任何组合。
此外,本发明的组合物或者试剂盒可含有TLR 3、TLR 7、TLR 8或者TLR 9的抗体作为至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具。
另外,本发明的组合物或者试剂盒可含有抗体或者拮抗剂作为至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具,所述抗体或者拮抗剂是白细胞介素-1-受体的抗体或者拮抗剂,特别是IL-ra的抗体或者拮抗剂;I型干扰素受体的抗体或者拮抗剂;干扰素-γ受体的抗体或者拮抗剂或者肿瘤坏死因子受体的抗体或拮抗剂。
在优选的实施方案中,至少部分抑制和/或激活免疫的多个上述工具可以彼此组合,也就是说根据本发明可以使用两个、三个或者多个成分以至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫。同样可以使用多个上述成分a)和/或b)和/或c)。
在本发明的试剂盒中,可以是:
-所有成分彼此单独存在,或者
-成分a)和b)存在于一起,或者
-成分a)和c)存在于一起,或者
-成分b)和c)存在于一起。
优选地,所述试剂盒中可以是:
-所有成分完全彼此单独存在,或者
-成分a)和b)彼此单独存在,或者
-成分a)和b)存在于一起。
例如,所述成分可以彼此单独存在,例如在包装在一起的玻璃或者塑料容器中,或者两种成分一起或者多种成分一起在合适的容器中。
本发明的试剂盒可含有非病毒基因输送系统,该系统是盐形式,特别是配制为脂质体/微团形式;溶液形式,特别是水溶液、盐溶液、缓冲的盐溶液如HEPES缓冲盐溶液,或者在生理可接受的溶剂如乙醇/DMSO中的溶液:冻干形式;固体形式或者膜形式。非病毒基因输送系统的溶液优选pH值为5-9。培养基中非病毒基因输送系统的终浓度为0.01-10mg/ml。
至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具如抗体、拮抗剂或者抑制剂,可以包含于本发明的试剂盒中,可以是冻干形式、溶解于水中、盐溶液、缓冲的盐溶液如PBS缓冲盐溶液或者合适的有机溶剂如乙醇DMSO等中的形式。溶液优选pH值为5-9。任选可以存在稳定剂。至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具优选浓度为0.01-10mg/ml。
含有遗传物质的试剂盒可含有冻干形式、溶解于水中、盐溶液或者缓冲的盐溶液如TE缓冲盐溶液形式的遗传物质。遗传物质的溶液优选pH值为5-9。培养基中遗传物质的终浓度优选为0.01-10mg/ml。
本发明的组合物和/或本发明的试剂盒可用于进行本发明的方法。
此外本发明的组合物可以是药物组合物形式,本发明的试剂盒可以是药物试剂盒形式。
另外,本发明的组合物和试剂盒可用于通过基因疗法治疗疾病。
所述疾病可以是例如囊性纤维化、肌营养不良症、苯丙酮尿症、枫糖浆病、Propionazidaemia、甲基丙二酸血症、腺苷脱氨酶缺乏症、高胆固醇血症、血友病、β-地中海贫血、癌症、病毒性疾病、黄斑变性、肌萎缩性脊髓侧索硬化和/或炎症疾病。
本发明还可用于进行转染,不用将细胞的表达谱改变为不希望的程度。这在体内应用中特别有意义,其中免疫系统的激活通常存在问题。
在通过siRNA敲低参与的蛋白质研究信号转导途径的情况中,细胞表达谱的不必要的改变特别不合适,尤其因为已知信号转导级联通常彼此影响。
实施例
一般材料
1.Hela细胞
2.Metafectene Pro,T040-1.0,Biontex Laboratories
3.24-孔平板,TPP,Product No.92024
4.48-孔平板,Corning Inc.,Costar,Product No.3548
5.DMEM,PAA,Cat.No.E15-883
6.FCS Mycoplex,PAA,Cat.No.E15-773
7.pCMV-lacZ,Product No.PF462-060207,PlasmidFactory,c=1mg/mlin WFI
8.β-半乳糖苷酶测定试剂盒,Stratagene
9.Hela-Luc细胞(用荧光素酶稳定转染的细胞)
10.荧光素酶测定试剂盒,Promega
11.BCA蛋白质测定试剂盒,Thermo Scientific,Product No.23227
12.二甲基亚砜(分子生物学DMSO),Fluka;No.41639
13.siRNA,脱盐的,30pMol/μl于通用缓冲液中(siMAX,得自MWG)
针对荧光素酶GL3(抗荧光素酶-siRNA):
有义序列:CUUACGCUGAGUACUUCGAtt
反义序列:UCGAAGUACUCAGCGUAAGtt
非特异性对照物:
有义序列:AGGUAGUGUAAUCGCCUUGtt
反义序列:CAAGGCGAUUACACUACCUtt
实施例1
材料:
1.抗人IFNβ的绵羊多克隆抗体,PBL Biomedical Laboratories,产品号31400-1,0.25mg/ml(估计),2×104单位/ml。
实验的详细描述:
第一天:将HeLa细胞接种于24孔平板中,细胞以500μl完全培养基(10%FCS)的2.3×105细胞/孔的细胞计数铺板。然后在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第二天:
首先解冻抗体(绵羊抗人IFNβ多克隆抗体)。然后加入400μl的PBS(磷酸盐缓冲盐水),轻轻混合。目前抗体浓度为0.05μg/μl。然后在该24孔平板的孔中提供如下量的抗体:
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
A | 0μg(0μl) | 0.25μg(5μl) | 0.5μg(10μl) | 1μg(20μl) | 1.5μg(30μl) | 3μg(60μl) |
B | 0μg(0μl) | 0.25μg(5μl) | 0.5μg(10μl) | 1μg(20μl) | 1.5μg(30μl) | 3μg(60μl) |
C | 0μg(0μl) | 0.25μg(5μl) | 0.5μg(10μl) | 1μg(20μl) | 1.5μg(30μl) | 3μg(60μl) |
D | 0μg(0μl) | 0.25μg(5μl) | 0.5μg(10μl) | 1μg(20μl) | 1.5μg(30μl) | 3μg(60μl) |
然后在温箱中保温0.5小时。在此期间制备脂复合物。为此,将26μl的DNA(pCMV-lacZ)移液至1300μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。同样将104μl的Metafectene Pro移液至1300μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。然后将这两个溶液混合,保温15分钟。
最后,在每个孔中加入100μl的脂复合物溶液。在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第三天:
在第三天,更新C和D行的培养基。对这些行重复脂复合物制备和转染步骤。然后在CO2温箱(10%)保温24小时。
第四天:
报道基因测定
使用β-半乳糖苷酶测定试剂盒根据厂商指导获得转染效率。使平板显色,直至在微平板读数器中测量到吸光度1-2的黄色,然后立即停止。记录保温时间。使用微平板读数器读取数值,计算平均值。
结果:
保温时间:9.5分钟
3次测量的平均值
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
A | 0.717 | 0.689 | 0.650 | 0.652 | 0.635 | 0.509 |
B | 0.668 | 0.672 | 0.690 | 0.679 | 0.714 | 0.525 |
C | 0.858 | 0.823 | 1.228 | 1.690 | 1.852 | 0.975 |
D | 1.501 | 1.805 | 1.518 | 1.886 | 2.017 | 1.909 |
A和B行是一式两份的单次转染结果。C和D行是一式两份重复转染结果。计算平均值。
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A&B/2 | 0.6925 | 0.6805 | 0.6700 | 0.6655 | 0.6745 | 0.5170 |
C&D/2 | 1.1810 | 1.3140 | 1.3730 | 1.7880 | 1.9345 | 1.4420 |
图1
实施例2
材料
1.小鼠抗人干扰素α/β受体第2链单克隆抗体(CD118),克隆MMHAR-2,同种型Ig2a,浓度(C)=0.5mg/ml于含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中,PBL Biomedical Laboratories,Product No.21385。
实验的详细描述
与实施例1类似
不同之处:
首先在400μl的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中加入所述抗体(小鼠抗人干扰素α/β受体链单克隆抗体),轻轻混合。目前抗体浓度为0.1μg/μl。在24孔平板孔中加入如下量的抗体:
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
A | 0μg(0μl) | 0.5μg(5μl) | 1μg(10μl) | 2μg(20μl) | 3μg(30μl) | 6μg(60μl) |
B | 0μg(0μl) | 0.5μg(5μl) | 1μg(10μl) | 2μg(20μl) | 3μg(30μl) | 6μg(60μl) |
C | 0μg(0μl) | 0.5μg(5μl) | 1μg(10μl) | 2μg(20μl) | 3μg(30μl) | 6μg(60μl) |
D | 0μg(0μl) | 0.5μg(5μl) | 1μg(10μl) | 2μg(20μl) | 3μg(30μl) | 6μg(60μl) |
在与抗体保温5小时之后加入脂复合物。
结果:
保温时间:4分钟。
3次测量的平均值
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
