DE60036700T2

DE60036700T2 - Antiproliferative aktivität von g-reichen oligonukleotiden und verfahren um sie zur bindung an nukleotin zu verwenden

Info

Publication number: DE60036700T2
Application number: DE60036700T
Authority: DE
Inventors: Donald M. Louisville MILLER; Paula J. Louisville BATES; John O. Louisville TRENT
Original assignee: Antisoma Research Ltd
Current assignee: Antisoma Research Ltd
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2020-04-08
Also published as: CA2370000A1; EP1181304A4; PT1181304E; EP1181304B1; ATE375358T1; DK1181304T3; EP1181304A1; JP2002541264A; WO2000061597A9; AU4212900A; CY1106991T1; AU775412B2; DE60036700D1; WO2000061597A1; US7314926B1; US20090326047A1; ES2296615T3; US8648051B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Hemmung von Zellproliferation. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung spezifische Oligonucleotide, die die Zellproliferation, die die von neoplastischen und/oder dysplastischen Zellen umfasst, durch Bindung an mit der Zellproliferation in Verbindung stehende spezifische Proteine hemmen.
Hintergrund der Erfindung
Oligonucleotide besitzen das Potential zur Erkennung von singulären Sequenzen von DNA oder RNA mit einem bemerkenswerten Spezifitätsgrad. Aus diesem Grund werden sie als vielversprechende Kandidaten zur Realisierung genspezifischer Therapien zur Behandlung von malignen, viralen und entzündlichen Erkrankungen betrachtet. Zwei Hauptstrategien einer oligonucleotidvermittelten therapeutischen Intervention wurden entwickelt, nämlich die Antisense- und Antigenansätze. Die Antisensestrategie hat als Ziel die Herabregulation der Expression eines spezifischen Gens durch Hybridisierung des Oligonucleotids an die spezifische mRNA, was zu einer Hemmung der Translation führt. Gewirtz et al. (1998) Blood 92, 712–736; Crooke (1998) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 115–122; Branch (1998) Trends Biochem. Sci. 23, 45–50; Agrawal et al. (1998) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 135–139. Die Antigenstrategie schlägt eine Hemmung der Transkription eines Zielgens mittels Tri pelhelixbildung zwischen dem Oligonucleotid und spezifischen Sequenzen in der doppelsträngigen Genom-DNA vor. Helene et al. (1997) Ciba Found. Symp. 209, 94–102. Klinische Versuche auf der Basis des Antisenseansatzes zeigen nun, dass Oligonucleotide in einer klinisch relevanten Weise verabreicht werden können und wenige toxische Nebenwirkungen aufweisen. Gewirtz et al. (1998) Blood 92, 712–736; Agrawal et al. (1998) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8, 135–139.
Während sowohl den Antisense- als auch Antigenstrategien ein gewisser Erfolg beschieden war, wurde in den letzten Jahren klar, dass die Interaktionen von Oligonucleotiden mit den Komponenten eines lebenden Organismus weit über eine sequenzspezifische Hybridisierung mit der Zielnucleinsäure hinausgehen. Vor kurzem durchgeführte Untersuchungen und die erneute Überprüfung von früheren Antisensedaten legten nahe, dass einige der beobachteten biologischen Wirkungen von Antisense-Oligonucleotiden nicht vollständig auf einer Watson-Crick-Hybridisierung mit der Ziel-mRNA beruhen können. In einigen Fällen wurde die erwartete biologische Wirkung (beispielsweise Hemmung von Zellwachstum oder Apoptose) erreicht, doch war dies nicht von einer Herabregulation des Zielproteins begleitet und es war daher unwahrscheinlich, dass es eine wirkliche Antisensewirkung war. White et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 227, 118–124; Dryden et al. (1998) J. Endocrinol. 157, 169–175. In vielen Fällen wurde gezeigt, dass andere nicht-sequenzspezifische Oligonucleotide biologische Wirkungen hervorrufen konnten, die der Antisensesequenz gleich waren oder über diese hinausgingen. Barton et al. (1995) Br. J. Cancer 71, 429–437; Burgess et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4051–4055; Benimetskaya et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 2648–2656. Obwohl unter Antisense-Forschern derzeit ein hohes Bewusstsein für die Bedeutung einer entspre chenden Kontrolle von Oligonucleotiden und die Notwendigkeit des Aufzeigens einer Hemmung der Zielproteinproduktion besteht (Stein (1998) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 129–132), ist der Mechanismus von Nicht-Antisensewirkungen wenig verstanden.
Insbesondere wurde wiederholt ermittelt, dass Phosphodiester- und Phosphorothioatoligodesoxynucleotide, die fortlaufende Guanosine (G) enthalten, Nicht-Antisensewirkungen auf das Wachstum von Zellen in Kultur zeigen. Burgess et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4051–4055; Benimetskaya et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 2648–2656; Saijo et al. (1997) Jpn. J. Cancer Res. 88, 26–33. Es gibt Anzeichen, dass diese Aktivität mit der Fähigkeit dieser Oligonucleotide zur Bildung stabiler Strukturen, die intramolekulare oder intermolekulare G-Quartette beinhalten, in Verbindung steht. Burgess et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4051–4055; Benimetskaya et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 2648–2656. Diese sind quadratisch-planare Anordnungen von vier über Wasserstoffbrückenbindungen gebundenen Guaninen, die durch einwertige Kationen stabilisiert sind. Es wird angenommen, dass derartige Strukturen eine wichtige Rolle in vivo spielen, und vermutliche quartettbildende Sequenzen wurden in Telomer-DNA (Sundquist et al. (1989) Nature 342, 825–829), Immunglobulinswitchregionsequenzen (Sen et al. (1988) Nature 334, 364–366), HIV1-RNA (Sundquist et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3393–3397), den fragilen X-Repeatsequenzen (Fry et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4950–4954) und dem Retinoblastomgen (Murchie et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20, 49–53) identifiziert.
Es wurde vorgeschlagen, dass Nicht-Antisensewirkungen auf der Sequestrierung von intrazellulären oder Oberflächenproteinen durch das Oligonucleotid beruhen können. Gold et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64, 763–797; Stein (1997) Ciba Found. Symp. 209, 79–89. Für G-reiche Oligonucleotide, die gefaltete, ein G-Quartett enthaltende Strukturen bilden können, wird angenommen, dass diese Bindung nicht durch die Primärsequenz der Oligonucleotide, sondern eher deren einzigartige dreidimensionale Formen vermittelt wird. Jedoch sind die Proteinziele dieser Oligonucleotide bisher nicht gut charakterisiert.
Oligonucleotide sind Polyanionspezies, die in Zellen, vermutlich durch rezeptorvermittelte Endocytose internalisiert werden. Vlassov et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1197, 95–108. Es ist wahrscheinlich, dass sie mit vielen Biomolekülen innerhalb der Zelle und auch in der extrazellulären Membran aufgrund von sowohl deren Ladung als auch deren Gestalt sowie sequenzspezifischen Interaktionen interagieren. Die Proteine, die an Oligonucleotide binden und Nicht-Antisensewirkungen vermitteln, wurden noch nicht eindeutig identifiziert.
Die vorliegende Anmeldung identifiziert ein ein G-reiches Oligonucleotid bindendes Protein, und die Fähigkeit eines G-reichen Oligonucleotids, an dieses Protein zu binden ist mit dessen Eignung bzw. Neigung, G-Quartette zu bilden, und mit dessen Fähigkeit zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen korreliert.
Die Anmelder beschreiben G-reiche Oligonucleotide (GROs), die starke Wachstumshemmwirkungen aufweisen, die in keiner Beziehung mit einer erwarteten Antisense- oder Antigenaktivität stehen. Obwohl der Mechanismus dieser Wirkungen noch nicht speziell angegeben wurde, zeigten die Anmelder, dass die antiproliferativen Wirkungen dieser Oligonucleotide mit deren Fähigkeit zur Bindung an ein spezifisches zelluläres Protein in Verbindung stehen. Da das GRO bindende Protein auch durch Anti-Nucleolin-Antikörper erkannt wird, folgerten die Anmelder, dass dieses Protein entweder Nucleolin selbst oder ein Protein ähnlicher Größe, das immunogene Ähnlichkeiten mit Nucleolin gemeinsam hat, ist.
Nucleolin ist ein in großer Menge vorhandenes multifunktionales 110-kDa-Phosphoprotein, von dem angenommen wird, dass es überwiegend im Nukleolus proliferierender Zellen lokalisiert ist (für Übersichtsartikel siehe Tuteja et al. (1998) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 407–436; Ginisty et al. (1999) J. Cell Sci. 112, 761–772). Nucleolin ist an vielen Aspekten der Ribosombiogenese beteiligt, wobei diese die Kontrolle von rDNA-Transkription, Prä-Ribosom-Verpackung und Organisation von nucleolärem Chromatin umfassen. Tuteja et al. (1998) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 33, 407–436; Ginisty et al. (1999) J. Cell Sci. 112, 761–772; Ginisty et al. (1998) EMBO J. 17, 1476–1486. Eine weitere hervorstechende Rolle für Nucleolin ist die als Shuttleprotein, das virale und zelluläre Proteine zwischen dem Cytoplasma und Nukleus/Nukleolus der Zelle transportiert. Kibbey et al. (1995) J. Neurosci. Res. 42, 314–322; Lee et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 7650–7656; Waggoner et al. (1998) J. Virol. 72, 6699–6709. Nucleolin ist auch, direkt oder indirekt, an anderen Rollen, die die nukleäre Matrixstruktur (Gotzmann et al. (1997) Electrophoresis 18, 2645–2653), Cytokinese und Kernteilung (Léger-Silvestre et al. (1997) Chromosoma 105, 542–52) umfassen, und als RNA- und DNA-Helicase (Tuteja et al. (1995) Gene, 160, 143–148) beteiligt. Die multifunktionale Natur von Nucleolin spiegelt sich in dessen Multidomänenstruktur, die aus einem histonähnlichen N-Terminus, einer zentralen Domäne, die RNA-Erkennungsmotive enthält, und einem glycin/argininreichen C-Terminus besteht. Lapeyre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1472–1476. Es ist bekannt, dass die Nucleolinspiegel mit der Rate der Zellproliferation in Verbindung stehen (Derenzini et al. (1995) Lab. Invest. 73, 497–502; Roussel et al. (1994) Exp. Cell Res. 214, 465–472), die bei rasch proliferierenden Zellen, beispielsweise malignen Zellen, erhöht sind und in sich langsamer teilenden Zellen niedriger sind. Aus diesem Grund ist Nucleolin ein attraktives therapeutisches Ziel.
Obwohl Nucleolin als ein vorwiegend nucleoläres Protein betrachtet wird, ist die Erkenntnis, dass Nucleolin in der Plasmamembran vorhanden war, konsistent mit mehreren Berichten, die Zelloberflächennucleolin identifizieren und dessen Rolle als Zelloberflächenrezeptor nahelegen. Larrucea et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 31718–31725; Callebout et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 21988–21997; Semenkovich et al. (1990) Biochemistry 29, 9708; Jordan et al. (1994) Biochemistry 33, 14696–14706.
Mehrere Mechanismen zur Erklärung der nicht-sequenzspezifischen Wirkungen von Oligonucleotiden wurden bereits vorgeschlagen. Diese umfassten die Bindung an zelluläre Rezeptoren (Rockwell et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6523–6528; Coulson et al. (1996) Mol. Pharmacol. 50, 314–325), die Modulation von Cytokin- oder Wachstumsfaktoraktivität (Hartmann et al. (1996) Mol. Med. 2, 429–438; Sonehara et al. (1996) J. Interferon Cytokine Res. 16, 799–803; Fennewald et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 21718–21721; Guvakova et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 2620–2627; Scaggiante et al. (1998) Eur. J. Biochem. 252, 207–215), die Hemmung der Zellzyklusprogression (Burgess et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4051–4055), Änderungen der Zelladhäsion (Saijo et al. (1997) Jpn. J. Cancer Res. 88, 26–33) und die Bindung an ein nicht-charakterisiertes 45-kDa-Protein (Ramanathan et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24564–24574). Die immunstimulierenden Eigenschaften von Oligonucleotiden, die 5'-CG-3'-Sequenzen ent halten, wurden ebenfalls beschrieben (McCluskie et al. (1998) J. Immunol. 161, 4463–4466), doch erscheint es unwahrscheinlich, dass sie mit den Wirkungen, die die Anmelder beobachteten, in Verbindung stehen.
