DE10211558A1

DE10211558A1 - Neue Formen RNAi

Info

Publication number: DE10211558A1
Application number: DE2002111558
Authority: DE
Inventors: Jens Wientges; Mathias Grote; Sven Klusmann
Original assignee: Noxxon Pharma AG
Current assignee: TME Pharma AG
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2003-10-09

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oligoribonukleotid, umfassend mindestens einen doppelsträngigen Bereich zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens, wobei ein Strang des doppelsträngigen Bereiches einen zum Zielgen im Wesentlichen komplementären Bereich aufweist und der komplementäre Bereich weniger als 25 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist, wobei das Oligoribonukleotid wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Formen von RNAi und die Verwendung von doppelsträngiger RNA als Adjuvans und zum Screenen von die Immunantwort modulierenden Verbindungen.

Doppelsträngige RNA, im Folgenden kurz dsRNA, mit einer Länge von mindestens 30 Basenpaaren ist als Translations-Inhibitor und als Induktor von Typ I-Interferon und damit als wichtiger Bestandteil der zellulären anitviralen Immunantwort bekannt. (Roberts et al., 1976; Feldmane et al., 1997; Bass, Nature 2001)

Typ I-Interferone, wozu die Interferone alpha, beta, delta, omega und tau, nicht jedoch Interferon gamma gehören, aktivieren über eine IRF (interferon regulatory factor) genannte Familie von Transkriptionsfaktoren zahlreiche Gene, die auch als auf Interferon ansprechende Gene ("Interferon-responsive genes") bezeichnet werden. Typ I-Interferone wirken antiviral und immunstimulierend. Darüber hinaus reguliert dsRNA unabhängig von Interferon eine Reihe von Genen, die als dsRNA-stimulierte Gene (dsRNA stimulated genes, DSGs) bezeichnet werden und ebenfalls in der antiviralen Antwort eine wichtige Rolle spielen. Aufgrund dieser vielfältigen Wirkungen von dsRNA wird diese als immunstimulierendes Adjuvans eingesetzt (Carter et al., 1991).

Die Wirkung von dsRNA als Interferon-Induktor wird dabei durch mindestens zwei Signalkaskaden vermittelt.

In der am besten beschriebenen Signalkaskade aktiviert dsRNA die dsRNA-abhängige Protein Kinase PKR (DAI), welche sich durch Autophosphorylierung weiter aktiviert und eIF2alpha phosphoryliert und damit inaktiviert. Dadurch wird die zelluläre Translation inhibiert, was die Konzentration an Interferon-Repressoren unter den kritischen Schwellwert senkt, so daß als Nettoeffekt die Expression von Interferon Typ 1 hochreguliert wird. Darüber hinaus aktiviert die PKR eine Reihe von Transkriptionsfaktoren wie z. B. NF-kappa-B (Petska et al., 1987; Gil and Esteban 2000).

In einer zweiten unabhängigen Signalkaskade aktiviert dsRNA die Oligo-Adenylat- Synthetase (2',5'-AS, OAS), die durch die Synthese von kurzen 2'-5'-Oligoadenylaten die RNaseL aktiviert, die wiederum diverse RNAs, darunter die 28sRNA und die 18 s rRNA des Ribosoms, spaltet und damit inaktiviert. Dadurch wird die gesamte Translation sequenzunspezifisch inhibiert. (Kerr and Brown, 1978; Zhou et al., 1993).

Neben der generellen und damit unspezifischen Inhibition der Translation werden von dsRNA die Kinasen JNK und p38MAPK aktivieren, die durch weitere Signalkaskaden eine Reihe proinflammatorischer und pyrogener Cytokine aktiviert wie z. B. IL-6, TNFalpha, IL-1beta und IFN-gamma (Iordanov et al., 2000).

Der vorliegende Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Adjuvans bereitzustellen, welches im Wesentlichen die gleichen immunstimulierenden Eigenschaften aufweist, wie die im Stand der Technik bekannte dsRNA, wobei diese jedoch den Nachteil der im Stand der Technik bekannten dsRNA bestehend in einer nur vergleichsweise kurzen Verfügbarkeit in biologischen Systemen, nicht aufweist.

Der vorliegenden Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde die Wirkung von RNAi zu verbessern, insbesondere eine RNAi bereitzustellen, die eine gegenüber dem Stand der Technik verlängerte Wirksamkeit zeigt.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem ersten Aspekt gelöst durch die Verwendung von doppelsträngiger RNA als Adjuvans, wobei die doppelsträngige RNA wenigstens ein L- Nukleotid umfasst.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem zweiten Aspekt gelöst durch die Verwendung von doppelsträngiger RNA zur Herstellung eines Medikamentes, wobei die doppelsträngige RNA wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Medikament für die Behandlung einer Krankheit ist, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die Krebs, Infektionskrankheiten und virale Erkrankungen umfasst.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem dritten Aspekt gelöst durch die Verwendung von doppelsträngiger RNA als Translations-Inhibitor, wobei die dsRNA mindestens ein L- Nukleotid umfasst.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem vierten Aspekt gelöst durch die Verwendung von doppelsträngiger RNA als Induktor für Interferon, insbesondere Typ 1 Interferon, wobei die doppelsträngige RNA mindestens ein L-Nukleotid umfasst.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem fünften Aspekt gelöst durch die Verwendung von doppelsträngiger RNA zur Aktivierung von Proteinen, wobei die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe, die Proteinkinase PKR, Transkriptionsfaktoren, insbesondere NF- KAPPA-B, Oligoadenylat-Synthetase, JNK, p38 MAPK und pyrogene Cytokine umfasst, und die doppelsträngige RNA zumindest ein L-Nukleotid umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das pyrogene Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe, die IL-6, TNFalpha, IL-1beta und IFN-gamma umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die doppelsträngige RNA wenigstens ein L-Nukleotid an dem 3'- und/oder 5'-Ende umfasst.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen dass mindestens ein L-Nukleotid in wenigstens einem Strang der doppelsträngigen RNA enthalten ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass zumindest eines der die doppelsträngige RNA aufbauenden Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen dass das modifizierte Nukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, die 2'-Amino-Nukleotide, 2'-Alkyl-Nukleotide und 2'-Methoxy-Nukleotide umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das modifizierte Nukleotid ein modifiziertes L-Nukleotid ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die doppelsträngige RNA oder zumindest ein Teil davon eine Rückgratmodifikation aufweist, wobei die Modifikation bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe, die Phosphorothioate und PNA umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Gehalt an L-Nukleotiden relativ zum Gesamtgehalt der die doppelsträngige RNA aufbauenden Nukleotide 5% bis 100% beträgt.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Gehalt 10% bis 100%, bevorzugterweise 20% bis 100% und bevorzugtererweise 50% bis 100% beträgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die dsRNA eine Länge von mindestens etwa 30 Basenpaaren aufweist.

