-
Hintergrund
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Kontrolle der Genexpression.
Genauer gesagt, bezieht sich diese Erfindung auf die Verwendung
von synthetischen Oligonukleotiden, um die Expression eines Gens in
einem Tier herunterzuregulieren.
-
Das
Potential für
die Entwicklung eines Antisense Oligonukleotide therapeutischen
Ansatzes wurde zuerst in drei Artikeln, die 1977 und 1978 publiziert
wurden, vorgeschlagen. Paterson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
(1977) 74: 4370-4374) offenbart, dass zellfreie Translation von
mRNA durch die Bindung eines Oligonukleotids, das zu der mRNA komplementär ist, gehemmt
werden kann. Zamcnik et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978)
75. 280-284 und 285-288) offenbart, dass ein 13mer synthetisches
Oligonukleotid, das zu einem Teil des Rous Sarcoma Virus (RSV) Genoms
komplementär
ist, RSV Replikation in infizierten Hühner Fibroblasten hemmt und
RSV vermittelte Transformation von primären Hühner Fibroblasten in maligne
Sarcoma Zellen hemmt.
-
Diese
frühen
Indikationen, dass synthetische Oligonukleotide verwendet werden
können,
um Virus Verbreitung und Neoplasien zu hemmen, wurden gefolgt von
der Verwendung synthetischer Oligonukleotide, um eine breite Vielzahl
von Viren, wie HIV (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 4,806,463); Influenza
(siehe z.B. Leiter et al. (1990) (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:
3430-3434); Vesicular Stomatitis Virus (siehe z.B. Agris et al. (1986)
Biochem. 25: 6268-6275); Herpes Simplex (siehe z.B. Gao et al. (1990)
Antimicrob. Agents Chem. 34. 808-812); SV40 (siehe z.B. Birg et
al. (1990) (Nucleic Acids Res. 18: 2901-2908); und humanes Papilloma
Virus (siehe z.B. Storey et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4109-4114)
zu hemmen. Eine Übersicht über die Verwendung
synthetischer Oligonukleotide und ihrer Analoge als antivirale Agentien
wurden ausgiebig durch Agrawal (Trends in Biotech. (1992) 10: 152-158)
geliefert.
-
Zusätzlich wurden
synthetische Oligonukleotide verwendet, um eine Vielzahl von nicht
viralen Pathogenen zu hemmen, wie auch um selektive die Expression
von bestimmten zellulären
Genen zu hemmen. Somit wurde die Verwendbarkeit von synthetischen
Oligonukleotiden als Agenzien zur Hemmung der Virus Verbreitung,
der Verbreitung von nicht-viralen Pathogenen und selektiven Expression
von nicht zellulären
Genen gut belegt.
-
Verbesserte
Oligonukleotide wurden kürzlich
entwickelt, die eine größere Wirksamkeit
aufweisen bei der Hemmung solcher Viren, Pathogene und selektiver
Genexpression. Einige dieser Oligonukleotide mit Modifikationen
in ihren Internukleotid Verbindungen erwiesen sich als wirksamer
als ihre nicht unmodifizierten Gegenstücke. Zum Beispiel lehrt Agrawal
et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1988) 85. 7079-7083), dass
Oligionukleotid Phosphorothioate und bestimmte Oligonukleotid Phosphoroamidate
wirksamer bei der Inhibierung von HIV 1 sind als konventionelle
Phosphodiester verbundenen Oligodeoxyukleotide. Agrawal et al. (Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) (1989) 86: 7790-7794) offenbart den Vorteil von
Oligonukleotid Phosphorothioaten bei der Hemmung von HIV-1 bei früh und chronisch
infizierten Zellen.
-
Zusätzlich wurden
chimäre
Oligonukleotide mit mehr als einem Typ von Internukleotid Verbindung
innerhalb des Oligonukleotids entwickelt. Pederson et al. (U.S.
Patent Nr. 5,149,797 und 5,220,007) offenbart chimäre Oligonukleotide
mit einer Oligonukleotid Phosphodiester oder Oligonukleotid Phosphorothioat
Kernsequenz flankiert durch Nukleotid Methylphosphonate oder Phosphoramidate.
Furdon et al. (Nucleic Acids Res. (1989) 17: 9193-9204) offenbart chimäre Oligonukleotide
mit Bereichen von Oligonukleotid Phosphodiestern zusätzlich zu
entweder Oligonukleotid Phosphorothioat oder Methylphosphonat Bereichen.
Quartin et al. (Nucleic Acids Res. (1989) 17: 7523-7562) offenbart
chimäre
Oligonukleotide mit Bereichen aus Oligonukleotid Phosphodiestern
und Oligonukleotid Methyphosphonaten, Inoue et al. (FEBS Lett. (1987)
215: 237-250) offenbart chimäre
Oligonukleotide mit Bereichen aus Deoxyribonukleotiden und 2'-O-Methyl-Ribonukleotiden.
-
Viele
dieser modifizierten Oligonukleotide trugen bei die potentielle
Wirksamkeit des Antisense Oligonukleotid therapeutischen Ansatzes
zu verbessern. Jedoch, bestimmte Defizite sind in den bekannten
Oligonukleotide vorhanden, und diese Defizite können die Wirksamkeit solcher
Oligonukleotide als therapeutische Agenzien begrenzen. Zum Beispiel
lehrt Wickstrom (J. Biochem. Biophys. Meth. (1986) 13: 97-102),
dass Oligonukleotid Phosphodiester für Nuklease vermittelten Abbau
empfänglich
sind, wodurch ihre Bioverfügbarkeit in
vivo begrenzt wird. Agarawal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
(1990) 87: 1401-1405) lehrt, dass Oligonukleotid Phosphoramidate
oder Methylphosphonate, wenn sie an RNA hybridisiert sind, RNase
H nicht aktivieren, wobei deren Aktivierung wichtig sein kann für die Funktion
der Antisense Oligonukleotide. Somit gibt es einen Bedarf für Verfahren
zur Kontrolle der Genexpression, die Oligonukleotide mit verbesserten
therapeutischen Eigenschaften verwenden.
-
Zahlreich
Berichte wurden veröffentlicht
bezüglich
der Entwicklung von Phosphorothioat verbundenen Oligonukleotiden
als potentielle anti-AIDS therapeutische Agenzien. Obgleich ausgiebige
Studien der chemischen und molekularen Mechanismen der Oligonukleotide
den potentiellen Wert dieser neuartigen therapeutischen Strategie
belegten, ist wenig bekannt über
die Pharmakokinetiken und den Metabolismus dieser Verbindungen in
vivo.
-
Zahlreiche
vorläufige
Studien bezüglich
dieses Themas wurden veröffentlicht.
Agrawal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1991) 88: 7595-7599)
beschreibt die intravenöse
und intraperitonale Verabreichung an Mäuse eines 20mer Phosphorothioate
verbundenen Oligonukleotids. In dieser Studie wurden ungefähr 30% der
verabreichten Dosis in dem Urin über
die ersten 24 Stunden ausgeschieden mit Anhäufung vorzugsweise in der Leber
und Niere. Die Plasma Halbwertszeiten reichten von ungefähr 1 Stunde
(t1/2α)
bis beziehungsweise 40 Stunden (t1/2β). Ähnliche
Ergebnisse wurden in nachfolgenden Studien berichtet (Iversen (1991)
Anti-Cancer Drug Design 6: 531-538; Iversen (1994) Antisense Res.
Devel. 4: 43-52); und Sands (1994) Mol. Pharm. 45: 932-943). Jedoch
können
Stabilitätsprobleme
auftreten, wenn die Oligonukleotide intravenös und intraperitonal verabreicht
werden. Vor kurzer Zeit durchgeführte
Studien belegten, dass zwei Hybrid Oligonukleotide, die zwei End-geschützte [35S]-radioaktiv markierte Analoge eines 25mer
Oligonukleotid Phosphorothioats, eines enthaltend Segmente von 2'-O-Methyloligoribonukleotid
Phosphorothioaten an beiden 3'- und 5'-Termini (MBO 1)
und eines anderen enthaltend Methyl Phosphonat Verbindungen an beiden
3'- und 5'-Termini (MBO 2)
eine enterohepatische Zirkulation in Ratten nach i.v. Bolus Verabreichung
aufwiesen, mit einer signifikant besseren in vivo Stabilität als das
Oligonukleotid Phosphorothioat (Zhang et al. (1995) Biochem. Pharmacol.
49: 929-939; Zhang et al. (1995) Biochem. Pharmacol. 50: 571-576;
und Zhang et al. (1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278: 971-979). Hybrid Oligonukleotide
wurden auch oral an Ratten verabreicht bei geringerem Abbau (Zhang et
al. (1995) Biochem. Pharm. 50: 545-556).
-
WO
94/17093 offenbart ein Oligonukleotid Analog umfassend wenigstens
ein Ribonukleotid Alkylphosphonat oder Alkylphosphonothioate. Dieses
Analog ist vorzugsweise 2 bis 60 Nukleotide lang und besitzt wenigstens
ein Ribonukleotid substituiert an der 2' Position seiner Ribose Gruppe. Offenbart
sind auch therapeutische Formulierung umfassend dieses Oligonukleotid
Analog, Verfahren zum Hemmen der Expression eines Gens aus einem
Virus, pathogenen Organismus, oder einer Zelle, wobei deren Expression
mit einem Krankheitszustand einhergeht, und Verfahren zum Behandeln
eines Säugers,
der mit einem Virus oder pathogenen Organismus infiziert ist, oder
unter einer krankhaften Störung
leidet, die aus der Expression eines zellulären Gens resultiert.
-
WO
96/12497 offenbart ein Verfahren zum Herunterregulieren der Expression
eines Gens in einem Tier, wobei eine pharmalogische Formulierung
umfassend ein Oligonukleotid, das komplementär ist zu dem Gen, oral an ein
Tier verabreicht wird. Das verabreichte Oligonukleotid besitzt nicht
Phosphodiester Internukleotid Verbindungen und schließt ein wenigstens
ein 2'-substitutiertes
Ribonukleotid, wobei das Oligonukleotid die Expression eines Produktes
des Gens hemmt, wodurch die Expression des Gens herunterreguliert
wird.