Dempsey et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, S. 1066–1071, beschreiben Verbindungen, die B-Zellen-spezifische Doppelhelix-DNA bindende Faktoren (LR1) und Nucleolin umfassen, die an synthetische Oligonucleotide mit G-G-Basenpaaren binden. Dempsey et al. diskutieren die Wirkung von G-G-Paaren auf die In-vivo-Rekombination, insbesondere eine Immunglobulin-Switchrekombination.
Serin et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, S. 13109–13116, beschreiben die Struktur von Nucleolin derart, dass sie zwei RNA bindende Domänen umfasst, die die RNA-Bindungsspezifität von Nucleolin bestimmen. Serin et al. untersuchten Mutationen dieser Bindungsstellen, um aufzuzeigen, dass diese Stellen die Bindungsspezifität beeinflussen.
Weidner et al. (1995) 366, S. 146–150, beschreiben Phosphothioratoligonucleotide, die in einer nicht-sequenzspezifischen Weise an Nucleolin und insbesondere die RNA-Erkennungsmotive von Nucleolin binden. Weidner et al. verglichen die Bindungsfähigkeiten von Phosphothioratoligonucleotiden mit Phosphodiesteroligonucleotiden (die nicht an Nucleolin-RNA-Bindungsmotive binden).
Ishikawa et al. (1993) 13, S. 4301–4310, diskutieren nukleäre Proteine, die an Telomer-DNA und -RNA und insbesondere TTAGGG-Repeats binden.
In der vorliegenden Anmeldung identifizierten die Anmelder ein oligonucleotidbindendes Protein und sie zeigten eine Korrelation zwischen einer Bindung an dieses Protein und antiproliferativer Aktivität für eine Reihe von G-reichen Oligonucleotiden. Diese Erkenntnisse legen eine mechanistische Rolle für dieses Protein bei einer Nicht-Antisense-Oligonucleotid-vermittelten Hemmung von Zellwachstum stark nahe. Die Basis für die Erkennung von GROs durch Nucleolin ist aus den Sequenzen der getesteten Oligonucleotide nicht offensichtlich, sie kann jedoch mit deren Eignung bzw. Neigung zur Bildung spezieller G-Quartettstrukturen in Verbindung stehen.
Die Beziehung zwischen Nucleolinbindung und antiproliferativer Aktivität für andere, nicht-G-reiche Oligonucleotide wurde noch nicht vollständig beurteilt. Für ein Mischsequenzoligonucleotid (MIX1) wurde ermittelt, dass es an Nucleolin bindet, obwohl es keine wachstumshemmende Wirkung aufwies. Nucleolin enthält RNA-Bindungsdomänen, die spezifische Sequenzen von RNA oder einsträngiger DNA erkennen können. Dickinson et al. (1995) Mol. Cll Biol. 15, 456–465; Ghisolfi et al. (1996) J. Mol. Biol. 260, 34–53. Es ist möglich, dass dieses spezielle Oligonucleotid eine Sequenz oder Struktur enthält, die einem derartigen Erkennungselement ähnelt.
Als Stütze der Erkenntnisse der Anmelder, dass Nucleolin an G-reiche Oligonucleotide bindet, zeigten jüngere Berichte, dass Nucleolin an andere, ein G-Quartett bildende Sequenzen, wie Immunglobulin-Switchregionen und ribosomale Gensequenzen, binden kann (Dempsey et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 1066–1071, und Hanakai et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 15903–15912). Es ist möglich, dass Nucleolin derzeit undefinierte Funktionen in vivo aufweist, die von der Erkennung von G-reichen Sequenzen in beispielsweise ribosomalen DNA-Switchregionsequenzen oder Telomeren abhängen.
Die Synthese von Nucleolin ist positiv mit erhöhten Zellteilungsraten korreliert und Nucleolinspiegel sind daher in Tumorzellen im Vergleich zu den meisten normalen Zellen höher. Tatsächlich ist Nucleolin eines der nukleären Organisatorregion(NOR)proteine, deren Spiegel, die durch Silberanfärbung ermittelt werden, von Pathologen als Marker der Zellproliferation und Indikator von Bösartigkeit festgestellt werden. Nucleolin ist daher ein tumorselektives Ziel für eine therapeutische Intervention und es wird angenommen, dass Strategien zur Verringerung der Spiegel von funktionalem Nucleolin Tumorzellwachstum hemmen.
Die Konsequenzen einer Nucleolinhemmung auf das Wachstum von Zellen wurden nicht untersucht, doch sollte die Hemmung eines Proteins, dessen Funktionen Ribosomenproduktion, nukleären Transport und Zelleintritt umfassen, tiefgreifende Wirkungen auf das Wachstum von Zellen zeigen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Hemmung der Proliferation von malignen, dysplastischen und/oder hyperproliferativen Zellen in einem Subjekt durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines guanosinreichen Oligonucleotids an das Subjekt bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Oligonucleotide bereit, die zur spezifischen Bindung an ein spezifisches zelluläres Protein, das an der Proliferation von Zellen, insbesondere malignen, dysplastischen und/oder hyperproliferativen Zellen, beteiligt ist, fähig sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Damit die Weise, auf die die oben genannten Merkmale, Vor teile und Aufgaben der Erfindung sowie andere, die deutlich werden, erhalten werden, und detailliert verstanden werden können, können speziellere Beschreibungen der Erfindung, die oben kurz zusammengefasst ist, unter Bezug auf bestimmte Ausführungsformen derselben, die in den angehängten Figuren erläutert sind, erhalten werden. Diese Figuren bilden einen Teil der Beschreibung. Es ist jedoch anzumerken, dass die angehängten Figuren bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung erläutern und daher nicht als deren Umfang beschränkend betrachtet werden sollen.
1: MTT-Assays, die das Wachstum von Tumorzellen, die mit G-reichen Oligonucleotiden oder Wasser als Kontrolle behandelt wurden, über die Zeit zeigen, wobei (A) der Zell typ DU145 ist, (B) der Zelltyp MDA-MB-231 ist, (C) der Zelltyp HeLa ist und (D) der Zelltyp MCF-7 ist und wobei ☐ für GRO15A,
für GRO15B, O für GRO29A, ∆ für GRO26A und
für Wasser steht.
2 erläutert die Ergebnisse von MTT-Assays, die das Wachstum von (A) DU145-Zellen, (B) MDA-MB-231-Zellen und (C) HS27-Zellen, die mit dem aktiven Oligonucleotid GRO29A (volle Quadrate), GRO15B (inaktives Oligonucleotid, halbgefüllte Quadrate) oder keinem Oligonucleotid (leere Quadrate) behandelt wurden, zeigen.
3: MTT-Assays, die die Dosisabhängigkeit der Wachstumshemmung durch GRO29A für Leukämiezelllinien, U937 und K563, und eine nichtmaligne hämopoetische Stammzelllinie von Mäusen (ATCC 2037) zeigen.
4 sind UV-Kurven der thermischen Renaturierung zur Feststellung von G-Quartettbildung durch G-reiche Oligonucleotide, wobei (A) TEL, (B) GRO29A, (C) GRO15A, (D) GRO15G und (E) GRO26A angibt.
5 ist ein Chromatogramm, das die Aufnahme von G-reichem Oligonucleotid durch MDA-MB-231-Brustkrebszellen erläutert.
6: (A) Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), der die Bindung von ³²P-markierten Oligonucleotiden an 5 μg HeLa-Kernextrakte und die Kompetition durch unmarkierte Kompetitoroligonucleotide (100-facher Molüberschuss gegenüber markiertem Oligonucleotid) zeigt. Kompetitoroligonucleotide sind mit T (TEL), 29 (GRO29A), 26 (GRO26A) und 15A (GRO15A) abgekürzt. (B) EMSA, der zwischen ³²P-markiertem TEL-Oligonucleotid (1 nM) und 5 μg HeLa-Kernextrakten gebildete Komplexe und die Wirkung von unmarkierten G-reichen Kompetitoroligonucleotiden (10 oder 100 nM) zeigt. (C) SDS-Polyacrylamidgel, das durch UV-Vernetzung von markierten Oligonucleotiden und HeLa-Kernextrakten bei Inkubation in Abwesenheit oder Gegenwart von unmarkiertem Kompetitor (100-facher Molüberschuss) gebildete Komplexe zeigt. (D) Southwestern-Blot von HeLa-Kernextrakten, die mit ³²P-markierten G-reichen Oligonucleotiden (2 × 10⁶ Zellimpulse pro min, etwa 0,75 nmol) sondiert wurden.
7: (A) ist ein Chromatogramm, das einen MTT-Assay von MDA-MB-231-Zellen, die mit einer einzigen 10-μM-Dosis von G-reichem Oligonucleotid oder PPS als Kontrolle behandelt wurden, erläutert, wobei der Assay am Tag 9 durchgeführt wurde (Oligonucleotid am Tag 1 zugegeben); (B) erläutert einen EMSA, der den durch Bindung von 5 μg MDA-MB-231-Kernextrakten an ³²P-markiertes TEL-Oligonucleotid und Kompetition durch unmarkierte G-reiche Oligonucleotide (10-facher Molüberschuss) gebildeten Komplex zeigt; (C) ist ein Chromatogramm, das die Ergebnisse eines MTT-Assays von MDA-MB-231-Zellen, die mit einer einzigen 10-μM-Dosis von 3'-geschütztem C-reichem Oligonucleotid (CRO) oder Misch sequenzoligonucleotid (MIX1) oder mit 20 Einheiten/ml Heparin (HEP) im Vergleich mit inaktiven (GRO15B) und aktiven (GRO29A) G-reichen Oligonucleotiden behandelt wurden, erläutert, wobei der Assay am Tag 7 durchgeführt wurde; und (D) ist ein Chromatogramm, das die Ergebnisse eines MMT-Assays von MDA-MB-231-Zellen, die mit einer einzigen 10-μM-Dosis von nichtmodifizierten Mischsequenzoligonucleotiden im Vergleich mit einem nichtmodifizierten GRO29A-Analogon (29A-OH) und TEL behandelt wurden, wobei zur Behandlung der Zellen das Kulturmedium durch serumfreies Medium, das 10 μm Oligonucleotid enthielt, ersetzt wurde und nach 4 h bei 37°C fetales Kälberserum bis zum Erreichen von 10% (V/V) zugegeben wurde und der Assay am Tag 7 durchgeführt wurde, erläutert.
8: (Oben) Southwestern-Blot unter Verwendung von radioaktiv markiertem GRO15A zur Detektion von GRO bindendem Protein in nukleären (N) und Cytoplasma(C)-Extrakten von verschiedenen Zelllinien. (Unten): Empfindlichkeit verschiedener Zelllinien für die wachstumshemmenden Wirkungen von GRO29A und GRO15A.
9: (A) Southwestern(SW)- und Western(W)-Blots, die jeweils mit ³²P-markiertem aktivem G-reichem Oligonucleotid (GRO15A) oder Nucleolinantiserum sondiert wurden. Das linke Bild zeigt MDA-MB-231-Kernextrakte (5 μg/Bahn); das rechte Bild zeigt HeLa-Kernextrakte (Promega Inc., 5 μg/Bahn). (B) Southwestern- und Western-Blots von Proteinen, die aus den Lysaten von MDA-MB-231-Zellen, die mit keinem Oligonucleotid (kein), aktivem G-reichem Oligonucleotid (15A) oder weniger aktivem G-reichem Oligonucleotid (15B) behandelt wurden, eingefangen wurden. (C) Southwestern- und Western-Blots, die die Bindung von GRO15A und Nucleolinantikörper an Proteinextrakte (3 μg/Bahn) von MDA-MB-231-Zellen: Kernextrakte (NU), Cytoplasmaextrakte (CY) und Membranproteine (ME), zeigen.
10 erläutert die Ergebnisse von Immunfluoreszenzuntersuchungen, die die Antinucleolinanfärbung von MDA-MB-231-Zellen, die unbehandelt sind (A) und mit GRO29A behandelt wurden (B), 72 h nach der Behandlung zeigen.
11: Einfärbung von nicht-permeabilisierten DU145-Zellen mit Nucleolinantikörper, die das Vorhandensein von Nucleolin in der Plasmamembran zeigt.