In einem sechsten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Screenen von Modulatoren der Immunantwort, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen eines Testsystems, wobei das Testsystem eine modulierbare Immunantwort zeigt,
b) Hinzufügen von doppelsträngiger RNA zu dem Testsystem, wobei die doppelsträngige RNA wenigstens ein L-Nukleotid umfasst,
c) Hinzufügen eines Kandidaten-Modulators,
d) Bestimmen, ob unter dem Einfluss des Kandidaten-Modulators die Immunantwort des Testsystems moduliert wird.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem siebten Aspekt gelöst durch ein Oligoribonukleotid, umfassend mindestens einen doppelsträngigen Bereich zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens, wobei ein Strang des doppelsträngigen Bereiches einen zum Zielgen im Wesentlichen komplementären Bereich aufweist und der komplementäre Bereich weniger als 25 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist, wobei das Oligoribonukleotid wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der komplementäre Bereich 17 bis 23, bevorzugterweise 19 bis 21 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Oligoribonukleotid aus zwei einzelnen Ribonukleotid-Einzelsträngen gebildet ist.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Zielgen aus der Gruppe ausgewählt ist, die Onkogene, Cytokin-Gene, ID-Protein-Gene, Entwicklungsgene, Priogene, Gene für Enzyme, Gene für Cytokine, Gene für Interferone, Gene für Botenstoffe und Gene für Strukturproteine umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Oligoribonukleotid wenigstens ein L-Nukleotid an einem der 3'- und/oder 5'-Enden umfasst.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass zumindest eines der das Oligoribonukleotid aufbauenden Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid ist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem achten Aspekt gelöst durch Medikament umfassend ein erfindungsgemäßes Oligoribonukleotid.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem neunten Aspekt gelöst durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids zur Herstellung eines Medikamentes.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem zehnten Aspekt gelöst durch Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens in einer Zelle

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Hemmung der Expression in vitro.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle eine eukaryontische Zelle.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle bevorzugterweise eine Säugetier-Zelle.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass es möglich ist, durch Aufnahme mindestens eines L-Nukleotids in eine doppelsträngige Ribonukleinsäure, hierin auch als doppelsträngige RNA oder dsRNA bezeichnet, deren Verweilzeitverhalten in einem biologischen System so zu erhöhen, dass die bei der Verwendung von dsRNA nach dem Stand der Technik, die lediglich aus D-Nukleotiden besteht, beobachteten Nachteile nicht auftreten und gleichzeitig die sonstigen, insbesondere der regulativen Eigenschaften der ausschließlich aus D-Nukleotiden bestehenden dsRNA beibehalten werden. Eine derartige doppelsträngige Ribonukleinsäure, die mindestens ein L-Nukleotid umfasst, wird hierin auch als erfindungsgemäße doppelsträngige Ribonukleinsäure oder erfindungsgemäße dsRNA bezeichnet.

Diese Eigenschaften und insbesondere regulativen Eigenschaften sind jene, wie sie für dsRNA nach dem Stand der Technik beschrieben sind, insbesondere die Fähigkeit, als Translationsinhibitor, als Induktor vom Typ I-Interferon, als wichtiger Bestandteil der zellulären antiviralen Immunantwort, als Regulator für eine Reihe von Genen, die ebenfalls in der antiviralen Antwort eine wichtige Rolle spielen, als immunstimulierendes Adjuvans, als Interferon-Induktor, als Proteine aktivierender Faktor, insbesondere die Proteine im Zusammenhang mit der PKR-Signalkaskade und der Oligoadenylat-Synthetase- Signalkaskade, zu wirken. Diese Wirkungen sind im einleitenden Teil der Beschreibung angeführt und werden zur Vermeidung unnötiger Wiederholungen durch Bezugnahme an dieser Stelle aufgenommen.

Grundsätzlich ist die Wirkung von dsRNA nach dem Stand der Technik, d. h. von solcher dsRNA, die lediglich aus D-Nukleotiden besteht, von begrenzter Wirksamkeit, was darin begründet ist, dass diese in einem biologischen System eine kurze Lebensdauer und damit einhergehend eine kurze Wirkungsdauer aufweist. Dies wird durch die Anwesenheit von dsRNA-spezifischen RNasen (z. B. RNase III (Dicer)) in biologischen Systemen wie beispielsweise Flüssigkeiten biologischen Ursprungs, zellfreie Systeme, zelluläre Systeme, wie Zellkulturen, Organkulturen, Tiermodelle oder Tiere bedingt. Die dsRNA-spezifische RNasen (Dicer) spalten längere dsRNA-Abschnitte in kurze 19-23-mer-Fragmente, die keine Interferon-induzierende und keine allgemeine, d. h. sequenzunabhängige translationsinhibierende Wirkung aufweisen, da sie weder die PKR noch die OAS aktivieren (Vase. Nature 2001). Die kurzen 19-mer bis 23-mer dsRNAs werden siRNAs (short inhibitory RNAs) genannt, da sie sequenzspezifisch zu einem Abbau der mRNA gleicher oder korrespondierender Sequenz führen (posttranscriptional gene silencing, PTGS), wie beispielsweise beschrieben von Boutla et al., 2001 und Billy et al., 2001.

Darüber hinaus erlaubt die Verwendung von dsRNA, die wenigstens ein L-Nukleotid umfasst, eine Verringerung der ansonsten bei der Verwendung von nukleotidbasierten Wirkstoffen beobachteten Nebenwirkungen. Dies wird im wesentlichen dadurch bedingt, dass infolge der Verwendung der erfindungsgemäßen dsRNA kein Abbau und insbesondere kein enzymatischer Abbau der erfindungsgemäßen dsRNA erfolgt und damit die Abbauprodukte, die ansonsten für die besagten Nebenwirkungen nukleotidbasierter Wirkstoffe wie dsRNA nach dem Stand der Technik verantwortlich sind, nicht entstehen können.