A | 1.269 | 1.113 | 1.163 | 1.185 | 1.214 | 1.084 |
B | 1.132 | 1.102 | 1.088 | 1.229 | 1.113 | 1.154 |
C | 1.127 | 1.438 | 1.533 | 1.378 | 1.504 | 1.367 |
D | 1.395 | 1.393 | 1.377 | 1.417 | 1.459 | 1.467 |
A和B行是一式两份的单次转染结果。C和D行是一式两份重复转染结果。计算平均值。
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
A&B/2 | 1.2005 | 1.1075 | 1.1255 | 1.2070 | 1.1635 | 1.1190 |
C&D/2 | 1.2610 | 1.4155 | 1.4550 | 1.3975 | 1.4815 | 1.4170 |
图2
实施例3
使用受体和细胞因子的抗体进一步实验。
实验的详细描述:
第一天:将HeLa细胞接种于48孔平板中,细胞以250μl完全培养基(10%FCS)的1.2×105细胞/孔的细胞计数铺板。然后在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第二天:
将抗体浓度用PBS调节为0.05μg/μl。然后在48孔平板的孔中加入如下量的抗体:
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 0μg(0μl) | 0μg(0μl) | 0μg(0μl) | 0μg(0μl) |
B | 0.25μg(5μl) | 0.25μg(5μl) | 0.25μg(5μl) | 0.25μg(5μl) |
C | 0.5μg(10μl) | 0.5μg(10μl) | 0.5μg(10μl) | 0.5μg(10μl) |
D | 1μg(20μl) | 1μg(20μl) | 1μg(20μl) | 1μg(20μl) |
E | 1.5μg(30μl) | 1.5μg(30μl) | 1.5μg(30μl) | 1.5μg(30μl) |
F | 3μg(60μl) | 3μg(60μl) | 3μg(60μl) | 3μg(60μl) |
然后根据抗体情况在温箱中保温5小时或者0.5小时。制备脂复合物。为此,将13μl的DNA(pCMV-lacZ)移液至650μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。同样将52μl的Metafectene Pro移液至650μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。然后将这两个溶液混合,保温15分钟。最后,在每个孔中加入50μl的脂复合物溶液。在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第三天:
在第三天,更新C和D行的培养基。对这些行重复脂复合物制备和转染步骤。然后在CO2温箱(10%)保温24小时。
第四天:
报道基因测定
与实施例1类似(这个实验使用实施例1的半量)
结果:
抗体:
小鼠抗人-CD282抗体(=抗-TLR2),单克隆抗体AbD Serotec,Cat.No.:MC2484E。
在转染之前与抗体的预保温时间:5小时
报道基因测定时间:5分钟
3次测量的平均值
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 0.65 | 0.66 | 1.08 | 1.18 |
B | 0.61 | 0.68 | 1.12 | 1.07 |
C | 0.72 | 0.70 | 1.70 | 1.21 |
D | 0.67 | 0.76 | 1.82 | 1.34 |
E | 0.67 | 0.86 | 1.62 | 1.66 |
F | 0.64 | 0.67 | 1.56 | 1.34 |
第1列和第2列是一式两份单次转染结果。第3列和第4列是一式两份重复转染结果。计算平均值。
A | B | C | D | E | F | |
1&2/2 | 0.65 | 0.64 | 0.71 | 0.71 | 0.76 | 0.65 |
3&4/2 | 1.13 | 1.09 | 1.45 | 1.58 | 1.65 | 1.45 |
图3
抗体:
小鼠抗人TLR3抗体,单克隆抗体,Lifespan Biosciences Cat.No.LS-C18685
在转染之前与抗体预保温时间:5小时。
报道基因测定时间:5.5分钟。
3次测量的平均值:
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 0.72 | 0.64 | 1.30 | 1.32 |
B | 0.64 | 0.67 | 1.42 | 1.30 |
C | 0.75 | 0.73 | 1.54 | 1.59 |
D | 0.75 | 0.86 | 1.71 | 1.69 |
E | 0.89 | 0.82 | 1.65 | 1.95 |
F | 0.76 | 0.82 | 1.83 | 1.65 |
第1列和第2列是一式两份单次转染结果。第3列和第4列是一式两份重复转染结果。计算平均值。
A | B | C | D | E | F | |
1&2/2 | 0.68 | 0.65 | 0.74 | 0.80 | 0.85 | 0.79 |
3&4/2 | 1.31 | 1.36 | 1.56 | 1.70 | 1.80 | 1.74 |
图4
抗体:
小鼠抗人CD284抗体(=抗TLR4),单克隆抗体,AbD Serotec.Cat.No.MCA2061EL
在转染之前与抗体预保温时间:5小时。
报道基因测定时间:5.5分钟。
3次测量的平均值:
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 0.65 | 0.65 | 1.03 | 1.22 |
B | 0.67 | 0.65 | 1.44 | 1.67 |
C | 0.74 | 0.64 | 1.42 | 1.17 |
D | 0.78 | 0.69 | 1.57 | 1.38 |
E | 0.74 | 0.73 | 1.59 | 1.63 |
F | 0.78 | 0.71 | 1.82 | 1.56 |
第1列和第2列是一式两份单次转染结果。第3列和第4列是一式两份重复转染结果。计算平均值。
A | B | C | D | E | F | |
1&2/2 | 0.65 | 0.66 | 0.69 | 0.73 | 0.73 | 0.74 |
3&4/2 | 1.12 | 1.55 | 1.29 | 1.47 | 1.61 | 1.69 |
图5
抗体:
小鼠抗人TLR1抗体(单克隆抗体,0.05%叠氮化钠,100μglyophilisate);Invivogen,No.Mab-htlr1
为了除去叠氮化钠,将该抗体用PBS透析:
透析膜:Spectra/Por DispoDialyser(500μl,纤维素酯膜,25000Da分子量截断值);Spectrum Laboratories;No.135492,Lot 3224004
在转染之前与抗体预保温时间:5小时。
报道基因测定时间:4分钟。
3次测量的平均值:
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 1.055 | 1.225 | 1.683 | 1.627 |
B | 1.354 | 1.328 | 1.905 | 1.798 |
C | 1.346 | 1.516 | 2.033 | 1.914 |
D | 1.401 | 1.367 | 2.106 | 1.827 |
E | 1.260 | 1.488 | 2.063 | 1.841 |
F | 1.085 | 1.020 | 1.816 | 1.712 |
第1列和第2列是一式两份单次转染结果。第3列和第4列是一式两份重复转染结果。计算平均值。
A | B | C | D | E | F | |
1&2/2 | 1.140 | 1.341 | 1.431 | 1.384 | 1.374 | 1.053 |
3&4/2 | 1.655 | 1.852 | 1.974 | 1.966 | 1.952 | 1.764 |
图6
实施例4
使用拮抗剂进一步实验。
实验的详细描述
第一天:
与实施例3类似。
第二天:
将拮抗剂浓度用PBS调节为0.025μg/μl。然后在48孔平板的孔中加入如下量的抗体。
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 0μg(0μl) | 0μg(0μl) | 0μg(0μl) | 0μg(0μl) |
B | 0.0625μg(2.5μl) | 0.0625μg(2.5μl) | 0.0625μg(2.5μl) | 0.0625μg(2.5μl) |
C | 0.125μg(5μl) | 0.125μg(5μl) | 0.125μg(5μl) | 0.125μg(5μl) |
D | 0.250μg(10μl) | 0.250μg(10μl) | 0.250μg(10μl) | 0.250μg(10μl) |
E | 0.375μg(15μl) | 0.375μg(15μl) | 0.375μg(15μl) | 0.375μg(15μl) |
F | 0.75μg(30μl) | 0.75μg(30μl) | 0.75μg(30μl) | 0.75μg(30μl) |
在温箱中保温7小时。制备脂复合物。为此,将13μl的DNA(pCMV-lacZ)移液至650μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。同样将52μl的Metafectene Pro移液至650μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。然后将这两个溶液混合,保温15分钟。最后,在每个孔中加入50μl的脂复合物溶液。在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第三天:
与实施例3类似。
第四天:
报道基因测定:
与实施例1类似(使用实施例1的半量)