12: (A) G-Quartett, das die Wasserstoffbrückenbindungsinteraktion erläutert. (B) Molekülmodell von GRO29A, das eine vorgeschlagene dimere Struktur, die durch 8 G-Quartette stabilisiert ist, zeigt. (C) Dimethylsulfonabdruck von GRO29A, der die bevorzugte Methylierung des Schleifenregionguanosins zeigt, was mit dem vorhergesagten Modell konsistent ist.
13: (A) MTT-Assay, der antiproliferative Aktivität von neuen guanosinreichen Oligonucleotiden gegenüber MDA-MB-231-Brustkrebszellen zeigt. (B) Sequenzen von neuen guanosinreichen Oligonucleotiden.

14: Photographie, die die Ergebnisse eines Electrophoretic Mobility Shift Assay zum Screening von Nucleolin bindenden Verbindungen zeigt, wobei gilt:

Bahn	Beschreibung
1. GRO15B	Inaktives G-reiches Oligonucleotid
2. GRO29A	Antiproliferatives G-reiches Oligonucleotid
3. Coffein	Stimulans; cAMP-Phosphodiesteraseinhibitor
4. 5-Fluoruracil	Nucleosidanalogon; Krebsarzneistoff; DNA schädigendes Mittel
5. Cisplatin	Krebsarzneistoff; DNA-Vernetzungsmittel
6. Polymyxin-B-Sulfat	Polypeptid; Antibiotikum
7. Ara-C	Nucleotidanalogon; Krebsarzneistoff; DNA schädigendes Mittel
8. Camptothecin	Naturprodukt; Krebsarzneistoff; Topoisomerase-I-Inhibitor
9. PMA	Phorbolester; Tumorpromotor; PKC-Aktivator
10. Taxol	Naturprodukt; Krebsarzneistoff; Antimitotikum
11. Doxorubicin (Adriamycin)	Antitumorantibiotikum; DNA bindendes Mittel
12. Heparin	Polyanionisches Polysaccharid
13. OMR29A	G-reiches Oligo mit modifiziertem Gerüst; antiproliferativ

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt die Bereitstellung von neuen guaninreichen Oligonucleotiden (GROs) sowie Verfahren zur Verwendung von mindestens einem GRO zur Hemmung des Wachstums von neoplastischen, dysplastischen oder in anderer Weise hyperproliferativen Zellen in einem Subjekt.
Beispiele für die neuen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung weisen die im folgenden angegebenen Nucleotidsequenzen und die folgende Bezeichnung auf: GRO14A (5'-GTTGTTTGGGGTGG-3' SEQ ID NO: 1), GRO15A (5'-GTTGTTTGGGGTGGT-3' SEQ ID NO: 2), GRO25A (5'-GGTTGGGGTGGGTGGGGTGGGTGGG-3' SEQ ID NO: 3), GRO28A (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG-3' SEQ ID NO: 4), GRO29A (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 5), GRO29-2 (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTTTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 6), GRO29-3 (5'-TTTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 7), GRO29-5 (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTTGGGTGGTGG TGG-3' SEQ ID NO: 8), GRO29-13 (5'-TGGTGGTGGTGGT-3' SEQ ID NO: 9), GRO11A (5'-GGTGGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 10), GRO14C (5'-GGTGGTTGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 11), GRO26B (5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 12), GRO56A (5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTGT GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 13), GRO32A (5'-GGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGGTTGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 14), GRO32B (5'-TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3' SEQ ID NO: 15), GRO29-6 (5'-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTT-3' SEQ ID NO: 16), GRO28B (5'-TTTGGTGGTGGTGGTGTGGTGGTGGTGG-3' SEQ ID NO: 17) und GRO13A (5'-TGGTGGTGGT-3' SEQ ID NO: 18). Andere Oligonucleotide mit der gleichen Aktivität werden ebenfalls betrachtet.
Für die Oligonucleotide GRO29-2, GRO29-3, GRO29-5, GRO29-13, GRO15C, GRO28H und GRO24I wurde gezeigt, dass sie das Wachstum von Brustkrebszellen hemmen und/oder um die Bindung an dem G-reiches Oligonucleotid bindenden Protein konkurrieren, wie durch einen Electrophoretic Mobility Shift Assay gezeigt wurde (siehe 6 und 7). Die Demonstration von Aktivität und Proteinbindung von GROs der vorliegenden Erfindung sind für GRO15A, 29A in 1 und 6; für GRO14A, 25A, 28A in 7; für GRO11A, 14C, 26B, 32A, 56A in 3 angegeben; für GRO29-2, 29-3, 29-5, 29-6, 28B wurde ebenfalls gezeigt, dass sie antiproliferative Aktivität und Proteinbindung aufweisen.
G-reiches Oligonucleotid (GRO) bedeutet, dass die Oligonucleotide aus 4-100 Nucleotiden (vorzugsweise 10-30 Nucleotiden) mit DNA-, RNA-, 2'-O-Methyl-, Phosphorothioat- oder anderen chemisch ähnlichen Gerüsten bestehen. Deren Sequenzen enthalten ein oder mehrere GGT-Motive. Die Oligonucleotide weisen antiproliferative Aktivität gegen Zellen auf und sie binden an GRO bindendes Protein und/oder Nucleolin. Diese Eigenschaften können unter Verwendung des MTT-Assays und der EMSA-Technik, die in 6 gezeigt ist, oder anderer ähnlicher Assays aufgezeigt werden.
Die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung sind reich an Guanosin und zur Bildung von G-Quartettstukturen fähig. Insbesondere bestehen die Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung primär aus Thymidin und Guanosin mit mindestens einem fortlaufenden Guanosinrepeat in der Sequenz jedes Oligonucleotids. Die G-reichen Oligonucleotide sind stabil und können in Serum über längere Zeiträume nicht-abgebaut verbleiben und es wurde ermittelt, dass sie deren wachstumshemmende Wirkungen über Zeiträume von mindestens sieben Tagen beibehalten.
Der hier verwendete Ausdruck "Oligonucleotid" ist als ein Molekül, das zwei oder mehrere Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide umfasst, definiert. Die exakte Größe hängt von einer Zahl von Faktoren ab, die die Spezifität und Bindungsaktivität gegenüber Zielliganden umfassen. In Bezug auf "Basen" oder "Nucleotide" umfassen die Ausdrücke sowohl Desoxyribonucleinsäuren als auch Ribonucleinsäuren.
Die neuen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Hemmung der Proliferation von malignen, dysplastischen und/oder hyperproliferativen Zellen durch spezifische Bindung an spezifische Zellproteine, die mit Zellproliferation in Verbindung stehen, die Nucleolin und nucleolinähnliche Proteine umfassen, verwendet werden.
Der Ausdruck "nucleonlinähnlich" wird zur Definition eines Proteins, das entweder Nucleolin selbst oder ein Protein ähnlicher Größe, das immunogene Ähnlichkeiten und/oder funktionale Ähnlichkeiten mit Nucleolin gemeinsam hat, ist, verwendet.
Die Oligonucleotide können an deren 3'-Ende modifiziert werden, um eine spezifische Eigenschaft des Oligonucleotids zu ändern. Beispielsweise kann der 3'-Terminus des Oligonucleotids durch Addition einer Propylamingruppe, für die ermittelt wurde, dass sie die Stabilität des Oligonucleotids gegenüber Serumnucleasen erhöht, modifiziert werden. Andere Modifikationen, die einschlägig bekannt sind, umfassen 3'- und 5'-Modifikationen, beispielsweise die Bindung von Cholesterin, und Gerüstmodifikationen, beispielsweise eine Phosphorothioatsubstitution und/oder 2'-O-Methyl-RNA.
Der Ausdruck "Hemmung der Proliferation von malignen, dysplastischen und/oder hyperplastischen Zellen" umfasst jede partielle oder vollständige Wachstumshemmung und er umfasst Verringerungen der Proliferationsrate oder des Wachstums der Zellen.
Der hier verwendete Ausdruck "neoplastisch" umfasst das neue anomale Wachstum von Geweben und/oder Zellen, wie Krebs oder ein Tumor, die beispielsweise Brustkrebs, Leukämie oder Prostatakrebs umfassen. Der Ausdruck "neoplastisch" umfasst auch maligne Zellen, die in benachbarte Strukturen eindringen und diese zerstören können und/oder metastasieren können.
Der hier verwendete Ausdruck "dysplastisch" umfasst jedes anomale Wachstum von Zellen, Geweben oder Strukturen, was Zustände wie Psoriasis umfasst.
Der Ausdruck "Subjekt" bedeutet alle tierischen Lebwesen einschließlich Menschen. Beispiele für Subjekte umfassen Menschen, Kühe, Hunde, Katzen, Ziegen, Schafe und Schweine.
Ein Fachmann kann ohne weiteres Patienten mit einem malignen, dysplastischen oder hyperproliferativen Zustand, wie Krebs oder Psoriasis, identifizieren; beispielsweise Patienten, die eine Krebserkrankung wie Brustkrebs, Prostatakrebs, Gebärmutterhalskarzinome und dgl. aufweisen.
Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge eines Oligonucleotids gemäß der vorliegenden Erfindung, die bei Verabreichung an das Subjekt ein Symptom der Erkrankung, Störung oder des Zustands, beispielsweise durch Hemmen oder Verringern der Proliferation von dysplastischen, hyperproliferativen oder malignen Zellen, verbessert.
Die GROs der vorliegenden Erfindung können einem Patienten oder Subjekt entweder allein oder als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden. Die GROs können Patienten entweder oral, rektal, parenteral (intravenös, intramuskulär oder subkutan), intrazisternal, intravaginal, intraperitoneal, intravesikal, lokal (Pulver, Salben oder Tropfen) oder als Mund- oder Nasenspray verabreicht werden.
Zusammensetzungen der GROs gemäß der vorliegenden Erfindung, die zur parenteralen Injektion geeignet sind, können physiologisch akzeptable sterile wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen und sterile Pulver zur Rekonstitution zu sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen umfassen. Beispiele für geeignete wässrige und nichtwässrige Träger, Verdünnungsmittel, Lösemittel oder Vehikel umfassen Wasser, Ethanol, Polyole (Propylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin und dgl.), geeignete Gemische derselben, pflanzliche Öle (wie Olivenöl) und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Eine entsprechende Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung eines Überzugs, wie Lecithin, durch Aufrechterhalten der erforderlichen Teilchengröße im Falle von Dispersionen und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden.
Diese Zusammensetzungen können ferner Adjuvantien, wie Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Dispensiermittel, enthalten. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und Antipilzmittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dgl., sichergestellt werden. Es kann auch günstig sein, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Natriumchlorid und dgl., einzuarbeiten. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form kann durch die Verwendung von absorptionsverzögernden Mitteln, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine, beigebracht werden.
Feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate. In derartigen festen Dosierungsformen ist die aktive Verbindung (GRO) mit mindestens einem inerten üblichen Streckmittel (oder Träger), wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat, oder (a) Füllstoffen oder Streckmitteln, beispielsweise Stärkearten, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannit und Kieselsäure, (b) Bindemitteln, beispielsweise Carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und Akaziengummi, (c) Feuchthaltemitteln, beispielsweise Glycerin, (d) Desintegrationsmitteln, beispielsweise Agaragar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte komplexe Silicate und Natriumcarbonat, (e) Lösungsverzögerungsmitteln, beispielsweise Paraffin, (f) Absorptionsbeschleunigern, beispielsweise quaternäre Ammoniumverbindungen, (g) Benetzungsmitteln, beispielsweise Cetylalkohol und Glycerinmonostearat, (h) Adsorptionsmitteln, beispielsweise Kaolin und Bentonit, und (i) Gleitmitteln, beispielsweise Talkum, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat oder Gemische derselben, gemischt. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Puffermittel umfassen.
Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen Art können auch als Füllstoffe in weichen und harten gefüllten Gelatinekapseln unter Verwendung von Streckmitteln wie Lactose oder Milchzucker sowie Polyethylenglykolen von hohem Molekulargewicht und dgl. verwendet werden.