Ein weiterer überraschender Vorteil, der mit der erfindungsgemäßen dsRNA erreicht werden kann, ist die Erhöhung der Interferon-induzierenden Wirkung, was erhebliche therapeutische Vorteile bei der Verwendung der erfindungsgemäßen dsRNA als Adjuvans mit sich bringt. Diese Wirkung ist antiviraler, antiprodiferativer und immunmodulatorischer Natur. Diese Wirkungen treten typischerweise nach Bindung von Interferonen an verschiedene Rezeptoren auf der Zielzelle, Genaktivierung und Induktion spezifischer Proteine auf.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff der doppelsträngigen RNA eine Nukleinsäure, insbesondere eine Ribonukleinsäure, die zumindest abschnittsweise aus zwei Doppelsträngen besteht. Bevorzugterweise handelt es sich bei dem doppelsträngigen Abschnitt um einen solchen, der aus zwei einzelnen Nukleinsäuresträngen (hierin auch als Nukleinsäuren bezeichnet) gebildet wird und beide Nukleinsäurestränge nicht miteinander kovalent verbunden sind. Dabei kann vorgesehen sein, dass einer der beiden Nukleinsäurestränge am 5'- und/oder 3'-Ende länger bzw. kürzer ist als der jeweils andere Nukleinsäurestrang. Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird dabei bevorzugterweise durch Watson-Crick-Basenpaarung ausgebildet, wobei auch andere Basenpaarungsschemata grundsätzlich geeignet sind, die doppelsträngige Struktur der Ribonukleinsäure auszubilden.

Neben der Ausführungsform, dass die doppelsträngige Ribonukleinsäure, genauer der doppelsträngige Abschnitt, aus zwei einzelnen Nukleinsäuresträngen ausgebildet ist, ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die beiden einzelnen Nukleinsäurestränge durch eine kovalente Bindung miteinander verknüpft sind. Diese kovalente Bindung kann dabei grundsätzlich zwischen einem jeden Bestandteil eines ersten Nukleotids, d. h. der Nukleobase, des Zuckers und des Phosphatrestes, mit einem jeden Bestandteil eines zweiten Nukleotids, d. h. der Nukleobase, dem Zucker und dem Phosphat, ausgebildet werden. Bevorzugterweise befindet sich das erste Nukleotid im ersten Nukleinsäurestrang und das zweite Nukleotid im zweiten Nukleinsäurestrang. Das erste und/oder das zweite Nukleotid können dabei unabhängig voneinander an einem der beiden Enden des jeweiligen Nukleinsäurestranges oder innerhalb der die Nukleinsäurestränge ausbildenden Sequenz(en) angeordnet sein. Dabei ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die doppelsträngige RNA-Struktur durch einen einzelnen Nukleinsäurestrang dadurch ausgebildet wird, dass die einzelsträngige Nukleinsäure zumindest einen Bereich umfasst, der zu zumindest einem weiteren Bereich des Nukleinsäurestranges komplementär ist und somit die Ausbildung eines doppelsträngigen Bereiches erlaubt, typischerweise unter Rückfaltung eines Endes der einzelsträngigen Nukleinsäure auf ein anderes Ende, wobei die dazwischen liegenden Nukleotide die kovalente Bindung der beiden, den doppelsträngigen Bereich ausbildenden Abschnitte der einzelsträngigen Nukleinsäure gewährleisten.

Die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA zeichnet sich durch einen Gehalt von wenigstens einem L-Nukleotid, bevorzugterweise einem L-Ribonukleotid aus. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das L-Nukleotid auch ein L-Deoxynukleotid ist. Dieses eine L-Nukleotid kann grundsätzlich an einem jeden Ende der doppelsträngigen RNA angebracht sein, d. h. am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende. Für den Fall, dass es sich bei der doppelsträngigen RNA um eine solche handelt, die aus zwei einzelsträngigen RNAs oder zwei einzelnen Nukleinsäuresträngen gebildet wird, kann darüber hinaus das L-Nukleotid an nur einem der beiden einzelsträngigen Nukleinsäure-Moleküle oder an beiden, und hierbei wiederum am 5'- und/oder 3'-Ende angebracht sein, so dass sämtliche Möglichkeiten grundsätzlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind. Das Versehen einer Nukleinsäure, insbesondere einer Ribonukleinsäure, sei es, dass diese als Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegt, mit mindestens einem L-Nukleotid am 5'-Ende wird auch als 5'-Capping bezeichnet; das Versehen einer Nukleinsäure, insbesondere einer Ribonukleinsäure, sei es, dass diese als Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegt, mit einem L-Nukleotid am 3'-Ende wird auch als 3'-Capping bezeichnet.

Die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA kann dabei so wenig wie ein L-Nukleotid in der vorstehend beschriebenen Weise umfassen, jedoch ist es auch möglich, dass anstelle des einzelnen L-Nukleotids ein Dimer aus zwei L-Nukleotiden oder ein entsprechendes Poly-L- Nukleotid an der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA vorhanden ist. Dabei kann ein derartiges Poly-L-Nukleotid in der gleichen Weise an der doppelsträngigen RNA angebracht sein, wie hierin für das einzelne L-Nukleotid beschrieben. Darüber hinaus ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein jedes der Poly-L-Nukleotide mit einer bestimmten Länge und Anordnung in der erfindungsgemäßen dsRNA oder Teilen davon mit einem anderen L-Nukleotid oder Poly-L-Nukleotid beliebiger Länge und beliebiger Anordnung in der erfindungsgemäßen RNA oder Teilen davon gekoppelt werden kann. Die weiteren Bestandteile der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA sind, sofern nicht anders angegeben, D-Nukleotide, bevorzugterweise D-Ribonukleotide.

Der Bereich der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA, der aus L-Nukleotiden besteht, kann dabei so wenig wie ein und so viel wie mehrere hundert L-Nukleotide umfassen. Bevorzugterweise beträgt die Länge 2 bis 10, bevorzugtererweise 5 bis 10 L-Nukleotide.

