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Stand der Technik
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Bei
Immunantworten des Körpers (Luke A. et al.; Spektrum
der Wissenschaft, August 2005, Seiten 68–75) gegen
eine infektiöse oder immunologische Herausforderung unterscheidet
man zwischen der angeborenen (innate immunity) und der erworbenen
Immunantwort (antigen-specific acquired immunity).
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Die
erworbene Immunabwehr wird erst bei einer Infektion mit Krankheitserregern
ausgebildet. Sie besitzt eine Art Gedächtnis, sodass es
bei einer zweiten Infektion durch denselben Erreger in der Regel
nicht mehr zum Ausbruch der Krankheit kommt. Auf diesem Prinzip
beruhen Impfstoffe. Gäbe es nur die erworbene Immunabwehr
wäre der Organismus vor der ersten Infektion völlig
ungeschützt. Das ist jedoch nicht der Fall, da es noch
eine weitere sehr ursprüngliche Immunabwehr gibt, die als
angeborene Immunabwehr bezeichnet wird und von der Fliege Drosophila
bis zu Säugetieren, ja sogar bei Pflanzen gefunden wird.
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Die
angeborene Immunabwehr ist die erste Abwehrfront gegen Krankheitserreger
und stellt ein evolutionär sehr altes System dar. Bei der
angeborenen Immunabwehr werden über so genannte Toll-like
Rezeptoren (TLRs)(Heine H. et al.; int. Arch. Allergy Immunol.
2003; 130; 180–192 und Uematsu S. et al.,
J. Biol. Chem. 2007, May 25; 282 (21);15319–23)
und RIG-I-like Helikasen (RLHs) die krankheitsassozierten molekularen Muster,
so genannte pathogen-associated molecular Patterns (PAMPs), erkannt
und entsprechende Entzündungs- sowie Immunreaktionen eingeleitet.
Dadurch kann der Organismus zwischen „selbst” und „nicht
selbst” unterscheiden. RLHs werden ubiquitär im
Zytosol exprimiert, wo sie in der Lage sind, die bei viraler Infektion entstehende
dsRNA zu erkennen. TLRs und RLHs gehören zu einer Gruppe
von Rezeptoren, die auch als pattern recognition receptors (PRRs)
bezeichnet werden.
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RIG-I-like Helikasen (RLHs)
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RIG-I
(retinoic inducible gene I) ist ein intrazellulärer Rezeptor
des angeborenen Immunsystems (Perry A. K. et al; Cell Research
2005; 15(6); 407–422 und Kawai T. et al.;
J. Biochem; 2007; 141; 137–145). Der Rezeptor
gehört zu den Helikasen und ist in der Lage, einzel- und
doppelsträngige RNS mit einem Triphosphatrest an 5'-Position
zu detektieren. Damit ist er in der Lage, zwischen zelleigenen und
viralen Ribonukleinsäuren zu unterscheiden. Wird fremde
RNA erkannt, wird über eine Signaltransduktionskaskade
eine Immunantwort ausgelöst und am Ende Interferon des
Typs I produziert. Wie diese Signaltransduktionskaskade genau funktioniert
ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Man vermutet
jedoch die Beteiligung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, IRF3, IRF7
und der Kinasen TBK1 und IKK-i. Eine Gruppe mit ähnlichen
Eigenschaften wird unter dem Begriff RIG-I-like Helikasen zusammengefasst.
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Toll-like Rezeptoren (TLRs)
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Toll-like
Rezeptoren wurden erstmals in der Mitte der 1990er Jahre entdeckt
(Zimmer A. et al.; PNAS, 1999; 96(10), 5780–5785).
Der Name ist abgeleitet von einem in Drosophila Melanogaster von
Christiane Nüsslein-Volhard gefundenem Protein, das Sie „Toll” nannte.
TLR-Proteine ähneln diesem Typus und werden damit als „Toll-like”-Proteine
bezeichnet. Dabei handelt es sich um Transmembranproteine mit einer
extrazellulären, „leucin-reichen repeat” Domäne
(LRR) wie auch einer zytoplasmatischen Domäne, die derjenigen
der IL-1R Familie homolog ist. Die verschiedenen TLRs reagieren
selektiv auf verschiedene molekulare virale und bakterielle Komponenten
und steuern über eine Signaltransduktionskaskade eine entsprechende
Aktivierung von Genen. Dies geschieht zunächst über
so genannte Adaptermolekule und darauf folgend über Kinasen,
die schließlich Transkriptionsfaktoren (z. B. NF-kB und
die IRF-Familien) durch Phosphorylierung derselben oder entsprechender
intrazellulärer Inhibitoren dieser Transkriptionsfaktoren
aktivieren. Letztendlich werden neben einer Vielzahl spezifischer
Gene, die eine antimikrobielle Wirkung haben, so genannte Zytokine
produziert. Zytokine sind wiederum notwendige Stimulatoren für
die erworbene Immunabwehr und damit auch ein Bindeglied zwischen
angeborener und erworbener Immunabwehr. Die Prinzipien der Ligandenerkennung,
Signaltransduktion und Signalweiterleitung sind allerdings erst
in Ansätzen verstanden.
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Bisher
sind 13 verschiedene TLRs bekannt (davon 10 beim Menschen), deren
Anzahl ausreichend ist für die Erkennung aller pathogenen
Erreger, angefangen von Bakterien über Pilze bis zu den
Viren. Die Rezeptoren erkennen dabei allen Erregern gemeinsame Strukturen,
des Weiteren mitunter auch mehrere Bestandteile gleichzeitig, ohne
dass diese sich strukturell ähneln. Beispielsweise erkennt
das TLR4 Lipopolysaccharide, aber auch Taxol. Bisher ist nicht bekannt
wie die TLRs das leisten können. Die TLRs unterscheiden sich
von Spezies zu Spezies nur wenig.
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Bisher
sind folgende Gruppen von Molekülen als Liganden der TLRs
bekannt, die zu einer Auslösung von Signaltransduktionskaskaden
führen:
- TLR1:
bildet mit TLR2 ein Heterodimer,
ist der Rezeptor von triacyliertem Lipoprotein und Zymosan aus Hefen.
- TLR2:
ist der Rezeptor für bestimmte Peptidoglykane,
Lipopeptide, Glykolipide und verschiedener Bakterien.
- TLR3:
erkennt lange dsRNA, wie Sie bei einer Virusreplikation
in infizierten Zellen vorkommt.
- TLR4:
ist der Rezeptor für Lipopolysaccharide
(LPS, auch Endotoxine), verschiedene Hüllglykoproteine
(auch von Viren) und Taxol. LPS sind Bestandteile von Bakterienzellwänden.
Der TLR4 Rezeptor benötigt für seine Funktion
ein zusätzliches membrangebundenes Protein (TLR assistierendes
Protein). Dabei bindet CD14 z. B. das LPS und führt es
dem TLR4 Rezeptor zu. Die Bindung an CD14 alleine löst
dabei keine Signaltransduktionskaskade aus.
- TLR5:
ist der Rezeptor von Flagellin, einem Hauptbestandteil
der Geiseln (Flagellae), mit welchen sich Bakterien fortbewegen.
- TLR6:
bildet mit TLR2 ein Heterodimer, ist der Rezeptor
von diacyliertem Lipoprotein und bestimmten Peptidoglykanen. Ein
spezielles Lipoprotein (MALP-2 = macrophage-activating lipopeptide)
wird mittels Unterstützung durch das membrangebundene Protein
CD36 detektiert (TLR assistierendes Protein).
- TLR7&TLR8:
sind
Rezeptoren für Imidazochinolinen und von ssRNA/dsRNA z.
B. von RNA-Viren.
- TLR9:
ist der Rezeptor für bakterielle DNA, bzw.
für nicht methylierte CpG Motive, die in bakterieller DNA
gehäuft (20 × häufiger als in Säugerzellen)
auftritt. Das CpG Motiv ist in Säugerzellen stark methyliert,
wodurch es unterschieden werden kann. Ähnliches wie für
bakterielle DNA gilt auch für virale DNA, die auch von
TLR9 detektiert wird. Über die immunstimulatorische Eigenschaft
von bakterieller DNA berichtete schon Anfang der 80er Jahre die
Gruppe um Dr. Tokunaga. Als zugehöriger Rezeptor wurde
von der Gruppe um Dr. Shizuo Akira der TLR9 Rezeptor identifiziert
(Aufklärung der Rollen von Toll-Rezeptoren und
ihrer Signaltransduktionskaskaden mittels Gen-Targeting, Robert-Koch-Vorlesung
von Dr. Shizuo Akira, Allgemeine Presseinformation 2002; www.robert-koch.stiftung.de).
- TLR10:
Ligand noch nicht bekannt
- TLR11:
Ist Rezeptor für das urpathogene Bakterium
Escherichia coli und dem Profilinähnlichen Protein des
Urtierchens Toxoplasma gondii
- TLR12:
Funktion und Ligand noch unbekannt
- TLR13:
Funktion und Ligand noch unbekannt
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Lokalisation der TLR:
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TLR2,
4, 5 und 6 sitzen insbesondere in den Plasmamembranen von Monozyten,
natürlichen Killerzellen, Mastzellen oder myaloiden dendritischen
Zellen., 7, 8, und 9 befinden sich insbesondere in Endosomen von
Immunzellen (Siegmund-Schultze N., www.aerzteblatt.de).
Die Aktivierung der Immunantwort erfordert daher eine intrazelluläre
Aufnahme über Endozytose und eine Reifung der Endosomen.
Die Signalweiterleitung beginnt hier in einem endosomalen Kompartiment.
Für TLR3 gibt es Hinweise, dass er sich in den Plasmamembranen
befindet, allerdings gibt es auch Darstellungen in der Literatur
die von einer endosomalen Lokalisation ausgehen. TLRs agieren häufig
paarweise und treten bei unterschiedlichen Zelltypen in unterschiedlichen
Kombinationen auf.
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Signaltransduktionskaskaden:
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Die
Signaltransduktionswege der unterschiedlichen TLRs (Perry
A. K. et al; Cell Research 2005; 15(6); 407–422 und Kawai
T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145) sind
teilweise zwar ähnlich, weisen aber durchaus auch größere
Unterschiede auf, sodass es am Ende zu einer unterschiedlichen Genexpression
und damit unterschiedlichen biologischen Reaktionen kommt. Mit Ausnahme
von TLR3 geben alle TLRs ihr Signal an das Adapterprotein MyD88
weiter. MyD88 spielt eine entscheidende Rolle bei der Signalübermittlung über
den TLR/Interleukin-1 Rezeptor. Die zytosolische Domäne
der TLRs zeigt hohe Ähnlichkeit zu der des Interleukin-1 Rezeptors
und wird daher auch als Toll/IR-1 Rezeptor Domäne (TIR)
bezeichnet. MyD88-defiziente Splenozyten zeigten z. B. keine Reaktionen
auf Interleukin-1, LPS oder CpG-DNA. Außerdem wurde bei
MyD88 defizienten Zellen in Reaktion auf TLR2, TLR7, TLR9-Liganden
keine Aktivierung von Signalmolekülen, wie NF-kB oder MAP
Kinasen beobachtet. Das ist ein deutlicher Hinweis auf die vollständige
Abhängigkeit der TLRs (außer TLR3) von MyD88 für
deren Signalweiterleitung. Andere Adaptermoleküle sind z.
B. TIRAP (Toll-Interleukin-1-Rezeptor(TIR)-Domäne enthaltendes
Adapterprotein (TLR1, TLR2, TLR4 und TLR6), Mal (MyD88-adapter-like),
TRIF (TLR3 und TLR4) und TRAM (TLR4).
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Welche
Proteine neben den Adaptermolekülen noch mitwirken hängt
vom jeweiligen TLR ab. Allgemein und vereinfacht dargestellt beginnt
eine Signatransduktionskaskade in der Regel mit einem Rezeptor an der
Zelloberfläche mit einer zytosolischen Domäne,
der sein Signal bei Belegung mir einem passenden Liganden über
zytosolische Adaptermoleküle an Kinasen weiterleitet, die über
Kaskaden Transkriptionsfaktoren aktivieren. Die aktivierten Transkriptionsfaktoren
lokalisieren im Kern und lösen die Expression von Proteinen, meistens
Zytokinen aus.
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Signaltransduktionskaskade über
TLR1/TLR2, TLR2/TLR2, TLR2/TLR6
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Die
Rezeptoren, die in entsprechenden Paaren auftreten, lösen
bei der Belegung mit passenden Liganden die gleichen Signaltransduktionskaskaden
aus. Letztendlich werden unter anderem die Transkriptionsfaktoren
NF-kB und AP-1 aktiviert, die insbesondere zur Expression von Zytokinen
führen. Dabei sind bei der Signalübertragung die
Adaptermoleküle RAC-1, TIRAP, MyD88 und TRAF6 beteiligt.
Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4, TAK1, PI 3K, IKKalpha,
IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
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Signaltransduktionskaskade über
TLR4
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Der
Rezeptor benötigt das membrangebundene Protein CD14 für
seine volle Funktion. CD14 bindet entsprechende Agonisten und führt
Sie dem Rezeptor zu. Dieser löst bei der Belegung mit passenden
Liganden letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren
NF-kB, AP-1, IRF3 und IRF7 aus und führt wiederum insbesondere
zur Expression von Zytokinen. Dabei sind bei der Signalübertragung
die Adaptermoleküle TIRAP, MyD88, TRAM, TRIF, TRAF3, TRAF6,
NAP1 und RIP1 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4,
TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, IKKepsilon, TBK1, ERK1, ERK2,
JNK, p38 MAPK, MEK1, MEK2 und MKKs beteiligt.
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Signaltransduktionskaskade über
TLR5
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Der
Rezeptor löst bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich
die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB und AP-1, die insbesondere
zur Expression von Zytokinen führen. Dabei sind bei der
Signalübertragung die Adaptermoleküle MyD88 und
TRAF6 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4, TAK1,
IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
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Signaltransduktionskaskade über
TLR10, 11, 12, 13
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Die
Rezeptoren lösen bei der Belegung mit passenden Liganden
letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB und
AP-1, die insbesondere zur Expression von Cytokinen führen.
Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle
MyD88 und TRAF6 beteiligt. Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4,
TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma und MKKs beteiligt.
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Signaltransduktionskaskade über
TLR3:
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Der
Rezeptor löst bei der Belegung mit passenden Liganden letztendlich
die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, AP-1, IRF3 und
IRF7 aus, wobei wiederum insbesondere Zytokine verstärkt
exprimiert werden. Dabei sind bei der Signalübertragung
die Adaptermoleküle TRIF, TRAF6, TRAF3, NAP1 und RIP1 beteiligt.
Als Kinasen sind mindestens IRAK1, IRAK4, TAK1, IKKalpha, IKKbeta,
IKKgamma, IKKepsilon, TBK1, PKR, PI K3, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
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Signaltransduktionskaskaden über
TLR7, TLR8 und TLR9
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Die
Rezeptoren, lösen bei der Belegung mit passenden Liganden
letztendlich die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren NF-kB, AP-1,
IRF1, IRF5 und IRF7 aus, wobei wiederum insbesondere Zytokine verstärkt exprimiert
werden.. Dabei sind bei der Signalübertragung die Adaptermoleküle
MyD88, TRAF6 und TRAF3 beteiligt. Als Kinasen sind IRAK1, IRAK4,
TAK1, IKKalpha, IKKbeta, IKKgamma, JNK, p38 MAPK und MKKs beteiligt.