-
WO
97/05267 offenbart eine Zusammensetzung zum Verabreichen eines Polynukleotids
an mukosale, neurale oder andere Zellen umfassend ein GN1 bindendes
Protein und ein Polynukleotid in Assoziierung mit dem bindenden
Protein; und ein Verfahren zum Modellierung der Immunität umfassend
die Verabreichung der Zusammensetzung an ein Tier und Exprimieren
des Polynukleotids, wobei das Tier eine Immunantwort gegen das Produkt
des Polynukleotids erzeugt. WO 97/05267 offenbart auch ein Verfahren
für die
Gentherapie umfassend die Verabreichung eines GM1 bindenden Proteins
und eines funktionalen Polynukleotids an ein Tier und Exprimieren
des Polynukleotids in dem Tier, wobei die Funktion des Polynukleotids
dem Tier einen therapeutischen Effekt vermittelt.
-
Jedoch
verbleicht immer noch ein Bedarf fpr wirksamere therapeutische Verfahren
zum Herunterregulieren der Expression von Genen zu entwickeln, die
leicht manipuliert werden können,
dass sie für
das zu behandelnde Tier und die zu behandelnde Kondition, und für das anzuzielende
Gen passen.
-
Vorzugsweise
sollten diese Verfahren einfach, schmerzlos und genau bei der Einwirkung
auf das Zielgen sein.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Formulierung zur
Verfügung
umfassend ein Oligonukleotid von ungefähr 12 bis ungefähr 50 Nukleotiden,
das Nicht-Phosphodiester
Internukleotid Verbindungen besitzt und komplementär zu einem
angezielten Gen ist, für
die kolorektale Verabreichung an einen Säuger, wobei das Oligonukleotid
3' und 5' Termini besitzt,
und ferner wenigstens ein 2'-substituiertes
Ribonukleotid an dem 5' Terminus,
an dem 3' Terminus
oder an dem 5' Terminus
und dem 3' Terminus
umfasst.
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines
Oligonukleotids bereit von ungefähr
15 bis 25 Nukleotiden und umfassend Nicht-Phosphodiester Internukleotid
Verbindungen für
die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung für kolorektale
Verabreichung für
die Behandlung von Virusinfektionen, Infektionen durch pathogene
Organismen, oder Krankheiten oder Funktionsstörungen, die aus abnormaler
Genexpression oder aus der Expression eines abnormalen Genproduktes
resultieren, wobei das Oligonukleotid 3' und 5' Termini besitzt, und ferner wenigstens
ein 2'-substituiertes
Ribonukleotid an dem 5' Terminus,
an dem 3' Terminus
oder an dem 5' Terminus
und dem 3' Terminus
umfasst.
-
Es
wurde entdeckt, dass bestimmte endmodifizierte Oligonukleotide in
vivo relativ stabil sind nach kolorektaler Verabreichung an ein
Tier, und dass diese Moleküle
erfolgreich von dem intestinalen Trakt absorbiert werden, und an
zahlreiche Körpergewebe
unter geringem Abbau verteilt werden. Somit umgeht diese Form der
Verabreichung die Schwierigkeiten, die während oraler, intravenöser und
anderer Arten der in vivo Verabreichung auftreten können. Diese
Entdeckung wurde benützt,
um die vorliegende Erfindung zu entwickeln, die ein Verfahren ist,
die Expression eines Gens in einem Tier herunterzuregulieren.
-
Dieses
Verfahren ist auch ein Mittel, die Funktion zahlreicher Gene in
einem Tier zu untersuchen, einschließlich derer, die für die Entwicklung
eines Tieres essentiell sind. Gegenwärtig kann Genfunktion nur untersucht
werden durch die arbeitsintensive Aufgabe, ein „knock out" Tier, wie eine Maus, herzustellen.
Diese Aufgabe ist schwierig, benötigt
viel Zeit und kann nicht für
Gene durchgeführt
werden, die für
die Entwicklung eines Tieres essentiell sind, da der „knock
out" einen lethalen
Phänotyp
produzieren würde.
Die vorliegende Erfindung überwindet
die Nachteile dieses Modells.
-
Bei
der Verwendung der Erfindung wird eine pharmazeutische Formulierung
enthaltend ein Olgonukleotid, das komplementär zu dem angezielten Gen ist,
kolorektal verabreicht in einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
an das Tier, das das Gen enthält.
Das Oligonukleotid hemmt die Expression des Gens, wodurch seine
Expression herunterreguliert wird.
-
Für Zwecke
dieser Erfindung, soll der Begriff „Tier" verstanden werden, Menschen wie auch
andere Säuger,
wie auch Reptilien, Amphibien, und Insekten zu umfassen. Der Begriff „kolorektale
Verabreichung" oder „rektale
Verabreichung" oder „kolorektal verabreicht" bezieht sich auf
die Bereitstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierung
für jeden
Teil des Dickdarms über
chirurgische Implantation, anale Verabreichung, oder jede andere
Weise der Platzierung darin.
-
Das
verabreichte Oligonukleotid besitzt nicht-Phosphodiester Bindungen.
Wie hier verwendet, soll der Begriff „Oligonukleotid" verstanden werden,
Polymere von zwei oder mehr Nukleotiden oder Nukleotidanalogen einzuschließen, die über 5' zu 3' Internukleotid Bindungen
verbunden sind, die jede Bindung einschließen können, die in der Antisense
Technik bekannt ist. Solche Moleküle haben einen 3' Terminus und einen
5' Terminus.
-
Der
Begriff „Nicht
Phosphodiester verbundenes Oligonukleotid", wie hier verwendet, ist ein Oligonukleotid,
in dem all seine Nukleotide über
eine synthetische Verbindung kovalent verbunden sind, d.h. eine
Bindung, die keine Phosphodiester Bindung ist, zwischen dem 5' Ende eines Nukleotids
und dem 3' Ende
eines anderen Nukleotids, bei dem das 5' Nukleotid Phosphat mit jeder Anzahl
von chemischen Gruppen ersetzt wurde. Bevorzugte synthetische Bindungen
schließen
ein Alkylphosphonate, Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Alkylphosphonothioate,
Phosphoramidate, Phosphoramidite, Phosphatester, Carbamate, Carbonate, Phosphattriester,
Acetamidate, und Caboxymethylester. In einer Ausführungsform
der Erfindung, sind alle Nukleotide, die das Oligonukleotid umfasst, über Phosphorothioat
und/oder Phosphorodithioat Bindungen verbunden, und in einer speziellen
Ausführungsform
sind die Nukleotide alle über
Phosphorothioat verbunden.
-
In
einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen
werden die verabreichten Oligonukleotide weiter modifiziert. Wie
hier verwendet, umfasst der Begriff „modifiziertes Oligonukleotid" Oligonukleotide
mit modifizierter(n) Nukleinsäure(n),
Base(n), und/oder Zucker(n), die anders als die sind, die in der
Natur gefunden werden. Zum Beispiel, ist ein 3' und 5' substituiertes Oligonukleotid ein Oligonukleotid
mit einem Zucker, der an beiden sein 3' und 5' Positionen angebracht ist an ein chemischen
Gruppe, die anders als ein Hydroxyl Gruppe (an seiner 3' Position) und als
eine Phosphat Gruppe (an seiner 5' Position) ist.
-
Ein
modifiziertes Oligonukleotid kann auch eines sein mit hinzugefügten Substituenten
wie Diaminen, Cholestryl, oder anderen lipophilen Gruppen, oder
eine gecappte Spezies. Zusätzlich
werden auch unoxidierte oder partiell oxidierte Oligonukleotide
mit einer Substitution in einem nicht verbrückenden Sauerstoff pro Nukleotid
in dem Molekül
auch als modifizierte Oligonukleotide betrachtet. Auch als modifizierte
Oligonukleotide werden betrachtet Oligonukleotide mit Nuklease Resistenz
verleihenden sperrigen Substituenten an ihren 3' und/oder 5' Ende(n) und zahlreiche andere strukturelle
Modifikationen, die in vivo ohne menschlichen Eingriff nicht auftreten,
wer hier auch als modifiziert betrachtet.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung schließen
die verabreichten Oligonukleotide wenigstens ein 2' substituiertes Ribonukleotid
an seinem 3' Terminus
oder 5' Terminus
ein.
-
Für Zwecke
der Erfindung bezieht sich der Begriff „ 2' substituiertes Oligonukleotid" auf ein Oligonukleotid
mit einem Zucker, der an eine chemische Gruppe angefügt ist,
an seiner 2' Position,
die nicht eine Hydroxyl Gruppe ist. Das 2'-OH des Ribose Moleküls kann substituiert werden
mit -O-niedrigem Alkyl enthaltend 1-6 Kohlenstoffatome, Aryl oder
substituiertes Aryl oder Alkyl mit 2-6 Kohlenstoff, z.B., 2'-O-Alkyl, 2'-O-Aryl, 2'-O-Alkyl (wie ein
2'-O-Methyl), 2'-Halo, oder 2'-Amino, aber nicht
mit 2'-H, wobei
Allyl, Aryl, oder Alkyl Gruppen unsubstituiert oder substituiert
seien können,
z.B. mit Halo, Hydroxy, Trifluoromethyl, Cyano, Nitro, Acyl, Acyloxy,
Alkoxy, Alkoxy, Carboxyl, Carbalkoxyl oder Aminogruppen.
-
In
einigen Ausführungsformen
sind alle bis auf vier oder fünf
Nukleotide an dem 5' oder
3' Terminus des
Oligonukleotids 2' substituierte
Ribonukleotide. In anderen Ausführungsformen
besitzt das Oligonukleotid wenigstens ein 2' substituiertes Ribonukleotid an beiden
seinen 3' und 5' Termini, und in
noch weiteren Ausführungsformen,
ist das Oligonukleotid zusammengesetzt aus 2' substituierten Ribonukleotiden an allen
Positionen mit der Ausnahme von wenigstens vier oder fünf zusammenhängenden
Deoxyribonukleotid Nukleotiden an irgendeiner inneren Position.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt ein die Verabreichung eines
Oligonukleotids, das zusammengesetzt ist aus Nukleotiden, die all
2' substituierte
Ribonukleotide sind. Bestimmte Ausführungsformen schließen Oligonukleotide
ein mit einem 2'-O-Alkyl-Ribonukleotid wie
einem 2'-O Methyl.