Mit der Ausgestaltung der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA, dass zumindest an einem Ende der doppelsträngigen RNA zumindest ein L-Nukleotid vorhanden ist, d. h. ein "Capping" der doppelsträngigen RNA, die ansonsten aus D-Nukleotiden besteht, mit wenigstens einem L-Nukleotid erfolgt ist, wird nach dem derzeitigen Verständnis der Erfinder, ohne darauf im Folgenden festgelegt werden zu wollen, gewährleistet, dass der enzymatische Abbau dieser doppelsträngigen RNA insbesondere nicht durch Exonucleasen erfolgt, und somit die Stabilität und damit auch die Lebensdauer der dsRNA in vivo und in vitro deutlich erhöht wird. Infolge dieser Erhöhung der Lebensdauer kommt es auch zu einer verlängerten Wirkungsdauer der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA gegenüber der im Stand der Technik beschriebenen doppelsträngigen RNA. In Ergänzung oder alternativ dazu kann infolge der verlängerten Wirkungsdauer der doppelsträngigen RNA die für das Erzielen einer Wirkung erforderliche Dosis der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA gegenüber derjenigen aus dem Stand der Technik verringert werden, was zum einen mit verringerten Kosten bei der Herstellung des jeweiligen Mittels und Anwendung eines entsprechenden therapeutischen Ansatzes bei einem Patienten, der der Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Mittel bedarf, und insbesondere auch mit einer verringerten Belastung, insbesondere physiologische Belastung, des mit entsprechender doppelsträngiger RNA behandelten Organismus einhergeht.

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das wenigstens eine L-Nukleotid, genauer das L-Ribonukleotid, in einem oder beiden der die doppelsträngige RNA ausbildenden Nukleinsäurestränge innerhalb des diesen bzw. diese jeweils ausbildenden Polynukleotids, d. h. an einer anderen Stelle als am 5'- und/oder 3'-terminalen Ende, enthalten ist. Der Einbau eines derartigen L-Nukleotids wird als "Doping" von RNA- Molekülen bezeichnet. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das wenigstens eine L-Nukleotid oder Poly-L-Nukleotid oder die mehreren L-Nukleotide oder Poly-L-Nukleotide in einen der beiden die doppelsträngige RNA ausbildenden Nukleinsäurestrang, oder auch in beide, eingebaut werden. Dabei kann an jeder einzelnen betrachteten Stelle des Oligonukleotides, d. h. an einer bestimmten Sequenzposition, so wenig wie ein L-Nukleotid ebenso eingebaut sein wie eine Abfolge mehrerer der L-Nukleotide, mithin ein Poly-L-Nukleotid. Dabei kann jeder der die dsRNA ausbildende Einzelstrang ein oder mehrere derartige Stellen umfassen. Für den Fall, dass die doppelsträngige RNA- Struktur durch Rückfalten eines einzelsträngigen RNA-Moleküls erzeugt wird, ist bzw. sind das einzelne L-Nukleotid oder die mehreren L-Nukleotide bzw. Poly-L-Nukleotid oder die mehreren Poly-L-Nukleotide in nur dem einzelnen Nukleotidstrang enthalten.

Bei der erfindungsgemäßen Form der Modifizierung der doppelsträngigen RNA durch Aufnahme oder Einbau wenigstens eines L-Nukleotids in die Sequenz der dsRNA, die als "Doping" bezeichnet wird, wird ebenfalls eine erhöhte Stabilität der erfindungsgemäßen dsRNA, d. h. insbesondere eine erhöhte Stabilität gegen enzymatischen Abbau, herbeigeführt, die zu ähnlichen Ergebnissen führt, wie im Falle des oben beschriebenen "Capping" von RNA-Moleküle. Darüber hinaus können bei "Doping" von doppelsträngigen RNA-Molekülen Fragmente entstehen, die nicht mit den natürlichen zellulären mRNAs hybridisieren und damit nicht zu einer unerwünschten PTGS-Nebenwirkung führen.

Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein doppelsträngiges RNA- Molekül sowohl ein "Capping" als auch ein "Doping" aufweist, d. h. zumindest an einem Ende der doppelsträngigen RNA mindestens ein L-Nukleotid und weiterhin innerhalb mindestens eines der die doppelsträngige RNA-Struktur ausbildenden Nukleinsäurestranges oder im Falle, dass die doppelsträngige RNA-Struktur durch Rückfaltung eines einzelnen Nukleinsäurestranges gebildet wird, in diesem Nukleinsäurestrang, das mindestens eine L- Nukleotid innerhalb der Sequenz vorhanden ist.

Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die doppelsträngige RNA vollständig aus L-Nukleotiden aufgebaut ist.

Bei dieser Ausführungsform kann dabei vorgesehen sein, dass beide Nukleinsäurestränge, die die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA ausbilden, oder der einzelne, durch Rückfaltung die dsRNA ausbildende Nukleinsäurestrang, aus L-Nukleotiden bestehen. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass lediglich einer der beiden die doppelsträngige RNA-Moleküle ausbildenden Nukleinsäurestränge vollständig aus L-Nukleotiden aufgebaut ist. Für den Fall, dass die doppelsträngige RNA als doppelsträngige RNA-Struktur durch Rückfalten eines einzelsträngigen RNA-Moleküls gebildet wird, ist dabei bevorzugt, dass die miteinander basenpaarenden Bereiche des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls nach Rückfaltung im doppelsträngigen Bereich vollständig aus L-Nukleotiden bestehen. Dabei ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das einzelsträngige RNA-Molekül vollständig aus L-Nukleotiden besteht und nicht nur die beiden komplementären Bereiche innerhalb des einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls, das durch Rückfaltung die doppelsträngige RNA-Struktur ausbildet.

Ein wesentlicher Vorteil der Ausbildung der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA unter Verwendung von ausschließlich L-Nukleotiden besteht darin, dass es keinen detektierbaren enzymatischen Abbau, d. h. weder durch Endonucleasen noch durch Exonucleasen, gibt, wie in den Beispielen weiter belegt werden wird. Insoweit gilt auch hier, dass die Wirkungsdauer der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA erhöht bzw. die zur Erzielung eines bestimmten Effektes erforderliche Dosis gegenüber der doppelsträngigen RNA nach dem Stand der Technik, die vollständig aus D-Nukleotiden besteht, verringert wird. Nachdem doppelsträngige RNA, die vollständig aus L-Nukleotiden aufgebaut ist, kein Substrat für die natürlicherweise in vivo und in vitro vorkommenden RNasen ist, weiterhin auch kein unbeabsichtigtes posttranslationales Verstummen eines Gens (engl. postranslational gene silencing, PTGS) auftritt, treten bei Verwendung der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA als Adjuvans bzw. Medikament, die ansonsten bei Verwendung von dsRNA nach dem Stand der Technik auftretenden Nebenwirkungen nicht auf.