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TLRs
sind von großem therapeutischem Interesse. TLR Agonisten
werden z. B. als Adjuvantien in Impfstrategien oder in der Krebstherapie
eingesetzt. Beispiele sind die Behandlung von Basalzellkarzinom durch
die TLR7/8 Agonisten Imiquimod/Resiquimod oder von Blasenkrebs durch
einen TLR2 Agonisten. Der TLR9 Rezeptor wird durch ein synthetisches
CpG-haltiges Oligonukleotid (CpG 7909 und CpG 10101) für
die Therapie von Autoimmunerkrankungen, Krebs und Infektionskrankheiten
angesteuert. Kommerzialisiert werden TLR9 basierende Therapiestrategien
von der Firma Coley Pharmaceuticals.
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Aber
auch durch eine Überreaktion der angeborenen Immunabwehr
können zahlreiche Krankheiten ausgelöst werden,
beispielsweise Autoimmunerkrankungen wie rheumatische Arthritis
und systemischer Lupus erythematodes. Hier reagieren TLRs mit Zerfallsprodukten
körpereigener Zellen und leiten damit die Immunabwehr fehl.
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Die
TLRs stehen sogar im Verdacht, ursächlich mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen
im Zusammenhang zu stehen. Entzündungsreaktionen am Herz
können zur Bildung von arteriosklerotischen Plaques beitragen, die
letztendlich durch Gefäßverschluss zum Infarkt
führen können.
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Zytokine/Cytokines:
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Zytokine
sind multifunktionale Signalstoffe. Es handelt sich dabei um zuckerhaltige
Proteine, die eine regulierende Funktion für das Wachstum
und die Differerenzierung von Körperzellen haben. Einige
von ihnen werden daher auch als Wachstumsfaktoren bezeichnet. Viele
Zytokine spielen zudem eine wichtige Rolle bei immunologischen Reaktionen
und werden daher auch Mediatoren genannt. Zytokine werden von den
Zellen durch Sekretion in das umgebende Medium abgegeben und stimulieren
andere Zellen, wenn diese einen passenden Rezeptor besitzen. Man
unterscheidet 5 Hauptgruppen von Zytokinen:
- 1.
Interferone (IFN)
Interferone weisen Zellen an, Proteine zu
bilden, die eine virale Infektion erschweren oder unterbinden. Auch
können Interferone antitumorale Wirkung haben.
- 2. Interleukine (IL)
Interleukine dienen insbesondere der
Kommunikation von Immunabwehrzellen untereinander und erhöhen dadurch
die Koordination bei der Abwehr von Krankheitserregern und der Tumorbekämpfung
- 3. Koloniestimulierende Faktoren
Koloniestimulierende Faktoren
werden in der Niere gebildet. Es handelt sich um Wachstumsfaktoren
für Blutkörperchen
- 4. Tumornekrosefaktoren (TNF)
Die wichtigste Funktion von
TNFs ist, die Aktivität verschiedener Immunzellen zu regeln.
Sie werden hauptsächlich von Makrophagen ausgeschüttet.
TNFs können den Zelltod (Apoptose), Zellproliferation,
Zelldifferenzierung und Ausschüttung anderer Zytokine anregen.
- 5. Chemokine
Chemokine sind Chemoattraktoren, die Zellen
mit passenden Rezeptoren veranlassen durch Chemotaxis zur Quelle
der Chemokine zu wandern
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Von
besonderer Bedeutung als Mediatoren für immunologische
Prozesse sind die Interferone (IFN), insbesondere die Interferone
vom Typ I. Das erste Interferon dieser Art wurde 1957 von Isaacs
und Lindemann gefunden (Isaacs, A. et al.; J. Proc. R. Soc.
Lond. B. Biol. Sci. 147, 258–267). Der Name rührt
daher, dass dieses Protein mit der Replikation von Viren interferiert.
Typ I Interferone sind Schlüsselzytokine, die eine antivirale
Antwort von Zellen auslösen, einen „antiviralen
Status” etablieren und Zellen des Immunsystems zu einer antiviralen
Antwort stimulieren. Diese Gruppe bindet an einen Rezeptor, den
so genannten IFN-alpha Rezeptor (IFNAR), der aus zwei Proteinketten
(IFNAR1 und IFNAR2) besteht. Man unterscheidet verschiedene Untertypen.
Diese werden als IFN-alpha, IFN-beta, IFN-kappa, IFN-delta, IFN-epsilon,
IFN-tau, IFN-omega und IFN-zeta bezeichnet. Wiederum von besonderer
Bedeutung sind hier die Interferone des Typs alpha und beta, die
von vielen Zellen sekregiert werden, z. B. von Lymphozyten, Makrophagen,
Fibroblasten Endothelzellen, Osteoplasten und anderen.
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Die
IFN-alpha Proteine kommen in 13 Subtypen vor, die als IFNAX (x =
1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 16, 17 und 21) bezeichnet werden.
Alle ihre Gene liegen clusterartig auf dem Chromosom 9.
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Von
den IFN-beta Proteinen sind zwei beschrieben. Es handelt sich um
IFNB1 und IFNB3. Ein als IFNB2 beschriebenes Protein konnte später
als ein bekanntes Interleukin identifiziert werden.
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Über
eine Signaltransduktionskaskade, den sogenannten JAK/STAT Pathway
wird nach der Bindung an den in der äußeren Zellmembran
liegenden Interferon-Typ-1-Rezeptor der Transkriptionsfaktor „interferone stimulated
gene factor 3” (ISGF3), ein Heterotrimer der Transkriptionsfaktoren
STAT1, STAT2 und „IFN regulatory factor 9 (IRF9), welche
in den Zellkern wandern und dort die Transkription von Hunderten
von Effektormolekülen (über so genannte IFN induzierbare
Gene) induziert. Diese Effektormoleküle beeinflussen direkt
die Proteinsynthese, das Zellwachstum und das Überleben
im Prozess der Etablierung des so genannten „antiviralen
Status” (antiviral state). In diesem Status wird die Infektiösität
der Viren z. B. durch verringerte Replikationsraten abgewehrt oder
zumindest verringert.
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Zusätzlich
wird das adaptive Immunsystem aktiviert, indem die Reifung von dendritischen
Zellen ausgelöst, die Antikörperantwort der B
Zellen und die T Zellantwort aktiviert wird. Es werden Lymphozyten
und Monozyten durch induzierte Chemokine zum Ort der Infektion rekrutiert.
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Auch
Stress kann Signaltransduktionswege anstossen, die in einen antiviralen
Status münden. Diese Signaltransduktionkaskaden kreuzen
die Signaltransduktionkaskaden der TLR.
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Stress-Signaltransduktionswege:
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Zellulärer
Stress kann ausgelöst werden, durch:
- – Hitze/Kälte
- – UV
- – mechanische Beanspruchung/Scherkräfte
- – Sauerstoffmangel
- – Nährstoffmangel
- – Osmotischer Stress
- – Oxidativer Stress/Freie Radikale
- – Entzündungen
- – biologische und chemische Agentien (z. B. TNFalpha,
Chemotherapeutika)
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Die
Zellen reagieren auf Stress mit komplexen Veränderungen
in der Aktivität von Signalketten, an welchen spezifische
MEK, MSK und MAP Kinasen und verschiedene Transkriptionsfaktoren
(z. B. NF-kB), Apoptoseregulatoren und Zellzyklus-regulatoren beteiligt
sind. GTP-bindende Proteine (Ras/Rho-Familie) die an der Membran
gebunden sind spielen bei der Reaktion der Zellen auf zellulären
Stress eine besondere Rolle.
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Die
angeborene Immunantwort erfolgt sowohl intrazellulär als
auch interzellulär. Bei der intrazellulären Antwort
löst eine durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffene
Zelle über PRRs, wie beispielsweise TLRs und RLHs, Signaltransduktionskaskaden
aus, wodurch sich der physiologische Status und das Expressionsprofil
der Zelle ändern. Daneben gibt es eine interzelluläre
Antwort, bei der die durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffene
Zelle andere Zellen, die keinem direkten Kontakt mit dem entsprechenden
Pathogen ausgesetzt waren, von der ”Infektion” mit
dem Pathogen „informiert”. Dabei werden von der
durch einen Kontakt mit einem Pathogen betroffenen Zelle Zytokine
freigesetzt, die von Zytokinrezeptoren, welche sich auf den anderen
nicht mit dem Pathogen in Kontakt gekommen Zellen befinden, detektiert
werden. Durch die Bindung der Zytokine an die Zytokinrezeptoren
wird eine Signaltransduktionskaskade in den Zellen, die keinem direkten
Kontakt mit dem Pathogen ausgesetzt waren, ausgelöst, mit
der Folge, dass sich auch deren physiologischer Status und Expressionsprofil ändert,
obwohl sie mit dem Pathogen nicht direkt in Berührung gekommen
sind. Die Änderung des physiologischen Status und des Expressionsprofils
der Zellen soll dabei den pathogenen Angriff abwehren und das Überleben
der Zellen sichern.
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Die
interzelluläre Antwort grenzt sich von der intrazellulären
Antwort durch die unterschiedlichen Rezeptoren und Agonisten ab.
Als Rezeptoren fungieren bei der interzellulären Antwort
Zytokinrezeptoren und bei der intrazellulären Antwort PRRs.
Die Agonisten der interzellulären Antwort sind Zytokine
und bei der intrazellulären Antwort sind die Agonisten
pathogene Muster.
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Genliefermethoden
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Die
Transfektion, d. h. das Einbringen von genetischem Material in eukariotische
Zellen, insbesondere Säugerzellen, ist heute eine Methode,
die aus der modernen Forschung nicht mehr wegzudenken ist (Domb A.
J.; Review in Molecules; 2005; 10; 34 und Xiang
G; Keun-Sik K.; Dexi L.; Review in The AAPS Journal; 2007; 9(1)
Article 9; http://www.aapsj.org). Ohne
diese Methode wäre eine Aufklärung der Funktion
verschiedener Gene wesentlich erschwert. Nicht zu vergessen ist
die Möglichkeit, auf diesem Wege Proteine eukariotischen Ursprungs
originalgetreu herzustellen, da die korrekte posttranslationale
Modifikation durch die eukariotischen Zellen, im Gegensatz zu früher
häufig verwendeten prokariotischen Zellen, sichergestellt
wird. Des Weiteren wird für die nahe Zukunft erwartet,
dass insbesondere das Einbringen von genetischem Material in humane Zellen,
also die Gentherapie, Einzug in die moderne Medizin in Form klinisch
getesteter Verfahren und Therapien halten wird. Das Einbringen von
genetischem Material ermöglicht es z. B. in eukariotischen
Zellen zerstörte DNA Bereiche zu ersetzen und somit Fehlfunktionen
zu beheben. Des Weiteren können Suizidgene eingeschleust
werden, die beispielsweise Krebszellen zum „Selbstmord” zwingen.
Aber auch das Stilllegen (Knock-down) von Genen kann erreicht werden,
indem beispielsweise siRNA (small interfering RNA), Ribozyme oder
Antisense Moleküle zum Einsatz kommen. Mit der Möglichkeit,
auf den genetischen Steuerungsapparat der Zelle zugreifen zu können,
steht dem Menschen daher ein wertvolles Mittel zur Verfügung,
sein Verständnis aber auch seinen Einfluss auf die natürlich
ablaufenden Prozesse in einer Zelle zu vermehren.
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In
den vergangenen Jahren erlangte die Erforschung so genannter Genliefermethoden
(Gene Delivery Systems), die sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt
werden können, enorme Bedeutung, da jenen große Chancen eingeräumt
werden, der Gentherapie zum Durchbruch zu verhelfen. Ein Schwerpunkt
der Gentherapieforschung besteht darin, Viren als Carriersysteme
zu nutzen. Da das Einbringen von DNA oder RNA in Fremdzellen ein
integraler Bestandteil des Vermehrungszyklus der Viren ist, wurde
diese Fähigkeit durch einen natürlichen, evolutiven
Prozess in der Entwicklungsgeschichte der Viren soweit verfeinert,
dass es bis heute keine effektiveren Gen-Carrier gibt. Die natürlich
vorkommenden Viren werden gentechnisch so manipuliert, dass sie
Ihre Fähigkeit zur Reproduktion und ihre Pathogenität
verlieren, jedoch eine Zelle mit rekombinant eingebrachtem genetischem
Material infizieren können. Da Viren außer aus
genetischem Material im Wesentlichen aus Proteinen bestehen, bieten
Sie dem Immunsystem allerdings eine große Angriffsfläche.
Dabei hat das Immunsystem in einem ebenso evolutionären
Anpassungsprozess Strategien entwickelt, sich diesen Eindringlingen
zur Wehr zu setzen. Daher wird die Immunantwort des Körpers
als ein besonders bedeutender Faktor bezüglich gescheiterter
Gentherapiestudien genannt.
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Die
gegenwärtig zur Verfügung stehenden Genliefermethoden
können in die zwei Hauptgruppen virale Systeme und nicht-virale
Systeme unterteilt werden. Die nicht-viralen Systeme können
wiederum in chemische und physikalische Methoden unterschieden werden.
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Von
den nicht-viralen Systemen, die auf chemischen Methoden beruhen,
sind insbesondere solche erwähnenswert, die auf kationischen
Lipiden (sog. Lipofektion) oder kationischen Polymeren (sog. Polyfektion) beruhen.
Deren Effizienz liegt in der Regel weit hinter den viralen Systemen.
Allseits bekannte kationische Polymere sind beispielsweise Poly-L-Lysin
(PLL), (
EP 388758 ) Polyethylenimin
(PEI), (
J. P. Behr et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1995;
92; 7297 (
WO 9602655 ),
Diethylaminoethyldextran (DEAE), (
S. C. De Smedt et al.; Phar.
Res.; 2000; 17; 113), Starburst Dendrimere (PAMAM), (
F.
C. Szoka et al.; Bioconjug. Chem.; 1996; 7; 703;
WO 9502397 ), Chitosanderivate
(
W. Guang Liu et al.; J. Control. Release; 2002; 83; 1)
oder auch Polydimethylaminoethylmethacrylate (
P. van de
Wetering et al.; J. Gene Med.; 1999; 1; 156; WO 9715680 ). Auch die weint verbreitete
Ca-Phosphat- Präzipitationsmethode nutzt in weiterem Sinne
ein „kationisches Polymer” und kann daher zu dieser
Gruppe gezählt werden.
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Kommerziell
erhältliche Produkte solcher kationischer Polymere sind
z. B. Superfect, Polyfect (Qiagen), ExGen500 (Biomol) und jetPEI
(Qbiogene).
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Ebenso
bekannte kationische Lipide (
J. P. Behr; Bioconjugate Chem.;
1994; 5; 382) sind beispielsweise DOTMA (
US 4946787 ), DOTAP (
Leventis
et al.; Biochim. Biophys. Acta; 1990; 1023; 124), DOGS
(
EP 394111 ), DOSPA (
WO 9405624 ), DOSPER (
WO 97002419 ), DMRIE (
US 5264618 ) oder DC-Chol
(
Huang et al; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1991; 179;
280;
WO 9640067 ).