-
In
anderen Ausführungsformen
besitzt das Oligonukleotid, das nützlich in der Erfindung ist,
wenigstens ein Methylphosphonat Deoxyribonukleotid an seinen 3' und 5' Termini. In einigen
bevorzugten Ausführungsformen
besitzt das Oligonukleotid wenigstens zwei Methylphosphonat Deoxynukleotide
an dem 3' Terminus
und an dem 5' Terminus.
In bestimmten Ausführungsformen
umfasst diese Oligonukleotid Phosphorothioat Internukleotid Verbindungen.
-
In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung, besitzt das verabreichte Oligonukleotid wenigstens ein
Deoxyribonukleotid, und in einer bevorzugten Ausführungsform,
besitzt das Oligonukleotid wenigstens vier oder fünf zusammenhängende Deoxyribonukleotide,
die in der Lage sind RNase H zu aktivieren.
-
Das
verabreichte Oligonukleotid ist komplementär zu einem Gen eines Virus,
pathogenen Organismus, oder eines zellulären Gens in einigen Ausführungsformen
der Erfindung. In einigen Ausführungsformen ist
das Oligonukleotid komplementär
zu einem Gen eines Virus, der involviert ist bei AIDS, oraler oder
genitaler Herpes, Papilloma Warzen, Influenza, Maul und Klauen Seuche,
Gelbfieber, Windpocken, Gürtelrose,
adulter T-Zell Leukämie,
Burkitt's Lymphom,
nasopharyngealen Karzinom oder Hepatitis. In einer besonderen Ausfühungsform,
ist das Oligonukleotid komplementär zu einem Gen, das für ein Protein
kodiert, das mit der Alzheimer Krankheit assoziiert ist.
-
In
noch anderen Ausführungsformen
ist das Oligonukleotid komplementär zu einem Gen, das für ein Protein
kodiert, das in einem Parasiten exprimiert wird, der ein parasitische
Krankheit, wie Amebiasis, Chagaskrankheit, Toxoplasmosis, Pneumocytosis,
Lambliasis, Kryptoporidiosis, Trichmoniasis, Malaria, Askaridiasis, Filariasis,
Trichinose und Schistosomiasis Infektionen.
-
In
einem anderen Aspekt stellt die Erfindung das Einbringen eines intakten
Oligonukleotids in ein Tier bereit. In diesem Verfahren wird ein
endgeschütztes
Oligonukleotid kolorektal an das Tier verabreicht, wobei das Oligonukleotid
in intakter Form in dem systemischen Plasma des Säugers für wenigstens
vier Stunden nach Verabreichung vorliegt.
-
Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff „intakte Form" auf ein verabreichtes
Oligonukleotid, das vergleichsweise unabgebaut oder unverdaut ist.
Dieses Oligonukleotid ist ungefähr
5 bis 50, vorzugsweise ungefähr
12 bis 35, und am bevorzugtesten 15 bis 25 Nukleotide lang.
-
Ein „endgeschütztes Oligonukleotid" wird hier verwendet,
um ein Oligonukleotid zu beschreiben, das an seinem 5' und/oder 3' Terminus modifiziert
ist, so dass es weniger anfällig
für enzymatischen
Abbau durch Exonukleasen ist, als Oligonukleotide, die nicht endgeschützt sind.
Jede Modifikation an dem Terminus oder den Termini eines verabreichten
Oligonukleotids, die in dem Schutz vor Exonuklease resultiert, die
aber nicht die Eignung eines Oligonukleotids an ein komplementäre Nukleotidsequenz
zu hybridisieren hemmt, wird verstanden, als durch diesen Begriff
umfasst zu sein. In einer Ausführungsform,
umfasst ein endgeschütztes
Oligonukleotid wenigstens ein 2'-O-Methyl-Ribonukleotid oder
Methylphosphonat Deoxynukleotid an jedem Terminus. In einer anderen
Ausführungsform
umfasst das endgeschützte
Oligonukleotid wenigstens zwei 2'-O-Methyl-Ribonukleotide
oder Methylphosphonat Deoxyribonukleotide an jedem Terminus. In
noch einer anderen Ausführungsform
umfasst das endgeschützte
Oligonukleotid wenigstens zwei 2'-O-Methyl-Ribonukleotide
an jedem Terminus und umfasst ferner Phosphorothioate Internukleosid
Bindungen. In noch einer anderen Ausführungsform umfasst das endgeschützte Oligonukleotid
wenigstens zwei Methylphosphonat Deoxyribonukleotide an jedem Terminus
und umfasst ferner Phosphorothioate Internukleotid Bindungen. In
einigen Ausführungsformen
umfasst das endgeschützte
Oligonukleotid vier Methylphosphonat Deoxyribonukleotide an jedem
Terminus.
-
Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
-
Die
vorstehenden und andere Ziele der vorliegenden Erfindung, ihre zahlreichen
Eigenschaften, wie auch die Erfindung selbst kann vollständiger durch
die folgende Beschreibung verstanden werden, wenn sie zusammen mit
den beigefügten
Zeichnungen gelesen wird, bei denen:
-
1 eine
schematische Darstellung der enterohepatischen Zirkulation der Oligonukleotide
und der Verabreichung solcher Oligonukleotide durch den gastrointestinalen
Trakt ist;
-
2 eine
schematische Darstellung der chemischen Struktur des PS-Oligonukleotids
und endmodifizierten MBO 1 (SEQ ID NO: 11) und MBO 2 (SEQ ID NO:
16) ist;
-
3A ein
HPLC Profil des radioaktiv markierten MBO 1 Standards ist;
-
3B ein
HPLC Profil der Radioaktivität
in den Inhalten des Dickdarms einer Ratte 4 Stunden nach Verabreichung
des radioaktiv markierten MBO 1 in den Dickdarm der Ratte ist;
-
3C ein
HPCL Profil der Radioaktivität
in dem Dickdarm einer Ratte 4 Stunden nach Verabreichung des radioaktiv
markierten MBO 1 in den Dickdarm der Ratte ist;
-
4 eine
graphische Darstellung der Konzentration der MBO 1 Äquivalente
im Plasma zu zahlreichen Zeitpunkten nach Verabreichung zahlreicher
Dosierungen von MBO 1 in den großen Dickdarm einer Ratte ist;
-
5 eine
graphische Darstellung der Konzentration der MBO 1 Äquivalente
in ausgewählten
Geweben 4 Stunden nach Verabreichung von zahlreichen Dosierungen
von MBO 1 in den Dickdarm einer Ratte ist;
-
6A ein
HPLC Profil der Radioaktivität
in dem Plasma einer Ratte 4 Stunden nach Verabreichung des radioaktiv
markierten MBO 1 in den Dickdarm der Ratte ist;
-
6B ein
HPLC Profil der Radioaktivität
in der Leber einer Ratte 4 Stunden nach Verabreichung des radioaktiv
markierten MBO 1 in den Dickdarm der Ratte ist; und
-
6C ein
HPLC Profil der Radioaktivität
in der Niere einer Ratte 4 Stunden nach Verabreichung des radioaktiv
markierten MBO 1 in den Dickdarm der Ratte ist.
-
Eingehende
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
-
Die
Patent und wissenschaftliche Literatur, auf die hier Bezug genommen
wird, stellt das Wissen zur Verfügung,
das den Fachleuten zugänglich
ist.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Formulierung zur
Verfügung
umfassend ein Oligonukleotid von ungefähr 12 bis ungefähr 50 Nukleotiden,
das Nicht-Phosphodiester
Internukleotid Verbindungen besitzt und komplementär zu einem
angezielten Gen ist, für
die kolorektale Verabreichung an einen Säuger, wobei das Oligonukleotid
3' und 5' Termini besitzt,
und ferner wenigstens ein 2'-substituiertes
Ribonukleotid an dem 5' Terminus,
an dem 3' Terminus
oder an dem 5' Terminus
und dem 3' Terminus
umfasst.
-
In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines
Oligonukleotids bereit von ungefähr
15 bis 25 Nukleotiden und umfassend Nicht-Phosphodiester Internukleotid
Verbindungen für
die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung für kolorektale Verabreichung
für die
Behandlung von Virusinfektionen, Infektionen durch pathogene Organismen,
oder Krankheiten oder Funktionsstörungen, die aus abnormaler
Genexpression oder aus der Expression eines abnormalen Genproduktes
resultieren, wobei das Oligonukleotid 3' und 5' Termini besitzt, und ferner wenigstens
ein 2'-substituiertes
Ribonukleotid an dem 5' Terminus,
an dem 3' Terminus
oder an dem 5' Terminus
und dem 3' Terminus
umfasst.
-
Es
ist bekannt, dass ein synthetisches Oligonukleotid, genannt ein „Antisense
Oligonukleotid" an
ein einzelsträngiges
Ziel Nukleinsäuremolekül binden
kann gemäß der Watson-Crick
oder Hoogsteen Regel für Basenpaarung,
und mittels dieses Vorgangs die Funktion des Ziels durch einen von
zahlreichen Mechanismen unterbindet: durch Verhinderung der Bindung
von Faktoren, die für
normale Transkription, Spleißen,
oder Translation benötigt
werden; durch Einleiten der enzymatischen Zerstörung von mRNA durch RNase H,
wenn eine zusammenhängender
Bereich von Deoxyribonukleotiden in dem Oligonukleotid existiert;
und/oder durch Zerstörung
des Ziels über
reaktive Gruppen, die unmittelbar an das Antisense Oligonukleotid
angebracht sind.
-
Somit
sind, wegen der oben beschriebenen Eigenschaften, solche Oligonukleotide
therapeutisch nützlich
durch ihre Fähigkeit,
die Expression eines bestimmten Gens in einem Tier herunterzuregulieren,
gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung.
-
Die
Pharmakokinetiken und Faktoren, die die gastrointestinale Absorption,
einschließlich
der kolorektalen Absorption, der Oligonukleotide beeinflussen, sind
in dem Schema, das in 1 wiedergegeben ist, zusammengefasst.