Der Gehalt an L-Nukleotiden in der doppelsträngigen RNA kann dabei 5 bis 10% der die doppelsträngige RNA insgesamt aufbauenden Nukleotide, d. h. die Summe aus L- Nukleotid(en) und D-Nukleotiden, 10 bis 20%, 20 bis 50% und 50 bis 100% betragen. Besonders bevorzugt sind dabei die Bereiche von 3 bis 10% und 100%.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA aufbauenden Nukleotide modifiziert sein können. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das/die L-Nukleotid(e) modifiziert ist/sind. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA aufbauenden D-Nukleotide einzeln oder in ihrer Gesamtheit, d. h. alle, modifiziert sind. Schließlich ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass einige der D-Nukleotide und/oder das bzw. einige der L-Nukleotide modifiziert sind. Derartige Modifikationen der die erfindungsgemäße doppelsträngige Nukleinsäure aufbauenden Nukleotide sind dabei bevorzugterweise Modifikationen an den Basen- oder Zucker-Anteilen der Nukleotide.

Gängige, d. h. den Fachleuten auf dem Gebiet bekannte Modifikationen der Zucker bei Nukleinsäuremolekülen sind z. B. 2'-Amino-, 2'-O-Alkyl- und 2'-O-Allyl-Modifikationen, wie beispielsweise beschrieben von Osborne und Ellington (Osborne und Ellington, 1997, Chem. Rev. 97, 349-370). Eine mögliche Modifikation des Zucker-Phosphat-Rückgrats ist die Verwendung von peptide nucleic acid (PNA) (Ray, A. & Nordén, B. (2000), FASEB J. Vol. 14, 1041-1060: Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future) oder von Phosphorothioaten (Eckstein, F. (1997), Ciba Found Symp, 209, 207-12: Exogenous application of ribozymes for inhibiting gene expression).

Hinsichtlich der Länge der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA ist in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, dass diese eine Mindestlänge von etwa 30 Basenpaaren aufweist. Bevorzugterweise ist die Länge 30 bis 90 Basenpaare, bevorzugterweise 30 bis 80 und bevorzugtererweise 30 bis 50 Basenpaare. Der Begriff der Mindestlänge bezieht sich dabei auf die Länge des als Doppelstrang ausgebildeten Abschnitts der dsRNA.

Die die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA ausbildenden Nukleinsäuremoleküle werden unter Standardbedingungen, die den Fachleuten bekannt sind, synthetisiert. In dem Fall, dass die doppelsträngige RNA durch Rückfaltung eines einzelsträngigen Nukleinsäuremoleküls ausgebildet wird, werden geeignete Reaktionsbedingungen die energetisch bevorzugte Rückfaltung besonders fördern. Derartige Reaktionsbedingungen sind beispielsweise beschrieben in Publisi, J. D. & Tinoco, I. Jr., Methods Enzymol., Vol. 180, 304-325: Absorbance melting curves of RNA. Bei Ausbildung der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA aus zwei einzelnen Nukleinsäuresträngen wird bevorzugterweise so vorgegangen, dass jeder Einzelstrang synthetisiert wird und beide Einzelstränge unter geeigneten Reaktionsbedingungen miteinander in Kontakt gebracht werden, so dass die Ausbildung der doppelsträngigen Struktur möglich ist. Auch diese Verfahrensweise ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Publisi, J. D. & Tinoco, I. Jr., Methods Enzymol., Vol. 180, 304-325: Absorbance melting curves of RNA. Die letzte Form der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA kann auch dadurch hergestellt werden, dass sich ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül rückfaltet, es zur Ausbildung der doppelsträngigen RNA-Struktur kommt und anschließend eine Spaltung des Nukleinsäurestranges unter Verwendung geeigneter Spaltmittel, wie beispielsweise Endonukleasen, vorgenommen wird mit der Folge, dass die doppelsträngige RNA nun als aus zwei nicht kovalent miteinander verbundenen einzelsträngigen Nukleinsäuren aufgebaut ist.

Die verschiedenen hierin offenbarten Verwendungen der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA und die korrespondierenden Verfahren, die die erfindungsgemäße dsRNA verwenden, gehen dabei alle im Wesentlichen auf die überraschende Erkenntnis zurück, dass die für oder bei doppelsträngiger RNA nach dem Stand der Technik beobachteten Wirkungen auch mit der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA erzielt werden können.

Entsprechend ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA im Rahmen der Therapie von Erkrankungen verwendet werden kann, bei denen eine immunstimulierende Wirkung für die Therapie und/oder Prävention hilfreich oder erwünscht ist. Dabei ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA zur Herstellung entsprechender Medikamente verwendet wird. Indikationen, bei denen doppelsträngige RNA und somit auch die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA vorteilhafterweise eingesetzt werden können, sind solche, bei denen grundsätzlich ein Adjuvans verwendet werden kann. Dazu gehören, unter anderem, auch Tumor- und Krebserkrankungen sowie Infektionen, hierbei insbesondere Virusinfektionen.

Derartige Virusinfektionen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Hepatitis-A, Hepatitis-B, Hepatitis-C, Aids und Influenza und solche Infektionen, die durch EBV, CMV oder Herpes-Viren verursacht werden. Infolge des allgemeinen Wirkprinzips von dsRNA sind somit sämtliche Krankheitsformen innerhalb dieser Indikationen mit der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA adressierbar. Unter Adjuvans wird hierin insbesondere ein in Arzneimittelpräparaten selbst unwirksamer, aber in Wirkung der anderen Komponenten, d. h. der pharmazeutisch wirksamen Komponenten, fördernder Bestandteil verstanden, ebenso wie eine die immunogene Wirkung eines Antigens verstärkenden Substanz.