Solche oder ähnliche Lipide werden als solche oder in Kombination
mit so genannten Colipiden (z. B. DOPE) in der Regel in ethanolischen,
wässrigen Pufferlösungen als Micellen oder Liposomen
formuliert. Als solche, oder auch als Öl oder Festsubstanz
zur Eigenformulierung sind sie als kommerziell erhältliche
Reagenzien, wie Lipofectin, Lipofectamin, Lipofectamine 2000 (Invitrogen),
Fugene (Roche), Effectene (Qiagen), Transfectam (Promega), Metafectene
(Biontex) etc. erhältlich.
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Kationische
Lipide und kationische Polymere bilden in Anwesenheit von DNA oder
RNA aufgrund der gegenläufigen Ladungsverhältnisse
spontan so genannte Lipoplexe oder Polyplexe. Die DNA wird dabei
durch die Kompensation der negativen Ladung am Phosphatrest kondensiert,
also in ihrer Größe minimiert. Im Allgemeinen
hängt die Transfektionseffizienz von Lipoplexen oder Polyplexen
von einer Vielzahl von Parametern ab. Die wichtigsten sind das Mengenverhältnis
von genetischem Material zu kationischer Komponente bei der Herstellung
der Lipo/Polyplexe, Ionenstärke während der Herstellung
der Lipo/Polyplexe, Absolutmenge von Lipo/Polyplexen pro Zelle,
Zelltyp, Proliferationszustand der Zellen, physiologischer Status
der Zellen, Zellteilungsrate, Inkubationszeit etc. Diese Einflussparameter
sind Ausdruck eines komplizierten Transfektionsgeschehens, bei der
die Lipo/Polyplexe bzw. die enthaltenen genetischen Materialien
eine Vielzahl von zellulären Barrieren überwinden
müssen.
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Die
erste Barriere stellt die äußere negativ geladene
Zellmembran dar. Es wird angenommen, dass transfektionsaktive Lipoplexe,
die eine positive Nettoladung haben müssen, durch adsorptive
Endocytose oder Flüssigphasenendocytose in das Innere der
Zelle gelangen. Durch die Endocytose, die einen aktiven Transportprozess
der Zelle darstellt, wird Material auf der Zelloberfläche
mit Zellmembran ummantelt und als Vesikel (Endosom) internalisiert.
Durch Verschmelzung mit so genannten Lysosomen, die ein komplexes
Gemisch von Enzymen beinhalten, werden die in den Endosomen enthaltenen
Stoffe abgebaut. Da zu diesem Abbau ein niedriger pH-Wert nötig
ist, besitzen Endosomen Protonenpumpen, die solange Protonen in
die Endosomen pumpen, bis ein entsprechender pH-Wert erreicht wird.
Um Ladungsneutralität zu wahren, strömen im gleichen Ausmaß Chloridionen
in die Endosomen.
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Viele
moderne kationische Lipide oder Polymere besitzen aus diesem Grund
Puffereigenschaften. Auf diese Weise wird der niedrige pH-Wert nicht
erreicht und es kommt zu einem Eintrag an Ionen in die Endosomen,
der die Endosomen durch den entstehenden osmotischen Druck zum Platzen
bringt. Auf diese Weise gelangen diese Lipo/Polyplexe in das Cytosol.
Da auch eine Reihe transfektionsaktiver Lipide und Polymere ohne
Puffereigenschaften bekannt sind, muss ein weiterer Mechanismus
existieren, der die Lipo/Polyplexe in das Cytosol gelangen lässt.
Man vermutet zumindest im Falle der Lipide eine Fusion der beteiligten
Membranen und damit einhergehend eine Destabilisierung. Ob dabei
vorwiegend der Lipoplex oder die enthaltende DNA/RNA als solches
in das Cytosol gelangt ist unklar. Es wird jedoch vermutet, dass
die DNA im Cytosol aus dem Lipoplex freigesetzt wird, da Versuche
scheiterten, durch Mikroinjektion von Lipoplexen direkt in den Zellkern
eine Proteinexpression zu erreichen. Es scheint, als ob die in den
Lipoplexen gebundene DNA dem Transkriptionsapparat nicht zugänglich
ist.
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Handelt
es sich um gegen mRNA gerichtete Antisense Moleküle oder
siRNA, ist der biologische Wirkort erreicht und die Dauer der Wirkung
hängt im wesentlichen von der Konzentration cytosolischer
RNasen und der Rate der Freisetzung aus den Lipo/Polyplexen ab.
DNA kann als solche nicht in den Zellkern eindringen, was als „Nuclear
Barrier” bezeichnet wird. Sie gelangt allerdings während
der Zellteilung an ihren Wirkort und führt so zur Expression
von Proteinen. Als weitere nicht-virale Methoden, die auf chemischen
Methoden basieren, seien Systeme genannt, die ein DNA-bindenden
Molekülteil sowie einen Liganden tragen, der rezeptorvermittelte
Endozytose auszulösen vermag (Beispiel Transferrinfektion).
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Das
bedeutendste Beispiel einer nicht-viralen Methode, die auf einem
physikalischen Verfahren beruht, stellt die Elektroporation dar.
Dabei werden die zu transfizierenden Zellen zwischen zwei Elektroden
verbracht, an die ein typischer Spannungsverlauf angelegt wird.
Auf diese Weise werden die Zellen einem intensiven elektrischen
Stromstoß (Puls) ausgesetzt, der zur einer reversiblen Öffnung
(Poren) der Zellmembran führt. Durch diese Poren können
Substanzen, wie z. B. genetisches Material, die sich in unmittelbarer
Umgebung der Poren befinden in die Zelle eindringen. Der Puls (also
Spannungsverlauf) als einer der wichtigsten Erfolgsparameter muss
für jeden Zelltyp optimiert werden. Es gibt inzwischen
einige kommerzielle Anbieter für Elektroporatoren (z. B.
Eppendorf/Multiporator,
US 6008038 ,
Biorad/Genpulser,
US 4750100 ,
Genetronics Inc.,
US 5869326 ,
BTX/ECM Serie), die speziell für eukariotische Zellen entwickelt
wurden und eine Anpassung der Pulsparameter an den jeweiligen Zelltyp
erlauben. Tatsächlich gibt es inzwischen auch Vorrichtungen die
eine in vivo Applikation möglich machen. Bei der in vitro
Anwendung werden die Zellen in einem Elektroporationspuffer suspendiert,
zusammen mit der zu transfizierenden DNA/RNA in eine mit Elektroden
versehene Elektroporationsküvette verbracht und einem oder
mehreren Pulsen ausgesetzt. Neben dem Spannungsverlauf sind weitere
wichtige Parameter die Beschaffenheit des Puffers, die Temperatur,
die Zellkonzentration und die DNA-Konzentration. Nach dem die Zellen
dem Puls ausgesetzt wurden, lässt man ihnen eine kurze Zeit
zur Regeneration der Zellmembran. Anschließend werden die
Zellen in ein Kulturgefäß ausgesäht und
wie üblich kultiviert.
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Als
weitere physikalische Methoden seien Mikroinjektion, Hydrodynamische
Methoden, ballistische Methoden (Genegun) oder Methoden, die Ultraschall benutzen
genannt oder auch die Injektion nackter DNA in verschiedene Organe,
die zu geringer Expression der entsprechenden Gene führt.
Zu den Verfahren die physikalische Methoden als auch chemische Methoden
vereinen, zählt insbesondere auch die Magnetofektion, die
DNA-bindende Moleküle auf magnetischen Nanoteilchen nutzt
um über eine magnetischen Feldgradienten DNA auch der Oberfläche
von Zellen anzureichern und Endozytose auszulösen
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Den
enormen Möglichkeiten, die das Einbringen von genetischem
Material in eukariotische Zellen mit sich bringt, steht ein Arsenal
von Methoden gegenüber, die nur unbefriedigende Leistungsfähigkeit
aufweisen. Die jeweils spezifisch auftretenden Mängel bis
dato vorhandener Methoden betreffen im Wesentlichen die wichtigen
Parameter Effizienz, Toxizität, Immunogenität,
Targeting, Restriktion bzgl. der Größe des genetischen
Materials, Möglichkeiten der in vivo/in vitro Anwendung,
Möglichkeit von High-Throughput-Anwendungen, Gefahrenpotential,
Einfachheit der Methode und Kosten der Methode. Kein Verfahren ist
in der Lage, alle diese Parameter ausreichend zu erfüllen.
Dem Fehlen eines geeigneten Gen-Carriersystems wird zugeschrieben,
dass sich bis heute trotz erheblicher Forschungsaufwendungen keine
auf Gentherapie beruhende medizinische Therapie etablieren konnte.
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Insbesondere
kann das angeborene Immunsystem von Eukaryoten eine erhebliche Barriere
für nicht-virale Genliefersysteme darstellen. Der Grund
dafür ist, dass das angeborene Immunsystem von Eukaryoten
in der Lage ist, über Toll Like Rezeptoren fremdes genetisches
Material zu erkennen und Signaltransduktionskaskaden anzustoßen,
die einen antiviralen Zustand von Zellpopulationen auslösen.
Ein derartiger antiviraler Zustand einer Zelle stellt auch eine
Barriere für die Transfektion mit einem nicht-viralen Genliefersystem
dar, die kaum bzw. nicht überwunden werden kann.
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So
zeigten beispielsweise repetitive Lipofektionsversuche, bei denen
zunächst eine Transfektion mit einer spezifisch gegen ein
bestimmtes Protein gerichteten siRNA durchgeführt wurde
und anschließend eine Plasmidtransfektion mit einem Reportergen
folgte, dass der Transfektionserfolg der Plasmidtransfektion ausblieb,
obwohl die Zellen einen gesunden Eindruck machten. Nur bei sehr
geringen siRNA Mengen konnte eine geringe Menge des Reporterproteins
detektiert werden.
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Um
auszuschließen, dass es sich um einen OFF-Target-Effekt
der spezifischen siRNA handelt, wurde der Versuch mit einer unspezifischen
siRNA wiederholt, die gegen das humane Erbgut „geblastet” wurde.
Das Ergebnis blieb jedoch dasselbe.
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Da
bekannt ist, dass auch die Proliferation der Zellen einen Einfluss
bei der Lipofektion hat, wurde untersucht, ob die Zellen in Ihrem
Proliferationsverhalten durch die Vortransfektion mit siRNA beeinträchtigt
wurden. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Proliferationsraten
bei höheren siRNA Mengen sinken, jedoch eine ausreichende
Proliferation bei den Experimenten gegeben, war, als die der Vortransfektion
folgende Plasmidtransfektion fehlschlug. Es schien, als ob die Zellen
sich überraschenderweise gegen die zweite Transfektion
wehren können.
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Mit
repetitiven Transfektionsversuchen, bei denen zwei Plasmidtransfektionen
hintereinander geschaltet wurden, konnte ein ähnliches
Ergebnis erhalten werden, wenn auch nicht mit der oben genannten
Deutlichkeit. Der zweite Transfektionschritt war häufig
entweder sehr ineffizient oder kontraproduktiv. Auch hier wurden ähnliche
Untersuchungen, wie oben genannt, durchgeführt, um sicherzustellen,
dass es sich nicht um toxische Effekte handelt. Weitere Untersuchungen
zeigten, dass es zur Aussschüttung von Interferonen kam.
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Beschreibung der Erfindung
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Aufgabe
der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das eine effizientere
Transfektion ermöglicht. Dies gilt sowohl für
eine einfache Transfektion als auch für eine wiederholte,
d. h. mindestens zwei- oder mehrmahlige Transfektion. Weiter stellt
sich die Aufgabe den physiologischen Status der Zellpopulation so
wenig wie möglich zu beeinflussen, d. h. das Protein-Expressionsprofil
der Zellpopulation sollte sich idealerweise nur bezüglich
der Proteine ändern, deren Gene in die Zelle eingeschleust
wurden oder deren Expression durch das eingeschleuste genetische
Material herabgesetzt oder blockiert werden sollte.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren zur Verbesserung des Transfektionsergebnisses, umfassend
die Transfektion mit einem nicht-viralen Genliefersystem und die
zumindest teilweise Unterdrückung der angeborenen intrazellulären
und/oder interzellulären Immunabwehr.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren zur Verbesserung des
Transfektionsergebnisses kann in vitro und/oder in vivo durchgeführt
werden.
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Durch
die zumindest teilweise Unterdrückung der angeborenen intrazellulären
und/oder interzellulären Immunabwehr, d. h. eine der intra-
und/oder interzellulären Signaltransduktionskaskaden der
angeborenen Immunabwehr wird unterbrochen, lässt sich das
Transfektionsergebnis verbessern und/oder unerwünschte Änderungen
des Expressionsprofils einer transfizierten Zelle vermeiden.
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Das
heißt, dass insbesondere die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade
ausgehend von den TLRs, über die Adaptermoleküle, über
die entsprechenden Kinasen, die die Transkriptionsfaktoren phosphorylieren,
welche wiederum über die Aktivierung von Transkriptionfaktoren
die Interferone induzieren, unterbrochen oder geschwächt
werden kann. Weiter kann die Signalübertragung durch Botenstoffe
zwischen den Zellen unterbrochen werden. Da es sich dabei allesamt
um Proteine handelt, werden erfindungsgemäß vorzugsweise
aktivitätssteigernde oder aktivitätsmindernde
Effektoren wie Antikörper, Aptamere, Antagonisten oder Inhibitoren
gegen diese Proteine eingesetzt. Dabei können die entsprechenden
Wirkstoffe als solches oder mit entsprechenden Hilfsmolekülen
an oder in die Zellen verbracht werden, je nach Zellgängigkeit
oder Zielort. So können z. B. Wirkstoffe über
liposomale Carrier in die Endosomen verbracht werden. Ist der Zielort
das Zytosol, bieten sich insbesondere Elektroporation oder spezielle
Peptidsequenzen an, die in der Lage sind, die Zellwände
zu permeabilisieren. Handelt es sich bei den Wirkstoffen um Peptide
oder Proteine, so können diese erfindungsgemäß auch
durch Transfektion geeigneten genetischen Materials intrazellulär
gebildet werden und falls nötig mit Lokalisationssequenzen
zu den entsprechenden Zellkompartimenten dirigiert werden. Will
man über siRNA Gene stilllegen, die für entscheidende
Proteine des Signatransduktionapparates kodieren, stehen erfindungsgemäß die
bekannten Transfektionssysteme zur Verfügung. Das erfindungsgemäße
Verfahren bzw. die erfindungsgemäße Verwendung
kann sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt werden bzw. erfolgen.
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Es
kann dazu angewendet werden die Ausbildung des „antiviralen
Status” von Zellen während der Transfektion zu
verhindern oder auch schon vorher. Da die Zellen bei der Kultivierung
auch mit biologischem Material z. B. Serum oder Trypsin in Verbindung
kommen können, das Stoffe beinhalten kann, auf die ein
oder mehrere TLR ansprechen (z. B. DNA, RNA, LPS etc.), kann es
dazu kommen, dass sich Zellen schon in einem antiviralen Status
befinden, bevor mit der Transfektion begonnen wurde.