Kurz gesagt, wenn die Oligonukleotide oral verabreicht werden, können sie
im Mageninhalt stabil sein, und ob sie über die Magenwand absorbiert
werden, ist nicht klar. Wenn die verabreichten Oligonukleotide sich
in den Dünndarm
bewegen, kann ausgiebiger Abbau der PS-Oligonukleotide und einiger
Abbau der MBOs vorkommen. Intakte Oligonukleotide (und vielleicht
abgebaute Formen) werden über
Pfortaderblut absorbiert und treten in die Leber ein. Die absorbierten
Oligonukleotide können
Metabolismus in der Leber durchlaufen (der Erstdurchtrittseffekt)
und in die systemische Zirkulation eintreten. Oligonukleotide und
ihrer Metabolite werden in die Gallenflüssigkeit ausgeschieden und
treten in das intestinale Lumen ein und treten wieder in die enterohepatische
Zirkulation ein. Oligonukleotide in der systemischen Zirkulation
werden in zahlreiche Gewebe verteilt und in den Urin ausgeschieden,
wie aus i.v. Verabreichung heraus ersehen wird. Wenn oral verabreichte
Oligonukleotide sich in den Dickdarm bewegen, können die meisten PS-Oligonukleotide
und einige MBOs als Abbauprodukte vorliegen. Im Allgemeinen treten
Oligonukleotide, die über
den oberen Teil des Dickdarms absorbiert werden, in die Leber ein,
und Oligonukleotide, die über
den unteren Teil des Dickdarms absorbiert werden, treten unmittelbar
in die systemische Zirkulation ein. Die Letztgenannten werden nicht
in der Leber metabolisiert und der Erstdurchtrittseffekt der Leber
wird vermieden. Kolorektale Verabreichung von Oligonukleotide zieht
einen Vorteil aus dieser Gelegenheit. Wenn Oligonukleotide in das
Rektum verabreicht werden, treten die meisten absorbierten Oligonukleotide
in die systemische Zirkulation ein. Kolorektale Verabreichung wendet
die Pharmakokinetiken von Phosphorothioaten wie auch MBOs an, wodurch
PS zu einer brauchbare Wahl für
gastrointestinale Verabreichung gemacht wird.
-
Im
Allgemeinen sind die folgenden Faktoren für die Entwicklung rektaler
Oligonukleotid Therapeutika wichtig: 1) Stabilität der Oligonukleotide in dem
gastrointestinalen Trakt; 2) Dauer der Retention der Oligonukleotide
in dem gastrointestinalen Trakt; 3) die Struktur und die physikalischen
und biochemischen Eigenschaften von Oligonukleotiden, z.B. Ladungen;
4) der Erstdurchtrittseffekt der Leber; 5) Ernährungs- und Wirtsstatus der
gastrointestinalen und hepatischen Funktionen; und 6) Formulierungen.
Die Vorteile der Verabreichung der Oligonukleotide durch rektale
Verabreichung sind offensichtlich. Die langsame aber kontinuierliche
Freisetzung der Oligonukleotide in die systemische Zirkulation kann
die Aufnahme der Zielgewebe erhöhen.
Zusätzlich
vermeidet sie die hohen Plasmakonzentrationen, die mit i.v. Injektion
einhergehen und reduziert das Risiko von Nebenwirkungen, die aus
diesen hohen Konzentrationen resultieren. Die Oligonukleotide, die
kolorektal gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
verabreicht werden, sind wenigstens 6 Nukleotide lang, sind aber vorzugsweise
6 bis 50 Nukleotide lang, wobei 15 bis 30mere am verbreitesten sind.
Sie sind zusammengesetzt aus Deoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden,
oder einer Kombination beider, wobei das 5' Ende eines Nukleotids und das 3' Ende eines anderen
Nukleotids kovalent durch Phosphodiester Bindungen verbunden sind.
-
Die
Oligonukleotide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
können
auch auf eine Vielzahl von Wegen modifiziert werden, ohne deren
Fähigkeit
zu beinträchtigen,
an die Zielnukleinsäure
zu hybridisieren. Solch Modifikationen schließen ein, zum Beispiel, Nicht-Phosphatdiester Internukleotid
Bindungen, einschließend
Alkylphosphonate, Phosphorothioate, Phosphorodithioate, Alkylphosphonothioate,
Alkylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphoramidite, Phosphatester,
Carbamate, Acetamidate, Caboxymethylester, Carbonate und Phosphattriester.
Besonders nützliche
Oligonukleotide sind verbunden mit Phosphorothioat und/oder Phosphorodithioat
Internukleosid Bindungen verbunden. Vorzugsweise werden erfindungsgemäße Oligonukleotide,
die im Bereich von ungefähr
6 bis ungefähr
50 Nukleotiden Länge,
und am bevorzugtesten von ungefähr
12 bis ungefähr
30 Nukleotiden Länge
sind, 11 bis 29 Nicht-Phosphodiester Internukleotid Bindung besitzen.
-
Andere
nützliche
Modifikationen schließen
diejenigen ein, die intern oder an dem(den) Ende(n) des Oligonukleotid
Moleküls
sind; und schließen
ein Additionen zu dem Molekül
der Internukleosid Phosphat Bindungen, wie Cholesteryl oder Diamin
Verbindungen mit variierender Anzahl an Kohlenstoffresten zwischen den
Aminogruppen und der terminalen Ribose, Deoxyribose und den Phosphonat
Modifikationen, die spalten oder mit den gegenüberliegenden Ketten oder assoziierten
Enzymen oder anderen Proteinen, die an das virale Genom binden,
quervernetzen.
-
Beispiele
für solche
modifizierten Oligonukleotide schließen Oligonukleotide mit einer
modifizierten Base und/Zucker ein, wie Arabinose anstallt von Ribose,
oder ein 3', 5'-substituiertes Oligonukleotide mit einem
Zucker, der an beiden seinen 3' und
5' Positionen an
eine chemische Gruppe angebracht ist, die nicht eine Hydroxyl Gruppe
(an seiner 3' Position)
und nicht eine Phosphat Gruppe (an seiner 5' Position) ist. Andere modifizierte
Oligonukleotide sind mit einem Nuklease Resistenz verleihenden sperrigen
Substituenten an ihrem 3' und/oder
5' Ende(n) gecappt,
oder besitzen eine Substitution in nicht verbrückenden Sauerstoff pro Nukleotid.
Solche Modifikationen können
an einigen oder allen Internukleosid Bindungen sein, wie auch an
jedem oder beiden Enden des Oligonukleotids und/oder in dem Innerem
des Moleküls.
Oligonukleotide, die sich selbst stabilisieren, werden auch als
modifizierte Oligonukleotide betrachtet, die nützlich für die erfindungsgemäßen Verfahren
(Tang et al. (1993) Nucleic Acids Res. 20: 2729-2735) sind. Diese
Oligonukleotide umfassen zwei Regionen: ein Ziel-Hybridisierungsregion;
und ein selbst komplementäre
Region, mit einer Oligonukleotidsequenz, die komplementär zu einer
Nukleinsäuresequenz
ist, die die innerhalb des sich selbst stabilisierenden Oligonukleotids
ist.
-
Modifizierte
und unmodifizierte Oligonukleotide können gemäß bekannten Verfahren hergestellt
werden, die manuell oder durch einen automatisierten Synthetisierer,
wie von Brown beschrieben (A Brief History of Oligonucleotide Synthesis.
Protocols for Oligonucleotides and Analogs. Methods in Molecular
Biology (1994) 20: 1-8), ausgeführt
werden. Siehe auch Sonveaux „Protecting
Groups in Oligonucleotide Synthesis" in Agrawal (1994) Methods in Molecular
Biology 26: 1- 72,
Agrawal et al. (1992) Trends Biotechnol. 10: 152-158; Uhlmann et
al. (1990) Chem. Rev. 90: 543-583; und (1987) Tetrahedron Lett.
28: (31): 3539-3542.
-
Ein
bevorzugtes Oligonukleotid, das nützlich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist, sind Hybridoligonukleotide enthaltend sowohl Deoxyribonukleotide
als auch wenigstens ein 2' substituiertes
Ribonukleotid. Für
Zwecke dieser Erfindung bezeichnet der Begriff „ 2'-substituiert" die Substitution
des 2'-OH des Ribosemoleküls mit,
z.B., 2'-O-Allyl,
2'-O-Alkyl, 2'-Halo, oder 2'-Amino, aber nicht
mit 2'-H, wobei.
Allyl, Aryl, oder Alkyl Gruppen nicht substituiert oder substituiert
sein können,
z.B. mit Halo, Hydroxy, Trifluormethyl, Cyano, Nitro, Acyl, Acyloxy,
Alkoxy, Carboxyl, Carbalkoxyl oder Amino Gruppen. Andere bevorzugte
Oligonukleotide, die nützlich
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
sind, besitzen wenigstens eine oder nur Phosphorothioat Internukleotid
Bindungen.
-
Die
Hybrid DNA/RNA Oligonukleotide, die nützlich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
sind, widerstehen nukleolytischem Abbau, bilden stabile Duplexe
mit RNA oder DNA, und aktivieren vorzugsweise RNase H, wenn sie
mit RNA hybridisiert sind. Sie können
zusätzlich
wenigstens ein unsubstituiertes Ribonukleotid einschließen. Zum
Beispiel kann ein Oligonukleotid, das nützlich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist, nur Deoxyribonukleotide enthalten, mit der Außnahme eines
2' substituierten
Ribonukleotids an dem 3' Terminus des
Oligonukleotids. Alternativ kann das Oligonukleotid wenigstens ein
substituiertes Ribonukleotid an sowohl seinen 3' als auch 5' Termini besitzen.
-
Eine
bevorzugte Klasse von Oligonukleotiden, die nützlich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist, enthält
mindestens vier oder mehr Deoxyribonukleotide in einem zusammenhängendem
Block, um so ein aktivierendes Segment für RNase H bereitzustellen.
In bestimmten Fällen,
wird mehr als ein solches aktivierendes Segment an jedem Ort innerhalb
des Oligonukleotids vorhanden sein. Es kann eine überwiegende
Anzahl von Deoxyribonukleotiden in Oligonukleotiden vorhanden sein,
die nützlich
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
sind. Tatsächlich
können
solche Oligonukleotide bis auf ein, zwei, drei oder vier, Nukleotid(e)
besitzen, die Deoxyribonukleotide sind. Somit reicht in einem bevorzugten
Oligonukleotid mit ungefähr
6 bis ungefähr 50
Nukleotiden oder am bevorzugtesten ungefähr 12 bis ungefähr 30 Nukleotide
die Anzahl der vorliegenden Deoxyribonukleotide von 1 bis ungefähr 29.