Feste Dosierungsformen wie Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit Überzügen und Hüllen, beispielsweise enterischen Überzügen und anderen einschlägig bekannten hergestellt werden. Sie können Opakifizierungsmittel enthalten und auch von einer derartigen Zusammensetzung sein, dass sie die aktive Verbindung oder aktive Verbindungen in einem bestimmten Teil des Darmtrakts in verzögerter Weise freisetzen. Beispiele für Einbettungszusammensetzungen, die verwendet werden können, sind Polymersubstanzen und Wachse. Die aktiven Verbindungen können ggf. auch in mikroverkapselter Form mit einem oder mehreren der oben genannten Streckmittel vorliegen.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch akzeptable Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Zusätzlich zu den aktiven Verbindungen können die flüssigen Dosierungsformen üblicherweise einschlägig verwendete inerte Verdünnungsmittel, wie Wasser oder andere Lösemittel, Solubilisierungsmittel und Emulgatoren, beispielsweise Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl, Glycerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitan oder Gemische dieser Substanzen und dgl. enthalten.
Außer derartigen inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen auch Adjuvantien, wie Benetzungsmittel, Emulgatoren und Suspendiermittel, Süßungsmittel, Aromatisierungsmittel und Duftstoffe, umfassen.
Suspensionen können zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Suspendiermittel, beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbit und Sorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agaragar und Tragant oder Gemische dieser Substanzen und dgl. enthalten.
Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung sind vorzugsweise Suppositorien, die durch Mischen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit geeigneten nichtreizenden Streckmitteln oder Trägern, wie Kakaobutter, Polyethylenglykol oder ein Suppositoriumwachs, die bei gewöhnlichen Temperaturen fest, jedoch bei Körpertemperatur flüssig sind und daher im Rektum oder der Vaginahöhle schmelzen und die aktive Komponente freisetzen, hergestellt werden.
Dosierungsformen zur topischen Verabreichung eines GRO gemäß dieser Erfindung umfassen Salben, Pulver, Sprays und Inhaliermittel. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen mit einem physiologisch akzeptablen Träger und beliebigen Konservierungsmitteln, Puffern oder Treibmitteln, die erforderlich sein können, gemischt. Ophthalmologische Formulierungen, Augensalben, -pulver und -lösungen werden ebenfalls als im Umfang dieser Erfindung liegend betrachtet.
Ferner können die GROs der vorliegenden Erfindung in nicht solvatisierten sowie solvatisierten Formen mit pharmazeutisch akzeptablen Lösemitteln, wie Wasser, Ethanol und dgl., existieren. Allgemein werden die solvatisierten Formen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als den nichtsolvatisieren Formen äquivalent betrachtet.
Die GROs der vorliegenden Erfindung können einem Patienten mit Dosierungsmengen im Bereich von etwa 1,5 mg bis etwa 150 mg pro Tag verabreicht werden. Für einen normalen erwachsenen Menschen mit einem Körpergewicht von etwa 70 kg ist eine Dosierung im Bereich von etwa 0,2 mg bis etwa 2,0 mg pro kg Körpergewicht pro Tag bevorzugt. Die verwendete spezifische Dosierung kann jedoch variieren. Beispielsweise kann die Dosierung von einer Zahl von Faktoren, die die Bedürfnisse des Patienten, die Schwere des zu behandelnden Zustands und die pharmakologische Aktivität der zu verwendenden Verbindung umfassen, abhängen. Die Bestimmung optimaler Dosierungen für einen speziellen Patienten ist dem Fachmann geläufig. Die GROs der vorliegenden Erfindung können in einer Einzeldosierung und/oder mehreren Dosierungen gegeben werden.
Ferner soll die vorliegende Erfindung GROs umfassen, die entweder unter Verwendung von Standardtechniken der organischen Synthese, die kombinatorische Chemie umfassen, oder durch biologische Verfahren, beispielsweise Metabolisierung, hergestellt werden.
Die G-reichen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit anderen Chemotherapeutika verwendet werden, um eine synergistische oder verstärkte Wirksamkeit oder Hemmung von neoplastischem Zellwachstum zu ergeben. Beispielsweise können die G-reichen Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Chemotherapeutika, die beispielsweise Cisplatin, Mitoxantron, Etoposid, Camptothecin, 5-Fluoruracil, Vinblastin, Paclitaxel, Docetaxel, Mithramycin A, Dexamethason, Coffein, und andere dem Fachmann bekannte Chemotherapeutika umfassen, verabreicht werden. Durch die Anmelder durchgeführte Experimente zeigten, dass GRO29A synergistisch mit Cisplatin zur Hemmung von MDA-MB-231-Zellwachstum in vitro wirkt. Die Anmelder ermittelten, dass unter Bedingungen, bei denen GRO29A als solches wenig Wirkung zeigt (5%-ige Wachstumshemmung), eine Kombination von Cisplatin (0,5 μg/ml) und GRO29A das Zellwachstum synergistisch hemmte (63%-ige Hemmung im Vergleich zu 29% Hemmung für Cisplatin allein).
Die im folgenden angegebenen Beispiele sollen spezielle Ausführungsformen der Erfindung erläutern und sollen den Umfang der Beschreibung einschließlich der Ansprüche in keinster Weise beschränken.
BEISPIELE
Experimentelle Verfahren
Oligonucleotide
3'-modifizierte Oligonucleotide wurden von Oligos Etc. (Wilsonville, OR) gekauft oder an der University of Alabama in Birmingham unter Verwendung von 3'-C3-Amin-CPG-Säulen von Glen Research (Sterling, VA) synthetisiert. Nichtmodifizierte Oligonucleotide wurden von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, erhalten. Die Oligonucleotide wurden in Wasser resuspendiert, in n-Butylalkohol ausgefällt, mit 70%-igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Sie wurden dann durch Filtration durch ein 0,2-μm-Filter sterilisiert. Jedes Oligonucleotid wurde auf Integrität durch 5'-Radiomarkierung und anschließende Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) überprüft. Die in dieser Arbeit berichteten Ergebnisse waren reproduzierbar und un abhängig von der Quelle synthetischer Oligonucleotide.
Zellwachstumsassays
Die Zellen wurde mit niedriger Dichte (10² bis 10³ Zellen pro Vertiefung, in Abhängigkeit von der Zelllinie) in dem mit entsprechendem Serum ergänzten Medium in 96-Vertiefungen-Platten (eine Platte pro MTT-Assayzeitpunkt) ausplattiert und unter Standardbedingungen der Zellkultur gezüchtet. Am folgenden Tag (Tag 1) wurde Oligonucleotid oder Wasser als Kontrolle zu dem Kulturmedium zum Erreichen einer Endkonzentration von 15 μM gegeben. Ferner wurde Oligonucleotid in einer der halben Anfangsdosis äquivalenten Menge an den Tagen zwei, drei und vier zu dem Kulturmedium gegeben. Die Zellen wurden unter Verwendung des MTT-Assay (Morgan (1998) Methods Mol. Biol. 79, 179–183) an den Tagen eins, drei, fünf, sieben und neun nach dem Ausplattieren getestet. Das Kulturmedium wurde über die Dauer des Experiments (die die zum Wachsen unbehandelter Zellen bis zur Konfluenz erforderliche Zeit war) nicht geändert. Die Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und die Balken stellen die Standardabweichung der Daten dar. Für das in 7A gezeigte Experiment wurden MDA-MB-231-Brustkrebszellen (5 × 10² Zellen pro Vertiefung) in einer 96-Vertiefungen-Platte ausplattiert. Nach 24 h wurde eine Einzeldosis eines Oligonucleotids oder ein gleiches Volumen PBS als Kontrolle zu dem Kulturmedium bis zu einer Endkonzentration von 10 μM gegeben. Lebensfähige Zellen wurden sieben Tage nach dem Ausplattieren unter Verwendung des MTT-Assays festgestellt. Für das Experiment unter Verwendung von 3'-nichtmodifizierten Oligonucleotiden (7D) wurde mit Serum ergänztes Medium durch serumfreies Medium, das Oligonucleotid enthielt, (oder serumfreies Medium allein in Kontrollvertiefungen) ersetzt. Nach Inkubation bei 37°C über 4 h wurde fetales Kälberserum (Life Technologies, Inc.) zu dem Medium bis zum Erreichen von 10% (V/V) gegeben. Das in diesen Experimenten verwendete Heparin war das von Schweinedarm stammende Natriumsalz von USP-Qualität, das von Apothecon (Bristol-Myers Squibb Co.) gekauft wurde. Arbeitslösungen wurden aus der Stammlösung (1000 Einheiten/ml) in sterilem PBS verdünnt.
Detektion von G-Quartetten durch W-Spektroskopie Oligonucleotide wurden in Tm-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 140 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂) mit einer derartigen Konzentration, dass A₂₆₀ 0,6 beträgt, (Molkonzentrationen im Bereich von 2,0 bis 3,9 μm) resuspendiert. Die Proben wurden durch Sieden während 5 min denaturiert und langsam auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und über Nacht bei 4°C inkubiert. Thermische Denaturierungs/Renaturierungsexperimente wurden unter Verwendung eines Amersham Pharmacia Biotech Ultrospec 2000-Instruments, das mit einer durch den Peltier-Effekt erhitzten Küvettenhalterung und Temperatursteuervorrichtung ausgestattet war, (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die Extinktion bei 295 nm wurde über einen Temperaturbereich von 25–95 oder 20–90°C mit einer Heiz/Kühlrate von 0,5°C/min überwacht.
Oligonucleotidaufnahme
MDA-MB-231-Zellen wurden in 24-Vertiefungen-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/Vertiefung ausgesät. Nach 24 h wurde Oligonucleotid (5 nmol von unmarkiertem Oligonucleotid und 5 × 10⁶ cpm (etwa 1 pmol) von 5'-³²P-markiertem Oligonucleotid) direkt dem Kulturmedium bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 10 μM zugesetzt. Die Zellen wurden 10 oder 26 h bei 37°C inkubiert und dann dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden von der Platte durch Trypsinisieren entfernt, gewaschen und in 100 μl PBS gesammelt. Ein 50-μl-Aliquot wurde durch Szintillationszählung zur Feststellung von zellgebundener Radioaktivität gezählt. Um sicherzustellen, dass die Waschverfahren zur Entfernung des gesamten überschüssigen Oligonucleotids ausreichend waren, wurde die letzte PBS-Waschflüssigkeit gezählt und es wurde ein sehr niedriger Wert im Vergleich zur zellgebundenen Radioaktivität ermittelt. Die verbliebenen 50-μl-Aliquots wurden 5 min gekocht und auf Eis gegeben. Ein gleiches Volumen Phenol/Chloroform wurde zugegeben und die Oligonucleotide wurden in die wässrige Phase extrahiert, mit n-Butylalkohol ausgefällt und durch Denaturieren der Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem 15%-igen Gel analysiert.
Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs)
Oligonucleotide wurden mit ³²P unter Verwendung von T4-Kinase 5'-markiert. Markiertes Oligonucleotid (Endkonzentration 1 nM, etwa 50 000 cpm) wurde 30 min bei 37°C entweder allein oder in Gegenwart von unmarkiertem Kompetitoroligonucleotid präinkubiert. Kernextrakte wurden zugegeben und die Probe wurde weitere 30 min bei 37°C inkubiert. Sowohl die Präinkubations- als auch die Bindungsreaktionen wurden in Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 140 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreit, 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 8% (V/V) Glycerin) durchgeführt. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von 5% Polyacrylamidgelen in TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA) durchgeführt.