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Unter
Beachtung dieses Hintergrundes wird auch verständlich,
warum es als schwierig gilt, Transfektionsergebnisse zu repoduzieren.
Die Qualität von Transfektionsergebnissen hängt
stark vom immunologischen Ausgangszustand der Zellen ab, der wiederum
von der Vorbehandlung (z. B. Subkultivierung) abhängt.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das nicht-virale
Genliefersystem ein kationisches Lipid, ein kationisches Polymer,
ein kationisches Protein oder eine Verbindung umfassen, die eine
DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist und rezeptorvermittelte
Endozytose auslösen kann, oder bei dem das nicht-virale
Genliefersystem insbesondere auf einer physikalischen Methode wie
Elektroporation, Mikroinjektion, Magnetofektion, Ultraschall oder
einer ballistischen oder hydrodynamischen Methode beruht.
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Ferner
kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Transfektion
mindestens zweimal, d. h. zwei- oder mehrfach (3, 4, 5, 6, etc.),
ausgeführt werden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann bei der Transfektion
genetisches Material, insbesondere modifizierte oder unmodifizierte
ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder
unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNA und/oder
modifizierte oder unmodifizierte siRNA eingesetzt werden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die angeborene
Immunabwehr durch mindestens einen Antikörper, Intrabody,
Aptamer, Antagonisten, Inhibitor und/oder eine siRNA, die die Weiterleitung
eines intra- und/oder interzellulären Signals der angeborenen
Immunabwehr blockieren, zumindest teilweise unterdrückt werden.
Entsprechende Antikörper, Intrabodies, Aptamere, Antagonisten
und Inhibitoren sind kommerziell erhältlich.einschränkung?
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Weiterhin
kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren durch
Knock-down mit siRNA zumindest ein Gen ausgeschaltet werden, das
für ein zur Signaltransduktion notwendiges Protein codiert.
Entsprechende siRNA oder Plasmide, die shRNA (short hairpin RNA)
z. B. gerichtet gegen TLRs, Kinasen und Transkriptionsfaktoren sind
teilweisekommerziell erhältlich (Imgenex/Invivogen).
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die angeborene
Immunabwehr auch durch die Aktivierung des Glucocorticoidrezeptors
unmittelbar durch ein Glucocorticoid oder einen Glucocorticoidrezeptor-Antagonisten
oder mittelbar durch einen Glucocorticoidvorläufer oder
Glucocorticoidrezeptor-Antagonistenvorläufer zumindest
teilweise unterdrückt werden.
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Dabei
kann es sich bei dem Glucocorticoid, Glucocorticoidvorläufer,
Glucocorticoidrezeptor-Antagonisten oder Glucocorticoidrezeptor-Antagonistenvorläufer
insbesondere um Cortison, Cortisol, Cloprednol, Prednison, Prednisolon,
Methylprednisolon, Deflazacort, Flourcortolon, Triamcinolon, Dexamethason
oder Betamethason handeln.
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Für
die Unterdrückung der angeborenen Immunabwehr ist der Glucocorticoid-Rezeptor
und seine Agonisten, die Glucocorticoidsteroide (Glucocorticoide)
von besonderer Bedeutung. Diese Glucocorticoide sind sehr leistungsfähige Immunsupressoren
und sind in der Lage auf sehr vielen Stufen in die Signaltransduktionskaskaden
einzugreifen. Das bekannteste Glucocorticoid ist das Cortisol. Häufig
wird auch Cortison eingesetzt, das durch physiologische Prozesse
zu Cortison umgewandelt werden kann. Weitere bekannte zum z. T.
synthetische (also nicht natürliche) Glucocorticoide bzw.
dessen Vorläufersubstanzen sind beispielsweise Cloprednol,
Prednison, Prednisolon, Methylprednisolon, Deflazacort, Flourcortolon,
Triamcinolon, Dexamethason oder Betamethason. Allen diesen Glucocorticoiden
ist gemeinsam, dass sie durch Bindung an den intrazellulären
Glucocorticoidrezeptor, diesen aktivieren.
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Dieser
Rezeptor liegt im Cytosol in einem oligomeren Komplex gebunden an
das Hitzeschockprotein HSP90 vor. Durch die Aktivierung wird der
Rezeptor aus dem Komplex freigelegt. Dabei wird auch ein „nuclear localisation
signal” freigelegt, was eine Translokation der dimeren
Form des Rezeptors in den Zellkern zur Folge hat. Dort bindet der
dimere Rezeptor an spezifische palindromische Nukleotidsequenzen,
sogenannte GRE (Glucocorticoid Response Elements) oder nGRE (negative
GRE). In Abhängigkeit dieser Sequenzen findet die Aktivierung
und Repression nachfolgender Gene statt. In der Regel werden Zytikone
hochreguliert, die immunsupressiv wirken und andere herunterreguliert,
die das angeborene Immunsystem ankurbeln.
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Der
Glucocorticoidrezeptor wirkt jedoch nicht nur selbst als Transkriptionsfaktor
sondern interagiert auch mit einer großen Vielzahl von
Molekülen, die die Transkription regulieren, wie z. B.
HAT, CBP, TBP, RNA Pol II usw. (Histone Acetyltransferase, CREB
Einding Protein, TATA Box-binding Protein, RNA Polymerase-II) oder
die Bestandteile der Signaltransduktionskaskaden des angeborenen
Immunsystems sind, wie z. B. NF-kB und AP-1. Insbesonders werden
auch die MAPK Subgruppen JNK, ERK1, ERK2 und p38 allesamt negativ
reguliert.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann zur zumindest
teilweisen Unterdrückung der angeborenen Immunabwehr mindestens
einer der TLR1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, CD14, CD38,
RIG-I Helikase und/oder RIG-I-like Helikase blockiert werden. Weiterhin
ist es bevorzugt, mehrere der vorstehend genannten Rezeptoren bzw.
Proteine zu blockieren.
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So
sind Antikörper gegen die Toll Like Rezeptoren TLR1, TLR2,
TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 und CD14 bekannt und kommerziell
erhältlich. Diese könnten zusammen mit Endozytose
auslösenden Lipo- oder Polyplexen als solche oder verpackt
in Liposomen in die Endosomen geschleust werden und so die Rezeptoren
blockieren. In der Regel reicht aber auch eine Zugabe zum extrazellulären
Raum. Die Wahl des zu blockierenden Rezeptors hängt erfindungsgemäß natürlich
auch von der Art des zu transfizierenden genetischen Materials ab.
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Aber
auch Inhibitoren bzw. Antagonisten für verschiedene TLRs
sind bekannt und werden erfindungsgemäß in bevorzugter
Weise eingesetzt. So hat man festgestellt, dass bestimmte DNA Sequenzen
viralen Ursprungs den TLR9 Rezeptor blockieren können (Krieg
A. M. et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1998; 95(21); 12631–6);
die entsprechende Offenbarung wird unter Bezugnahme aufgenommen.
Diese DNA Sequenz enthält das Motiv TTAGGG in der Regel
in wiederholter Form. Entsprechende Antisensemoleküle als
nukleaseresistente Phosphorthioate sind ebenfalls kommerziell erhältlich
bei der Firma InvivoGen (San Diego, USA). Dieselbe Firma bietet
auch Plasmide an, die gegen TLRs und TLR-bezogene Gene shRNA codiert
oder verschiedene Inhibitoren für Kinasen wie 2-AminoPurin(PKR/dsRNA
activated Protein Kinase Inhibitor), LY294002 (Phosphatidylinositol
3-Kinase Inhibitor), PD098059 (MAPKK Inhibitor), U0126 (MEK1 und
MEK2 Inhibitor) sowie SB203580 (p38 MAP Kinase/p30RK MAP Kinase/PDK1/PDK2
Inhibitor). Weitere Kinase Inhibitoren sind literaturbekannt und/oder
teilweise auch kommerziell erhältlich (z. B. CNI-1493,
CEP-1347, SB202190, SB220025, SB239063, SP600125).
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann TLR9 mit
mindestens einer modifizierten oder unmodifizierten DNA Sequenz,
insbesondere mit der Rasensequenz TTAGGG blockiert werden.
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Weiterhin
kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zumindest
eines der Adaptermoleküle MyD88, TRIF, TIRAP, TRAM, TRAF6
oder TRAF3 blockiert werden.
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Inhibitoren,
die wichtige Adaptermoleküle wie MyD88, TIRAP, TRAM, TRAF6,
TRAF3 und/oder TRIF attackieren, sind bekannt und zum Teil auch
kommerziell erhältlich und werden erfindungsgemäß in
bevorzugter Weise eingesetzt. So bietet die Firma IMGENEX (San Diego,
USA) beispielsweise ein Peptid an, das die zur Wirkung von MyD88
notwendige Homodimerisierung unterbindet. Das dafür bevorzugte
Peptidmotiv ist RDVLPGT (Loiarro M. et al.; J. Biol. Chem.;
2005; 16; 15809–14). Das kommerziell angebotene
Peptid enthält weiterhin eine PTD Sequenz (protein transduction
sequence), welche das gesamte Peptid zellpermeabel macht (Derossi
D. at al. J. Biol. Chem. 1994, 269; 10444–10459). Ähnliche
Produkte bietet die Firma Imgenex gegen die Adaptermoleküle
TIRAP, TRAF6, den Transkriptionsfaktor NF-kB und die Kinasen IKKgamma
und ERK an, die ebenfalls erfindungsgemäß in bevorzugter
Weise eingesetzt werden. Dieselbe Firma bietet im Übrigen
auch gegen MyD88 gerichtete Antikörper an, die erfindungsgemäß eingesetzt
werden können.
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Erfindungsgemäß kann
das Adaptermolekül Myd88 durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv
DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT oder Teilen desselben blockiert werden.
Als Teil desselben wird hierbei ein Peptid verstanden, das
- – mindestens in 10 aufeinanderfolgenden
Aminosäuren identisch zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv
ist; oder
- – mindestens zu 80%, insbesondere mindestens zu 90%
identisch ist zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv; oder
- – mindestens in 6, 7, 8 oder 9 von 10 aufeinanderfolgenden
Aminosäuren identisch ist zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv.
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Erfindungsgemäß kann
das Adaptermolekül TRAF6 durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv
DRQIKIWFQNRRMKWKKRKIPTEDEY oder Teilen desselben blockiert werden.
Als Teil desselben wird hierbei ein Peptid verstanden, das
- – mindestens in 10 aufeinanderfolgenden
Aminosäuren identisch zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv
ist; oder
- – mindestens zu 80%, insbesondere mindestens zu 90%
identisch ist zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv; oder
- – mindestens in 6, 7, 8 oder 9 von 10 aufeinanderfolgenden
Aminosäuren identisch ist zu dem vorstehend genannten Strukturmotiv.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ferner zumindest
eine der Kinasen IRF-Kinase TBK1, MAP Kinase, MAPK Kinase, MAPK
Kinase, MAPKK Kinase, MAPKKK Kinase, MEK1, MEK2, MEK5, MKK4/SEK,
MKK5, MKK7, ERK1, ERK2, ERK3, ERK4, ERK5, ERK6, ERK7, ERK8, JAK,
JNK1, JNK2, p38 MAP Kinase, RK, p38/RK MAP Kinase, p30/RK MAP Kinase,
Phosphatidylinositol 3-Kinase, IRAK-1, IRAK-4, IKK-alpha, IKK-beta,
IKKgamma, IKK delta, IKK epsilon, TAK1, PKB Kinase, PKD1, PKD2,
MSK1 oder PKR blockiert werden. Weiterhin ist es bevorzugt, mehrere
der vorstehend genannten Kinasen zu blockieren.
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Erfindungsgemäß kann
die Kinase p38 MAPK und/oder PKB durch 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol
(SB203580) blockiert werden.
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Weiterhin
kann erfindungsgemäß die Kinase MEK1 und/oder
MEK2 durch 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-amionophenylmercapto)butadien
(U0126) blockiert werden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ferner zumindest
einer der Transkriptionsfaktoren IRF1, IRF3, IRF7, IRF9, IRF2, IRF4,
IRF5, IRF6, IRF8, STAT1, STAT2, NF-kB oder AP-1 blockiert werden.
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Erfindungsgemäß kann
der Transkriptionsfaktor NF-kB durch ein Peptid mit dem Strukturmotiv
DRQIKIWFQNRRMKWKKVQRKRQKLM oder Teilen desselben blockiert werden.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren kann auch zumindest
ein Zytokin, zumindest ein Tumornekrosefaktor (TNF), zumindest ein
Interleukin und/oder zumindest ein Interferon blockiert werden.
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Als
zu blockierendes Interferon kommt beispielsweise ein Interferon
des Typs I, insbesondere zumindest eines der Interferone, ausgewählt
aus Interferon-alpha, Interferon-beta, Interferon-gamma oder Interferon-omega
in Betracht. Als zu blockierendes Interleukin kommt insbesondere
Interleukin-1 in Betracht.
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Auch
kann zumindest ein Rezeptor für Zytokine blockiert werden,
insbesondere zumindest ein Rezeptor für Interferone, insbesondere
des Typs I, zumindest ein Rezeptor für Interleukine, und/oder
zumindest ein Rezeptor für Tumornekrosefaktoren.
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In
einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden mehrere
der vorstehend erwähnten Rezeptoren und/oder Proteine,
die an der Signaltransduktionskaskade zur Auslösung der
angeborenen intra- und/oder interzellulären Immunabwehr
beteiligit sind, blockiert. So können beispielsweise mehrere
Antikörper gegen TLR-Rezeptoren kombiniert werden, um additive
Effekte und/oder Synergieeffekte zu nutzen. Ebenso können beispielsweise
auch Inhibitoren und/oder Antikörper, und/oder Intrabodys,
und/oder Aptamere, und/oder Antagonisten, und oder siRNA gegen TLR-Rezeptoren
und/oder TLR assistierende Proteine und/oder Adaptermoleküle
und/oder Kinasen und/oder Transkriptionsfaktoren und/oder Zytokine
und/oder Zytokinrezeptoren kombiniert werden, um die Signaltransduktionskaskade
der angeborenen Immunabwehr zumindest teilweise zu unterbrechen.
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Erfindungsgemäß wird
ferner eine Zusammensetzung bereitgestellt, die zumindest zwei der
folgenden Komponenten umfasst:
- a) ein nicht-virales
Genliefersystem,
- b) einen Wirkstoff, und
- c) ein Mittel zur Verringerung der angeborenen Immunabwehr.
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Auch
wird erfindungsgemäß ein Kit of Parts vorgesehen,
der zumindestzwei der folgenden Komponenten umfasst:
- a) ein nicht-virales Genliefersystem,
- b) einen Wirkstoff, und
- c) ein Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung
der angeborenen Immunabwehr.
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Erfindungsgemäß umfasst
das nicht-virale Genliefersystem insbesondere ein kationisches Lipid,
ein kationisches Polymer, ein kationisches Protein und/oder eine
Verbindung, die eine DNA und/oder RNA-bindende Domäne aufweist
und rezeptorvermittelte Endozytose auslösen kann.
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Erfindungsgemäß kann
als Wirkstoff beispielsweise ein Wirkstoff zur Reparatur eines Gendefekts,
z. B. genetisches Material, insbesondere modifizierte oder unmodifizierte
ssDNA, modifizierte oder unmodifizierte dsDNA, modifizierte oder
unmodifizierte ssRNA, modifizierte oder unmodifizierte dsRNS und/oder
modifizierte oder unmodifizierte siRNA eingesetzt werden.