-
Andere
nützliche
Oligonukleotide können
insbesondere aus wenigstem einem, zweien, vieren, oder mehr 2'-substituierten Ribonukleotid(en)
an einem oder beiden Termini des Oligonukleotids bestehen. Einige Oligonukleotide,
die nützlich
bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
sind, besitzen nur 2'-susbstituierte
Ribonukleotide. Das 2' substituierte
Ribonukleotid(e) in dem Oligonukleotid kann an der 2' Position der Ribose
enthalten einen -O- niedrigen Alkyl enthaltend 1-6 Kohlenstoffatome,
Aryl oder substituiertes Aryl oder Allyl mit 2-6 Kohlenstoffatomen,
z.B., 2'-O-Allyl,
2'-O-Aryl, 2'-O-Alkyl, 2'-Halo, oder 2'-Amino, aber nicht
mit 2'-H, wobei Allyl,
Aryl, oder Alkyl Gruppen nicht substituiert oder substituiert sein
können,
z.B. mit Halo, Hydroxy, Trifluormethyl, Cyano, Nitro, Acyl, Acyloxy,
Alkoxy, Carboxyl, Carbalkoxyl oder Amino Gruppen. Nützliche
substituierte Ribonukleotide sind 2'-Alkyle,
wie 2'-O-Methyl.
-
Tabelle
1 führt
einige repräsentative
Spezies von Oligonukleotiden auf, die nützlich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
sind. 2'-substituierte
Nukleotide sind unterstrichen, und Nukleotid Methylphosphonate sind
in Fettdruck.
-
-
-
Die
Oligonukleotide, die in der Erfindung benutzt werden, sind wirksam
bei der Hemmung der Expression zahlreicher Gene in Viren, pathogenen
Organismen, oder bei der Hemmung der Expression zellulärer Gene.
Die Fähigkeit
solche Agenzien zu hemmen ist klarerweise wichtig, um eine Vielzahl
von Krankheitszuständen
zu behandeln. Somit besitzen Oligonukleotide gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
ein Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleinsäuresequenz,
die von einem Virus, einem pathogenen Organismus oder einem zellulären Gen
ist.
-
Für Zwecke
der Erfindung soll der Begriff „Oligonukleotidsequenz, die
komplementär
ist zu einer Nukleinsäuresequenz" bedeuten, dass eine
Oligonukleotidsequenz, die an die Ziel-Nukleinsäuresequenz unter physiologischen
Bedingungen bindet, z.B., durch Watson-Crick Basenpaarung (Wechselwirkung
zwischen Oligonukleotid und einzelsträngiger Nukleinsäure, wie
RNA oder cDNA) oder durch Hoogsteen Basenpaarung (Wechselwirkung
zwischen Oligonukleotid und doppelsträngiger Nukleinsäure) oder
auf jede andere Weise einschließlich
des Falls eines Oligonukleotid, das an RNA bindet, Pseudoknoten
Bildung. Solche Bindung (durch Watson Crick Basenpaarung) unter
physiologischen Bedingungen wird in der Praxis durch Beobachten des
Interferierens mit der Funktion der Nukleinsäuresequenz gemessen. Die Nukleisäure, zu
der das Oligonukleotid komplementär ist kann genomische DNA,
RNA, mRNA oder cDNA.
-
Die
Sequenz der Nukleinsäure,
zu der ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid
komplementär
ist, wird variieren, abhängig
von dem herunterzuregulierenden Gen. In einigen Fällen wird
das Zielgen oder die Nukleinsäuresequenz
eine Virus Nukleinsäuresequenz
seien. Die Verwendung von Antisense Oligonukleotiden, um zahlreiche
Viren zu hemmen, ist wohl bekannt (ein Übersicht findet sich in Agrawal
(1992) Trends in Biotech. 10: 152-158). Virale Nukleinsequenzen,
die zu wirksamen Antisense Oligonukleotiden komplementär sind, wurden
für viele
Vieren beschrieben, einschließlich
des humanen Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) (U.S. Patent Nr. 4,806,463), Herpes
simplex Virus (U.S. Patent Nr. 4,689,320), Influenza Virus (U.S.
Patent Nr. 5,194,428), und humanes Papilloma Virus (Storey et al.
(1991) Nucleic Acids Res. 19: 4109-4114). Sequenzen, die komplementär zu irgendeiner
dieser Nukleinsäuren
Sequenzen sind, können
verwendet werden für erfindungsgemäße Oligonukleotide,
wie auch Oligonukleotid Sequenzen, die komplementär sind zu
Nukleinsäuresequenzen
jedes anderen Virus. Zusätzliche
Viren, die bekannte Nukleinsäuresequenzen
besitzen, gegen welche Antisense Oligonukleotide hergestellt werden
können,
schließen
ein, sind aber nicht begrenzt auf, Maul und Klauen Seuche Virus
(siehe Robertson et al. (1985) J. Virol. 54: 651; Harris et al.
(1980) Virol. 36: 659), Gelbfiebervirus (siehe Rice et al. (1985)
Science 229: 726), Varicella-Zoster
Virus (siehe Davison und Scott (1986) J. Gen. Virol. 67: 2279),
Epstein-Barr Virus, Cytomegalovirus, Respiratory Syncytical Virus
(RSV), und Gurken Mosaik Virus (siehe Richards et al. (1978) Virol.
89: 395).
-
Zum
Beispiel wurde ein Oligonukleotid entworfen, das komplementär ist zu
einem Teil des HIV-1 Gens, und als solches, signifikante anti-HIV
Effekte besitzt (Agrawal (1992) Antisense Res. Development 2: 261-266). Das
Ziel dieses Oligonukleotids erwies sich als unter zahlreichen HIV-1
Isolaten konserviert. Es ist reich an 56% G+C, wasserlöslich, und
relative stabil unter physiologischen Bedingungen. Dieses Oligonukleotid
bindet an ein komplementäres
RNA Ziel unter physiologischen Bedingungen, wobei der T der Duplex
ungefähr
56°C ist.
Die antivirale Aktivität
dieses Oligonukleotids wurde in zahlreichen Modellen getestet, einschließlich akut und
chronisch infizierter CEM Zellen, Langzeit Kulturen, die in vivo
Bedingungen nachahmen, humane peripheren Blutlymphozyten und Macrophagen,
und Isolaten aus HIV-1 infizierten Patienten (Lisziewicz et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) (1992) 89: 11209-11213); Lisziewicz et al.
(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1993) 90: 3860-3864); Lisziewicz
et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1994) 91: 7942-7946); Agrawal
et al. (J. Ther. Biotech) im Druck).
-
Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
können
alternativ eine Oligonukleotid Sequenz haben, die komplementär ist zur
einer Nukleinsäuresequenz
eines pathogenen Organismus. Die Nukleinsäuresequenz vieler pathogener
Organismen wurde beschrieben, einschließlich des Malaria Organismus,
Plasmodium falciparum, und vieler pathogener Bakterien. Oligonukleotid
Sequenzen, die komplementär
sind zu Nukleinsäuresequenzen
irgendeines solchen pathogenen Organismus können in erfindungsgemäßen Oligonukleotiden
verwendet werden. Beispiele von pathogenen Eukaryoten mit bekannten
Nukleinsäuresequenzen,
gegen die Antisense Oligonukleotide hergestellt werden können, schließen ein
Trypanosom abrucei gambiense und Leishmania (siehe Campbell et al.,
Nature 311: 350 (1984)), Fasciola hepatica (siehe Zurita et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2340 (1987).
-
Antifungale
Oligonukleotide können
hergestellt werden unter Verwendung einer Ziel Hybridisierungsregion
mit einer Oligonukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleinsäuresequenz
aus, z.B., dem Chitin Synthetase Gen, und antibakterielle Oligonukleotide
können
verwendet werden unter Verwendung von, z.B., dem Alanin Racemase
Gen. Unter den Pilzerkrankungen, die durch das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren
behandelbar sein können
sind Candidase, Histoplasmose, Cryptococcocis, Blastomycosis, Aspergillose,
Sporotrichose, Chromomycose, Dermatophytose und Coccidioidomycose.
Das Verfahren könnte auch
verwendet werden, um rickettsiale Erkrankungen (z.B. Typhus, Rocky
Mountain Spotted Fever), wie auch sexuell übertragenen Krankheiten verursacht
durch Chlamydia trachomatis oder Lymphogranuloma venerum zu behandeln.
Eine Vielzahl von parasitischen Krankheiten können durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt
werden, einschließlich
Amebiasis, Chagaskrankheit, Toxoplasmosis, Pneumocytosis, Lambliasis, Kryptoporidiosis,
Trichmoniasis und Pneumocystis carini pneumonia; auch Wurm (helminthische)
Krankheiten, wie Askaridiasis, Filariasis, Trichinose und Schistosomiasis
und Nematoden und Cestoden Infektionen. Malaria kann durch das erfindungsgemäße Verfahren
behandelt werden unabhängig
davon, ob sie durch P. falciparum, P. vivas, P. orale, oder P. malariae
verursacht wird.
-
Die
oben identifizierten Infektionskrankheiten können alle durch das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren
behandelt werden, da die infektiösen
Agenzien für
diese Krankheiten bekannt sind und somit erfindungsgemäße Oligonukleotide
hergestellt werden können
mit einer Oligonukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Nukleinsäuresequenz,
die eine essentielle Nukleinsäuresequenz
ist für
die Verbreitung des infektiösen
Agens, wie ein essentielles Gen.
-
Andere
Krankheitszustände
und Konditionen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelbar sein
können,
sind diejenigen, welche aus einer abnormalen Expression oder eines abnormalen
Produktes eines zellulären
Gens resultieren. Diese Konditionen können behandelt werden durch
Verabreichung von erfindungsgemäßen Oligonukleotiden,
und wurden zuvor in dieser Offenbarung diskutiert.