Neben der Verwendung der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA zu therapeutischen und/oder präventiven Zwecken ist es dabei auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA im Rahmen von Screening-Programmen verwendet wird. Bedingt durch die hierin offenbarte erhöhte biologische Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA können die dsRNA immanenten Eigenschaften und Wirkungen, die im Übrigen unabhängig von der Sequenz der dsRNA sind, über einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten bzw. erzeugt werden bzw. bei Verwendung einer geringeren Menge der erfindungsgemäßen dsRNA. Diese Anwendung der erfindungsgemäßen dsRNA ist mit besonderen Vorteilen bei der Durchführung von Screening-Verfahren verbunden, bei denen Modulatoren der Immunantwort gescreent werden sollen. Im Rahmen eines derartigen Verfahrens wird typischerweise ein Testsystem bereitgestellt, wobei das Testsystem eine modulierbare Immunantwort zeigt, die durch Hinzufügen der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA auf ein hohes Aktivitätsniveau gehoben wird. Ein derartiges Testsystem kann, ähnlich wie das biologische System, beispielsweise ein Zellextrakt-basierter Assay, ein Zellkultur-basierter Assay, ein Organkultur-basierter Assay oder aber auch ein Tiermodell oder Tier sein. Geeignete Tiermodelle oder Tiere sind bevorzugterweise solche, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Mäuse, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten, Hunde, Katzen, Schweine, Rinder, Ziegen, Schafe und Affen umfassen. Der Begriff modulierbare Immunantwort, wie hierin verwendet, bezeichnet dabei die Eigenschaft des Testsystems, dass die Immunantwort des Testsystems unter dem Einfluss eines oder mehrerer Faktoren wie Adjuvanzien und/oder eines Modulators für die Immunantwort erhöht und/oder verringert werden kann. Bevorzugterweise weist das Testsystem die Fähigkeit der Verringerung einer Immunantwort bei Zusetzen eines geeigneten Modulators auf. Solche Modulatoren können sodann als immunsupprimierende Mittel verwendet werden.

Der Begriff Modulator, wie hierin verwendet, bezeichnet eine chemische Verwendung oder ein biologisches Agens, welches die Immunantwort moduliert, d. h. diese erhöht oder verringert. Indem mittels der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA die Immunantwort stimuliert wird, sind somit Untersuchungen möglich, die bisher ohne Verwendung eines entsprechenden Adjuvans nicht möglich waren. Gleichzeitig wird durch die erhöhte Stabilität der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA gewährleistet, dass lediglich ein minimaler Eingriff in das verwendete Testsystem erfolgt, da infolge der erhöhten Lebensdauer der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA nur vergleichsweise geringe Mengen der doppelsträngigen RNA zu dem Testsystem hinzugesetzt werden müssen. Durch das unter dem Einfluss der erfindungsgemäßen dsRNA erhöhte Aktivitätsniveau der Immunantwort des Testsystems können somit geringfügige Änderungen, insbesondere auch solche, die wegen des geringen Aktivitätsniveaus ohne den Einfluss der erfindungsgemäßen dsRNA analytisch nicht zugänglich wären, und die durch einen Modulator bzw. einen Kandidaten-Modulator in dem Testsystem erzeugt werden, überwacht werden. Damit wird der Zugang zu und damit das Screenen und letztlich die Verwendung solcher Modulatoren erstmals möglich, die bei Verwendung von Testsystemen nach dem Stand der Technik nicht zugänglich wären oder gescreent werden könnten.

Der Begriff der Kandidaten-Modulatoren bezeichnet insoweit einen Modulator, dessen Eigenschaft, die Immunantwort eines Testsystems zu verändern, erst getestet werden muss. Für den Fall, dass sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens das Ergebnis einstellt, dass der Kandidaten-Modulator die Immunantwort des Testsystems tatsächlich moduliert oder verändert, handelt es sich bei dem Kandidaten-Modulator um einen Modulator der Immunantwort.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Screenen von Modulatoren der Immunantwort eines Testsystems ist dabei vorgesehen, dass die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA in ihren verschiedenen Ausführungsformen, wie sie hierin beschrieben sind, verwendet werden kann.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligoribonukleotid, welches mindestens einen doppelsträngigen Bereich zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens umfasst, wobei ein Strang des doppelsträngigen Bereiches einen zum Zielgen im Wesentlichen komplementären Bereich aufweist und der komplementäre Bereich weniger als 25 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist und das Oligoribonukleotid wenigstens ein L- Nukleotid umfasst

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben weiterhin überraschend festgestellt, dass es möglich ist, die Vorteile Oligoribonukleotid, welches mindestens einen doppelsträngigen Bereich zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens umfasst, wobei ein Strang des doppelsträngigen Bereiches einen zum Zielgen im Wesentlichen komplementären Bereich aufweist und der komplementäre Bereich weniger als 25 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist, und in der Fachwelt auch als RNAi beschrieben ist, so z. B. in der internationalen Patentanmeldung WO 00/44895, hinsichtlich seiner Wirkung, insbesondere der Lebensdauer und damit der Wirkzeit in einem biologischen System, weiter zu verbessern, indem das Oligoribonukleotid mindestens ein L-Nukleotid umfasst. Wie bei RNAi nach dem Stand der Technik kommt es auch bei der erfindungsgemäßen RNAi, d. h. bei dem Oligoribonukleotid, welches mindestens einen doppelsträngigen Bereich zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens umfasst, wobei ein Strang des doppelsträngigen Bereiches einen zum Zielgen im Wesentlichen komplementären Bereich aufweist und der komplementäre Bereich weniger als 25 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist, zu einer Wechselwirkung zwischen dem einen Strang des doppelsträngigen Bereiches des Oligoribonukleotids und dem Zielgen bzw. einer mRNA des entsprechenden Zielgens. Dabei ist es für den dem Phänomen der RNAi zugrundeliegenden Mechanismus offensichtlichbevorzugt, dass der doppelsträngige Bereich des Oligoribonukleotids bevorzugterweise eine Länge von 25 oder weniger aufeinanderfolgenden Nukleotidpaaren aufweist.

Hinsichtlich der Ausgestaltung der erfindungsgemäßen RNAi gilt das hierin zur Ausgestaltung der erfindungsgemäßen dsRNA Gesagte im gleichen Maße.

Infolge der Allgemeingültigkeit des der RNAi zugrundeliegenden Wirkmechanismus kann praktisch ein jedes Zielgen mit RNAi und auch mit dem erfindungsgemäßen Oligoribonukleotid, das hierin auch als erfindungsgemäße RNAi bezeichnet wird, adressiert und dessen Expression somit verringert oder unterbunden werden. Voraussetzung dafür ist, wie vorstehend bereits ausgeführt, die Komplementarität eines der die doppelsträngige Struktur des Oligoribonukleotid ausbildenden Teils, genauer gesagt eines einzelsträngigen Teils des doppelsträngigen Bereichs davon.