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Das
Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen
Immunabwehr kann zumindest einen aktivitätsmindernden oder
aktivitätssteigernden Effektor, einen Antikörper,
Intrabody, Aptamer, Antagonist, Inhibitor und/oder eine siRNA umfassen,
insbesondere einen Antikörper, Intrabody, Aptamer, Antagonisten,
Inhibitor und/oder eine siRNA, welche(r) zumindest eine Signaltransduktionskaskade
des angeborenen Immunsystems blockiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mittel zur
zumindest teilweisen Unterdrückung der angeborenen Immunabwehr
ferner die Rasensequenz TTAGGG.
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Auch
kann das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung
der angeborenen Immunabwehr genetisches Material umfassen, das einen
Knock-down eines Proteins einer Signaltransduktionskaskade des angeborenen
Immunsystems bewirkt oder das zur Expression eines Proteins führt,
welches die Aktivität eines Proteins in einer Signaltransduktionskaskade
des angeborenen Immunsystems blockiert.
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Weiterhin
kann das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung
der angeborenen Immunabwehr zumindest ein Peptid:
- (i)
DRQIKIWFQNRRMKWKKVQRKRQKLM;
- (ii) DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT; oder
- (iii) DRQIKIWFQNRRMKWKKRKIPTEDEY; oder
- (iv) eine Kombination aus mindestens zwei der Peptide (i) bis
(iii); oder
- (v) ein Peptid, das mindestens in 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren
identisch zu (i), (ii) oder (iii) ist; oder
- (vi) ein Peptid, das mindestens zu 80%, insbesondere mindestens
zu 90% identisch ist zu (i), (ii), oder (iii); oder
- (vii) ein Peptid, das in mindestens 6, 7, 8 oder 9 von 10 aufeinanderfolgenden
Aminosäuren identisch ist zu (i), (ii) oder (iii) umfassen.
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Ferner
kann das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung
der angeborenen Immunabwehr Cortison, Cortisol, Cloprednol, Prednison,
Prednisolon, Methylprednisolon, Deflazacort, Flourcortolon, Triamcinolon,
Dexamethason oder Betamethason oder ein anderes Glucocorticoid oder
einen anderen Glucocorticoidrezeptoragonist oder einen anderen Glucocoriciodvorläufer
oder einen anderen Glucocorticoidrezeptoragonisten-Vorläufer
umfassen.
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Weiterhin
kann das Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung
der angeborenen Immunabwehr 4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol
(SB203580) oder 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-amionophenylmercapto)butadien
(U0126) umfassen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform können mehrere
der vorstehend genannten Mittel zur zumindest teilweisen Unterdrückung
der Immunabwehr miteinander kombiniert werden, d. h. es können
zwei, drei oder mehrere Komponenten der Komponente c) eingesetzt
werden. Ebenso ist es möglich mehrere der vorstehend genannten
Komponenten a) und/oder b) und/oder c) einzusetzen.
-
Bei
dem erfindungsgemäßen Kit of parts können:
- – alle Komponenten getrennt voneinander
vorliegen, oder
- – die Komponenten a) und b) gemeinsam, oder
- – die Komponenten a) und c) gemeinsam, oder
- – die Komponenten b) und c) gemeinsam vorliegen.
-
So
können die Komponenten entweder getrennt voneinander z.
B. in Glas- oder Plastikbehälter vorliegen, die gemeinsam
verpackt sind, oder die Komponenten können zu zweit oder
zu mehreren in entsprechenden Behältern bereitgestellt
werden.
-
Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung und/oder der
erfindungsgemäße Kit of Parts können
zur Durchführung eines erfindungsgemäßen
Verfahrens eingesetzt werden.
-
Ferner
kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung als
pharmazeutische Zusammensetzung vorliegen.
-
Weiterhin
kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung oder
Kit of Parts zur Behandlung einer Krankheit durch Gentherapie verwendet
werden.
-
Bei
der Krankheit kann es sich beispielsweise um cystische Fibrose,
Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie,
Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie,
Hämophilie, β-Thalassämie, Krebs, eine
Viruserkrankung, eine Degeneration der Macula, Amyotropische Lateral-Sklerose
und/oder eine Entzündungserkrankung handeln.
-
Die
vorliegende Erfindung kann auch dazu genutzt werden Transfektionen
durchzuführen, ohne das Expressionprofil der Zellen in
einem ungewünschten Ausmaß zu verändern.
Von besonderem Interesse ist dies bei in vivo Anwendungen, da hier
die Aktivierung des Immunsystems häufig ein Problem darstellt.
-
Besonders
auch bei der Untersuchung von Signaltransduktionswegen durch den
Knockdown eines beteiligten Proteins durch siRNA ist es unerwünscht,
dass übrige Expressionsprofil der Zelle unnötig
zu verändern, insbesondere da bekannt ist, dass die Signaltransduktionskaskaden
sich gegenseitig häufig beeinflussen.
-
Beispiele
-
Allgemeines
Material:
- 1. Hela Zellen
- 2. Metafectene Pro, T040-1.0, Biontex Laborstories
- 3. 24-Well-Platte, TPP, Produktnummer 92024
- 4. 48-Well-Platten, Corning Inc., Costar, Produktnummer 3548
- 5. DMEM, PAA, Kat-Nr. E15-883
- 6. FCS Mycoplex, PAA, Kat-Nr. E15-773
- 7. pCMV-lacZ, Produktnr.: PF462-060207, Plasmidfactory, c =
1 mg/ml in WFI
- 8. β-Galaktosidase Assay Kit, Stratagene
-
Beispiel 1
-
Material:
-
- 1. Sheep Polyclonal Antibody against human IFNβ,
PBL Biomedical Laborstories, Product Number 31400-1, 0,25 mg/ml
(estimate), 2 × 104 Units/ml.
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesät. Dabei
wird eine Zellzahl von 2,3·105 Zellen
in ein Well in 500 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%)
inkubiert.
-
2. Tag:
-
Zunächst
wird der Antikörper (Sheep Polyclonal Antibody against
human IFNβ) aufgetaut. Anschließend wird er mit
400 μl PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt und sanft
gemischt. Er hat jetzt eine Konzentration von 0,05 μg/μl.
Anschließend werden die Wells der 24 Well Platte mit folgenden
Mengen Antikörper versorgt:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A | 0 μg
(0 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 3 μg
(60 μl) |
B | 0 μg
(0 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 3 μg
(60 μl) |
C | 0 μg
(0 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 3 μg
(60 μl) |
D | 0 μg
(0 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 3 μg
(60 μl) |
-
Anschließend
wird im Inkubator für 0,5 h inkubiert. Derweilen werden
die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 26 μl DNA (pCMV-lacZ)
in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und
Abpipettieren gemischt. 104 μl Metafectene Pro werden ebenfalls
in 1300 μl PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und
Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen gemischt
und 15 min inkubiert.
-
Am
Ende werden jeweils 100 μl der Lipoplexlösung
in jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem
CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
Am
dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte
Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen
wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
Die
Effizienz der Transfektion wird mit dem β-Galaktosidase
Assay Kit nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die
Platten werden so lange entwickelt bis im Mikroplate-Reader eine
Gelbfärbung mit einer Absorption von 1–2 gemessen
wird und anschließend sofort gestoppt. Die Inkubationszeit
wird anschließend notiert. Die Werte werden mit dem Mikroplate-Reader
ausgelesen, und der Mittelwert gebildet.
-
Ergebnis:
-
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A | 0,717 | 0,689 | 0,650 | 0,652 | 0,635 | 0,509 |
B | 0,668 | 0,672 | 0,690 | 0,679 | 0,714 | 0,525 |
C | 0,858 | 0,823 | 1,228 | 1,690 | 1,852 | 0,975 |
D | 1,501 | 1,805 | 1,518 | 1,886 | 2,017 | 1,909 |
-
Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A&B/2 | 0,6925 | 0,6805 | 0,6700 | 0,6655 | 0,6745 | 0,5170 |
C&D/2 | 1,1810 | 1,3140 | 1,3730 | 1,7880 | 1,9345 | 1,4420 |
-
-
Beispiel 2
-
Material:
-
1.
Mouse monoclonal Antibody against Human Interferone Alpha/Beta Receptor
Chain 2 (CD118), clone MMHAR-2, Isotype Ig2a, C = 0,5 mg/ml in PBS
(Phosphat buffered saline) containing 0,1% bovine serum albumin
(BSA), PBL Biomedical Laborstories, Product-No: 21385
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
-
Abweichungen:
-
Zunächst
wird der Antikörper (Mouse monoclonal Antibody against
Human Interferone Alpha/Beta Receptor Chain) mit 400 μl
PBS (Phosphate Buffered Saline) versetzt und sanft gemischt. Er
hat jetzt eine Konzentration von 0,1 μg/μl.
-
Die
Wells der 24 Well Platte werden mit folgenden Mengen Antikörper
versorgt:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A | 0 μg
(0 μl) | 0,5 μg
(5 μl) | 1 μg
(10 μl) | 2 μg
(20 μl) | 3 μg
(30 μl) | 6 μg
(60 μl) |
B | 0 μg
(0 μl) | 0,5 μg
(5 μl) | 1 μg
(10 μl) | 2 μg
(20 μl) | 3 μg
(30 μl) | 6 μg
(60 μl) |
C | 0 μg
(0 μl) | 0,5 μg
(5 μl) | 1 μg
(10 μl) | 2 μg
(20 μl) | 3 μg
(30 μl) | 6 μg
(60 μl) |
D | 0 μg
(0 μl) | 0,5 μg
(5 μl) | 1 μg
(10 μl) | 2 μg
(20 μl) | 3 μg
(30 μl) | 6 μg
(60 μl) |
-
Die
Lipoplexzugabe erfolgt nach 5 h Inkubationszeit mit dem Antikörper
-
Ergebnis:
-
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A | 1,269 | 1,113 | 1,163 | 1,185 | 1,214 | 1,084 |
B | 1,132 | 1,102 | 1,088 | 1,229 | 1,113 | 1,154 |
C | 1,127 | 1,438 | 1,533 | 1,378 | 1,504 | 1,367 |
D | 1,395 | 1,393 | 1,377 | 1,417 | 1,459 | 1,467 |
-
Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A&B/2 | 1,2005 | 1,1075 | 1,1255 | 1,2070 | 1,1635 | 1,1190 |
C&D/2 | 1,2610 | 1,4155 | 1,4550 | 1,3975 | 1,4815 | 1,4170 |
-
-
Beispiel 3
-
Material:
-
- 1. ODN (Full PTO = Phosphothioatoligo): Seq.: 5'TTT AGG
GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3'; 0,2 μmol synthesis scale,
Purification: HPLC + NAP, lyophilisiert, 213,8 μg; TLR9
Antagonist
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
-
2. Tag:
-
Zunächst
wird der TLR9 Antagonist (ODN). Anschließend wird es in
956 μl sterilem bidest Wasser gelöst. Er hat jetzt
eine Konzentration von 0,25 μg/μl.
-
Lipoplexherstellung:
-
Lipoplexe
folgender Zusammensetzung werden für die Zellen der jeweiligen
Wells der 24 Well Platte mit den Zellen hergestellt (DNA = pCMV-LacZ;
ODN = TLR9 Antagonist):
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,0 μg
(0,0 μl)
ODN
2,0 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,1 μg
(0,4 μl)
ODN
2,4 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,2 μg
(0,8 μl)
ODN
2,8 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,3 μg
(1,2 μl)
ODN
3,2 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,4 μg
(1,6 μl)
ODN
3,6 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,5 μg
(2,0 μl)
ODN
4,0 μl
M.
Pro |
| 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,0 μg
(0,0 μl)
ODN
2,0 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,1 μg
(0,4 μl)
ODN
2,4 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,2 μg
(0,8 μl)
ODN
2,8 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,3 μg
(1,2 μl)
ODN
3,2 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,4 μg
(1,6 μl)
ODN
3,6 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,5 μg
(2,0 μl)
ODN
4,0 μl
M.
Pro |
| 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,0 μg
(0,0 μl)
ODN
2,0 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,1 μg
(0,4 μl)
ODN
2,4 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,2 μg
(0,8 μl)
ODN
2,8 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,3 μg
(1,2 μl)
ODN
3,2 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,4 μg
(1,6 μl)
ODN
3,6 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,5 μg
(2,0 μl)
ODN
4,0 μl
M.
Pro |
| 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,0 μg
(0,0 μl)
ODN
2,0 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,1 μg
(0,4 μl)
ODN
2,4 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,2 μg
(0,8 μl)
ODN
2,8 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,3 μg
(1,2 μl)
ODN
3,2 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,4 μg
(1,6 μl)
ODN
3,6 μl
M.
Pro | 0,5 μg
(0,5 μl)
DNA
0,5 μg
(2,0 μl)
ODN
4,0 μl
M.
Pro |
-
Die
DNA für jedes Well wird in 100 μl PBS gelöst
und die entsprechende Menge ODN zupipettiert und gemischt. Anschließend
werden die entsprechenden Mengen Metafectene Pro zupipettiert und
nochmals gemischt. Danach wird für 15 min inkubiert und
die Lipoplexe auf die Zellen in den korrespondierenden Wells gegeben.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
Am
dritten Tag wird das Medium der Zeilen C und D erneuert. Die Schritte
Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen
wiederholt.
-
Des
Weiteren werden bei den Zeilen A und B je 500 μl Medium
in die Wells hinzugegeben.
-
Anschließend
wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
-
Ergebnis:
-
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A | 0,431 | 0,400 | 0,448 | 0,404 | 0,419 | 0,566 |
B | 0,415 | 0,453 | 0,419 | 0,435 | 0,696 | 0,543 |
C | 0,573 | 0,966 | 0,748 | 1,054 | 0,820 | 1,234 |
D | 0,778 | 0,898 | 1,312 | 1,302 | 1,195 | 1,352 |
-
Die
Zeilen A und B stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Zeilen C und D stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A&B/2 | 0,4230 | 0,4265 | 0,4335 | 0,4195 | 0,5570 | 0,5545 |
C&D/2 | 0,6575 | 0,9320 | 1,0300 | 1,1780 | 1,0075 | 1,2930 |
-
-
Beispiel 4
-
Der
TLR7, 8 und 9 detektieren fremde RNA oder DNA in den Endosomen.
Auf deren cytosolischer Seite bindet das Adaptermolekül
MyD88. Dieses Protein besteht aus zwei Proteinketten, die durch
Homodimerierung das biologisch aktive Adaptormolekül bilden.
Peptide mit dem Sequenzmotiv RDVLPGT verhindern diese Homodimerisierung,
indem sie selbst an die Monomeren binden. Diese Peptide sind allerdings
in der Regel nicht zellgängig. Sie können aber
mit einer „Protein transduction sequence” (PTO)
versehen werden. Eine solche Sequenz ist z. B. DRQIKIWFQNRRMKWKK.
Das komplette Peptid ist damit in der Lage in Zellen einzudringen
und die Signaltransduktion der TLRs zu unterbindet. Ein solches
komplettes Peptid wird von der Firma Imgenex kommerziell angeboten.