W-Vernetzung
Für die UV-Vernetzungsexperimente wurden Proben wie oben beschrieben (EMSA) inkubiert. Sie wurden dann auf Eis gegeben und 5 cm von der Quelle entfernt unter Verwendung der "Autocrosslink"-Funktion eines Stratagene UV Stratalinker bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Proben unter denaturierenden Bedingungen auf einem 8% Polyacrylamid-SDS-Gel unter Verwendung eines Standard-Tris-Glycin-Puffers einer Elektrophorese unterzogen und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Southwester-Blotting
Kernextrakte wurden auf einem 8% Polyacrylamid-SDS-Gel einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Polyvinylidendifluorid(PVDF)membran durch Elektroblotting unter Verwendung eines Tris-Glycin/Methanol(10% (V/V))-Puffers übertragen. Immobilisierte Proteine wurden denaturiert und renaturiert, indem sie 30 min bei 4°C mit 6 M Guanidin·HCl gewaschen wurden, worauf Waschen in 1:1-, 1:2- und 1:4-Verdünnungen von 6 M Guanidin in HEPES-Bindungspuffer (25 mM HEPES, pH 7,9, 4 mM KCl, 3 mM MgCl₂) folgte. Die Membran wurde durch Waschen während 1 h in einer 5%-igen Lösung von fettarmer Trockenmilch (NDM) in Bindungspuffer blockiert. Die Hybridisierung mit markiertem Oligonucleotid (1/4 × 10⁶ cpm) erfolgte während 2 h bei 4°C in HEPES-Bindungspuffer, der mit 0,25% NDM, 0,05% Nonidet P 40, 400 μg/ml Lachssperma-DNA und 100 μg/ml eines nichtverwandten Mischsequenz-35-mer-Oligonucleotids (5'-TCGAGAAAAACTCTCCTCTCCTTCCTTCCTCTCCA-3' SEQ ID NO: 19) ergänzt war. Die Membranen wurden in Bindungspuffer gewaschen und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Western-Blotting
Western-Blotting wurde bei Raumtemperatur in PBS-Puffer, der Tween 20 zu 0,1% (für polyklonalen Antikörper) oder 0,05% (monoklonaler Antikörper) enthielt, durchgeführt. Die PVDF-Membranen wurden mit PBS-Tween 20, das 5% NDM enthielt, 1 h blockiert, gewaschen und 1 h mit einer 1:1000-Verdünnung von Nucleolinantiserum oder einem monoklonalen Antikörper von Nucleolin (MBL Ltd., Japan, 1 μg/ml Endkonzentration) in PBS-Tween 20 inkubiert. Die Membranen wurden dreimal jeweils 5 min in PBS-Tween 20 gewaschen und 1 h mit einem sekundären Antikörper, der in PBS-Tween 20 verdünnt war, (1:1000 Anti-Kaninchen-IgG-HRP oder 1:2000 Anti-Maus-IgG-HRP) inkubiert. Nach dem Waschen wurde der Blot unter Verwendung von ECL-Reagens (Amersham Pharmacia Biotech) nach den Vorschriften des Herstellers sichtbar gemacht.
Einfangen von biotinylierten Oligonucleotid-Protein-Komplexen
MDA-MB-231-Zellen wurden in 90-mm-Schalen bis 50% Konfluenz gezüchtet. 5'-biotinylierte Oligonucleotide wurden zu dem Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 5 μM gegeben. Nach Inkubation während 2 h bei 37°C wurden die Zellen ausführlich mit PBS gewaschen und durch Zugabe von 1 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,02% (Gew/V) Natriumazid, 0,1 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid, 1% (V/V) Nonidet P40, 0,5% (Gew/V) Natriumdesoxycholat, 0,5 mM Dithiothreit, 1 μg/ml Aprotinin) lysiert und anschließend 10 min bei –20°C inkubiert. Genomische DNA wurde durch wiederholte Injektion des Lysats durch eine Nadel feiner Abmessung geschert. Das Lysat wurde zu streptavidinbeschichteten Magnetperlen (MagneSphere, Promega Inc.) gegeben und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden gewonnen und ungebundene Probe wurde entfernt. Die Perlen wurden dann zweimal mit 1 ml Lysepuffer und erneut mit 1 ml Puffer A gewaschen. Schließlich wurden die Proteine durch Zugabe von 50 μl Beladungspuffer (der 1% SDS und 5% 2-Mercaptoethanol enthielt) und Inkubation während 15 min bei 65°C eluiert.
Präparation von Kern-, Cytoplasma- und Membranproteinextrakten
Die in EMSAs verwendeten HeLa-Kernextrakte wurden von Promega Inc. gekauft (Bandshift-Qualität). Kern- und Cytoplasmaextrakte von MDA-MB-231-Zellen wurden unter Verwendung des Protokolls gemäß der Beschreibung in F. M. Ausubel et al., Ausubel et al. (Hrsg.) (1996) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, NY, Abschnitt 12.1, hergestellt. Plasmamembranproteine wurden aus MDA-MB-231-Zellen unter Verwendung eines früher beschriebenen Verfahrens hergestellt. Yao et al. (1996) Biochemical Pharmacology 51, 431–436; Naito et al. (1988) J. Biol. Chem. 263, 11887–11891.
India-Ink-Anfärbung
Die Membran wurde 15 min bei Raumtemperatur in PBS-Tween 20, das drei Tropfen Higgins India Ink 4415 enthielt, inkubiert und mit destilliertem Wasser gewaschen.
Nucleolinbindungsassay
Um zu bestimmen, welche Moleküle oder Verbindungen auf Nichtoligonucleotidbasis zur Bindung an Nucleolin fähig sind, wurde ein EMSA wie im folgenden beschrieben durchgeführt und die Ergebnisse hierfür sind in 14 angegeben. In diesem Assay wurde die Bindungsfähigkeit mehrerer verschiedener Moleküle oder Verbindungen für Nucleolin untersucht. Dieser Assaytyp kann zum Screening auf Moleküle oder Verbindungen, die Nucleolin binden können, benutzt werden.
Kernproteine (2,5 μg, in diesem Fall von HeLa-Zellen) wurden zu 5'-³²P-markiertem TEL-Oligonucleotid (5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG SEQ ID NO: 20, 2 nM Endkonzentration) gegeben. Nichtmarkiertes Kompetitoroligonucleotid oder eine Verbindung wurden bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 50 nM Oligonucleotid (äquivalent zu etwa 0,5 μg/ml für GRO29A) oder 0,5 μg/ml (Bahnen 3–12) zugegeben. Die Bindungsreaktionen erfolgten während 30 min bei 37°C in einem Puffer, der 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 140 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, 8% (V/V) Glycerin, 1 mM DTT, 0,2 mM PMSF enthielt. Die Proben wurden auf einem 5% Polyacrylamidgel unter Verwendung von TBE-Puffer analysiert.
Versuchsprotokoll für Chemotherapeutikum und GRO
Cisplatin (in 1%-iger DMSO-Lösung bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml) wurde zu dem Medium von MDA-MB-231-Brustkrebszellen, die in der Kultur wuchsen, gegeben. Nach 2 h wurde GRO29A (in PBS-Lösung bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 8 μM) zu dem Medium gegeben. Nach sechs Tagen wurde die relative Zahl lebensfähiger Zellen unter Verwendung des MTT-Assay bestimmt. Mit GRO29A allein behandelte Zellen erhielten ein entsprechendes Volumen von 1% DMSO anstelle von Cisplatin. Mit Cisplatin allein behandelte Zellen erhielten ein entsprechendes Volumen von PBS anstelle von GRO29A.
In-vivo-Wirksamkeit von GROs gegenüber Krebs
Die erste Aufgabe ist das Aufzeigen von In-vivo-Wirksamkeit von GROs gegenüber Prostatakrebs und ein Erfolg in diesen Untersuchungen kann zu klinischen Versuchen von GROs führen. Die zweite Aufgabe ist die Untersuchung von Nucleolinspiegeln und -eigenschaften in Prostatazellen. Nucleolin, ein nucleoläres Protein, das an mehreren Aspekten des Zellwachstums beteiligt ist, wurde als das vermutliche Ziel für GRO-Wirkungen identifiziert. Es ist eine Hypothese der Anmelder, dass GROs an Nucleolin binden und dieses inaktivieren. Es ist bekannt, dass die Nucleolinkonzentrationen (im Kern) positiv mit der Zellproliferationsrate korreliert sind und daher weisen Strategien, die Nucleolin hemmen, signifikantes therapeutisches Potential auf. Die Anmelder zeigten, dass Nucleolin auch auf der Oberfläche von Prostatakrebszellen vorhanden ist, und dies kann für den Mechanismus von GRO-Wirkungen relevant sein. Ferner können die Konzentrationen von Zelloberflächennucleolin in malignen Zellen im Vergleich zu normalen Zellen erhöht sein. Dies kann Implikationen in Bezug auf Nucleolin als Tumorzellmarker ergeben. Eine weitere Aufgabe ist die Erforschung neuer Therapien für Prostatakrebs, beispielsweise Kombinations therapien von GRO und Chemotherapeutika und Inhibitoren von Nucleolin aus kleinen Molekülen.
Bestimmung der Aktivität von GROs in einer Reihe von Zell
linien, die von normalem und malignem Prostatagewebe stammen
Nucleolinkonzentrationen im Nukleus, Cytoplasma und der Plasmamembran dieser Zellen werden unter Verwendung von Blottingtechniken und Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Zur Optimierung der Zufuhr von GROs kann die Aufnahme und Aktivität von GROs, die in kultivierte Zellen durch eine Zahl verschiedener Verfahren eingeführt werden, untersucht werden. Ferner wird die Tumoraufnahme von GROs, die durch verschiedene Verfahren zugeführt werden, in Maus- und Rattenmodellen von Prostatakrebs untersucht. Zur Untersuchung der In-vivo-Wirksamkeit werden nackte Mäuse mit subkutanen oder orthotopisch implantierten Tumorxenotransplantaten und das Dunning-Rattenmodell von Prostatakrebs verwendet. Vorbereitende Daten legen nahe, dass GROs synergistisch mit einigen Chemotherapiearzneistoffen sind. Daher können die Wirkungen von Kombinationen von GROs mit einer Vielzahl von cytotoxischen und anderen Mitteln in kultivierten Zellen untersucht und auf etwaige synergistische Kombinationen in Tiermodellen getestet werden. Schließlich kann ein Homologiemodell von Nucleolin auf der Basis der berichteten Strukturen vieler ähnlicher Proteine konstruiert und zur Identifizierung potentieller Inhibitoren von Nucleolin aus kleinen Molekülen durch ein "virtuelles Screening"-Verfahren verwendet werden.
Herkömmliche Chemotherapeutika waren zur Verlängerung des Überlebens in randomisierten Versuchen von Patienten mit hormonreferaktärem Prostatakrebs unwirksam und neue therapeutische Ansätze sind dringend erforderlich. Die GROs der vorliegenden Erfindung sind potentielle tumorspezifische Mittel, die hoch aktiv gegenüber Prostatakrebszellen sind. Sie weisen einen neuen Wirkmechanismus und enormes therapeutisches Potential im Kampf gegen Prostatakrebs auf. Die Anmelder identifizierten ferner Nucleolin als neues Ziel für eine therapeutische Intervention bei Prostatakrebs. Die Entwicklung des Verstehens von diesem Protein kann zu verbesserten diagnostischen oder prognostischen Techniken für Prostatakrebs oder einer neuen Klasse von Arzneistoffen, die Nucleolin hemmen, führen.
Die im folgenden beschriebenen Verfahren beschreiben das Testen des Oligonucleotids GRO29A. Wenn jedoch ein anderes GRO höhere Aktivität und ähnliche Stabilität aufweist, kann es anstelle von GRO29A verwendet werden.
Empfindlichkeit von verschiedenen malignen und transformierten Prostatazelllinien und der Beziehung zwischen Empfindlichkeit und den Konzentrationen von Nucleolin/GRO bindendem Protein
Der GI₅₀-Wert für GRO29A gegenüber einer Vielzahl von Zelllinien, die von humaner und Rattenprostata stammen, unter Verwendung des MTT-Assays wird berechnet. Diese umfassen hormonabhängige (LNCaP) und -unabhängige (DU145, PC-3), nichtmaligne (PZ-HPV-7 und Ratten-YPEN-1) und multiarzneistoffresistente (Ratten-AT3 B1 und MLBB-2) Zelllinien. Die Zelllinien können von ATCC gekauft werden. Zur Bestimmung von Nucleolinkonzentrationen werden Kern-, Cytoplasma- und Plasmamembranextrakte von jeder Zelllinie durch Standardverfahren hergestellt. Bates et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (37): 27369–77. Die Extrakte werden auf 8% Polyacrylamid-SDS-Gelen einer Elektrophorese unterzogen und auf PVDF-Membranen übertragen. Sie werden durch Southwestern-Blotting (mit radioaktiv markiertem GRO) und Western-Blotting (mit monoklonalem Antikörper von Nucleolin, Santa Cruz) zur Bestimmung der Konzentrationen von GRO bindendem Protein/Nucleolin untersucht. Die Zellen werden auch durch Immunfluoreszenzanfärbung unter Verwendung von Nucleolinantikörper und entsprechenden Mitteln zur Anfärbung von entweder intrazellulären oder Zelloberflächenproteinen untersucht.