结果:
拮抗剂:
人白细胞介素-1受体拮抗剂(人ILl-ra),Biomol,Cat.No.:54592
在转染之前与抗体预保温时间:7小时
报道基因测定时间:10分钟。
3次测量的平均值:
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 0.436 | 0.433 | 0.932 | 0.820 |
B | 0.427 | 0.448 | 0.791 | 1.021 |
C | 0.415 | 0.435 | 0.856 | 1.185 |
D | 0.393 | 0.439 | 1.035 | 1.026 |
E | 0.392 | 0.460 | 1.076 | 1.081 |
F | 0.443 | 0.455 | 1.161 | 1.207 |
第1列和第2列是一式两份单次转染结果。第3列和第4列是一式两份重复转染结果。计算平均值。
A | B | C | D | E | F | |
1&2/2 | 0.435 | 0.437 | 0.425 | 0.416 | 0.426 | 0.449 |
3&4/2 | 0.876 | 0.906 | 1.020 | 1.030 | 1.078 | 1.184 |
图7
实施例5
使用激酶抑制剂进一步实验。
MEK1和MEK2抑制剂:
U0126,1,4-二氨基-2,3-二氰-1,4-二(o-氨基苯基巯基)丁二烯,分子量=380.5,Invivogen,Cat.No.:tlr-u0126。
实验的详细描述
第一天:将HeLa细胞接种于48孔平板中,细胞以250μl完全培养基(10%FCS)的0.8×105细胞/孔的细胞计数铺板。然后在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第二天:
将1mg抑制剂溶解于100μl的DMSO中(原液)。然后用PBS以1∶20稀释(工作溶液)。然后在48孔平板的孔中加入如下量的抑制剂。
F | E | D | C | B | A | |
1 | 0μM(0μl) | 5μM(0.95μl) | 10μM(1.9μl) | 25μM(4.75μl) | 50μM(9.5μl) | 75μM(14.25μl) |
在温箱中保温2小时。然后制备脂复合物。为此,将5μl的DNA(pCMV-lacZ)移液至250μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。同样将20μl的Metafectene Pro移液至250μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。然后将这两个溶液混合,保温15分钟。
最后,在每个孔中加入50μl的脂复合物溶液。在CO2温箱(10%)中保温48小时。
第三天:
在第三天更新培养基,用表中指示量的抑制剂置换。重复脂复合物制备和转染步骤,不进行保温。然后在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第四天:
报道基因测定
与实施例1类似(使用实施例1的半量)。
结果:
在转染之前与抑制剂的预保温时间:2小时。
报道基因测定时间:10分钟。
3次测量的平均值:
F | E | D | C | B | A | |
1 | 0.63 | 0.72 | 0.92 | 0.79 | 0.90 | 0.97 |
图8
实施例6
使用HepG2细胞进一步实验
程序与实施例3类似。
不同之处:HepG2细胞,抗体浓度0.1μg/μl代替在PBS中0.05μg/μl。
在无血清DMEM中代替在PBS中形成脂复合物。
抗体:
小鼠抗人-CD282抗体(=抗TLR2),单克隆抗体,AbD Serotec,Cat.No.:MC2484EL。
在转染之前与抗体的预保温时间:5小时。
报道基因测定时间:4分钟。
3次测量的平均值:
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 1.680 | 1.486 | 1.649 | 1.815 |
B | 1.884 | 1.792 | 1.999 | 2.267 |
C | 2.095 | 1.960 | 2.111 | 2.297 |
D | 2.036 | 1.936 | 1.911 | 2.184 |
E | 1.964 | 1.930 | 1.987 | 2.164 |
F | 1.719 | 1.935 | 1.930 | 2.224 |
第1列和第2列是一式两份单次转染结果。第3列和第4列是一式两份重复转染结果。计算平均值。
A | B | C | D | E | F | |
1&2/2 | 1.583 | 1.838 | 2.028 | 1.986 | 1.947 | 1.827 |
3&4/2 | 1.732 | 2.133 | 2.204 | 2.048 | 2.076 | 2.077 |
图9
实施例7
使用掺入脂复合物中TLR9抗体进一步实验。
抗体:
兔抗人-TLR9抗体(=抗TLR9),多克隆抗体,0.5μg/μl于PBS、0.2%凝胶、0.05%叠氮化钠中,Lifespan Biosciences Cat.No.:MCA2484EL。
为了除去叠氮化钠,将抗体用PBS透析。
透析膜:Spectra/Por DispoDialyser(500μl,纤维素酯膜,25000Da分子量截断值);Spectrum Laboratories;No.135492,Lot 3224004。
实验的详细描述
第一天:将HeLa细胞接种于48孔平板中,细胞以250μl完全培养基(10%FCS)的1.0×105细胞/孔的细胞计数铺板。然后在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第二天:
将抗体用PBS调节为浓度0.1μg/μl。将15mg的DNA(pCMVβGal)和60μl的Metafectene Pro均溶解于300μl无血清DMEM中。通过轻轻上下移液混合各个溶液。制备如下成分的脂复合物。
溶液 | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 |
抗体溶液[μl] | 0 | 11 | 22 | 44 | 66 |
Metafectene Pro溶液[μl] | 44 | 44 | 44 | 44 | 44 |
DNA溶液[μl] | 44 | 44 | 44 | 44 | 44 |
无血清DMEM[μl] | 132 | 121 | 110 | 88 | 66 |
首先将Metafectene Pro溶液与抗体溶液组合,在室温(RT)保温5分钟。然后加入DNA溶液和无血清DMEM,在室温再保温15分钟。
将50μl的DNA-抗体-脂质复合物移液至每个孔中,溶液1移液至第1列的4个孔中,溶液2移液至第2列的4个孔中,如此类推。在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第三天:
更新所有行的培养基。C和D行进行与第一天的转染类似的二次转染。
第四天:
报道基因测定:
与实施例1类似(使用实施例1的半量)。
结果:
3次测量的平均值:
1 | 2 | 3 | 4 | |
A | 0.819 | 1.671 | 1.419 | 1.845 |
B | 0.860 | 1.591 | 1.604 | 1.858 |
C | 1.005 | 2.185 | 1.940 | 2.267 |
D | 1.472 | 2.650 | 2.264 | 2.401 |
第1列和第2列是一式两份单次转染结果。第3列和第4列是一式两份重复转染结果。计算平均值。
1 | 2 | 3 | 4 | |
A&B | 0.840 | 1.631 | 1.512 | 1.852 |
C&D | 1.239 | 2.417 | 2.102 | 2.334 |
抗体的添加量相应于如下每孔的抗体量:
1 | 2 | 3 | 4 | |
μg | 0 | 0.5 | 1.0 | 1.5 |
图10
实施例8
在存在激酶抑制剂的条件下siRNA转染:
-p38/RK MAPK抑制剂:SB203580,Invivogen;No.tirl-sb20
-MEK抑制剂:U0126,Invivogen,No.tlr-u0126
实验的详细描述:
第一天:将HeLa-Luc细胞接种于48孔平板中,细胞以250μl完全培养基(10%FCS)的1.5×105细胞/孔的细胞计数铺板。然后在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第二天:
首先制备抑制剂:
SB203580(M=377.43g/mol):将其1mg溶解于20μl DMSO中。将该原液用PBS 1∶105稀释。
U0126(M=380.49g/mol):将1mg抑制剂溶解于100μl DMSO中。将该原液用PBS 1∶20稀释。
为48孔平板的孔提供如下量的抑制剂:
在温箱中保温2小时。然后制备脂复合物。为此,将1μl的抗荧光素酶-siRNA原液移液至300μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。对于该溶液,仅进一步使用240μl。将1μl的非特异性对照siRNA移液至300μl的PBS中,通过轻轻上下移液混合。对于该溶液,仅进一步使用40μl。
将3μl的Metafectene Pro移液至225μl的PBS中,同样通过轻轻上下移液混合。然后将190μl移液至抗荧光素酶-siRNA工作溶液中,将35μl移液至非特异性对照-siRNA工作溶液中。将溶液混合,保温15分钟。获得siRNA试剂比率为1∶5μg/μl的脂复合物。
最后,将15μl抗荧光素酶-siRNA-脂复合物溶液移液至平板的前6行中。将15μl非特异性对照-siRNA-脂复合物溶液导入该平板的第7行。获得1pMol/孔的siRNA量。第8行保持未转染。然后在CO2温箱(10%)中保温24小时。
第三天:
在第三天,更新所有孔的培养基,用表中指示量的抑制剂置换。在加入抑制剂之后,对E和C列重复脂复合物制备和转染步骤。然后在CO2温箱(10%)中再保温24小时。
第四天:
荧光素酶测定和BCA蛋白质测定:
这两个测定均根据厂商指导进行。
评估:
从48孔平板中除去培养基,将细胞用100μl的PBS洗涤。然后加入120μl荧光素酶裂解缓冲液。将该平板在冰上保温大约30分钟,通过小心振荡(叩击)20-30秒混合。然后从该48孔平板的每个孔中取出25μl,导入另一个相似48孔平板中。使用第一个平板进行荧光素酶测定,使用第二个平板进行BCA测试。
荧光素酶测定:
光度计的参数设置:
-测量时间:15秒
-溶液注射间隔时间:0.5秒
-溶液注射与测量间隔时间:0.1秒。
BCA蛋白质测定:
-在562nm波长评估。
所有测量均进行3次。在荧光素酶测定中,三次测量使用三个新的细胞提取物。得自荧光素酶测定(RLU)的数值根据1μl细胞提取物和1秒钟测量时间标准化。得自BCA蛋白质测定的数值同样根据1μl细胞提取物标准化。
荧光素酶测定:
RLU/μl细胞提取物/秒
3x3次测量的平均值
F | E | D | C | |
1 | 1157 | 1001 | 1027 | 976 |
2 | 375 | 641 | 693 | 696 |
3 | 567 | 162 | 747 | 656 |
4 | 268 | 179 | 630 | 617 |
5 | 193 | 171 | 671 | 587 |
6 | 260 | 103 | 669 | 610 |
7 | 1829 | 2290 | 2029 | 2135 |
8 | 1674 | 2249 | 2504 | 2531 |
BCA测定:
ABS/μl细胞提取物
3次测量的平均值:
F | E | D | C | |
1 | 0.0196 | 0.0196 | 0.0192 | 0.0192 |
2 | 0.0192 | 0.0204 | 0.0193 | 0.0189 |
3 | 0.0189 | 0.0196 | 0.0193 | 0.0187 |
4 | 0.0183 | 0.0188 | 0.0186 | 0.0186 |
5 | 0.0182 | 0.0191 | 0.0183 | 0.0186 |
6 | 0.0182 | 0.0190 | 0.0184 | 0.0192 |
7 | 0.0184 | 0.0186 | 0.0183 | 0.0184 |
8 | 0.0184 | 0.0178 | 0.0181 | 0.0187 |
图11
实施例9
在存在TLR7/8激动剂条件下siRNA转染:
-咪喹莫特,InvivoGen,Cat.No.:tirl-imq
-ssRNA40/LyoVec,InvivoGen,Cat.No.:tirl-Irna-40
实验的详细描述:
第一天:
细胞的制备
将细胞以250μl完全培养基的2×104细胞/cm2/孔的细胞计数铺板。
脂复合物的制备:
首先,将48孔平板前3排的前5个孔均填充30μl的PBS。
用PBS将抗荧光素酶-siRNA和非特异性对照-siRNA的原液调节为浓度1pmol/10μl。然后将10μl抗荧光素酶-siRNA工作溶液移液至所述48孔平板的前三排的前三个孔中。将10μl非特异性对照-siRNA工作溶液移液至每个第四个孔中。
将Metafectene Pro试剂用PBS以1∶300稀释。将20μl该稀释液导入含有siRNA的每个孔中。
将脂复合物在室温保温20分钟。然后将250μl细胞悬浮液加入每个孔中。
类似充填第二个平板。
激动剂的添加:
将两种不同的激动剂加入这两个48孔平板的前2列中,使用三种不同工作浓度的激动剂。所述激动剂是冻干形式。将其用无内毒素水溶解,形成浓度为100μg/ml的原液。将该原液用水1∶10稀释,产生工作溶液。
对于咪喹莫特工作溶液,将0.78μl(=0.25μg/ml终浓度)移液至A1,将15.5μl(=5μg/ml)移液至A2,以及将31μl(=10μg/ml)移液至A3。
对于ssRNA40/LyoVec工作溶液,将0.78μl(=0.5μg/ml终浓度ssRNA40)移液至B1,将15.5μl(=5μg/ml)移液至B2以及将31μl(=10μg/ml)移液至B3。
在加入激动剂之后,将这两个48孔平板在CO2温箱中保温48小时。
第三天:
生存率确定:
在保温48小时后,将平板的细胞用胰蛋白酶消化,使用Neubauer计数板对用台盼蓝染色的每个孔进行生存率测量。
荧光素酶测定和BCA蛋白质测定:与实施例13类似。
结果
台盼蓝染色
评估40-70个细胞。
生存率[%] | |
咪喹莫特0.5μg/ml+抗荧光素酶-siRNA/Metafectene Pro | 98.6 |
咪喹莫特5μg/ml+抗荧光素酶-siRNA/Metafectene Pro | 88.7 |
咪喹莫特10μg/ml+抗荧光素酶-siRNA/Metafectene Pro | 88.6 |
ssRNA40/LyoVec 0.5μg/ml+抗荧光素酶-siRNA/Metafectene Pro | 97.8 |
ssRNA40/LyoVec 5μg/ml+抗荧光素酶-siRNA/Metafectene Pro | 81.5 |
ssRNA40/LyoVec 10μg/ml+抗荧光素酶-siRNA/Metafectene Pro | 83.0 |
抗荧光素酶-siRNA/Metafectene Pro | 87.7 |
非特异性对照-siRNA/Metafectene Pro | 92.6 |
空白样品 | 95.9 |
荧光素酶测定:
RLU/μl细胞提取物/秒
3x3次测量的平均值
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
A | 676 | 1023 | 1604 | 3016 | 2936 |
B | 349 | 223 | 1302 | 2753 | 2673 |
C | 116 | 98 | 1481 | 2822 | 2476 |
BCA测定ABS/μl细胞提取物
3x3次测量的平均值
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
A | 0.0086 | 0.0080 | 0.0080 | 0.0087 | 0.0093 |
B | 0.0069 | 0.0068 | 0.0078 | 0.0080 | 0.0092 |
C | 0.0073 | 0.0069 | 0.0078 | 0.0080 | 0.0088 |
图12
本发明实施例的结果也使得可以得出结论,即不仅遗传物质而且化学物质如阳离子脂质和阳离子聚合物也被TLR检测。根据本发明的结果,必须假定在Hela细胞、作为转染剂的Metafectene Pro及高品质DNA(质粒)的情况中,包括如下TLR。TLR 4检测质粒溶液中LPS的踪迹。TLR9和TLR3检测遗传物质,即在这种情况中质粒或者相应的杂质。TLR1和TLR2检测转染剂。
因此一种可能的但不确切的解释也可能是不同的细胞与不同比率的遗传物质和转染剂呈现最佳结果。例如对于转染剂而言表达大量TLR9和少量TLR的细胞应因此呈现最佳结果,其中小量DNA遇到大量转染剂。
显然在转染之前和期间TLR的激活依赖于大量因子。例如,根据靶细胞的表达谱,所述细胞可以对于某些PAMP特别敏感。此外,不同试剂和不同遗传物质可以激活不同TLR。甚至不同DNA序列也可以根据CpG含量而对于转染结果起作用。最后但并非最不重要的一点是,不可低估杂质所起作用。例如,细菌源的DNA可以污染例如LPS或者鞭毛蛋白或者RNA。ssRNA可以污染dsRNA,且因此除了TLR7/8之外,TLR3也可以应答,反之亦然。对于细胞的不同处理由于应激信号转导级联而可以导致不同结果。概括而言,可以说对于不同的转染实验需要不同的阻断策略。
可以同样解释关于单次和重复转染阻断先天性免疫系统的不同转染结果。已知胞吞作用(即外膜转运)很大程度上受激酶调节。通过快速磷酸化途径,在检测病原性相关模式时,细胞可以负调节胞吞作用且因此关闭病原体的入口。由于信号转导级联也通过激酶传导信号,因此在此可以设想是相关的。在早如第一次转染时即出现转染效率显著增加表明快速防御机制已经被抑制,即大概也是膜转运所致。通过特定蛋白质或者细胞因子的表达进行的防御机制相当持久,且在仅可用于双重转染的时间范围内有效。在重复转染之后一天出现转染效率增加表明对于防御机制重要的一或多个蛋白质的表达降低。
只有在siRNA转染的情况中,通过TLR激活可以实现转染结果得以改进,因为在这种情况中必需的RNAi机制是先天性免疫系统的组成成分。然而,在这种情况中,各个信号转导途径的阻断也是有利的(ExampleU0126)。
正如所提及的,本发明可用于治疗目的。特别地,本发明可用于如下疾病的基因治疗:例如囊性纤维化、肌营养不良症、苯丙酮尿症、枫糖浆病、Propionazidaemia、甲基丙二酸血症、腺苷脱氨酶缺乏症、高胆固醇血症、血友病、β-地中海贫血和癌症。当激素、生长因子、细胞毒素或者具有免疫调节作用的蛋白质在生物体内合成时,基因治疗方法也是感兴趣的。对于上述目的,通过本发明可以将DNA片段有效地导入细胞中,在此这个DNA能展示希望的作用而不引起不希望的副作用。希望的作用可以是代替患病的细胞类型中缺失或缺陷的DNA区域或者抑制触发该疾病的DNA区域(例如通过反义-DNA/RNA或者siRNA)。以此方式,例如可以用于癌症治疗中的肿瘤抑制基因,或者通过导入调节胆固醇的基因防止心血管疾病。此外,编码核酶、siRNA或者shRNA的DNA、或者核酶或者siRNA自身可以插入患病细胞中。DNA的翻译产生活性核酶或者siRNA,其在特定位点催化裂解m-RNA,及以此方式阻止转录。以此方式,例如病毒m-RNA可以被裂解,而不影响其它细胞m-RNA。以此方式可以中断病毒(HIV、疱疹病毒、乙型和丙型肝炎病毒、呼吸道合包病毒)的复制周期。可以通过siRNA治疗明确治愈的其它疾病是年龄相关的黄斑变性(眼部疾病)、肝癌癌症、实体肿瘤、肌萎缩性脊髓侧索硬化和炎症疾病。转染在癌症治疗中也起发挥越来越多的作用,例如制备癌症疫苗,这也是本发明的可能应用领域。
本发明也可以用于例如免疫接种方法中,其基于编码免疫原性肽的DNA在人或者动物机体内表达而起作用。为此,例如脂质/DNA复合物用作疫苗。DNA插入机体细胞中导致免疫原性肽表达,且因此触发获得性免疫应答。
根据本发明给出如下定义只是举例说明而无限制之意。
转染:
遗传物质插入真核细胞中。
转染结果/转染效率
使用特别编码表达的蛋白质的遗传物质转染方法获得的细胞群的蛋白质表达量;或者细胞群的蛋白质表达由于使用遗传物质转染所致敲低程度,所述遗传物质能触发这种敲低,特别是siRNA或者核酶或者编码shRNA或者核酶的DNA;或者总细胞群中由于转染结果呈现插入的遗传物质的生物活性的细胞的比例。同时,细胞群的生理状态应尽可能小地受影响,也就是说细胞群的蛋白质表达谱应理想地仅对于其基因已经插入细胞中或其表达由于插入的遗传物质而降低或阻止的蛋白质发生改变。