-
Material:
-
- 1. Imgenex, MyD88 homodimerisation Inhibitory Peptide Set,
Product Nr. IMG, 2005-1, 2 mg, lyophilisiert, MW 3100, Sequence:
DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 24 Well Platte ausgesäht. Dabei
wird eine Zellzahl von 1,5·105 Zellen in
ein Well in 200 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
Vorbereiten des Inhibitors:
-
Von
dem MyD88-Homodimerisation-Inhibitor Peptid wird, den Angaben des
Herstellers folgend, eine 5 mM Lösung in PBS hergestellt.
-
Anschließend
werden die Wells mit folgenden Mengen Inhibitor versorgt, um die
entsprechenden Konzentrationen einzustellen:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A | 0 μl
(0 μM) | 2 μl
(50 μM) | 4 μl
(100 μM) | 8 μl
(200 μM) | 12 μl
(300 μM) | 16 μl
(400 μM) |
-
Anschließend
wird für 24 h im CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
2. Tag:
-
Zuerst
werden 300 μl komplettes Medium zu jedem Well gegeben.
-
Darauf
folgend werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl
DNA (pCMV-lacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes
Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro
werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch
sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Anschließend werden
beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert. Am Ende werden
jeweils 100 μl der Lipoplexlösung in jedes Well
gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
-
Ergebnis:
-
-
Mittelwert aller 3 Messungen
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
A | 0,850 | 1,120 | 1,268 | 1,555 | 1,518 | 1,442 |
-
-
Beipiel 5
-
- Weitere Versuche mit Antikörpern gegen Rezeptoren & Zytokine
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei
wird eine Zellzahl von 1,2·105 Zellen
in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%)
inkubiert.
-
2. Tag:
-
Der
Antikörper wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,05 μg/μl
eingestellt. Anschließend werden die Wells der 48 Well
Platte mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 0 μg
(0 μl) | 0 μg
(0 μl) | 0 μg
(0 μl) | 0 μg
(0 μl) |
B | 0,25 μg
(5 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,25 μg
(5 μl) | 0,25 μg
(5 μl) |
C | 0,5 μg
(10 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 0,5 μg
(10 μl) | 0,5 μg
(10 μl) |
D | 1 μg
(20 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1 μg
(20 μl) | 1 μg
(20 μl) |
E | 1,5 μg
(30 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 1,5 μg
(30 μl) | 1,5 μg
(30 μl) |
F | 3 μg
(60 μl) | 3 μg
(60 μl) | 3 μg
(60 μl) | 3 μg
(60 μl) |
-
Anschließend
wird im Inkubator je nach Antikörper für 5 oder
0,5 h inkubiert. Anschließend werden die Lipoplexe hergestellt.
Dazu werden 13 μl DNA (pCMV-lacZ) in 650 μl PBS
einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt.
52 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 650 μl
PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt.
Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
-
Am
Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in
jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
Am
dritten Tag wird das Medium der Spalten 3 und 4 erneuert. Die Schritte
Lipoplexherstellung und Transfektion werden für diese Zeilen
wiederholt. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator
(10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
- Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
-
Ergebnisse:
-
Antikörper:
-
- Mouse Anti-human-CD282 Antibody (= anti TLR2), monoclonal,
AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2484EL
- Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion:
5 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 0,65 | 0,66 | 1,08 | 1,18 |
B | 0,61 | 0,68 | 1,12 | 1,07 |
C | 0,72 | 0,70 | 1,70 | 1,21 |
D | 0,67 | 0,76 | 1,82 | 1,34 |
E | 0,67 | 0,86 | 1,62 | 1,66 |
F | 0,64 | 0,67 | 1,56 | 1,34 |
-
Die
Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| A | B | C | D | E | F |
1&2/2 | 0,65 | 0,64 | 0,71 | 0,71 | 0,76 | 0,65 |
3&4/2 | 1,13 | 1,09 | 1,45 | 1,58 | 1,65 | 1,45 |
-
-
Antikörper:
-
- Mouse Anti-humanTLR3 Antibody, monoclonal, Lifespan Biosciences
Kat-nr.: IS-C18685
- Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion:
5 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5,5
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 0,72 | 0,64 | 1,30 | 1,32 |
B | 0,64 | 0,67 | 1,42 | 1,30 |
C | 0,75 | 0,73 | 1,54 | 1,59 |
D | 0,75 | 0,86 | 1,71 | 1,69 |
E | 0,89 | 0,82 | 1,65 | 1,95 |
F | 0,76 | 0,82 | 1,83 | 1,65 |
-
Die
Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| A | B | C | D | E | F |
1&2/2 | 0,68 | 0,65 | 0,74 | 0,80 | 0,85 | 0,79 |
3&4/2 | 1,31 | 1,36 | 1,56 | 1,70 | 1,80 | 1,74 |
-
-
Antikörper:
-
- Mouse Anti-human-CD284 Antibody (= anti TLR4), monoclonal,
AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2061EL
- Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion:
5 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 5,5
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 0,65 | 0,65 | 1,03 | 1,22 |
B | 0,67 | 0,65 | 1,44 | 1,67 |
C | 0,74 | 0,64 | 1,42 | 1,17 |
D | 0,78 | 0,69 | 1,57 | 1,38 |
E | 0,74 | 0,73 | 1,59 | 1,63 |
F | 0,78 | 0,71 | 1,82 | 1,56 |
-
Die
Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| A | B | C | D | E | F |
1&2/2 | 0,65 | 0,66 | 0,69 | 0,73 | 0,73 | 0,74 |
3&4/2 | 1,12 | 1,55 | 1,29 | 1,47 | 1,61 | 1,69 |
-
-
Antikörper:
-
- Antikörper: Mouse Anti human TLR1 Antibody (monoclonal,
0.05% Natriumazid, 100 μg Lyophilisat); Invivogen, No.
Mab-htlr1.
- Zur Entfernung des Natriumazides wurde der Antikörper
gegen PBS dialysiert:
Dialysemembran: Spectra/Por DispoDialyser
(500 μl, Celluloseestermembran, 25000 Da Molecular Weight Cut-Off);
Spectrum Laborstories; No. 135492, Lot 3224004.
- Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion:
5 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 4
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 1,055 | 1,225 | 1,683 | 1,627 |
B | 1,354 | 1,328 | 1,905 | 1,798 |
C | 1,346 | 1,516 | 2,033 | 1,914 |
D | 1,401 | 1,367 | 2,106 | 1,827 |
E | 1,260 | 1,488 | 2,063 | 1,841 |
F | 1,085 | 1,020 | 1,816 | 1,712 |
-
Die
Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| A | B | C | D | E | F |
1&2/2 | 1,140 | 1,341 | 1,431 | 1,384 | 1,374 | 1,053 |
3&4/2 | 1,655 | 1,852 | 1,974 | 1,966 | 1,952 | 1,764 |
-
-
Antikörper:
-
- Bender Medsystems, Anti-human IFN-omega Antikörper,
monoclonal, 100 μg in 100 μl PBS (c = 1 μg/μl),
azide free, Kat-nr.: BMS155 (Anikörper-online: ABIN 123937).
- Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion:
0,5 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 12 min
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 0,51 | 0,52 | 1,26 | 1,47 |
B | 0,50 | 0,50 | 1,27 | 1,19 |
C | 0,49 | 0,51 | 1,14 | 1,18 |
D | 0,47 | 0,50 | 1,32 | 1,42 |
E | 0,50 | 0,53 | 1,45 | 1,46 |
F | 0,55 | 0,57 | 1,71 | 2,18 |
-
Die
Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| A | B | C | D | E | F |
1&2/2 | 0,51 | 0,50 | 0,50 | 0,48 | 0,51 | 0,56 |
3&4/2 | 1,36 | 1,23 | 1,16 | 1,37 | 1,45 | 1,94 |
-
-
Beispiel 6
-
- Weitere Versuche mit Antagonisten
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
-
2. Tag:
-
Der
Antagonist wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,025 μg/μl
eingestellt. Anschließend werden die Wells der 48 Well
Platte mit folgenden Mengen Antikörper versorgt:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 0
ng (0μl) | 0
ng (0 μl) | 0
ng (0μl) | 0
ng (0 μl) |
B | 0,0625
ng (2.5 μl) | 0,0625
ng (2.5 μl) | 0,0625
ng (2.5 μl) | 0,0625
ng (2.5 μl) |
C | 0,125
ng (5 μl) | 0,125
ng (5 μl) | 0,125
ng (5 μl) | 0,125
ng (5 μl) |
D | 0,250
ng (10 μl) | 0,250
ng (10 μl) | 0,250
ng (10 μl) | 0,250
ng (10 μl) |
E | 0,375
ng (15 μl) | 0,375
ng (15 μl) | 0,375
ng (15 μl) | 0,375
ng (15 μl) |
F | 0,75
ng (30 μl) | 0,75
ng (30 μl) | 0,75
ng (30 μl) | 0,75
ng (30 μl) |
-
Anschließend
wird im Inkubator für 7 inkubiert. Anschließend
werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 13 μl DNA
(pCMV-lacZ) in 650 μl PBS einpipettiert und durch sanftes
Auf- und Abpipettieren gemischt. 52 μl Metafectene Pro
werden ebenfalls in 650 μl PBS einpipettiert und durch
sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen
gemischt und 15 min inkubiert.
-
Am
Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in
jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
- Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
-
Ergebnisse:
-
Antagonist:
-
- Human Interleukin-1 Receptor Antagonist (IL1-ra Human),
Biomol, Kat.-Nr.: 54592
- Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion:
7 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 10
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 0,436 | 0,433 | 0,932 | 0,820 |
B | 0,427 | 0,448 | 0,791 | 1,021 |
C | 0,415 | 0,435 | 0,856 | 1,185 |
D | 0,393 | 0,439 | 1,035 | 1,026 |
E | 0,392 | 0,460 | 1,076 | 1,081 |
F | 0,443 | 0,455 | 1,161 | 1,207 |
-
Die
Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| A | B | C | D | E | F |
1&2/2 | 0,435 | 0,437 | 0,425 | 0,416 | 0,426 | 0,449 |
3&4/2 | 0,876 | 0,906 | 1,020 | 1.030 | 1,078 | 1,184 |
-
-
Beispiel 7
-
Weiterer
Versuch mit einem Kinase-Inhibitor:
-
- p38 MAP Kinase Inhibitor und PKB Kinase Inhibitor:
4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazol,
SB203580, MW = 377,44, 5 mg, Invivogen, Kat.-Nr.: tlrl-sb20.
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei
wird eine Zellzahl von 0,8·105 Zellen
in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%)
inkubiert.
-
2. Tag:
-
1
mg Inhibitor wird in 20 μl DMSO gelöst (Stocklösung).
Anschließend wird mit PBS 1:100 verdünnt (Arbeistlösung).
Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden
Mengen Inhibitor versorgt:
| F | E | D | C | B | A |
1 | 0 μM
(0 μl) | 5 μM
(0,95 μl) | 10 μM
(1,9 μl) | 20 μM
(3,8 μl) | 25 μM
(4,75 μl) | 30 μM
(5,7 μl) |
-
Anschließend
wird im Inkubator für 2 h inkubiert. Anschließend
werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 5 μl DNA
(pCMV-lacZ) in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes
Auf- und Abpipettieren gemischt. 20 μl Metafectene Pro
werden ebenfalls in 250 μl PBS einpipettiert und durch
sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen
gemischt und 15 min inkubiert.
-
Am
Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in
jedes Well gegeben. Anschließend wird 48 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
- Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
-
Ergebnisse:
-
- Vorinkubationszeit mit dem Inhibitor vor der Transfektion:
2 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 9
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| F | E | D | C | B | A |
1 | 1,01 | 1,16 | 1,18 | 1,28 | 1,36 | 1,48 |
-
-
Beispiel 8
-
Weiterer
Versuch mit einem Kinase-Inhibitor:
- MEK1 und MEK2 Inhibitor:
U0126,
1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(o-amionophenylmercapto)butadiene,
MW = 380,5, Invivogen, Kat.-Nr.: tlr-u0126.
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei
wird eine Zellzahl von 0,8·105 Zellen
in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%)
inkubiert.
-
2. Tag:
-
1
mg Inhibitor wird in 100 μl DMSO gelöst (Stocklösung).
Anschließend wird mit PBS 1:20 verdünnt (Arbeistlösung).
Anschließend werden die Wells der 48 Well Platte mit folgenden
Mengen Inhibitor versorgt:
| F | E | D | C | B | A |
1 | 0 μM
(0 μl) | 5 μM
(0,95 μl) | 10 μM
(1,9 μl) | 25 μM
(4,75 μl) | 50 μM
(9,5 μl) | 75 μM (14,25 μl) |
-
Anschließend
wird im Inkubator für 2 h inkubiert. Anschließend
werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 5 μl DNA
(pCMV-lacZ) in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes
Auf- und Abpipettieren gemischt. 20 μl Metafectene Pro
werden ebenfalls in 250 μl PBS einpipettiert und durch
sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen
gemischt und 15 min inkubiert.
-
Am
Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in
jedes Well gegeben. Anschließend wird 48 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
Am
dritten Tag wird das Medium erneuert und die in der Tabelle angegebenen
Inhibitormengen ersetzt. Die Schritte Lipoplexherstellung und Transfektion
werden ohne Inkubationszeit wiederholt. Anschließend wird 24
h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
- Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
-
Ergebnisse:
-
- Vorinkubationszeit mit dem Inhibitor vor der Transfektion:
2 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 10
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| F | E | D | C | B | A |
1 | 0,63 | 0,72 | 0,92 | 0,79 | 0,90 | 0,97 |
-
Beispiel 9
-
Weiterer
Versuch mit Inhibitoren gegen die Adaptermoleküle TRAF6,
MyD88, und den Transkriptionsfaktor NF-kB:
- TRAF6 Inhibitory
Peptide, Imgenex, Product Nr.: IMG 2002,
Sequence: DRQIKIWFQNRRMKWKKRKIPTEDEY,
MW 3494,
Control-Peptide: DRQIKIWFQNRRMKWKK, MW 2361.
- NF-κB p50 (NLS) Inhibitory Peptide, Imgenex, Product
Nr.: IMG 2004,
Sequence: DRQIKIWFQNRRMKWKKVQRKRQKLM, MW 3529.
- MyD88 Inhibitory Peptide, Imgenex, Product Nr.: IMG 2005,
Sequence:
DRQIKIWFQNRRMKWKKRDVLPGT, MW 3100,
- μ-Slide, ibidi, 80606.
- Plasmid: pCMV-GFP, PlasmidFactory, Produktnr.: PF463-06020,
c = 1 mg/ml in WFI.
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei
wird eine Zellzahl von 0,8·105 Zellen
in ein Well in 125 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%)
inkubiert.
-
Von
den Inhibitoren und von dem Control-Peptide werden 5 mM Lösungen
in PBS hergestellt.
-
Anschließend
werden die Wells der 48 Well Platte nach folgender Tabelle mit 5 μl
Inhibitor oder Control-Peptide versorgt. Die Zeile „leer” bleibt
unbehandelt:
| | A |
TRAF6 | 8 | 200 μM
(5 μl) |
NF-κB | 7 | 200 μM
(5 μl) |
My-D88 | 6 | 200 μM
(5 μl) |
Kontrollpqeptid | 5 | 200 μM
(5 μl) |
leer | 4 | 0 μM
(0 μl) |
-
Enstrechend
resultieren Konzentrationen von 200 μM oder 0 μM.