Optimierung der Zufuhr von Oligonucleotiden zu Tumorzellen in Kultur und in vivo
Zur Untersuchung der Aufnahme von GRO29A in kultivierten Zellen wird ein 5'-FITC-markiertes Analogon von GRO29A verwendet. Die Zellen (zunächst DU145 und PC-3) werden mit diesem Oligonucleotid, das durch eine Vielzahl verschiedener Verfahren zugeführt wird, behandelt. Diese umfassen Elektroporation, kationische Lipide (1 μg GRO29A: 4 μg DOTAP-DOPE [1:1]), Polymyxin-B-Sulfat (Sigma), Milchsäurenanopartikel (eine einfache Synthese ist in Berton et al. (1999) Eur. J. Pharm. Biopharm. 47 (2): 119–23, beschrieben) und Streptolysin-O-Permeabilisation (Giles et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26 (7): 1567–75). Die Oligonucleotidaufnahme und intrazelluläre Lokalisation werden durch Fluoreszenzmikroskopie festgestellt. Die Wirkungen von verschiedenen Zufuhrverfahren auf die antiproliferative Aktivität von GRO29A werden durch den MTT-Assay bestimmt. Um zu bestimmen, ob die Aufnahmeeigenschaften von GRO29A signifikant verschieden von nicht-G-reichen Oligonucleotiden sind, wird die nicht-unterstützte Aufnahme von GRO29A mit C-reichen und Mischsequenz-FITC-markierten Oligonucleotiden verglichen. Wenn die Aufnahme signifikant verschieden ist, wird eine Untersuchung der Möglichkeit, dass verschiedene Rezeptoren verwendet werden, in Experimenten, wobei FITC-markierte Oligonucleotide mit Zellen in Gegenwart von nichtmarkierten Kompetitoroligonucleotiden inkubiert werden, durchgeführt. Diese Experimente liefern wichtige Informationen in Bezug auf die Aufnahme von Oligonucleotiden allgemein und die Bedeutung einer GRO-Interaktion mit Nucleolin an der Zelloberfläche.
Zur Untersuchung der Pharmakokinetik, Stabilität und Tumorzufuhr werden In-vivo-Verfahren ähnlich den früher für ein G-reiches Phosphodiesteroligonucleotid, das als Anti-HIV-Mittel beurteilt wurde, berichteten verwendet. Wallace et al. (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 280 (3): 1480–8. Zunächst wird ein Analogon von GRO29A, das intern mit ³²P markiert ist, synthetisiert. Dieses Verfahren wurde früher beschrieben (Bishop et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 (10): 5698–703) und es umfasst die Synthese von zwei kurzen Oligonucleotidfragmenten, die 5'-Markierung von einem Fragment unter Verwendung von T4-Kinase und die anschließende templatgerichtete Ligation der zwei Fragmente durch T4 Ligase. Das markierte Oligonucleotid wird dann durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) gereinigt. Männliche nackte Mäuse (insgesamt 9) werden subkutan (s. c.) an deren Hinterseite mit DU145-Prostatakrebszellen unter milder Anästhesie beimpft. Wenn Tumore etabliert sind (etwa 0,5 cm Durchmesser), werden die Mäuse mit einer einzigen 5-mg/kg-Dosis von GRO29A (ein Gemisch von markiertem und nichtmarkiertem Oligonucleotid) in einem Volumen von 25 μl durch intratumorale, intraperitoneale oder intravenöse (Schwanzvene) Injektion behandelt. Die Tiere werden auf Zeichen von akuter Toxizität und Gewichtsabnahme beobachtet. An den Tagen zwei, vier und sieben nach der GRO-Injektion werden die Mäuse durch CO₂-Inhalation euthanasiert, der Tumor herausgeschnitten und Blut und Organe gewonnen. Die Radioaktivitätsmengen in Tumor, Serum, Leber, Niere, Milz und Prostata werden untersucht. Die Stabilität wird durch denaturierende PAGE von Serumproben bestimmt. Ähnliche Experimente werden auch unter Verwendung des Dunning-Prostatakarzinommodells durchgeführt. Isaacs et al. (1978) Cancer Res. 38 (11 Pt 2): 4353–9; Zaccheo et al. (1998) Prostate 35 (4): 237–42. Wenn eine der in kultivierten Zel len getesteten Zufuhrtechniken zu einer signifikant verbesserten Aufnahme führt (und zur In-vivo-Zufuhr geeignet ist), wird sie ebenfalls getestet. Diese Experimente bestimmen die optimalen Verabreichungswege bei Ratten und Mäusen und sie liefern Angaben für ein optimales Dosierungsprogramm. Alle Tierexperimente erfolgen strikt nach den institutionellen Richtlinien in Bezug auf Versorgung und Verwendung von Tieren.
Beurteilung der Wirksamkeit von GROs bei der Hemmung von Prostatakrebswachstum und -metastasierung in vivo
Die Wirksamkeit in Modellen nackter Mäuse wird als erstes getestet. Mäuse werden s. c. mit DU145-Zellen unter milder Anästhesie beimpft. Nach der Etablierung von tastbaren Xenotransplantaten werden die Mäuse (sechs Mäuse pro Gruppe) mit GRO29A, Kontrolloligonucleotid (5'-GACTGTACCGAGGTGCAAGTACTCTA mit 3'-Aminomodifikation) oder PBS unter Verwendung des oben beschriebenen optimalen Verabreichungswegs behandelt. Drei Behandlungsgruppen erhalten 0,5-, 5- oder 50-mg/kg-Dosen zweimal pro Woche während zwei Wochen. Körpergewicht und Tumorgröße (mit Greifzirkeln ermittelt) werden überwacht. An einem geeigneten Zeitpunkt werden die Mäuse durch Inhalation von CO₂ euthanasiert und die Tumore herausgeschnitten. Schnitte des Tumors werden durch morphologische Analyse und Immunanfärbung untersucht, wobei dies Nucleolin-, PCNA-, Ki-67- und TUNEL-Analyse für Apoptose umfasst. Ähnliche Experimente unter Verwendung der optimalen (oder wirtschaftlich durchführbaren) Dosis werden zur Bestimmung der Wirksamkeit von GRO29A zur Hemmung von PC-3- und LNCaP-Xenotransplantaten durchgeführt. Modelle von metastasierendem Prostatakrebs werden dann implementiert. Eine chirurgische orthotopische Implantation von PC-3-Tumoren in die Prostatadrüsen von nackten Mäusen wurde vor kurzem berichtet (An et al. (1998) Prostate 34 (3): 169–74) und sie führte zu Lymphknotenmetastasen (13/19 Mäuse) und Lungenmetastasen (5/19) nach zwölf Wochen nach der Implantation. Das Dunning-Rattenmodell von Prostatakarzinom wurde von Isaacs et al. entwickelt ((1978) Cancer Res. 38 (11 Pt 2): 4353–9) und es wird in weitem Umfang zur Untersuchung von Tumorwachstum und -metastasierung verwendet. Dieses umfasst die s. c. Injektion von Tumorgewebe und führt zu Lymphknoten-, Lungen- und Skelettmetastasen. Tiere (fünfzehn pro Gruppe) erhalten Tumore wie zuvor beschrieben implantiert (Isaacs et al. (1978) Cancer Res. 38 (11 Pt 2): 4353–9; Zaccheo et. al. (1998) Prostate 35 (4): 237–42) und eine Behandlung mit GRO29A beginnt sechs Wochen nach der Implantation (oder beim ersten Erscheinen von tastbaren Tumoren im Rattenmodell) und sie wird zweimal pro Woche über weitere sechs Wochen fortgesetzt. An diesem Zeitpunkt (oder zuvor, wenn Tiere sterbend oder gequält erscheinen) werden die Tiere euthanasiert und einer Autopsie unterzogen, um die primäre Tumorgröße und eine Metastasierung zu untersuchen. Tumore und Metastasen werden wie oben histologisch untersucht.
Beurteilung von Therapien mit Kombinationen GRO/cytotoxischer Arzneistoff für Prostatakrebs
Die Wirksamkeit von Kombinationsbehandlungen von GRO29A mit Chemotherapiearzneistoffen und anderen Mitteln, von denen erwartet wird, dass sie wachstumsgehemmte Zellen beeinflussen, wird bestimmt. Diese umfassen Mitoxantron, Etoposid, Cisplatin, Camptothecin, 5-Fluoruracil, Vinblastin, Mithramycin A, Dexamethason und Coffein (fördert die Progression durch Checkpoints des S-Phase-Zellzyklus). Diese Gruppe umfasst Mittel mit verschiedenen Wirkmechanismen, beispielsweise Topoisomerase-I- und -II-Inhibitoren, Mitoseinhibitoren und DNA schädigende Mittel. Die Aktivität dieser wird in kultivierten Zellen unter Verwendung des MTT-Assays unter Bestimmung von Zellzahlen getestet. Die Zellen werden durch Zugabe von Arzneistoff (mit der GI₃₀-Dosis) zu dem Medium, worauf 24 h später die Zugabe von GRO29A (GI₃₀-Dosis) folgt, oder in der umgekehrten Reihenfolge behandelt. Für Kombinationen, für die synergistische Aktivität besteht, werden die Zellen auf Zellzyklusstörung (durch Durchflusscytometrie) und Apoptose (Durchflusscytometrie von Annexin-V-angefärbten Zellen) untersucht. Synergistische Kombinationen werden auch in vivo wie oben beschrieben getestet.
Entwicklung von Homologiemodellen von Nucleolin und Durchführen eines "virtuellen Screening" einer Bibliothek kleiner Moleküle zur Identifizierung potentieller Nucleolininhibitoren
Inhibitoren von Nucleolin aus kleinen Molekülen können praktischere Alternativen zu Oligonucleotiden sein. Homologiemodellierung (mit MSI Modeller und Homologieprogrammen) wird zur Erstellung eines 3D-Modells von Nucleolin ausgehend von dessen Sequenzalignment mit bekannten Strukturen verwandter Proteine (16 wurden identifiziert) verwendet. Standardtechniken für Gerüstaufbau, Schleifenmodellierung, Strukturüberlagerung und statistische Analyse der erhaltenen Modelle werden verwendet. Das Homologiemodell wird unter Verwendung von Moleküldynamik verfeinert.
Das virtuelle Screening verwendet die MSI Ludi-Software kombiniert mit der ACD-Datenbank. Ludi passt Moleküle in das aktive Zentrum von Nucleolin durch Übereinstimmen von komplementären polaren und hydrophoben Gruppen ein. Eine empirische Punktbewertungsfunktion wird zur Priorisierung der Treffer verwendet. Ludi schlägt auch Modifikationen vor, die die Bindungsaffinität zwischen den aktiven Nucleotiden und Nucleolin erhöhen können, und es kann auch das Homologiemodell von Nucleolin durch Folgerungen aufgrund der Bindung der aktiven Nucleotide verbessern. Die ACD-Strukturdatenbank enthält 65 800 kommerziell und synthe tisch erhältliche Chemikalien, die unmittelbar zur weiteren Entwicklung erhalten werden können. Eine Auswahl der vielversprechendsten Verbindungen wird auf Proteinbindung und antiproliferative Aktivität in kultivierten Zellen und in vivo getestet.
Wachstumshemmende Wirkungen von G-reichen Oligonucleotiden Die Wirkungen von vier G-reichen Phosphodiesteroligonucleotiden (GROs) auf das Wachstum von Tumorzellen in Kultur wurde getestet. Diese Oligonucleotide bestanden vollständig aus Desoxyguanosin und Thymidin und sie enthielten mindestens zwei fortlaufende Guanosine. Für eine erhöhte Stabilität gegenüber Serumnucleasen wurden die Oligonucleotide am 3'-Terminus mit einer Propylaminogruppe modifiziert. Diese Modifikation schützt die Oligonucleotide vor einem Abbau in einem Serum enthaltenden Medium für mindestens 24 h.
1A–D zeigt die Ergebnisse von MTT-Assays zur Bestimmung der relativen Zahlen lebender Zellen in behandelten Zelllinien, die von Prostata(DU145)-, Brust(MDA-MB-231, MCF-7)- oder Gebärmutterhals(HeLa)karzinomen stammen.
Zwei Oligonucleotide, GRO29A und GRO15A, hemmten die Proliferation in allen getesteten Zelllinien konsistent. Für drei der Zelllinien wies GRO29A eine stärkere hemmende Wirkung als GRO15A auf (für MCF-7-Zellen hatten die Oligonucleotide ähnliche Wirkungen). Das Wachstum von mit zwei anderen Oligonucleotiden, GRO15B und GRO26A, behandelten Zellen war ähnlich dem der zur Kontrolle wasserbehandelten Zellen (GRO26A wies eine schwache wachstumshemmende Wirkung in MDA-MB-231- und HeLa-Zellen auf).