Diese allgemeine Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen RNAi gilt dabei für die Verwendung im Bereich von Therapie und Prävention bzw. Herstellung entsprechender Medikamente ebenso wie für in vitro-Verfahren, wie beispielsweise bei Target- Identifizierungsverfahren und Target-Validierungsverfahren, bei denen bevorzugterweise in Zellen die Zielgene in ihrer Expression modifiziert werden können unter Verwendung der erfindungsgemäßen RNAi in den entsprechenden Zellen.

Infolge des Wirkmechanismus ist es besonders bevorzugt, wenn das wenigstens eine L- Nukleotid am 5'-Ende und/oder 3'-Ende zumindest eines Stranges, der an der Ausbildung der doppelsträngigen Struktur des erfindungsgemäßen Oligoribonukleotids beteiligt ist, angebracht ist. Entsprechend ist ein "Capping", wie hierin beschrieben, mit einem oder mehreren L-Nukleotiden bei der Realisierung bzw. Verwendung der erfindungsgemäßen RNAi besonders bevorzugt, wenngleich auch solche erfindungsgemäßen Oligoribonukleotide in vorteilhafter Weise verwendet werden können, wie vorstehend beschrieben, bei denen ein "Doping" erfolgt ist. Gleiches gilt für solche erfindungsgemäße RNAi, welche sowohl ein Capping als auch ein Doping zeigt.

Die vorliegende Erfindung wird nun im folgenden anhand der Figuren und Beispiele weiter erläutert werden, wobei
Fig. 1 das gelelektrophoretische Ergebnis der Inkubation von L-RNA und aus unmodifizierten D-Nukleotiden aufgebauter RNA nach Inkubation in Serum;
Fig. 2 die Stabilität von L-RNA gegen enzymatischen Abbau relativ zu Nukleinsäuren aus 2'-Amino-modifizierten D-Nukleotiden;
Fig. 3 das Modell für die Inhibition der Translation durch doppelsträngige RNA und den davon unabhängigen Aktivierungsmechanismus von Stress-aktivierten MAP-Kinasen durch dsRNA; und
Fig. 4 die unspezifische Translationsinhibition durch doppelsträngige RNA mit den beiden wichtigen Signalkaskaden PKR und 2',5'-Oligoadenylatsynthase zeigt.

Beispiel 1

Stabilität von L-RNA gegen enzymatischen Abbau relativ zu unmodifizierter D-RNA

Es wurde die Stabilität von L-RNA relativ zu unmodifizierter RNA, d. h. D-RNA, bei Inkubation in Serum untersucht. Die D-RNA wurde für einige Sekunden, die L-RNA für mehrere Stunden in Serum inkubiert, bevor der Reaktionsansatz auf ein Agarosegel unter Standardbedingungen aufgetragen wurde, um den Anteil an nicht abgebauter RNA zu bestimmen. Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt. Dabei zeigt Fig. 1A, dass die unmodifizierte RNA innerhalb Sekunden abgebaut wird, während die L-RNA, wie in Fig. 1B dargestellt, auch noch nach sechs Stunden keinen signifikanten Abbau zeigte.
Ein ähnlicher Vergleich wurde hinsichtlich der Stabilität von L-RNA und 2'-Amino- modifizierter RNA, ebenfalls bei Inkubation in Serum, aufgestellt. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt.
Wie aus der Darstellung ersichtlich, ist eine Nukleinsäure, die vollständig aus L-Nukleotiden besteht, gegenüber enzymatischem Abbau resistent. So konnte gezeigt werden, dass auch nach 60 Stunden die Mengen an nicht abgebauter RNA 100% betrug. Im Gegensatz dazu zeigten RNAs, die eine 2'-Amino-Modifikation aufwiesen, bei der gleichen Untersuchung nach 60 Stunden lediglich noch einen Wert von ca. 10-20% an nicht abgebauter RNA. Unmodifizierte RNA, in Fig. 2 nicht dargestellt, wird bereits nach wenigen Sekunden abgebaut, wie vorstehend gezeigt wurde.
Diese Daten belegen, dass L-RNA unter Bedingungen, wie sie in einem biologischen System, sei es in vitro oder in vivo, wie einem biochemischem Assay, einem zellulären Assay, einem Zellfragment-Assay oder einem Tiermodell, gegenüber Nukleinsäure und insbesondere Ribonukleinsäure aus D-Nukleotiden, sei es, dass diese modifiziert oder nicht-modifiziert vorliegen, eine erhöhte Stabilität und somit Wirksamkeit aufweist, was die hierin offenbarte Verwendung von doppelsträngiger RNA, die wenigstens ein L-Nukleotid umfasst, belegt.

Beispiel 2

Stabilität von RNAs mit L-Nukleotid am 5'-Ende

Die Stabilitätsuntersuchung der Oligonukleotide erfolgte durch Inkubation der Festphase (Eupergit C 250L von Röhm Pharma GmbH, Weiterstadt; ein Copolymerisat aus Methacrylamid, N-Methylen-bis-methacrylamid und oxirangruppenhaltigen Monomeren; makroporöse Perlen mit 250 µm Durchmesser; biokompatibel. Quelle: Produktinformation Röhm Pharma), an der die zu untersuchenden Oligonukleotide immobilisiert waren, in humanem Serum bei 37°C. Der pH-Wert des Serums wurde durch den Zusatz von 10 mM Natriumphosphat pH 7,0 zusätzlich gepuffert. Ähnliche Stabilitätsuntersuchungen wurden unter Verwendung von Plasma anstelle von Serum durchgeführt. Die Ergebnisse der entsprechenden Untersuchungen sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt, wobei die angegebenen Werte den Verlust an Oligonukleotid, ausgedrückt in % der ursprünglich immobilisierten Menge, angeben. Die Länge der immobilisierten Nukleinsäure betrug 52 Nukleotide ("52-mer"). Die Immobilisierung erfolgte über einen am 3'-Ende der Nukleinsäure vorhandenen Biotin-Rest ("(52-mer)3'-Biotin"), wobei die Vergleichs- Nukleinsäure im zweiten Versuchsansatz noch am 5'-Ende ein L-Nukleotid (capping) aufwies ("5'-L(52-mer)3'-Biotin"). Tabelle 1 Stabilität der immobilisierten Nukleinsäure bei Exposition gegenüber Plasma

Tabelle 2 Stabilität der immobilisierten Nukleinsäure bei Exposition gegenüber Serum

Beispiel 3

dsRNA als Interferon-Induktor

Das in Fig. 3 dargestellte Modell zeigt die Inhibition der Translation durch dsRNA und den davon unabhängigen Aktivierungsmechanismus von Stress-aktivierten MAP-Kinasen durch dsRNA. Infolge der Tatsache, dass die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA ein Verhalten hinsichtlich der von ihr ausgehenden Wirkung zeigt, das demjenigen von dsRNA aus D- Nukleotiden entspricht, kommt es auch bei Verwendung der erfindungsgemäßen dsRNA zur Induktion von Interferon.