非病毒基因输送系统:
非病毒基因输送系统不是通过重组天然发生的病毒的遗传物质而产生的。它们能将遗传物质插入真核细胞中。非病毒基因输送系统特别是物理方法和化学方法。物理方法至少将遗传物质定位于相比的邻近;然而在特殊的物理方法中,利用提供能量、特别是热、动力、电或其它能量介导遗传物质转运通过细胞膜。化学方法基于核酸的化学修饰或者衍生化,其特别使其细胞可通透,或者特别有结合DNA的物质组成且能介导通过细胞膜的转运。特别地,其使用静电力或者氢键结合核酸。随之,由于细胞的主动转运机制即胞吞的结果,DNA转运通过细胞膜。具有那些性质的物质特别包含阳离子脂质、阳离子聚合物、阳离子肽,或者具有能结合DNA或者RNA的结构域且同时具有含有配体的第二个结构域的分子,所述配体由细胞表面受体识别且由于该识别过程而触发胞吞作用。第二种可能性是所述配体能触发膜转移,即介导转运至膜的另一侧。所述物质也可以是特殊配制的,特别是微团或者脂质体形式,也也可以由多个成分组成,特别是具有不同功能的多个成分。
基因治疗
治愈或者减轻疾病的治疗方法,其中修饰的或者未修饰的核酸用作活性物质。
先天性免疫
先天性免疫与获得性免疫不同,其对抗病原体而不需要先与病原体接触以训练免疫系统。先天性免疫是大多数细胞类型的固有性质,由两部分组成:细胞内成分和细胞间成分。细胞内成分利用受体的归因于病原体的分子结构识别机制。这种受体通过大量细胞内源基因的表达以及重要蛋白质的磷酸化刺激信号转导级联,导致直接参与的细胞的生理状态改变(例如抗病毒状态)。此外,分泌细胞因子。
通过先天性免疫系统的细胞间成分,受影响的细胞通过信使物质(细胞因子)通知未受影响的细胞,也触发改变的生理状态(例如抗病毒状态),细胞因子停靠(dock)其它细胞的细胞因子受体,由此触发信号转导级联。因此细胞间成分与细胞内成分通过不同的受体(细胞因子受体而不是PRR(模式识别受体)和激动剂(细胞因子而不是致病模式))而区分。
抗病毒状态
通过细胞试图通过对策阻止外来遗传物质的可能的生物活性而辨别的细胞状态。
体内转染
在活的生物体内发生的遗传物质插入真核细胞中。
体外转染
在活的生物体外发生的遗传物质插入真核细胞中,特别是在适于培养真核细胞的容器中。
遗传物质
核酸、特别是核糖核酸或者脱氧核糖核酸,其基本上由两个至少部分互补的链组成(双链=ds),例如dsDNA和dsRNA;或者其特别由一个链组成(单链=ss),例如ssDNA和ssRNA,其可以具有通过氢键彼此结合的部分互补的区域。在DNA情况中,所述遗传物质用以产生RNA和/或蛋白质。在ssRNA情况中,其用以产生蛋白质。在dsRNA情况中,所述遗传物质通过RNA-干扰实现基因的敲低。
修饰的遗传物质
其性质通过修饰被改变的天然核酸。这些修饰可以是涉及磷酸酯结构、糖或者碱基的化学修饰,用于增加核酸对于核酸酶和核糖核酸酶的稳定性。此外,分子(标记)可以共价或者非共价附着于核酸,使得核酸具有新的性质,特别是通过荧光标记或者将核酸定位于细胞特定部位的标记(定位元件)或者介导核酸通过细胞膜使得核酸成为例如可透过细胞的核酸的光学监测能力。
举例的修饰是在磷酸酯结构中将氧置换为硫,在RNA情况中核糖的2′-OH基团的甲基化,或者2′-OH基团由氟完全取代,以增加对于核酸酶的稳定性。再一实例是附着FITC(异硫氰酸荧光素)作为荧光标记,以能在显微镜下监测遗传物质在细胞中的路径,或者附着所谓的NLS(核定为信号,例如PKKKRKVG),以实现转运至细胞核中。
siRNA(小干扰RNA):
小dsRNA(直至28bp)能通过RNA干扰敲低蛋白质。
shRNA(短的发夹RNA):
小ssRNA在3’末端和5’末端具有互补区,由此能通过氢键杂交及形成发夹结构。shRNA能通过RNA干扰敲低蛋白质。
受体:
能检测物质(激动剂)并因此触发生物反应的分子;受体特别是蛋白质。
阻断:
生物功能、特别是蛋白质生物功能的阻止。
抑制:
免疫、特别是先天性免疫细胞内和/或细胞间的通讯网络的中断,即触发免疫应答的一或多个信号转导级联中断。由于中断的结果,免疫被削弱,导致免疫应答降低。
DNA/RNA-结合结构域:
分子中具有共价结合的或者通过非共价相互作用结合的DNA的区域;特别地,所述非共价相互作用是静电力和氢键。
信号转导级联:
从受体开始,通过将物质附着于受体而检测该物质的存在,关于该物质存在的信息被转换为信号,并且通过信号转导分子链传导。在结束时,存在生物反应。特别地,由受体产生的信号被适体分子获取并传导,特别是通过激酶传到至转录因子。转录因子刺激介导所述生物反应的基因表达。
敲低:
在蛋白质生物合成期间,削弱或者关闭mRNA翻译成蛋白质。
抗体:
能识别分子结构、特别是其它蛋白质及通过结合影响其生物功能的分子,特别是蛋白质。在本发明中,它们可以是阻断抗体,即在先天性免疫系统的受体中,信号传送被降低或者阻止。所述抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。所述抗体可以是人源化的。其通常是待转染的细胞的受体。然而,由于受体的相似性的结果,也可以出现抗体是交叉反应性的情况。此外,抗体可以是已经被修饰,即例如一部分分子可以被分裂(例如Fc片段,由此仅剩下Fab片段),条件是其生物功能不由此而降低。
此外,可以将赋予另外性质的分子的抗体部分附于所述抗体上,条件是其生物功能不因此而降低。
一个实例是荧光标记的附着或者疏水性基团的附着(例如磷脂,A.Schnyder et al.;J.Am.Soc.for Exp.NeuroTherapeutics;2005;2;99-107),以便于锚定膜和/或脂质体。
胞内抗体:
在细胞内表达的抗体。
适体:
RNA分子,其通过三级结构的形成而与抗体相似地能识别分子结构、特别是蛋白质,以及通过结合影响其生物功能。适体可以由修饰的或者未修饰的RNA或者DNA组成。
拮抗剂:
不是自己触发而是通过阻断相应受体作用而抑制激动剂的物质。
激动剂:
通过结合受体能实现生物作用的激动剂。
抗病毒细胞因子:
在真核细胞感染病毒事件中表达的细胞因子。举例的细胞因子是干扰素α、干扰素β、干扰素γ、TNFα、TFN β、白细胞介素6,8,15,28和29。
抑制剂:
能抑制另一分子、特别是蛋白质的生物功能的分子。特别地,所述抑制剂自身即是蛋白质,修饰的或者未修饰的核酸或者小的有机分子。
TLR、RIG-I-解旋酶、RIG-I-样解旋酶:
根据其功能在物种之间交叉组合的受体。
适体分子:
接受受体信号及根据其功能在物种之间交叉组合的分子。
缩略语
AP-1=激活的蛋白质-1
ERK=细胞外信号调节激酶
IkB=抑制性结合蛋白kB
IKK=IκB激酶=抑制性结合蛋白κB激酶
IKKa=Ikkα=IκKα=IKK1
IKKb=IKKβ=IκKβ=IKK2
IKKd=IKKδ=IκKδ
IKKe=IKKepsilon=IκKepsilon
IKKg=IKKγ=IκKγ=IKK3
IKKi=IKK epsilon
IRAK1=白细胞介素1受体相关激酶1
IRAK4=白细胞介素-1受体相关激酶4
IRF=干扰素调节因子
JNK=c-Jun N-末端激酶
JAK=Janus激活的激酶
Mal=TIRAP=MyD88-适体样
MAPK=丝裂原活化蛋白激酶
MEK=MAPK/ERK激酶
MKK=MAP激酶激酶
MKK=丝裂原活化蛋白激酶激酶
MSK=丝裂原和应激活化激酶
MyD88=骨髓分化因子88
NAP1=Nck-相关蛋白1
NEMO=IKKγ
NF-κB=核因子κB
P13K=磷酸肌醇-3-激酶
PKR=蛋白激酶R=蛋白激酶RNA-激活的
PKB=蛋白激酶B
PDK1=磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1
PDK2=磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1
Rac1=Ras-相关C3肉毒杆菌毒素底物1
RIP1=受体相互作用蛋白1
STAT=转录的信号转导物和激活物
TAK1=转化生长因子-β-激活的激酶
TBK1=IKKd=TANK结合激酶
TIRAP=Mal=含有适体蛋白的Toll-白细胞介素1受体(TIR)结构域
TRAF3=TNF受体相关因子3
TRAF6=TNF受体相关因子6
TRAM=TRIF-相关适体分子
TRIF=含有诱导干扰素-β适体蛋白的适体的Toll/IL-1受体结构域
序列表
<110>BIONTEX实验室有限公司
<120>通过影响先天性免疫系统改进非病毒输送系统的转染结果
<130>18327-PCT
<140>PCT
<141>2008-11-22
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>9
<212>RNA
<213>Homo sapiens
<400>1
guccuucaa 9
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>Photinus pyralis
<400>2
cuuacgcuga guacuucgat t 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>Photinus pyralis
<400>3
ucgaaguacu cagcguaagt t 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>unknwon organism
<400>4
agguagugua aucgccuugt t 21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>unknown organism
<400>5
caaggcgauu acacuaccut t 21
Claims (33)
1.转染组合物,其包含:
a)非病毒基因输送系统,所述非病毒基因输送系统包含:
(i)阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白质;和/或
(ii)一种化合物,其具有DNA-和/或RNA-结合结构域,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或
(iii)一种化合物,其与DNA和/或RNA共价结合,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;以及