Die in 2A–C angegebenen Ergebnisse zeigen, dass GRO29A eine geringere wachstumshemmende Wirkung auf eine nicht-maligne Zelllinie (HS27) im Vergleich zu den meisten malignen Zelllinien, beispielsweise DU145, MDA-MB-231, aufweist. Ferner zeigt GRO29A antiproliferative Wirkungen gegenüber Leukämiezelllinien, beispielsweise K562 und U937, wie in 3 angegeben ist. Es weist eine geringere wachstumshemmende Wirkung gegenüber einer nicht-malignen hämopoetischen Stammzelllinie (ATCC 2037) auf.
G-Quartettbildung durch G-reiche Oligonucleotide
Zur Untersuchung der Bildung von G-Quartettstrukturen durch die G-reichen Oligonucleotide wurde eine von Mergny et al. (1998) FEBS Lett. 435, 74–78, beschriebene UV-Schmelztechnik verwendet. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass die Dissoziation von G-Quartetten zu einer Verringerung der Extinktion bei 295 nm führt, und es wird berichtet, dass dies eine zuverlässigere Anzeige für eine intramolekulare G-Quartettbildung als die Messung bei 260 nm ergibt. Als Kontrolle zur G-Quartettbildung verwendeten wir ein einzelsträngiges Oligonucleotid, TEL. Dieses Oligonucleotid enthält vier Repeats der humanen Telomersequenz 5'-TTAGGG und es ist bekannt, dass es in vitro eine G-Quartettstruktur bildet. Wang et al. (1993) Structure 1, 263–282. 4A zeigt die Denaturierungskurve dieser Sequenz. Die G-Quartettbildung wird durch einen klaren Übergang mit einer Schmelztemperatur von 66°C angezeigt. Der Übergang war reversibel und eine leichte Hysterese wurde zwischen den Aufheiz- und Abkühlkurven (nicht gezeigt) mit 0,5°C/min beobachtet, was einen sehr langsamen Übergang anzeigt. Das aktivste Oligonucleotid, GRO29A, (4B) zeigte ein ähnliches Profil, was klar das Vorhandensein von G-Quartetten anzeigt. Das am wenigsten aktive Oligonucleotid, GRO15A, (4C) zeigte eine Verringerung der Extinktion zwischen 20 und 50°C. Dies legt eine G-Quartettbildung nahe, jedoch wird ein klarer Übergang nicht beobachtet, da die Schmelztemperatur niedriger als für TEL (4A) oder GRO15A (4C) ist. Die Kurven für die zwei inaktiven Oligonucleotide, GRO15B (4B) und GRO26A (4E), zeigten keine für eine intramolekulare G-Quartettbildung charakteristischen Übergänge unter diesen Bedingungen.
Relative Aufnahme von Oligonucleotiden
Um zu bestimmen, ob die antiproliferative Aktivität von G-reichen Oligonucleotiden durch deren unterschiedliche Aufnahme in Zellen erklärt werden kann, wurde die Zellaufnahme von 5' radioaktiv markierten Oligonucleotiden festgestellt. Obwohl dieses Verfahren die absolute Zellaufnahme eines Oligonucleotids aufgrund der Wirkung von Phosphomonoesterase zur Entfernung der 5'-Markierung unterschätzen kann, kann es eine verwendbare Information bei Vergleichen der relativen Aufnahme liefern. Scaggiante et al. (1998) Eur. J. Biochem. 252, 207–215; Capaccioli et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 197, 818–825. 5 zeigt die relative Aufnahme von Oligonucleotiden in Zellen nach 10 h, die durch zellgebundene Radioaktivität ermittelt wurde. Die Reihenfolge der Aufnahme (d. h. GRO15A > GRO29A ~ CRO > GRO15B > GRO26A > MIX1) war nach 26 h die gleiche. Das Vorhandensein von intaktem Oligonucleotid im Inneren von Zellen wurde durch Polyacrylamidelektrophorese von Zelllysaten verifiziert.
Obwohl 5 zeigt, dass Unterschiede im Hinblick auf das Ausmaß der Oligonucleotidaufnahme in Abhängigkeit von der Sequenz bestanden, korrelierten diese nicht mit antiproliferativer Aktivität. Beispielsweise wurde ein inaktives Oligonucleotid, CRO, (siehe 6C) mit ähnlicher Wirksamkeit wie das aktivste Oligonucleotid, GRO29A, aufgenommen. Daher können die unterschiedlichen wachstumshemmenden Eigenschaften der Oligonucleotide nicht im Hinblick auf Unterschiede der Zellaufnahme erklärt werden. Es wurde festgestellt, dass die relative Aufnahme gut mit dem Anteil (jedoch nicht der Zahl) von Thymidinen in einer Sequenz zu korrelieren schien, doch ist die Bedeutung dieser Beobachtung derzeit nicht klar.
Aktive G-reiche Oligonucleotide binden an ein spezifisches zelluläres Protein
Zur weiteren Untersuchung des Mechanismus der wachstumshemmenden Wirkungen wurde die Bindung der Oligonucleotide an zelluläre Proteine untersucht. 5' radioaktiv markierte Oligonucleotide wurden mit HeLa-Kernextrakten allein oder in Gegenwart von nichtmarkierten Kompetitoroligonucleotid inkubiert und durch einen Electrophoretic Mobility Shift Assay untersucht. Das ein G-Quartett bildende Telomersequenzoligonucleotid, TEL, wurde als Kompetitor in diesem Experiment mitverwendet. Ein einzelsträngiges Oligonucleotid, TEL, wurde ebenfalls als Kompetitor in diesem Experiment mitverwendet. TEL enthält vier Repeats der humanen Telomersequenz 5'-TTAGGG-3' und es ist bekannt, dass es in vitro eine G-Quartettstruktur bildet. Wang et al. (1993) Structure 1, 263–282. 6A zeigt die Bildung eines stabilen Protein-Oligonucleotid-Komplexes (mit "*" markiert). Diese Bande war intensiv, wenn das markierte Oligonucleotid eines der wachstumshemmenden Oligonucleotide GRO15A oder GRO29A (Bahnen 1 und 5) war, jedoch bildete das inaktive Oligonucleotid GRO26A nur einen schwachen Komplex (Bahn 9). Dieses Experiment zeigte auch, dass der Komplex von entweder nichtmarkierten antiproliferativem Oligonucleotid oder TEL, jedoch nicht von dem inaktiven GRO26A, effektiv Konkurrenz erhalten konnte.
Zur weiteren Bestätigung, dass das gleiche Protein an TEL und die wachstumshemmenden Oligonucleotide bindet, wurde ein ähnliches Experiment durchgeführt, wobei TEL markiert wurde. Markiertes TEL bildete zwei Komplexe mit Kernextrakten in Abwesenheit von Kompetitoroligonucleotiden (Banden A und B, 6B). Der langsamer wandernde TEL-Protein-Komplex (Bande A) erhielt Konkurrenz durch nichtmarkierte wachstumshemmende Oligonucleotide (GRO15A, GRO29A), jedoch nicht durch inaktive Oligonucleotide (GRO26A, GRO15B). Der schneller wandernde Komplex (Bande B) war für TEL spezifisch und erhielt keine Konkurrenz durch G-reiche Oligonucleotide. Daher war die Bindung von Kompetitor-GROs durch eine Verringerung der Intensität der Bande A und eine Erhöhung der Intensität der Bande B (aufgrund der Freisetzung von markiertem TEL aus dem Komplex der Bande A) gekennzeichnet. Dieser Assay ermöglichte einen Vergleich der Bindungsaffinität von nativen GROs (ohne 5'-Phosphorylierung) und er wurde zur Feststellung von Proteinbindung in folgenden Experimenten verwendet. Um sicherzustellen, dass die Kompetition auf der Bindung des GRO an die Proteinkomponente von Komplex A beruhte und nicht das Ergebnis einer Interaktion zwischen GRO und dem TEL-Oligonucleotid war, wurde ein Mobilitätsshift an einem 15% Polyacrylamidgel durchgeführt. Keine verschobenen Banden wurden beobachtet, wenn markiertes TEL mit GROs in Abwesenheit von Protein inkubiert wurde (Daten nicht gezeigt).
Um das nährungsweise Molekulargewicht des an Komplex A beteiligten Proteins zu bestimmen und zu bestätigen, dass die Kompetition für diesen Komplex eine Folge der direkten Bindung des Proteins an Oligonucleotide ist, wurde eine UV-Vernetzungsuntersuchung durchgeführt. 5'-markierte Oligonucleotide und HeLa-Kernextrakte wurden allein oder in Gegenwart von nichtmarkierten Kompetitoroligonucleotiden inkubiert. Die Proben wurden dann mit UV-Licht bestrahlt, was zu einer Vernetzungsbildung zwischen Proteinresten und Thymidinen in dem Oligonucleotid führte. Das Protein wurde auf diese Weise radioaktiv markiert und konnte auf einem SDS-Polyacrylamidgel detektiert werden. 6C zeigt die Ergebnisse dieses Experiments. Sowohl TEL als auch GRO15A vernetzten sich mit einem Protein (als "*" markiert), was Konkurrenz durch antiproliferative Oligonucleotide und TEL, jedoch nicht inaktives GRO26A erhielt. Das aktivste Oligonucleotid, GRO29A, bildete ebenfalls diesen etwa 100-kDa-Komplex und einen weiteren Komplex von höherem Molekulargewicht (nicht angegeben). Inaktives GRO26A ergab eine kaum sichtbare Bande bei etwa 100 kDa (nicht angegeben).
Das Molekulargewicht des Kernproteins wurde durch Southwestern-Blotting genauer bestimmt. HeLa-Kernextrakte wurden auf einem 8 Polyacrylamid-SDS-Gel einer Elektrophorese unterzogen und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde blockiert und in Streifen geschnitten. Jeder Streifen wurde bei 4°C mit einem ³²P-markierten G-reichen Oligonucleotid in Gegenwart von nicht verwandter nichtmarkierter doppelsträngiger und einzelsträngiger DNA zur Blockierung von nichtspezifischer Bindung inkubiert. 6D zeigt die aktiven Oligonucleotide GRO15A und GRO29A hybridisiert an eine Einzelproteinbande bei 106 kDa (die Bande war exakt angrenzend an einen 106-kDa-Molekülmassemarker, nicht angegeben). Die inaktiven Oligonucleotide GRO15B und GRO26A hybridisierten nur schwach mit diesem Protein. Die in 6 angegebenen Daten legen eine Korrelation zwischen Aktivität und Proteinbindung mindestens für die vier untersuchten Oligonucleotide nahe. Diese Experimente zeigen ferner, dass die Bindung von GROs an p106 hochspezifisch ist, da nur eine Einzelproteinbande mit hoher Affinität erkannt wird (siehe 6D). Dies war nicht nur einfach das Ergebnis einer Hybridisierung mit einem in großer Menge vorhandenen Protein, da eine India Ink-Anfärbung von immobilisierten Kernextrakten das Vorhandensein von vielen anderen Proteinbanden, die gleich oder stärker intensiv als die Bande bei 106 kDa waren, zeigte (Daten nicht angegeben).
Antiproliferative Aktivität korreliert mit Proteinbindung
Zur weiteren Bestätigung der Beziehung zwischen Aktivität und Bindung an das 106-kDa-Protein wurden vier weitere G-reiche Oligonucleotide synthetisiert und deren Wirkungen mit aktiven (GRO29A) und inaktiven (GRO15B) Oligonucleotiden verglichen. Die 7A und 7B zeigen, dass die wachstumshemmende Wirkung der Oligonucleotide mit deren Fähigkeit zur Konkurrenz um das TEL bindende Protein korrelierte. Drei der neuen Oligonucleotide (GRO14A, GRO25A, GRO28A) zeigten eine mäßige antiprolifertive Aktivität, waren jedoch nicht so wirksam wie GRO29A. Das Oligonucleotid GRO14B zeigte keine antiproliferative Aktivität. Entsprechend waren die mäßig aktiven Oligonucleotide zur Konkurrenz mit TEL um die Bindung an das nukleäre Protein fähig, wenn auch nicht so effektiv wie GRO29A. Das nichthemmende Oligonucleotid GRO14B war zur Konkurrenz um die Proteinbindung unfähig.