-
Andere
erfindungsgemäße Oligonukleotide
können
eine Nukleotidsequenz haben, die komplementär ist zu einem zellulären Gen
oder Gentranskript, deren abnormale Expression oder deren abnormales
Produkt in einem Krankheitszustand resultiert. Die Nukleinsäuresequenzen
von zahlreichen solchen zellulären
Genen ist beschrieben worden, einschließlich des Prion Proteins (Stahl
et al. (1991) FASEB J. 5: 2799-2807), des Amyloidartigen Proteins,
das mit der Alzheimer Krankheit assoziiert ist (U.S. Patent Nr.
5,015,570), und zahlreich wohl bekannte Onkogene und Protoonkogene,
wie c-myb, c-myc, c-abl und n-ras. Zusätzlich können Oligonukleotide, die die
Synthese von strukturellen Proteinen oder Enzymen, die weitestgehend
oder ausschließlich
bei der Spermatogenese, Spermiumbeweglichkeit, der Bindung des Spermiums
an das Ei oder jedem anderen Schritt, die die Lebensfähigkeit
des Spermiums beeeinflusst, involviert sind, als Verhütungsmittel
verwendet werden. In ähnlicher
Weise können
Verhütungsmittel
für Frauen
Oligonukleotide sein, die Proteine oder Enzyme hemmen, die involviert
sind bei der Ovulation, Befruchtung, Einnistung oder bei der Biosynthese von
Hormonen, die in diesen Vorgängen
involviert sind.
-
Bluthochdruck
kann durch Oligonukleotide kontrolliert werden, die die Synthese
von Enzym, das Angiotensin umwandelt oder verwandten Enzymen, herunterreguliert.
Plättchen
Aggregation kann durch Unterdrückung
der Synthese von Enzymen kontrolliert werden, die für die Synthese
von Thromboxan A2 notwendig sind, für die Verwendung bei myokardialen
und zerebralen Blutkreislaufstörungen,
Infarkten, Arteriosklerose, Embolien und Thrombose. Ablagerung von
Cholesterin in der arteriellen Wand kann gehemmt werden durch Unterdrückung der
Synthese von Fettsäure
Coenzym A: Cholesterin Acyl Transferase bei Arteriosklerose. Hemmung
der Synthese von Cholinephosphotransferase kann nützlich bei
der Hypolipidämie
sein.
-
Es
gibt zahlreiche neurale Störungen,
bei denen Hybridisierungsarrest verwendet werden kann, um nachteilige
Effekte der Störung
zu reduzieren oder eliminieren. Zum Beispiel kann die Unterdrückung der
Synthese von Monoaminoxidase bei der Parkinsonschen Krankheit verwendet
werden. Unterdrückung
der Catechol O-Methyl Transferase kann verwendet werden, um Depressionen
zu behandeln; und Unterdrückung
der Indol N-Methyl Transferase kann verwendet werden bei der Behandlung
von Schizophrenie.
-
Unterdrückung ausgewählter Enzyme
in der Arachidonsäure
Kaskade, die zu Prostagladinen und Leukotrienen führt, kann
nützlich
bei der Kontrolle der Plättchen
Aggregation, Allergie, Entzündung,
Schmerz und Asthma sein.
-
Unterdrückung des
Proteins, das durch das Mutidrug Resistance (mdr-1) Gen exprimiert
wird, das für die
Entwicklung der Resistenz von Tumoren gegen eine Vielzahl von Antikrebs
Medikamenten verantwortlich sein kann und ein wesentlich Hindernis
bei der Chemotherapie ist, kann sich als vorteilhaft bei der Behandlung von
Krebs erweisen. Oligonukleotidsequenzen, die komplementär zu den
Nukleinsäuresequenzen
irgendeines dieser Gene sind, können
verwendet werden für
erfindungsgemäße Oligonukleotide,
wie auch Oligonukleotidsequenzen, die komplementär zur irgendeinem anderem zellulären Gentranskript
sind, deren abnormale Expression oder deren abnormales Produkt zu
einem Krankheitszustand führt.
-
Die
hier beschriebenen Oligonukleotide werden kolorektal verabreicht
an das tierische Subjekt in der Form von therapeutischen pharmazeutischen
Formulierungen, die wirksam für
die Behandlung von Virusinfektionen, Infektionen durch pathogenen
Organismen, oder Krankheiten oder Störungen sind, die aus abnormaler Genexpression
oder aus der Expression eines abnormalen Genprodukts resultieren
und geeignet sind für
die kolorektale Verabreichung. In einigen Aspekten des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden die Oligonukleotide in Verbindung mit anderen therapeutischen
Agenzien verabreicht, z.B. AZT im Fall von AIDS.
-
Die
erfindungsgemäße therapeutische
pharmazeutische Formulierung schließt Oligonukleotide, wie oben
beschrieben ein, und einen physiologisch verträglichen Träger, wie ein inertes Verdünnungsmittel
oder einen vergleichbaren Träger
mit dem das Oligonukleotid verabreicht wird. Geeignete Formulierungen,
die pharmazeutische verträgliche
sonstige Bestandteile für
das Einführen
von Verbindungen in den Blutstrom durch nicht Injektionsrouten können in
Remington's Pharmaceutical
Sciences (18te Ausgabe) (Genarro, Hrg. (1990) Mack Publishing Co.,
Easton, PA) gefunden werden. Die pharmazeutische Formulierung, die
eingeführt werden
kann, ist in fester, halbfester, Suspensions-, oder Emulsionsform,
und kann zusätzlich
enthalten jede Anzahl an wohl bekannten pharmazeutisch verträglichen
Zusätzen.
Das Oligonukleotid und andere Inhaltsstoffe können in einer Hart- oder Weichschalen
Gelatine Kapsel eingeschlossen sein, können in Gelen oder Cremes enthalten
sein, oder können
in Zäpfchen,
und ähnliche,
gepresst sein.
-
Verabreichungssysteme
für anhaltende
Freisetzung und/oder Beschichtungen für kolorektal verabreichte Dosierungsformen
werden auch in Erwägung
gezogen, wie diejenigen die in U.S. Patent Nr. 4,704,295, 4,556,552,
4,309,404, und 4,309,406 für
orale Verabreichung beschrieben werden.
-
Wie
hier verwendet bedeutet der Begriff „therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge
jeder aktiven Komponente der pharmazeutischen Formulierung oder
des Verfahrens, die ausreicht, um eine bedeutsame Verbesserung beim
Subjekt oder beim Patienten zu zeigen, d.h. die Heilung der Krankheitszustände, die die
behandelte Krankheit kennzeichnen, und/oder ein Anstieg der Heilungsgeschwindigkeit
von solchen Zuständen,
eine Reduktion der Expression der Proteine oder der Zellen, die
die behandelte Krankheit oder Störung
verursachen (z.B. in dem Fall eines Virus, einen Abfall der Virusladung
oberhalb des Basisniveaus unter Krankheitsbedingungen). Wenn der
Begriff auf einen einzelnen aktiven Inhaltsstoff angewendet wird,
der allein verabreicht wird, bezieht sich er sich allein auf diesen
Inhaltsstoff. Wenn er auf eine Kombination angewendet wird, bezieht
sich der Begriff auf eine kombinierte Menge von aktiven Inhaltsstoffen,
die zu einer therapeutische Wirkung führen, ob in Kombination, seriell
oder gleichzeitig, verabreicht.
-
Die
therapeutisch wirksame Menge eines synthetischen kolorektal verabreichten
Oligonukleotids bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, wird von der
Eigenheit und der Schwere des behandelten Zustands abhängen, und
der von dem Wesen der früheren
Behandlungen, denen sich der Patient unterzogen hat. Letztendlich
wird der zuständige
Arzt über
die Menge des synthetischen Oligonukleotids entscheiden, mit der
jeder einzelne Patient behandelt wird. Anfänglich kann der zuständige Arzt
niedrigen Dosen des synthetischen Oligonukleotids verabreichen und
die Reaktion des Patienten beobachten. Größere Dosen des synthetischen
Oligonukleotids können
verabreicht werden bis die optimale therapeutische Wirkung für den Patienten
erreicht wird, und an diesem Punkt wird die Dosis nicht weiter erhöht. Es wird
erwogen, dass die Dosierungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen,
die bei der Verfahren der vorliegenden Erfindung verabreicht werden,
ungefähr
enthalten sollten 0.1 bis 100.0 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise
0.1 bis 75.0 mg/kg Körpergewicht
pro Tag, bevorzugter 1.0 bis 50.0 mg/kg Körpergewicht pro Tag, noch bevorzugter
1 bis 25 mg/kg Körpergewicht
pro Tag, und noch bevorzugter 1 bis 10 oder 1 bis 5.0 mg/kg Körpergewicht
pro Tag. Das Oligonukleotid wird vorzugsweise bei einer ausreichende
Dosierung verabreicht, um ein Blutlevel des Oligonukleotids von
ungefähr
0.01 μM
bis ungefähr
100 μM zu
erreichen. Vorzugsweise sollte die Konzentration des Oligonukleotids
an der Stelle der gestörten
Genexpression ungefähr
0.01 μM
bis ungefähr
50 μM sein,
bevorzugter ungefähr
0.01 μM
bis ungefähr
10 μM sein,
und am bevorzugtesten ungefähr
0.05 μM
bis ungefähr
5 μM sein. Jedoch
können
bei lokalisierter Verabreichungen, wesentlich geringere Konzentrationen
als diese wirksam sein, und wesentlich höhere Konzentrationen toleriert
werden. Es kann gewünscht
sein, eine therapeutisch wirksame Menge der einen oder mehreren
therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung simultan oder sequentiell
zu verabreichen, wenn sie einzeln als eine einzelne Behandlungsphase
vorliegen.
-
Es
wird gewürdigt
werden, dass der Einheitsinhalt von einem aktiven Inhaltsstoff und
Inhaltsstoffen, die in einzelnen Dosis jeder Dosierungsform enthalten
ist, nicht für
sich selbst einen wirksame Menge darzustellen braucht, da die notwendige
wirksame Menge durch Verabreichung einer Vielzahl von Dosierungseinheiten
(wie Zäpfchen,
Gelen, Cremes oder Kombinationen davon) erreicht werden kann. Tatsächlich wurde
gezeigt, dass Multi-Dosierung
(einmal am Tag) die Plasma- und Gewebekonzentrationen der MBOs signifikant erhöht (Daten
nicht gezeigt).