b)至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具,所述工具选自:
(i)TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗体;
(ii)细胞因子受体的抗体或者细胞因子受体拮抗剂;
(iii)激酶MEK1和/或MEK2的抑制剂;
(iv)TLR7和/或TLR8的激动剂,选自溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、咪唑并喹啉(imidazoquinolines)、噻唑并喹啉(thiazoloquinolines)和鸟苷类似物;以及
(v)其组合。
2.转染试剂盒,其包含:
a)非病毒基因输送系统,所述非病毒基因输送系统包含:
(i)阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白质;和/或
(ii)一种化合物,其具有DNA-和/或RNA-结合结构域,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或
(iii)一种化合物,其共价结合DNA和/或RNA,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;以及
b)至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具,所述工具选自:
(i)TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗体;
(ii)细胞因子受体的抗体或者细胞因子受体拮抗剂;
(iii)激酶MEK1和/或MEK2的抑制剂;
(iv)TLR7和/或TLR8的激动剂,选自溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉和鸟苷类似物;以及
(v)其组合。
3.权利要求1或2的组合物或者试剂盒,特征在于所述非病毒基因输送系统包含阳离子脂质。
4.权利要求1-3任一项的组合物或者试剂盒,特征在于在a)中所述非病毒基因输送系统包含如下式所示阳离子脂质:
其中:
R1是
其中R2和R3独立地是其它十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、十八烯基或其它烷基,在所有可能的组合中,它们是饱和的、不饱和的、支链的、非支链的、氟化的或非氟化的,并由5-30个碳原子组成;
X是
且其中
m=0及n=0;或者
m=0及n=1;或者
m=0及n=2;或者
m=1及n=1;或者
m=1及n=2;或者
m=2及n=2;以及
g是1、2、3、4、5、6、7或者8;
a是0、1、2、3、4、5或者6;
b是0、1、2、3、4、5或者6;
c是0、1、2、3、4、5或者6;
d是0、1、2、3、4、5或者6;
e是0、1、2、3、4、5或者6,以及
f是0、1、2、3、4、5或者6。
5.权利要求4的组合物或者试剂盒,特征在于R2和R3独立地是其它十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、或者十八烯基;
m和n是1;
g是1、2、3、4、5、6、7或者8;
a是0、1、2、3、4、5或者6;
b是0、1、2、3、4、5或者6;
c是0、1、2、3、4、5或者6;
d是0、1、2、3、4、5或者6;
e是0、1、2、3、4、5或者6,以及
f是0、1、2、3、4、5或者6。
6.权利要求1-5任一项的组合物或者试剂盒,其含有修饰的或者未修饰的遗传物质,尤其是修饰的或者未修饰的ssDNA,修饰的或者未修饰的dsDNA,修饰的或者未修饰的ssRNA,修饰的或者未修饰的dsRNA和/或修饰的或者未修饰的siRNA。
7.权利要求1-6至少一项的组合物或者试剂盒,特征在于其中至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具是1,4-二氨基-2,3-二氰-1,4-二(o-氨基苯基巯基)丁二烯(U0126);咪喹莫特(R837,1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺);瑞喹莫德(R848,4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a,a-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇);Gardiquimod(1-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇);CL075;CL097;洛索立宾(7-烯丙基-7,8-二氢-8-氧-鸟苷);艾沙托立宾(7-硫代-8-氧鸟苷);溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮);或其任何组合。
8.权利要求1-7至少一项的组合物或者试剂盒,特征在于至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具是TLR 3、TLR 7、TLR 8或者TLR 9的抗体。
9.权利要求1-8至少一项的组合物或者试剂盒,特征在于至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具是白细胞介素-1受体的抗体或者拮抗剂,特别是IL-ra的抗体或者拮抗剂;I型干扰素受体的抗体或者拮抗剂;γ-干扰素受体的抗体或者拮抗剂或者肿瘤坏死因子受体的抗体或者拮抗剂。
10.权利要求2-9任一项的试剂盒,其中
(i)所有成分均彼此完全独立存在;
(ii)成分a)和b)彼此独立存在;或者
(iii)成分a)和b)一起存在。
11.包含权利要求1-9任一项的组合物的药物组合物。
12.包含权利要求2-10任一项的试剂盒的药物试剂盒。
13.权利要求1-12任一项的组合物或者试剂盒在通过基因治疗方法治疗疾病中的应用。
14.权利要求13的应用,其中所述疾病是囊性纤维化、肌营养不良症、苯丙酮尿症、枫糖浆病、Propionazidaemia、甲基丙二酸血症、腺苷脱氨酶缺乏症、高胆固醇血症、血友病、β-地中海贫血、癌症、病毒性疾病、黄斑变性、肌萎缩性脊髓侧索硬化和/或炎症疾病。
15.改进非病毒基因输送系统的转染结果的方法,特征在于:
a)将细胞在转染之前和/或转染期间用至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理,以及在转染期间将遗传物质,特别是修饰的和/或未修饰的ssDNA、修饰的和/或未修饰的dsDNA、修饰的和/或未修饰的ssRNA、修饰的和/或未修饰的dsRNA和/或修饰的和/或未修饰的siRNA,导入细胞中;或者
b)将细胞在转染之前和/或转染期间和/或转染之后用至少部分激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理,以及在转染期间将修饰的和/或未修饰的siRNA导入细胞中。
16.权利要求15的方法,特征在于所述非病毒基因输送系统:
(i)包含阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白质;和/或
(ii)包含一种化合物,其具有DNA和/或RNA结合结构域,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或
(iii)包含一种化合物,其与DNA和/或RNA共价结合,且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移;和/或
(iv)基于物理方法如电穿孔、显微注射、磁转染、超声或者弹道或水力方法。
17.权利要求15或16的方法,特征在于将细胞在转染之前用至少部分抑制或者激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理直至4天,优选直至18小时,特别是直至6小时。
18.权利要求15-17任一项的方法,特征在于将细胞用至少部分抑制或者激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理及同时与所述非病毒基因输送系统接触。
19.权利要求15-18任一项的方法,特征在于所述至少部分抑制先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具包含抗体、胞内抗体、适体、拮抗剂、抑制剂和/或siRNA。
20.权利要求15-19至少一项的方法,特征在于通过用siRNA敲低,编码通过TLR进行信号转导必需的蛋白质的至少一个基因被关闭。
21.权利要求15-20至少一项的方法,特征在于先天性细胞内和/或细胞间免疫通过阻断TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12、TLR 13、CD14、CD38、RIG-I解旋酶和RIG-I-样解旋酶中的至少一个、特别是通过阻断TLR 1、TLR 2、TLR 4和TLR 9中的至少一个而被至少部分抑制。
22.权利要求15-21至少一项的方法,特征在于先天性细胞内和/或细胞间免疫通过阻断选自MEK1和MEK2的至少一种激酶而被至少部分抑制。
23.权利要求22的方法,特征在于所述激酶MEK1和/或MEK2被1,4-二氨基-2,3-二氰-1,4-二(o-氨基苯基巯基)丁二烯(U0126)阻断。
24.权利要求15-23至少一项的方法,特征在于通过至少阻断细胞因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素或者干扰素而至少部分抑制先天性细胞内免疫。
25.权利要求24的方法,特征在于I型干扰素、特别是α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素和ω-干扰素被阻断。
26.权利要求15-25至少一项的方法,特征在于先天性细胞内免疫通过阻断至少一种受体而被至少部分抑制,所述受体是细胞因子受体、干扰素受体、特别是I型干扰素受体、白细胞介素受体和肿瘤坏死因子受体。
27.权利要求15-18至少一项的方法,特征在于激活先天性免疫的工具是激动剂。