Anschließend wird im Inkubator für 24 h inkubiert.
-
2. Tag:
-
Vor
der Transektion wird das alte Medium entfernt und durch 250 μl
frisches Medium ersetzt. Anschließend werden die Lipoplexe
hergestellt. Dazu werden 4 μl DNA (pCMV-GFP) in 200 μl
PBS einpipettiert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gemischt.
16 μl Metafectene Pro werden ebenfalls in 200 μl
PBS einpipettiert und durch sanftes Auf und Abpipettieren gemischt.
Jetzt werden beide Lösungen gemischt und 15 min inkubiert.
-
Am
Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in
jedes Well gegeben. Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
Am
dritten Tag wird das Medium erneuert. Anschließend wird
24 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
4. Tag
-
Das
Medium in den Wells wird entfernt und es wird 1 × mit Trypsinlösung
gespült. Anschließend werden die Zellen mit 125 μl
Trypsinlösung pro Well für ca. 15 min inkubiert.
Die Trypsinierung wird mit 125 μl komplettem Kulturmedium
gestoppt und die Zeilen durch Klopfen und Pipettieren von der Wachstumsfläche
getrennt.
-
Die
Zellsuspensionen werden bei 300 g für 5 min zentrifugiert
und die erhaltenen Zellpellets in 500 μl PBS resusupendiert.
Mit jeder Suspension wird ein μ-Slides befüllt
und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops die Transfektionsrate
(Anteil fluoreszierender Zellen von der Gasamtzellzahl) bestimmt. Ergebnisse:
TRAF-6 | Ausgewertete
Zellzahl | 293 |
| Zahl
transfizierter Zellen | 157 |
NF-kB | Ausgewertete
Zellzahl | 448 |
| Zahl
transfizierter Zellen | 232 |
MyD88 | Ausgewertete
Zellzahl | 340 |
| Zahl
transfizierter Zellen | 191 |
Kontrollpeptid | Ausgewertete
Zellzahl | 162 |
| Zahl
transfizierter Zellen | 46 |
leer | Ausgewertete
Zellzahl | 283 |
| Zahl
transfizierter Zellen | 115 |
-
Das
ergibt folgende Transfektionsraten [in %]:
TRAF-6 | 53,6 |
NF-kB | 51,8 |
MyD88 | 56,2 |
Kontrollpeptide | 28,4 |
leer | 40,6 |
-
-
Beispiel 10
-
Weiterer
Versuch mit einem Glucocorticoid:
Hydrocortisone (Cortisol;
17-Hydroxycorticosterone); MW = 362,47 Sigma-Aldrich Chemie, Produktnr.:
H0888
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei
wird eine Zellzahl von 0,8·105 Zellen
in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%)
inkubiert.
-
2. Tag:
-
Von
dem Cortisol wird eine 0,138 mM Stocklösung hergestellt.
Dazu wird 1 mg in Ethanol gelöst und mit PBS 1:20 verdünnt.
Anschließend wird mit PBS 1:50 verdünnt (1 ng/μl
= Arbeitslösung). Danach werden die Wells der 48 Well Platte
mit folgenden Mengen Arbeitslösung versorgt:
| A | B | C | D | E | F |
1 | 0 μl
0,0 ng/μl | 2,5 μl
0,01 ng/μl | 5 μl
0,02 ng/μl | 7,5 μl
0,03 ng/μl | 10 μl
0,04 ng/μl | 12,5 μl
0,05 ng/μl |
-
Danach
wird im Inkubator für 2,5 h inkubiert. Anschließend
werden die Lipoplexe hergestellt. Dazu werden 5 μl DNA
(pCMV-lacZ) in 250 μl PBS einpipettiert und durch sanftes
Auf- und Abpipettieren gemischt. 20 μl Metafectene Pro
werden ebenfalls in 250 μl PBS einpipettiert und durch
sanftes Auf und Abpipettieren gemischt. Jetzt werden beide Lösungen
gemischt und 15 min inkubiert.
-
Am
Ende werden jeweils 50 μl der Lipoplexlösung in
jedes Well gegeben. Anschließend wird 48 h in einem CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
3. Tag:
-
- Zu den Wells werden 250 μl komplettes Medium gegeben
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
- Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
-
Ergebnisse:
-
- Vorinkubationszeit mit den Inhibitoren vor der Transfektion:
2,5 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 3
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| A | B | C | D | E | F |
1 | 0,867 | 0,991 | 1,026 | 1,170 | 1,216 | 1,344 |
-
-
Beispiel 11
-
Weiterer
Versuch mit HepG2 Zellen
- Durchführung anlalog Beipiel
5
- Abweichungen: HepG2 Zellen, Antikörperkonzentration
0,1 μg/μl statt 0,05 μg/μl in
PBS, Lipoplexbildung in serumfreien DMEM statt in PBS
-
Antikörper:
-
- Mouse Anti-human-CD282 Antibody (= anti TLR2), monoclonal,
AbD Serotec, Kat-nr.: MCA2484EL
- Vorinkubationszeit mit dem Antikörper vor der Transfektion:
5 h
- Entwicklungszeit Reportergenassay [min]: 4
-
Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 1,680 | 1,486 | 1,649 | 1,815 |
B | 1,884 | 1,792 | 1,999 | 2,267 |
C | 2,095 | 1,960 | 2,111 | 2,297 |
D | 2,036 | 1,936 | 1,911 | 2,184 |
E | 1,964 | 1,930 | 1,987 | 2,164 |
F | 1,719 | 1,935 | 1,930 | 2,224 |
-
Die
Spalten 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| A | B | C | D | E | F |
1&2/2 | 1,583 | 1,838 | 2,028 | 1,986 | 1,947 | 1,827 |
3&4/2 | 1,732 | 2,133 | 2,204 | 2,048 | 2,076 | 2,077 |
-
-
Beispiel 12
-
Weiterer
Versuch mit einem Antikörper gegen TLR9 mit Einbau in einen
Lipoplex
-
Antikörper:
-
- Rabbit Anti-human-TLR9 Antibody (= anti TLR9), polyclonal,
0,5 μg/μl in PBS, 0,2% Gelatine, 0,05% Natriumazid,
Lifespan Biosciences, Kat-nr.: MCA2484EL.
-
Zur
Entfernung des Natriumazides wurde der Antikörper gegen
PBS dialysiert:
Dialysemembran: Spectra/Por DispoDialyser (500 μl,
Celluloseestermembran, 25000 Da Molecular Weight Cut-Off); Spectrum
Laborstories; No. 135492, Lot 3224004.
-
Detaillierte Versuchsbeschreibung:
-
1. Tag:
-
Es
werden HeLa Zellen in eine 48 Well Platte ausgesät. Dabei
wird eine Zellzahl von 1,0·105 Zellen
in ein Well in 250 μl komplettem Medium (10% FCS) ausplattiert.
Anschließend wird 24 h in einem CO2-Inkubator (10%)
inkubiert.
-
2. Tag:
-
Der
Antikörper wird mit PBS auf eine Konzentration von 0,1 μg/μl
eingestellt.
-
15 μg
DNA (pCMVβGal) und 60 μl Metafectene Pro werden
jeweils in 300 μl serumfreien DMEM gelöst. Durch
sanftes Auf- und Abpipettieren werden die einzelnen Lösungen
gemischt. Anschließend werden Lipoplexe folgender Zusammensetzung
hergestellt.
Lösung | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 |
Antikörperlösung
[μl] | 0 | 11 | 22 | 44 | 66 |
Metafectene
Pro-Lösung [μl] | 44 | 44 | 44 | 44 | 44 |
DNA-Lösung
[μl] | 44 | 44 | 44 | 44 | 44 |
Serumfreies
DMEM [μl] | 132 | 121 | 110 | 88 | 66 |
-
Dabei
wird zunächst die Metafectene Pro-Lösung mit der
Antikörperlösung vereint und für fünf
Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend
wird die DNA-Lösung und das serumfreie DMEM hinzugegeben
und weitere 15 Minuten bei RT inkubiert.
-
Jeweils
50 μl der DNA-Antikörper-Lipidkomplexe werden
in die Wells pipettiert. Dabei wird die Lösung 1 in vier
Wells der Spalte 1 pipettiert. Lösung 2 in vier Wells der
Spalte 2 und so weiter. Anschließend wird 24 h in einem
CO2-Inkubator (10%) inkubiert.
-
3. Tag
-
Das
Medium aller Zeilen wird erneuert. Für die Zeilen C und
D wird eine zweite Transfektion analog der Transfektion am ersten
Tag durchgeführt.
-
4. Tag
-
Reportergenassay:
-
- Analog Beispiel 1 (mit halben Mengen)
-
Ergebnisse: Mittelwert von 3 Messungen:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A | 0,819 | 1,671 | 1,419 | 1,845 |
B | 0,860 | 1,591 | 1,604 | 1,858 |
C | 1,005 | 2,185 | 1,940 | 2,267 |
D | 1,472 | 2,650 | 2,264 | 2,401 |
-
Die
Zeien 1 und 2 stellen Duplikate der Ergebnisse für eine
einfache Transfektion dar. Die Spalten 3 und 4 stellen Duplikate
der Ergebnisse für eine repetitive Transfektion dar. Es
wird daher der Mittelwert gebildet:
| 1 | 2 | 3 | 4 |
A&B | 0,840 | 1,631 | 1,512 | 1,852 |
C&D | 1,239 | 2,417 | 2,102 | 2,334 |
-
Die
zugegebene Antikörpermenge enspricht folgenden Mengen Antikörper
pro Well:
-
-
Die
Ergebnisse der erfindungsgemäßen Beispiele lassen
auch den Schluss zu, dass nicht nur das genetische Material, sondern
auch die chemischen Agentien wie z. B. kationische Lipide und kationische
Polymere von den TLRs detektiert werden. Zwanglos lässt
sich damit möglicherweise auch erklären, dass
unterschiedliche Zellen bei unterschiedlichen Verhältnissen
von genetischem Material und Transfektionsreagenz optimale Ergebnisse
zeigen. Zellen die z. B. sehr viele TLR9 und wenige TLRs für
die Reagentien exprimieren, sollten demnach bei einem Verhältniss
optimale Ergebnisse zeigen, bei dem wenig DNA auf viel Reagenz trifft.
-
Es
ist einleuchtend, das die Aktivierung der TLRs vor und während
der Transfektion von vielen Faktoren abhängt. Je nach Expressionsprofil
der Zielzelle kann dabei z. B. eine besondere Empfindlichkeit der
Zellen gegenüber bestimmten PAMPs gegeben sein. Weiter
können unterschiedliche Reagentien und unterschiedliches
genetisches Material unterschiedliche TLRs aktivieren. Selbst unterschiedliche
DNA Sequenzen können je nach CpG Gehalt Einfluss auf die
Transfektionsergebnisse nehmen. Nicht zuletzt spielen auch Verunreinigungen
eine nicht zu unterschätzende Rolle. So kann DNA bakteriellen
Ursprungs beispielsweise mit LPS oder Flagellin oder RNA verunreinigt
sein. ssRNA kann mit dsRNA verunreinigt sein und damit ausser TLR7/8
auch TLR3 ansprechen und umgekehrt. Unterschiedliche Behandlung
der Zellen kann durch Stress- Signaltransduktionkaskaden zu unterschiedlichen
Ergebnissen führen. Zusammefasst kann gesagt werden, dass
für unterschiedliche Transfektionsexperimente unterschiedliche
Blockierungsstrategien erforderlich sind.
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Wie
bereits ausgeführt, kann die Erfindung zu Therapiezwecken
eingesetzt werden. Insbesondere kann die Erfindung für
die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibrose, Muskeldystrophie,
Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie,
Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie,
Hämophilie, β-Thalassämie und Krebs genutzt
werden. Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant,
wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend
wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für
die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels
der Erfindung effektiv in Zellen gebracht werden, in denen diese
DNA die gewünschte Wirkung entfalten kann ohne dabei zu
unerwünschten Nebenwirkungen zu führen. Die gewünschte
Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder
die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel durch Antisense-DNA/RNA
oder siRNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten
Zelltyp sein. Auf diese Weise können z. B. tumorunterdrückende
Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung
cholesterolregulierender Gene ein Beitrag zur Vorbeugung von Herz-
und Blutgefäßkrankheiten geleistet werden. Weiters
kann DNA, welche Ribozyme, siRNA oder shRNA kodiert, oder Ribozyme
oder siRNA selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die
Translation der DNA erzeugt aktive Ribozyme oder siRNA, die an spezifischen
Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription
verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel virale m-RNA gespalten
werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft
zu ziehen. Der Vermehrungszyklus von Viren (HIV, Herpes, Hepatitis
B und C, respiratorisches Syncytial Virus) kann auf diesem Wege
unterbrochen werden. Weitere Erkrankungen, die speziell über
die Behandlung mit siRNA geheilt werden sollen sind die altersbedingte
Degeneration der Macula (Augenerkrankung), Leberkrebs, solide Tumoren,
Amyotropische Lateral-Sklerose und Entzündungserkrankungen.
Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion beispielsweise zur
Herstellung von Krebsvakzinen eine immer größer werdende
Rolle. Damit ist jene auch mögliches Anwendungsgebiet für
die Erfindung.
-
Eine
weitere Anwendung kann die Erfindung zum Beispiel in Impfverfahren
finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogene
Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu
werden z. B. Lipid/DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt. Die Einschleusung
der DNA in die Körperzellen führt zur Expression
des immunogenen Peptids und löst somit die adaptive Immunantwort
aus.
-
Im
folgenden werden erfindungsgemäß beispielhafte,
aber keinesfalls beschränkende Definitionen aufgeführt:
-
Transfektion:
-
Einschleusen
von genetischem Material in eine eukariotische Zelle.
-
Transfektionsergebnis/Transfektionseffizienz
-
Menge
einer Proteinexpression einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen
mit genetischem Material, welches unter anderem dieses exprimierte
Protein codiert oder Ausmaß eines Knock-downs einer Proteinexpression
einer Zellpopulation in Folge von Transfektionsprozessen mit genetischem
Material, welches einen solchen Knock-Down auslösen kann,
insbesondere siRNA oder Ribozyme oder DNA, die für shRNA
oder Ribozyme codiert oder Anteil der Zellen einer Gesamtpopulation
von Zellen, die die biologische Wirksamkeit des eingeschleusten
genetischen Materials in Folge von Transfektionsprozessen zeigt.
Gleichzeitig soll der physiologische Status der Zellpopulation so
wenig wie möglich beeinflusst werden, das heisst das Protein-Expressionsprofil
der Zellpopulation soll sich idealerweise nur bezüglich
der Proteine ändern, deren Gene in die Zelle eingeschleust
wurden oder deren Expression durch das eingeschleuste genetisches
Material herabgesetzt oder verhindert werden soll.
-
Nicht-virales Genliefersystem:
-
Nicht-virale
Genliefersysteme werden nicht durch Rekombination genetischen Materials
von natürlich vorkommenden Viren erzeugt. Sie sind in der
Lage genetisches Material in eukariotische Zellen einzuschleusen.