-
Die
erfindungsgemäßen Oligonukleotide
werden an das Tier in einer therapeutisch wirksamen Weise verabreicht.
Eine „therapeutisch
wirksame Weise" bezieht
sich auf eine Route, Dauer und Häufigkeit
der Verabreichung der pharmazeutischen Formulierung, die letztendlich
zu einer bedeutungsvollen Verbesserung für den Patienten führt, wie
oben beschrieben. In einigen Ausführungsformen der Erfindung
wird die pharmazeutische Formulierung in Bolus, kontinuierlichen,
unterbrochen oder kontinuierlichen Mengen, die von unterbrochenen
Behandlungsschemata gefolgt werden, verabreicht.
-
Die
pharmazeutische Formulierung kann in Bolus, kontinuierlichen, oder
unterbrochenen Dosierungen, oder in einer Kombination von kontinuierlichen
und unterbrochenen Dosierungen verabreicht werden, wie durch den
Arzt und dem Grad und/oder Phase der Krankheit des Patienten bestimmt
wird. Die Länge
der Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung wird variieren, in Abhängigkeit
von den einzigartigen Charakteristiken des Oligonukleotids und des
genauen therapeutischen Effekts, der erreicht werden soll, den Beschränkungen
der Technik, die in der Herstellung solch einer therapeutischen
Formulierung zur Behandlung von Menschen inhärent sind, der Schwere der
zu behandelnden Krankheit und dem Zustand und der potentiellen individuelle
Reaktion jedes einzelnen Patienten. Letztendlich wird der zuständige Arzt über die
angebrachte Länge
der intravenösen
Therapie entscheiden unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung.
-
Um
die Stabilität
der erfindungsgemäßen Antisense
Oligonukleotide in dem intestinalen Trakt zu bestimmen, und um deren
Fähigkeit
zu bestimmen, durch die intestinale Wand absorbiert zu werden, wurden zwei
radioaktiv markierte, endmodifizierte Oligonukleotide, MBO 1 (SEQ
ID Nr: 11) und MBO 2 (SEQ ID NO: 16) und ein Phosphorothioat Oligonukleotid
(SEQ ID NO: 16) in den Dickdarm von Ratten verabreicht. Die chemische
Struktur dieser Oligonukleotide wird in 2 gezeigt.
Die Gewebeverteilung dieser Oligonukleotide und ihre Stabilität wurden
dann gemessen.
-
MBO
1 war in dem Dickdarm stabil, wie durch HPLC und PAGE analysiert,
für bis
zu 4 Stunden nach Verabreichung, bei minimalem beobachteten Abbau
(3B und 4). Gel Elektrophorese enthüllte, dass die
Mehrzahl der extrahierten Radioaktivität im Dickdarm und seinen Inhalten
intaktes Oligonukleotid war (Daten nicht gezeigt). Die Absorption
von MBO 1 wurde bei Dosierungen von 3.3, 10, 30 und 90 mg/kg untersucht. Oligonukleotid
abgeleitete Radioaktivität
war in zahlreichen Geweben nachweisbar nach Verabreichung in den Dickdarm
des radioaktiv markierten MBO 1. 4 veranschaulicht
die Konzentration der MBO 1 Äquivalente im
Plasma, was anzeigte, dass das Oligonukleotid in einer Zeit- und
Konzentrationsabhängigen
Weise absorbiert wurde. Signifikante Anhäufung von Oligonukleotid abgeleiteter
Radioaktivität
wurde in zahlreichen Geweben beobachtet. 5 veranschaulicht
die Konzentration von MBO 1 Äquivalenten
in ausgewählten
Geweben, einschließlich
Niere, Leber, Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Hirn 4 Stunden
nach Verabreichung. Wie in 6B und 6C gesehen
werden kann, enthüllte
HPLC Analyse sowohl intakte als auch abgebaute Formen von MBO 1
in der Niere, aber die Mehrzahl der Radioaktivität in der Leber und den Nieren
war mit der intakten Form von MBO 1 assoziiert. Gel Elektrophorese
enthüllte
auch, dass die Mehrzahl der Radioaktivität in diesen Proben mit der
intakten Form von MBO 1 assoziiert war (Daten nicht gezeigt). Keine
signifikanten abgebauten Produkte wurden im Dickdarm für bis zu
4 Stunden nach Verabreichung nachgewiesen. Ungefähr 4 bis 14% der verabreichten
MBO 1 wurde innerhalb von 4 Stunden in den anästhetisierten Tieren absorbiert, in
Abhängigkeit
von den Dosierungslevels.
-
In
getrennten Untersuchungen wurden ähnliche Ergebnisse erhalten
nach rektaler Verabreichung von PS-Oligonukleotid und MBO 2. Bei
10 mg/kg hatte PS-Oligonukleotid ein 4 Stunden Absorptionsverhältnis von 8.74%
der verabreichten Dosierung, und MBO 2 hatte ein Verhältnis von
6.6% der verabreichten Dosis (Daten nicht gezeigt).
-
Frühere Untersuchungen,
beschrieben in Zhang et al. (Clin. Chem. (1995) 41: 863-873), demonstrierten,
dass nach oraler Verabreichung PS-Oligonukleotide gut durch die
gastrointestinale Wand absorbiert werden konnten, aber in der Leber
weitgehend abgebaut wurden; wenig intakte PS-Oligonukleotide waren
daher in den systemischen Geweben verfügbar Rektale Verabreichung
vermeidet den Erstdurchtrittseffekt in der Leber. Nach Dickdarm
Verabreichung wurde PS-Oligonukleotid gut größtenteils in der intakten Form
absorbiert und wurde weniger weitgehend in anderen Geweben abgebaut.
Weiterhin kann, da die Absorptionsraten in anästhetisierten Ratten abgeschätzt wurden,
die tatsächliche
Bioverfügbarkeit
von kolorektalen Oligonukleotiden unterschätzt werden.
-
Diese
Untersuchungen stellen die ersten Berichte über die Bioverfügbarkeit
von Antisense Oligonukleotide nach kolorektaler Verabreichung in
Tierexperimenten dar. Sie zeigen, dass nach Dickdarm Verabreichung:
1) PS-Oligonukleotide und endmodifizierte Oligonukleotide in dem
Dickdarm Lumen stabil sind; 2) sie durch die Dickdarmwand absorbiert
wurden; 3) die absorbierte Oligonukleotid abgeleitete Radioaktivität an zahlreiche
Gewebe verteilt wurde mit einem Muster ähnlich zu dem, das nach i.v.
Verabreichung gesehen wird; und 4) Radioaktivität in Geweben wie Leber und
Nieren mit intakten Oligonukleotiden wie auch mit Metaboliten assoziiert
war.
-
Somit
wurde unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung die erfolgreiche
Absorption von Oligonukleotiden über
den intestinalen Trakt erreicht und im ganzen Körper verteilt. Intakte Oligonukleotide
wurden im Plasma und zahlreichen Geweben nachgewiesen. Diese Ergebnisse
demonstrieren, dass kolorektale Verabreichung ein mögliches
Mittel ist für
die Verabreichung von Oligonukleotiden als therapeutische Agenzien.
-
Diese
Ergebnisse demonstrieren auch, dass synthetische Oligonukleotide
in intakter Form in einen Säuger
eingeführt
werden können,
und dass solch ein Oligonukleotid in intakter Form wenigstens vier
Stunden nach kolorektaler Verabreichung in intakter Form im systemischen
Plasma und in anderen Organen und Geweben gefunden werden kann.
-
Die
folgenden Beispiele veranschaulichen die bevorzugten Arten des Herstellens
und Praktizierens der vorliegenden Erfindung, sollen aber nicht
verstanden werden, den Umfang der Erfindung zu beschränken, da
alternative Verfahren verwendet werden können, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen.
-
Beispiele
-
1. Synthese und Analyse
des Oligonukleotids
-
Hybrid
25mer Phosphorothioat verbundene Oligonukleolide mit SEQ ID NO:
1 und 11 und enthaltend 2'-O-Methyl
Ribonukleotid 3' und
5' Sequenzen und
ein Deoxyribonukleotid Inneres wurden synthetisiert, aufgereinigt
und wie folgt analysiert.
-
Unmodifizierte
Phosphorothioat Deoxyribonukleoside wurden auf CPG in einem 5-6 μmol Format
auf einem automatischen Synthetisierer (model 8700, Millipore, Bedford,
MA) unter Verwendung des H-Phosphonat Ansatzes synthetisiert, der
beschrieben wurde in U.S. Patent Nr. 5,149,798. Deoxynukleosid H-Phosphonate
wurden erhalten von Millipore (Bedford, MA). 2'-O-Methly Ribonukleotid H-Phosphonate
oder Phosphorothioate wurden durch Standardverfahren synthetisiert
(siehe, z.B., „Protocols
for Oligonucleotides and Analogs" in
Meth. Mol. Biol. (1993) Band 20) oder kommerziell bezogen (z.B.
von Glenn Research, Sterling, VA und Clontech, Palo Alto, CA). Segmente
von Oligonukleotiden enthaltend 2'-O-Methyl
Nukleosid(e) wurden zusammengebaut durch Verwendung von 2'-O-Methyl Ribonukleosid
H-Phosphonate oder Phosphorothioate für die gewünschten Zyklen. In ähnlicher
Weise wurden Segmente von Oligonukleotiden enthaltend Deoxyribonukleoside
zusammengebaut unter Verwendung von Deoxynukleosid H-Phosphonaten
für die
gewünschten
Zyklen. Nach Zusammenbau wurde CPG gebundenes Oligonukleotid H-Phosphonat oxidiert
mit Schwefel, um die Phosphorothioat Bindung zu erzeugen. Oligonukleotide
wurden dann deprotektiert in konzentrierter NH4OH bei
40°C für 48 Stunden.
-
Rohes
Oligonukleotid (ungefähr
500 A260 Einheiten) wurden mittels reverser
Niedrigdruckchromatographie auf einem C18 reverse
Phase Medium analysiert. Die DMT Gruppe wurde entfernt durch Behandlung
mit 80% wässriger
Essigsäure,
dann wurden die Oligonukleotide gegen destilliertes Wasser dialysiert
und lyophilisiert.