28.权利要求15-18和27至少一项的方法,特征在于先天性细胞内和/或细胞间免疫通过至少一种TL受体激动剂而被至少部分激活,特别是被TLR7和/或TLR8的至少一种激动剂至少部分激活。
29.权利要求28的方法,特征在于TLR7和/或TLR8的至少一种激动剂选自溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、咪唑并喹啉、噻唑并喹啉、鸟苷类似物和ssRNA。
30.权利要求29的方法,特征在于所述至少一种激动剂是:
(i)咪喹莫特(R837,1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)、瑞喹莫德(R848,4-氨基-2-(乙氧基甲基)-a,a-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-乙醇)或者Gardiquimod(1-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇);或者
(ii)CL075或者CL097;或者
(iii)洛索立宾(7-烯丙基-7,8-二氢-8-氧-鸟苷)或者艾沙托立宾(7-硫代-8-氧鸟苷);或者
(iv)具有U富集和/或GU富集序列的ssRNA,特别是具有序列基序UGUGU和/或GUCCUUCAA的ssRNA。
31.权利要求15-18和27-30至少一项的方法,特征在于先天性细胞间免疫通过至少一种抗病毒细胞因子受体激动剂而被至少部分激活,特别是被干扰素-β或干扰素-γ至少部分激活。
32.权利要求15、16和27-31至少一项的方法,特征在于在转染后将细胞用至少部分激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的至少一种工具处理直至2天,优选直至12小时,特别是直至6小时。
33.权利要求15-32至少一项的方法,特征在于所述非病毒基因输送系统包含权利要求4和5任一项的阳离子脂质。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE102007056488.2 | 2007-11-22 | ||
DE102007056488A DE102007056488A1 (de) | 2007-11-22 | 2007-11-22 | Steigerung von Transfektionseffizienzen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems |
DE102008016275A DE102008016275A1 (de) | 2008-03-28 | 2008-03-28 | Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Blockierung des angeborenen Immunsystems |
DE102008016275.2 | 2008-03-28 | ||
DE102008023913A DE102008023913A1 (de) | 2008-05-16 | 2008-05-16 | Verbesserung von Transfektionsergebnissen nicht-viraler Genliefersysteme durch Beeinflussung des angeborenen Immunsystems |
DE102008023913.5 | 2008-05-16 | ||
PCT/EP2008/009947 WO2009065618A2 (de) | 2007-11-22 | 2008-11-24 | Verbesserung von transfektionsergebnissen nicht-viraler genliefersysteme durch beeinflussung des angeborenen immunsystems |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101918566A true CN101918566A (zh) | 2010-12-15 |
Family
ID=40456494
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200880117341XA Pending CN101918566A (zh) | 2007-11-22 | 2008-11-24 | 通过影响先天性免疫系统改进非病毒输送系统的转染结果 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2212425A2 (zh) |
CN (1) | CN101918566A (zh) |
WO (1) | WO2009065618A2 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102349995A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-02-15 | 武汉大学 | 一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用 |
WO2020259667A1 (zh) * | 2019-06-28 | 2020-12-30 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Tlr激动剂与抗ox40抗体或其抗原结合片段联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途 |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2421563B1 (en) * | 2009-04-22 | 2017-04-12 | Massachusetts Institute of Technology | Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules |
EP3524275A1 (en) * | 2009-04-22 | 2019-08-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Innate immune supression enables repeated delivery of long rna molecules |
US10837020B2 (en) | 2009-04-22 | 2020-11-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Innate immune suppression enables repeated delivery of long RNA molecules |
WO2010133369A1 (de) * | 2009-05-20 | 2010-11-25 | Biontex Laboratories Gmbh | Transfektionsverfahren für nicht-virale genliefersysteme mit verbesserter wirksamkeit durch blockierung des angeborenen immunsystems |
WO2013050048A2 (en) | 2011-10-07 | 2013-04-11 | Skau Aps | Identification and attenuation of the immunosuppressive domains in fusion proteins of enveloped rna viruses |
WO2014166502A2 (en) * | 2013-04-10 | 2014-10-16 | Skau Aps | Use of immune suppressive domains as medicaments |
WO2014166500A2 (en) * | 2013-04-10 | 2014-10-16 | Skau Aps | Peptides having immune suppresive domains for transfection |
WO2017096326A1 (en) | 2015-12-02 | 2017-06-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for efficient generation of neurons from non-neuronal cells |
DE102016113714A1 (de) | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Rosa Karl | Transfektionsverfahren mit nicht-viralen Genliefersystemen |
KR102177776B1 (ko) * | 2019-06-11 | 2020-11-11 | 한국생명공학연구원 | 가디퀴모드를 유효성분으로 포함하는 근력 약화 관련 질환 치료용 조성물 |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4750100A (en) | 1986-06-06 | 1988-06-07 | Bio-Rad Laboratories | Transfection high voltage controller |
US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
FR2645866B1 (fr) | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
US5334761A (en) | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
ATE258434T1 (de) | 1993-07-14 | 2004-02-15 | Univ California | Sich selbst zusammensetzendes polynukleotid- abgabesystem, das dendrimer-polykationen enthält |