Insbesondere handelt es sich bei den nicht-viralen Genliefersystemen
um physikalische Methoden und chemische Methoden. Physikalische
Methoden lokalisieren mindestens das genetische Material in der
Nähe der Zelle, insbesondere nutzen physikalische Verfahren
jedoch Energiezufuhr insbesondere in Form von thermischer, kinetischer,
elektrischer oder sonstiger Energie um einen Transport des genetischen
Materials durch die Zellmembran zu vermitteln. Chemische Methoden
beruhen entweder auf einer chemischen Veränderung oder
Derivatisierung der Nukleinsäuren, die sie insbesondere
zellgängig machen oder bestehen insbesondere aus Stoffen,
die DNA binden und einen Transport durch die Zellmembran vermitteln
können. Insbesondere nutzen diese zur Bindung der Nukleinsäuren
elektrostatische Kräfte oder Wasserstoffbrückenbindungen.
Wiederum insbesondere geschieht der Transport der DNA durch die
Zellmembran durch einen aktiven Transportmechanismus der Zelle,
der Endozytose. Stoffe, die diese Eigenschaften aufweisen enthalten
insbesondere kationische Lipide, kationische Polymere, kationische
Peptide oder auch Moleküle die eine Domäne haben,
die DNA oder RNA binden kann und zugleich eine zweite Domäne
haben, die eine Liganden enthält, der von einem Rezeptor
auch der Zelloberfläche erkannt wird und durch diesen Erkennungsprozess
Endozytose auslöst. Die Stoffe können auch besonders
formuliert sein, insbesondere als Micellen oder Liposomen und auch
aus mehreren Komponenten insbesondere mit unterschiedlicher Funktion
bestehen.
-
Gentherapie
-
Therapie
zur Heilung oder Linderung von Krankheiten bei der als Wirkstoff
modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren eingesetzt
werden.
-
Angeborene Immunabwehr
-
Die
angeborene Immunabwehr grenzt sich von der erworbenen oder adaptiven
Immunabwehr dahingehen ab, dass sie einen Erreger abwehrt, ohne
dass es vorher jemals zu einem Kontakt mit dem Erreger gekommen
sein muss, um das Immunsystem zu schulen. Die angeborene Immunabwehr
ist den meisten Zelltypen zu eigen und besteht aus zwei Teilen,
dem intrazellulären und dem interzellulären Anteil.
Der intrazelluläre Anteil nutzt die Erkennung von Pathogenen
zuzuordnenden molekularen Strukturen durch Rezeptoren. Diese Rezeptoren
stoßen insbesondere Signaltransduktionskaskaden an, die
insbesondere durch Expression vieler zelleigener Gene und Phosphorylierung
wichtiger Proteine in einem geänderten physiologischen
Status (z. B. „antiviralen Status”) der direkt
betroffenen Zellen münden. Zusätzlich werden Zytokine
ausgeschüttet.
-
Über
den interzellulären Anteil des angeborenen Immunsystems
benachrichtigen betroffene Zellen über diese Botenstoffe
(Zytokine) nichtbetroffene Zellen und lösen auch dort einen
geänderten physiologischen Status (z. B. „Antiviralen
Status”) aus. Dabei docken die Zytokine an Zytokin-Rezeptoren
der anderen Zellen an und lösen wiederum eine Signaltransduktionskaskade
aus. Der interzelluläre Anteil grenzt sich also vom intrazellulären
Anteil durch die unterschiedlichen Rezeptoren (Zytokinrezeptoren
statt PRRs (pattern recognition receptors) und Agonisten (Zytokine
statt pathogene Muster) ab.
-
Antiviraler Status
-
Status
von Zellen, der sich dadurch auszeichnet, dass die Zelle versucht
die mögliche biologische Wirksamkeit von fremdem genetischen
Material durch Gegenmaßnahmen zu unterbinden.
-
Transfektion in vivo
-
Das
Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet
in einem lebenden Organismus statt.
-
Transfektion in vitro
-
Das
Einschleusen von genetischem Material in eukariotische Zellen findet
außerhalb eines lebenden Organismus statt, insbesondere
in Gefäßen, die sich zur Kultivierung von eukariotischen
Zellen eignen.
-
Genetisches Material
-
Nukleinsäuren,
insbesondere Ribonukleinsäuren oder Desoxyribonukleinsäuren,
die insbesondere aus zwei wenigstens teilweise komplementären
Strängen (doppelsträngig = ds) bestehen z. B.
dsDNA und dsRNA, oder die insbesondere aus einem Strang (einzelsträngig
= ss) besteht, z. B. ssDNA und ssRNA, der teilweise komplentäre
Bereiche aufweisen kann, die über Wasserstoffbrückenbindung
miteinander verbunden sein können.
-
Modifiziertes genetisches Material
-
Natürliche
Nukleinsäuren die durch Modifikation in ihren Eigenschaften
verändert wurden. Dabei können diese Modifikationen
insbesondere chemische Veränderungen sein, die insbesondere
das Phaphatgerüst, die Zucker oder Basen betreffen, was
insbesondere die Stabilität der Nukleinsäuren
gegen Nukleasen und Ribonukleasen erhöhen soll. Weiters
können Moleküle (Labels) an die Nukleinsäuren
kovalent oder nicht-kovalent angeheftet werden, die zu neuen Eigenschaften
der Nukleinsäuren führen, insbesondere zu optischer
Verfolgbarkeit durch Fluoreszenzlabels oder Labels, die die Nukleinsäuren
zu einen bestimmen Ort in der Zelle dirigieren (Lokalisationselemente)
oder Labels, die den Durchtritt von Nukleinsäuren durch
Membranen vermitteln und so Nukleinsäuren beispielsweise
zellgängig machen.
-
siRNA (short interfering RNA):
-
Kurze
dsRNA (bis 28 bp) die durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines
Proteins bewirken kann.
-
shRNA (short hairpin RNA):
-
Kurze
ssRNA, die am 3'-Ende und am 5'-Ende komplementäre Bereiche
besitzt und dadurch über Wasserstoffbrückenbindung
hybridisieren und eine Haarnadelstruktur ausbilden kann. shRNA kann
durch RNA-Interferenz den Knock-Down eines Proteins bewirken.
-
Rezeptor:
-
Molekül,
das in der Lage ist einen Stoff (Agonist) zu detektieren und damit
eine biologische Reaktion auslöst, Insbesondere handelt
es sich bei Rezeptoren um Proteine.
-
Blockierung:
-
Verhinderung
der biologischen Funktion, insbesondere von Proteinen.
-
Unterdrückung:
-
Unterbrechung
des Kommunikationsnetzes der Immunabwehr, d. h. von einer oder mehreren
eine Immunantwort auslösenden Signaltransduktionskaskade(n),
insbesondere der angeborenen intra- und/oder interzellulären
Immunabwehr. Durch diese Unterbrechung wird die Immunabwehr geschwächt,
wodurch sich die Immunantwort verringert.
-
DNA/RNA-bindende Domäne:
-
Bereich
in einem Molekül das DNA kovalent oder über nicht
kovalente Wechselwirkungen gebunden trägt, insbesondere
sind die nicht kovalenten Wechselwirkungen elektrostatische Kräfte
und Wasserstoffbrückenbindungen.
-
Signaltransduktionskaskade
-
Ausgehend
von einem Rezeptor, der die Anwesenheit eines Stoffes durch Anlagerung
dieses Stoffes an den Rezeptor detektiert, wird die Information über
die Anwesenheit dieses Stoffes in ein Signal umgewandelt und über
eine Kette von Molekülen durch Signaltransduktion weitergetragen.
Am Ende steht eine biologische Reaktion. Insbesondere wird das durch
den Rezeptor erzeugte Signal von Adaptermolekülen aufgenommen
und insbesondere über Kinasen insbesondere an Transkriptionsfaktoren
weitergetragen. Die Transkriptionsfaktoren stimulieren die Expression
von Genen, die die biologische Reaktion vermitteln.
-
Knock-down
-
Abschwächung
oder Ausschaltung der Translation einer mRNA zu einem Protein bei
der Proteinbiosynthese.
-
Antikörper
-
Moleküle,
insbesondere Proteine, die in der Lage sind molekulare Strukturen,
insbesondere andere Proteine, zu erkennen und durch Bindung dessen
biologische Wirkung beeinflussen.
-
Intrabodies
-
Intrazellular
exprimierte Antikörper.
-
Aptamere
-
RNA-Moleküle,
die durch Ausbildung einer Tertiärstruktur in der Lage
sind molekulare Strukturen, insbesondere Proteine, ähnlich
einem Antikörper zu erkennen und durch Bindung dessen biologische
Wirkung beeinflussen. Aptamere können aus modifizierter
oder unmodifizierter RNA oder DNA bestehen.
-
Antagonist
-
Substanz,
die einen Agonisten durch Blockierung eines entsprechenden Rezeptors
in seiner Wirkung hemmt, ohne selbst einen Effekt auszulösen.
Ein Agonist ist im Gegenzug in der Lage durch Bindung an einen Rezeptor
eine biologische Wirkung zu erzielen.
-
Inhibitoren
-
Moleküle,
die die biologische Wirkung eines anderen Moleküls, insbesondere
von Proteinen inhibieren können. Insbesondere sind die
Inhibitoren selbst Proteine, modifizierte oder unmodifizierte Nukleinsäuren
oder kleine organische Moleküle.
-
TLRs, RIG-I-Helikase, RIG-I-like Helikase
-
Rezeptoren
die speziesübergreifend in Gruppen nach ihrer Funktion
zusammengefasst werden.
-
Adaptermoleküle
-
Moleküle
die ein Signal von Rezeptoren übernehmen und die speziesübergreifend
in Gruppen nach ihrer Funktion zusammengefasst werden.
-
Glucocorticoidvorläufer
-
Eine
Substanz die durch den natürlichen Stoffwechsel der Zellen
in das eigentliche Glucocorticoid umgewandelt wird.
- AP-1
- = Activated protein-1
- ERK
- = Extracellular-signal
Regulated Kinase
- IkB
- = Inhibitory-binding
protein kB
- IKK
- = IkappaBKinase =
inhibitory-binding protein κB kinase
- IKKa
- = Ikkalpha= I Kappa
Kalpha = IKK1
- IKKb
- = IKKbeta = I Kappa
Kbeta = IKK2
- IKKd
- = IKKdelta = I Kappa
Kdelta
- IKKe
- = IKKepsilon = I Kappa
Kepsilon
- IKKg
- = IKK gamma = I Kappa
Kgamma = IKK3
- IKKi
- = KK epsilon
- IRAK1
- = Interleukin 1 Receptor-Associated
Kinase 1
- IRAK4
- = interleukin-1 receptor-associated
kinase 4
- IRF
- = Interferon regulating
Factor
- JNK
- = c-Jun N-terminal
Kinase
- JAK
- = Janus activated
Kinaste
- Mal
- = TIRAP = MyD88-adapter-like
- MAPK
- = Mitogen activated
Protein Kinase
- MEK
- = MAPK/ERK kinase
- MKK
- = MAP Kinase Kinase
- MKK
- = Mitogen-activated
protein kinase kinase
- MSK
- = Mitogen and stress
activated kinase
- MyD88
- = Myeloid differentiation
factor 88
- NAP1
- = Nck-associated protein
1
- NEMO
- = IKK gamma
- NF-kB
- = Nuclear Factor kappaB
- P1 3K
- = Phosphoinositol-3-Kinase
- PKR
- = Protein Kinase R
= Protein Kinase RNA-activated
- PKB
- = Protein Kinase B
- PDK1
- = Phosphoinositide-dependend
Protein Kinase 1
- PDK2
- = Phosphoinositide-dependend
Protein Kinase 1
- Rac1
- = Ras-related C3 botulinum
toxin substrate 1
- RIP1
- = Receptor-interacting
protein 1
- STAT
- = Signal Transducers
and Activators of Transcription
- TAK1
- = Transforming growth
factor-β-activated kinase
- TBK1
- = IKKd = TANK-binding
Kinase
- TIRAP
- = Mal = Toll-interleukin
1 receptor (TIR) domain-containing adapter protein
- TRAF3
- = TNF receptor-associated
factor 3
- TRAF6
- = TNF receptor-associated
factor 6
- TRAM
- = TRIF-related adaptor
molecule
- TRIF
- = Toll/IL-1 receptor
domain–containing adaptor inducing interferon-b adaptor
protein
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
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-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - EP 388758 [0034]
- - WO 9602655 [0034]
- - WO 9502397 [0034]
- - WO 9715680 [0034]
- - US 4946787 [0036]
- - EP 394111 [0036]
- - WO 9405624 [0036]
- - WO 97002419 [0036]
- - US 5264618 [0036]
- - WO 9640067 [0036]
- - US 6008038 [0041]
- - US 4750100 [0041]
- - US 5869326 [0041]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Luke A. et
al.; Spektrum der Wissenschaft, August 2005, Seiten 68–75 [0001]
- - Heine H. et al.; int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 130; 180–192 [0003]
- - Uematsu S. et al., J. Biol. Chem. 2007, May 25; 282 (21);15319–23 [0003]
- - Perry A. K. et al; Cell Research 2005; 15(6); 407–422 [0004]
- - Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145 [0004]
- - Zimmer A. et al.; PNAS, 1999; 96(10), 5780–5785 [0005]
- - Aufklärung der Rollen von Toll-Rezeptoren und ihrer
Signaltransduktionskaskaden mittels Gen-Targeting, Robert-Koch-Vorlesung
von Dr. Shizuo Akira, Allgemeine Presseinformation 2002 [0007]
- - www.robert-koch.stiftung.de [0007]
- - www.aerzteblatt.de [0008]
- - Perry A. K. et al; Cell Research 2005; 15(6); 407–422 [0009]
- - Kawai T. et al.; J. Biochem; 2007; 141; 137–145 [0009]
- - Isaacs, A. et al.; J. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 147,
258–267 [0021]
- - Domb A. J.; Review in Molecules; 2005; 10; 34 [0031]
- - Xiang G; Keun-Sik K.; Dexi L.; Review in The AAPS Journal;
2007; 9(1) Article 9 [0031]
- - http://www.aapsj.org [0031]
- - J. P. Behr et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1995; 92; 7297 [0034]
- - S. C. De Smedt et al.; Phar. Res.; 2000; 17; 113 [0034]
- - F. C. Szoka et al.; Bioconjug. Chem.; 1996; 7; 703 [0034]
- - W. Guang Liu et al.; J. Control. Release; 2002; 83; 1 [0034]
- - P. van de Wetering et al.; J. Gene Med.; 1999; 1; 156; [0034]
- - J. P. Behr; Bioconjugate Chem.; 1994; 5; 382 [0036]
- - Leventis et al.; Biochim. Biophys. Acta; 1990; 1023; 124 [0036]
- - Huang et al; Biochem. Biophys. Res. Commun.; 1991; 179; 280 [0036]
- - Krieg A. M. et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1998; 95(21);
12631–6 [0068]
- - Loiarro M. et al.; J. Biol. Chem.; 2005; 16; 15809–14 [0071]
- - Derossi D. at al. J. Biol. Chem. 1994, 269; 10444–10459 [0071]