Beispiel 4

Abbau von längeren dsRNA zu kurzen siRNAs durch Dicer

Fig. 4 zeigt die unspezifische Translationsinhibition durch lange dsRNA, d. h. solcher doppelsträngiger RNA, die mehr als 30 Basenpaare aufweist, vermittels der beiden wichtigsten Signalkaskaden, nämlich PKR und 2',5'-Polyadenylatsynthetase, und den Abbau der dsRNA durch RNase III (Dicer) zu den kurzen siRNAs, short interfering RNAs, die nicht mehr unspezifisch die Translation inhibieren, aber dafür sequenzspezifisch den Abbau der mRNA induzieren.
Infolge des hierein offenbarten Mechanismus kann für den Fall, dass die erfindungsgemäße doppelsträngige RNA vollständig aus L-Nukleotiden aufgebaut ist, der vorstehend beschriebene Mechanismus nicht mehr wirken, mit der Folge, dass es zu keiner Ausbildung von kurzen interferierenden RNAs kommt und somit die ansonsten damit einhergehende Verringerung der Genaktivität unterbleibt.
Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

1. Verwendung von doppelsträngiger RNA als Adjuvans, dadurch gekennzeichnet, dass die doppelsträngige RNA wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

2. Verwendung von doppelsträngiger RNA zur Herstellung eines Medikamentes, dadurch gekennzeichnet, dass die doppelsträngige RNA wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament für die Behandlung einer Krankheit ist, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, die Krebs, Infektionskrankheiten und virale Erkrankungen umfasst.

4. Verwendung von doppelsträngiger RNA als Translations-Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA mindestens ein L-Nukleotid umfasst.

5. Verwendung von doppelsträngiger RNA als Induktor für Interferon, insbesondere Typ 1 Interferon, dadurch gekennzeichnet, dass die doppelsträngige RNA mindestens ein L-Nukleotid umfasst.

6. Verwendung von doppelsträngiger RNA zur Aktivierung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe, die Proteinkinase PKR, Transkriptionsfaktoren, insbesondere NF-KAPPA-B, Oligoadenylat-Synthetase, JNK, p38 MAPK und pyrogene Cytokine umfasst, und die doppelsträngige RNA zumindest ein L-Nukleotid umfasst.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das pyrogene Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe, die IL-6, TNFalpha, IL-1beta und IFN-gamma umfasst.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die doppelsträngige RNA wenigstens ein L-Nukleotid an dem 3'- und/oder 5'-Ende umfasst.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein L-Nukleotid in wenigstens einem Strang der doppelsträngigen RNA enthalten ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eines der die doppelsträngige RNA aufbauenden Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Nukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, die 2'-Amino-Nukleotide, 2'-Alkyl- Nukleotide und 2'-Methoxy-Nukleotide umfasst.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das modifizierte Nukleotid ein modifiziertes L-Nukleotid ist.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die doppelsträngige RNA oder zumindest ein Teil davon eine Rückgratmodifikation aufweist, wobei die Modifikation bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe, die Phosphorothioate und PNA umfasst.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an L-Nukleotiden relativ zum Gesamtgehalt der die doppelsträngige RNA aufbauenden Nukleotide 5% bis 100% beträgt.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt 10% bis 100%, bevorzugterweise 20% bis 100% und bevorzugtererweise 50% bis 100% beträgt.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die dsRNA eine Länge von mindestens etwa 30 Basenpaaren aufweist.

17. Verfahren zum Screenen von Modulatoren der Immunantwort, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen eines Testsystems, wobei das Testsystem eine modulierbare Immunantwort zeigt,

b) Hinzufügen von doppelsträngiger RNA zu dem Testsystem, wobei die doppelsträngige RNA wenigstens ein L-Nukleotid umfasst,

c) Hinzufügen eines Kandidaten-Modulators,

d) Bestimmen, ob unter dem Einfluss des Kandidaten-Modulators die Immunantwort des Testsystems moduliert wird.

18. Oligoribonukleotid, umfassend mindestens einen doppelsträngigen Bereich zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens, wobei ein Strang des doppelsträngigen Bereiches einen zum Zielgen im Wesentlichen komplementären Bereich aufweist und der komplementäre Bereich weniger als 25 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligoribonukleotid wenigstens ein L-Nukleotid umfasst.

19. Oligoribonukleotid nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der komplementäre Bereich 17 bis 23, bevorzugterweise 19 bis 21 aufeinanderfolgende Nukleotide aufweist.

20. Oligoribonukleotid nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligoribonukleotid aus zwei einzelnen Ribonukleotid-Einzelsträngen gebildet ist.

21. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielgen aus der Gruppe ausgewählt ist, die Onkogene, Cytokin-Gene, ID- Protein-Gene, Entwicklungsgene, Priogene, Gene für Enzyme, Gene für Cytokine, Gene für Interferone, Gene für Botenstoffe und Gene für Strukturproteine umfasst.

22. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligoribonukleotid wenigstens ein L-Nukleotid an einem der 3'- und/oder 5'- Enden umfasst.

23. Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eines der das Oligoribonukleotid aufbauenden Nukleotide ein modifiziertes Nukleotid ist.

24. Medikament umfassend ein Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 18 bis 23.

25. Verwendung eines Oligoribonukleotids nach einem der Ansprüche 18 bis 23 zur Herstellung eines Medikamentes.

26. Verwendung eines Oligoribonukleotids nach einem der Ansprüche 18 bis 23 zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens in einer Zelle, insbesondere in vitro.

27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine eukaryontische, bevorzugterweise eine Säugetier-Zelle ist.