FR2722506B1 (fr) | 1994-07-13 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations |
US5753262A (en) | 1995-06-07 | 1998-05-19 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Cationic lipid acid salt of 3beta N- (N', N'-dimethylaminoethane) - carbamoyl!cholestrol and halogenated solvent-free preliposomal lyophilate thereof |
FR2736390B1 (fr) | 1995-07-05 | 1997-08-08 | Hispano Suiza Sa | Inverseur de poussee de turboreacteur a une coquille |
ES2242198T3 (es) | 1995-10-25 | 2005-11-01 | Octoplus B.V. | Poliacrilatos y poli(alquil) acrilatos cationicos o las correspondientes acrilamidas para utilizar en sistemas de transfeccion sinteticos. |
US5869326A (en) | 1996-09-09 | 1999-02-09 | Genetronics, Inc. | Electroporation employing user-configured pulsing scheme |
EP0866123B1 (de) | 1997-03-21 | 2005-03-16 | Eppendorf Ag | Verfahren und Schaltungsanordnung zur Elektropermeation oder Elektroporation von lebenden Zellen |
-
2008
- 2008-11-24 WO PCT/EP2008/009947 patent/WO2009065618A2/de active Application Filing
- 2008-11-24 CN CN200880117341XA patent/CN101918566A/zh active Pending
- 2008-11-24 EP EP08851432A patent/EP2212425A2/de not_active Withdrawn
- 2008-11-24 EP EP11001260A patent/EP2363494A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102349995A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-02-15 | 武汉大学 | 一种广谱抗病毒的药物及其制备方法和应用 |
WO2020259667A1 (zh) * | 2019-06-28 | 2020-12-30 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Tlr激动剂与抗ox40抗体或其抗原结合片段联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009065618A3 (de) | 2009-09-24 |
WO2009065618A8 (de) | 2010-07-01 |
EP2212425A2 (de) | 2010-08-04 |
EP2363494A9 (de) | 2014-03-19 |
EP2363494A1 (de) | 2011-09-07 |
WO2009065618A2 (de) | 2009-05-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101918566A (zh) | 通过影响先天性免疫系统改进非病毒输送系统的转染结果 | |
US20110045001A1 (en) | Transfection results of non-viral gene delivery systems by influencing of the innate immune system | |
Kim et al. | Cholesteryl oligoarginine delivering vascular endothelial growth factor siRNA effectively inhibits tumor growth in colon adenocarcinoma | |
De Martimprey et al. | Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids: oligonucleotides and siRNA | |
Judge et al. | Confirming the RNAi-mediated mechanism of action of siRNA-based cancer therapeutics in mice | |
Sakurai et al. | Endosomal escape and the knockdown efficiency of liposomal-siRNA by the fusogenic peptide shGALA | |
Höbel et al. | Polyethylenimine/small interfering RNA‐mediated knockdown of vascular endothelial growth factor in vivo exerts anti‐tumor effects synergistically with Bevacizumab | |
US20150291678A1 (en) | Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression | |
US8058256B2 (en) | Polymeric carrier for delivery of small interfering RNA | |
CN108064155A (zh) | 用于p21基因调节的rna剂 | |
Ma et al. | Anti-inflammatory activity of chitosan nanoparticles carrying NF-κB/p65 antisense oligonucleotide in RAW264. 7 macropghage stimulated by lipopolysaccharide | |
Olejniczak et al. | Recent advances in understanding of the immunological off-target effects of siRNA | |
JP2005519976A (ja) | 動物細胞への阻害剤の伝達によるrna機能の阻害 | |
CN102203254B (zh) | 有效抑制病毒感染的siRNA组合物及方法 | |
KR101678876B1 (ko) | 복합 유전자를 표적하는 siRNA 다중 접합체 및 이의 제조방법 | |
US20040019008A1 (en) | Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations | |
JP2015221026A (ja) | 人工合成mRNAの翻訳効率化方法 | |
Xu et al. | Efficient siRNA delivery using PEG-conjugated PAMAM dendrimers targeting vascular endothelial growth factor in a CoCl2-induced neovascularization model in retinal endothelial cells | |
US20050043263A1 (en) | Use of double-stranded ribonucleic acid for inducing cell lysis | |
Min et al. | Bacterial tRNase–based gene therapy with poly (β‐amino ester) nanoparticles for suppressing melanoma tumor growth and relapse | |
Montazeri Aliabadi et al. | Suppression of human coronavirus 229E infection in lung fibroblast cells via RNA interference | |
Adamek et al. | Small interfering RNA treatment can inhibit Cyprinid herpesvirus 3 associated cell death in vitro | |
Heidel | Targeted, systemic non-viral delivery of small interfering RNA in vivo | |
Keates et al. | TransKingdom RNA interference: a bacterial approach to challenges in RNAi therapy and delivery | |
Hashemi | siRNA delivery improvement by co-formulation of different modified polymers in erythroleukemic cell line K562 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101215 |