-
Ein
2'-O-Methyl endgeschütztes Oligonukleotid,
gezeigt in 2 und mit SEQ ID NO: 16 wurde
hergestellt, wie beschrieben in Agrawal und Tang (Antisense Res.
Dev. (1992) 2: 261-66),
Padmapriya et al. (Antisense Res. Dev. (1994) 4: 185-199), Zhang
et al. (Biochem. Pharmacol. (1995) 50: 545-556; und Zhang et al. (J.
Pharm. Exp. Ther. (1996) 278:971-979).
-
2. Radioaktive
Markierung des Oligonukleotids
-
Um 35S markiertes Oligonukleotid zu erhalten,
wurde die Synthese in zwei Schritten ausgeführt. Die ersten 19 Nukleotide
der Sequenz SEQ ID NO: 1 wurden von ihrem 3' Ende aus unter Verwendung des β-Cyanoethyl-Phosphoramidit
Ansatzes zusammengebaut (siehe Beaucage in Protocols for Oligonucleotides
and Analogs (Agrawal, Hrg.), Humana Press, (1993), S. 33-61). Die
letzten sechs Nukleotide wurden zusammengebaut unter Verwendung
des H-Phosphonat Ansatzes (siehe Froehler in Protocols for Oligonucleotides
and Analogs (Agrawal, Hrg.) Humana Press, 1993, S. 63-80). Kontrolliertes
Porenglas (CPG) Träger
gebundenes Oligonukleotid (30 mg CPG; ungefähr 1 μM) enthaltend eine fünf H-Phosphonat
Bindung wurde mit 35S8 oxidiert (4
mCi, 1 Ci/mg, Amersham; 1 Ci = 37 GBq) in 60 ml Kohlenstoff disulfid/pyridin/triethylamin
(10:10:1). Die Oxidationsreaktion wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde
unter gelegentlichem Schütteln
durchgeführt.
Dann wurden 2 μl,
5 μl und
200 μl 5%
kalten Schwefels (32S8)
in der gleichen Lösungsmittelmixtur
alle 30 Min hinzugefügt,
um die Oxidation zu vervollständigen.
Die Lösung
wurde entfernt und der CPG Träger
wurde mit Kohlenstoff disulfid/pyridin/triethylamin (10:10:1) (3 × 500 μl) und mit
Acetonitril (3 × 700 μl) gewaschen.
Das Produkt wurde in konzentriertem Ammonium hydroxid deprotektiert
(55°C, 14
Stunden) und eingedampft. Das resultierende Produkt wurde durch
Polyacrylamid Gel Elektrophorese aufgereinigt (20% Polyacrylamid
enthaltend 7 M Harnstoff). Die gewünschte Bande wurde unter UV
Beschattung ausgeschnitten und das PS-Oligonukleotid wurde aus dem Gel extrahiert
und mit einer Sep-Pak C18 Kartusche (Waters) und Sephadex G-15 Säule entsalzen.
Die Ausbeute waren 20 A260 Einheiten (600 μg; spezifische
Aktivität,
1 μCi/μg).
-
3. Tiere und
Wirkstoffbehandlung
-
Männliche
Sprague-Dawley Ratten (150-200 g, Harlan Laboratories, Indianapolis,
IN) wurden bei der Studie verwendet. Die Tiere wurden mit kommerziellem
Futter und Wasser nach Bedarf für
1 Woche vor der Studie gefüttert.
Nachdem jedes Tier unter Verwendung von Pentobarbital anästhetisiert
wurde, wurde ein Einschnitt an dem unteren Teil des Abdomens gemacht,
um den Dickdarm zu exponieren. Das Kolon wurde an der Position 0.5
cm zum Caecum aufgeschnitten. Die Darminhalte wurden ausgewaschen
unter Verwendung von 30 ml physiologischer Kochsalzlösung (0.9%
NaCl) bei 37°C.
Nachdem der Anus ligiert war, wurden unmarkierte und [35S]-markierte
Oligonukleotide, die in physiologischer Kochsalzlösung (0.9%
NaCl) bei den vorgesehenen Konzentrationen aufgelöst waren,
in den Dickdarm durch den Schnitt injiziert, der nach Wirkstoffverabreichung
ligiert wurde. Das Abdomen wurde dann geschlossen und die Körpertemperatur
wurde bei 38 ± 0.5°C mittels
einer Wärmelampe
gehalten.
-
Oligonukleotide
wurden an Ratten in vier Dosierungshöhen verabreicht, d.h. 3.3,
10, 30 und 90 mg/kg (3 Ratten pro Dosierungshöhe). Blutproben wurden in Heparin-Röhrchen von
den Tieren zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt, d.h. nach 1,
2, 3 und 4 Stunden. Plasma wurde durch Zentrifugation abgetrennt.
4 Stunden nach Wirkstoffverabreichung wurden Tiere durch Ausbluten
während
der Natrium pentobarbital Anästhesie
eingeschläfert.
Nach dem Einschläfern
wurden alle Gewebe/Organe gesammelt, unmittelbar auf Whatman Nr.
1 Filterpapier aufgebracht, äußeres Fett
oder Bindegewebe entfernt, von allen Inhalten geleert und gereinigt,
und einzeln gewogen vor der Quantifizierung der Oligonukleotid abgeleiteten
Radioaktivität.
Biologische Proben wurden durch Bestimmung der Gesamt-Radioaktivität, HPLC
und PAGE Analyse unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren
analysiert.
-
4. Gesamt-Radioaktivitäts-Messungen
-
Die
Gesamt-Radioaktivitäten
in Geweben und Körperflüssigkeiten
wurden durch Flüssigkeitsszintillations-Spektrometrie
bestimmt (LS 6000TA, Beckman, Irvine, CA). Kurz gesagt, wurden biologische
Flüssigkeiten
(Plasma, 50-100 μl;
Urin, 50-100μl)
mit 6 ml Szintillationsflüssigkeit
(Budget-Solve, RPI, Mt. Prospect, IL) gemischt, um die Gesamt-Radioaktivität zu bestimmen.
Fäzes wurden
gemahlen und gewogen, bevor sie in einem 9-fachen Volumen 0.9% NaCl Kochsalzlösung homogenisiert
wurden. Ein Aliquot des Homogenats (100 μl) wurde mit Solubilisierer
(TS-2, RPI, Mt. Prospect, IL) und dann mit Szintillationsflüssigkeit
(6 ml) gemischt, um die Quantifizierung der Gesamt-Radioaktivität zu ermöglichen.
-
Nach
ihrer Entfernung wurden Gewebe sofort auf Whatman Nr. 1 Filterpapier
aufgebracht und gewogen, bevor sie in 0.9% NaCl Kochsalzlösung homogenisiert
wurden (3-5 ml pro Gram Nassgewicht). Das resultierende Homogenat
(100 μl)
wurde mit Solubilisierer (TS-2, RPI, Mt. Prospect, IL) und dann
mit Szintillationsflüssigkeit
(6 ml) gemischt, um die Gesamt-Radioaktivität zu bestimmen.
Das Volumen der jeder Probe hinzugefügten 0.9% NaCl Kochsalzlösung wurde
aufgezeichnet. Die homogenisierten Gewebe/Organe wurde bei ≤ 70°C gefroren
aufbewahrt, bis sie für
weitere Analysen verwendet wurden.
-
5. HPLC Analyse
-
Die
Radioaktivität
im Urin wurde analysiert durch Ionen gepaarte HPLC unter Verwendung
einer Modifikation des Verfahrens, das in seinen Grundzügen durch
Sands et al. beschrieben wurde (Mol. Pharm. (1994) 45: 932-943).
Urin Proben wurden zentrifugiert und durch einen 0.2 μm Acro Filter
passiert (Gelman, Ann Arbor, MI) vor der Analyse. Hybrid Oligonukleotide
und Metabolite in Plasmaproben wurden extrahiert unter Verwendung
der obigen Verfahren für
die Probenaufbereitung für
PAGE. Eine Microsorb MV-C4 Säule
(Rainin Instruments, Woburn, MA) wurde in der HPLC eingesetzt unter
Verwendung einer Hewlett Packard 1050 HPLC mit einer quaternären Pumpe
für das
Erstellen von Gradienten. Die mobile Phase schloss zwei Puffer ein;
Puffer A war 5 mM A Reagenz (Waters Co., Bedford, MA) in Wasser
und Puffer B war 4:1 (v/v) Acetonitril (Fisher)/Wasser. Die Säule wurde
mit einer Fließrate
von 1.5 ml/min eluiert, unter Verwendung des folgenden Gradienten:
(1) 0-4 min, 0% Puffer B; (2) 4-15 min 0-35% Puffer B; und (3) 15-70
min 35%-80% Puffer B. Die Säule
wurde mit Puffer A für
wenigstens 30 min vor dem nächsten
Lauf äquilibriert.
Durch Verwendung eines RediFrac Fraktionskollektors (Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, NJ), wurden 1 min Fraktionen (1.5 ml)
gesammelt und mit 5 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt, um die Radioaktivität in jeder
Fraktion zu bestimmen.
-
6. Gel Elektrophorese
-
Polyacrylamid
Gel Elektrophorese (PAGE) der extrahierten Oligonukleotide wurde
ausgeführt
unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren (Agrawal et al.
(1995) Biochem. Pharmacol. 50: 571-576; Zhang et al. (1995) Biochem.
Pharmacol. 49: 929-939; Zhang et al. (1995) Biochem. Pharmacol.
50: 571-576; und Zhang et al. (1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278: 971-979).
Plasma und Gewebe Homogenate wurden mit Proteinase K (2 mg/ml) in
Extraktionspuffer (0.5% SDS/10mM NaCl/20 mM Tris-HCl, pH 7.6/10
mM EDTA) für 1
Stunde bei 60°C
inkubiert. Die Proben wurden dann zweimal mit Phenol/Chloroform
(1:1, v/v) und einmal mit Chloroform extrahiert. Nach Ethanol Fällung wurden
die Extrakte durch Elektrophorese in 20% Polyacrylamid Gelen analysiert,
die 7 M Harnstoff enthielten. Urin Proben wurden filtriert, entsalzt,
und dann durch PAGE analysiert. Die Gele wurden in 10% Essigsäure/10%
Methanol Lösung
fixiert und dann vor der Autoradiographie getrocknet.
-
-
-
-
-
-
-