Die Bedeutung des etwa 106-kDa-Proteins in Bezug auf GRO-wirkungen wurde ferner durch die Korrelation zwischen der Empfindlichkeit von verschiedenen Zelllinien für die GRO-induzierten antiproliferativen Wirkungen und den Konzentrationen dieses Proteins in Kern- und Cytoplasmaextrakten von diesen Zelllinien, die in 8 angegeben ist, belegt.
Wirkungen von nicht-G-reichen Oligonucleotiden
Zur Untersuchung der Spezifität der antiproliferativen Wirkungen wurden die wachstumshemmenden Wirkungen von nicht-G-reichen Oligonucleotiden und Heparin, einem polyanionischen Polysaccharid, untersucht. 7C zeigt, dass mit einer Konzentration von 10 μM (äquivalent zu etwa 0,1 mg/ml für GRO29A) weder ein 3'-modifiziertes C-reiches Oligonucleotid (CRO) noch ein 3'-modifiziertes Mischbasenoligonucleotid (MIX1) zur Hemmung des Wachstums von MDA-MB-231-Brustkrebszellen fähig waren. Dieses Ergebnis zeigte, dass die wachs tumshemmende Aktivität von GRO15A und GRO29A nicht nur einfach unspezifische Wirkungen infolge des Vorhandenseins von einem 3'-modifizierten Oligonucleotid waren, sondern auf einem einzigartigen Merkmal dieser Sequenzen beruhte. Heparin hatte ebenfalls keine Wirkung auf das Zellwachstum, wenn es dem Kulturmedium mit einer Konzentration von 20 Einheiten/ml (etwa 0,12 mg/ml) zugesetzt wurde, was ferner belegt, dass die antiproliferativen Wirkungen von aktiven Oligonucleotiden nicht einfach das Ergebnis von deren polyanionischem Charakter sind. Zur Untersuchung der antiproliferativen Eigenschaften von nicht-3'-geschützten Oligonucleotiden wurde ein leicht modifiziertes Behandlungsprotokoll verwendet, wobei Oligonucleotide Zellen in serumfreiem Medium zugesetzt wurden (siehe "Experimentelle Verfahren"). Die 7D zeigt, dass ähnliche Wirkungen auch mit nichtmodifizierten Oligonucleotiden unter diesen Bedingungen beobachtet werden konnten. Sowohl 29A-OH (ein 3'-nichtmodifiziertes Analogon von GRO29A) als auch TEL hemmten das Wachstum von Zellen, während zwei Mischsequenzoligonucleotide keine wachstumshemmenden Wirkungen aufwiesen.
Die Proteinbindungseigenschaften dieser nicht-G-reichen Oligonucleotide und von Heparin (nicht angegeben) wurden ebenfalls verglichen. Wie erwartet zeigten die nichtmarkierten wachstumshemmenden Oligonucleotide GRO29A, 29A-OH und TEL starke Konkurrenz um die Proteinbindung in dem kompetitiven Electrophoretic Mobility Shift Assay (unter Verwendung von markiertem TEL-Oligonucleotid und MDA-MB-231-Kernextrakten) bei einer Konzentration von 10 nM (etwa 0,1 μg/ml für GRO29A). Entsprechend dessen geringerer antiproliferativer Aktivität konkurrierte TEL etwas weniger effizient als 29A-OH oder GRO29A. Keine Konkurrenz wurde bei Verwendung von 10 nM nichtmarkiertem CRO, MIX2 oder MIX3 oder in Gegenwart von 0,02 Einheiten/ml Heparin (etwa 0,12 μg/ml) beobachtet. Jedoch war das Mischsequenzoligonucleotid MIX1 anomal. Obwohl dieses Oligonucleotid keine Wirkung auf das Wachstum von Zellen aufwies, schien es um die Proteinbindung in dem kompetitiven EMSA zu konkurrieren.
Beweisanzeichen, dass das G-reiches Oligonucleotid bindende Protein Nucleolin ist
Zwei frühere Berichte beschreiben die Bindung des nucleolären Proteins, von Nucleolin, an die G-reiche Telomersequenz. Ishikawa et al. ((1993) Mol. Cell. Biol. 13, 4301–4310) identifizierten ein 50-kDa-Protein aus HeLa-Extrakten, das an 5'-(TTAGGG)₄-3' band. Die Mikrosequenzbestimmung legte nahe, dass dies ein proteolytisches Fragment von Nucleolin war. Die Bindung des gereinigten 106-kDa-Nucleolinproteins voller Länge wurde unabhängig voneinander von Dickinson und Kohwi-Shigematsu belegt. Dickinson et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 456–465. Da das vorliegende Protein das richtige Molekulargewicht aufwies und auch an 5'-(TTAGGG)₄-3' (TEL) band, wurde die Hypothese, dass das G-reiches Oligonucleotid bindende Protein Nucleolin war, getestet. Kernextrakte von HeLa-Zellen (von Promega gekauft) oder MDA-MB-231-Brustkrebszellen (die im Labor der Anmelder durch Standardverfahren erhalten wurden) wurden einer Elektrophorese unterzogen und auf eine PVDF-Membran übertragen. Die immobilisierten Proteine wurden auf die Bindung an ³²P-markiertes GRO15A unter Verwendung des beschriebenen Southwestern-Verfahrens sondiert und durch Belichtung eines Autoradiographiefilms über Nacht sichtbar gemacht. Die gleiche Membran wurde in Bezug auf Oligonucleotid durch die beschriebenen Denaturierungs/Renaturierungsstufen bloßgelegt (experimentelle Verfahren, siehe "Southwestern-Blotting") und unter Verwendung von Nucleolinantiserum als primärer Antikörper und eines Meerrettichperoxidase(HRP)-konjugierten Anti-Kaninchen-sekundären-Antikörpers einem Western-Blotting unterzogen. Der Blot wurde durch Inkubation mit einem Chemilumineszenzdetektionsreagens und anschließende Belichtung eines Autoradiographiefilms von 20 s sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in 9A gezeigt. Southwestern-Blots von Kernextrakten zeigten eine intensive Bande bei Hybridisierung und radioaktiv markiertem GRO15A bei 106 kDa (HeLa) oder etwa 116 kDa (MDA-MB-231). Der Western-Blot von MDA-MB-231-Kernproteinen zeigt eine intensive Bande bei etwa 116 kDa und schwächere Banden bei etwa 50 kDa. In HeLa-Extrakten erkennt der Nucleolinantikörper mehrere Banden bei etwa 50, 75, 106 und 120 kDa. Von größter Bedeutung ist, dass in beiden Zelllinien die Bande, die durch GRO15A erkannt wurde, exakt einer Bande entsprach, die erkannt wurde, wenn die Membran bloßgelegt und mit Nucleolinantikörper ein Western-Blotting durchgeführt wurde. Nucleolin ist ein Protein, das in Zellen durch eine Zahl von Kinasen phosphoryliert werden kann, und es ist auch für Eigenproteolyse empfindlich. Zhou et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 31130–31137; Schwab et al. (1997) Eur. J. Cell Biol. 73, 287–2979; Li et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 15662–15668; Peter et al. (1990) Cell 60, 791–801; Belenguer et al. (1990) Mol Cell Biol. 10, 3607–3618; Fang et al. (1993) Exp. Cell Res. 208, 48–53; Chen et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 7754–7758. Es wird angenommen, dass der Unterschied in Bezug auf die Molekulargewichte der in diesem Blot detektierten Proteine von den verschiedenen Verfahren der Herstellung des Kernextrakts herrühren kann, die zu unterschiedlich phosphorylierten oder abgebauten Formen von Nucleolin, das die vorherrschende Spezies ist, führen können. Der Unterschied der Intensitäten der in den Southwestern-Blots in 9A gezeigten Banden kann auf der bevorzugten Bindung von GRO15A an eine Form von Nucleolin (scheinbar die 106-kDa-Spezies) gegenüber anderen beruhen.
Um zu bestimmen, ob die Bindung des spezifischen Proteins innerhalb der Zellumgebung erfolgte, wurden biotinylierte G-reiche Oligonucleotide zur Behandlung von MDA-MB-231-Brustkrebszellen verwendet. Streptovidinbeschichtete Magnetperlen wurden dann zum Einfangen von Oligonucleotid-Protein-Komplexen nach Lyse der Zellen mit einem Puffer des Immunfällungstyps verwendet (siehe "Experimentelle Verfahren"). Dieses Verfahren wurde für Zellen, die mit entweder einem aktiven Oligonucleotid (5'-Biotin-GRO15A) oder einem inaktiven Oligonucleotid (5'-Biotin-GRO15B) behandelt wurden, und unbehandelte Zellen als Kontrolle durchgeführt. Gleiche Volumina der einzelnen Proben wurden einer Elektrophorese unterzogen und auf eine PVDF-Membran übertragen. Diese wurde durch India Ink-Anfärbung, Southwestern-Blotting mit radioaktiv markiertem GRO15A und Western-Blotting mit einem monoklonalen Antikörper gegen Nucleolin analysiert. Die India Ink-Anfärbung der Membran zeigte eine Hauptproteinbande bei etwa 116 kDa, die in mit biotinyliertem GRO15A behandelten Zellen vorhanden war, jedoch in unbehandelten Zellen fehlte und von viel niedrigerer Intensität in mit inaktivem biotinyliertem GRO15B behandelten Zellen war (Daten nicht angegeben). Die Southwestern- und Western-Blots (9B) bestätigen, dass dieses eingefangene Protein an sowohl GRO15A als auch Nucleolinantikörper bindet.
Dieses Experiment zeigte, dass ein 116-kDa-Protein spezifisch von mit biotinylierten GROs behandelten Zellen eingefangen wurde, dass dieses Protein auch von einem Nucleolinantikörper erkannt wurde und ferner, dass durch aktives GRO15A eine größere Menge dieses Proteins eingefangen wurde als sie durch das weniger aktive GRO15B eingefangen wurde. Obwohl die Möglichkeit, dass die Protein-Oligonucleotid-Assoziierung während der Zelllyse oder des Oligonucleotidabfangens stattfand, nicht absolut ausgeschlossen werden kann, ist es unwahrscheinlich, dass das Oligonucleotid im Inneren der Zelle in einem freien unkomplexierten Zustand existiert. Diese Ergebnisse liefern starke Anzeichen für die Bindung von Oligonucleotid an das 116-kDa-Protein im Inneren der Zelle (oder möglicherweise an der Zelloberfläche).
Um die subzelluläre Lokalisierung des G-reiches Oligonucleotid bindenden Proteins zu bestimmen, wurden Southwestern- und Western-Blottingexperimente durchgeführt, um Kernextrakte, Cytoplasmaextrakte und aus der Zellmembran stammende Proteine zu vergleichen (5 μg Extrakt pro Bahn). Die 9C zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchungen. Der Southwestern-Blot zeigt, dass ein 116-kDa-Protein, das zur Bindung von markiertem GRO15A fähig ist, in den Kernextrakten und in geringerem Ausmaß in der Cytoplasmafraktion vorhanden ist. Die gleiche Bande war in Plasmamembranextrakten vorhanden und sie hybridisierte stark mit GRO15A. Western-Blotting der gleichen Membran zeigte, dass ein monoklonaler Antikörper gegen Nucleolin auch diese Banden bei 116 kDa in jeder Fraktion erkannte. (Eine Bande bei etwa 70 kDa wurde auch von sowohl GRO15A als auch Nucleolinantikörper erkannt und kann ein proteolytisches Fragment von Nucleolin sein.) Da sowohl die Lokalisierung als auch die relative Intensität der Banden, die von GRO15A und Nucleolinantikörper erkannt werden, die gleichen sind, liefern diese Ergebnisse ferner Anzeichen, dass das Protein, das an antiproliferative G-reiche Oligonucleotide bindet, Nucleolin ist. Die Detektion von GRO bindendem Protein in den Plasmamembranextrakten legt ferner die Möglichkeit nahe, dass die Bindung an ein Zelloberflächenprotein beim Wirkmechanismus von G-reichen Oligonucleotiden wichtig sein kann.
Ferner wurde die Beteiligung von Nucleolin/GRO bindendem Protein an der antiproliferativen Aktivität von GRO ge zeigt, da ermittelt wurde, dass die Empfindlichkeit von Zelllinien gegenüber GRO-Wirkungen mit den Konzentrationen von GRO bindendem Protein in Verbindung stand (detektiert durch Southwestern-Blotting von Zellextrakten). Beispielsweise wiesen Zelllinien, die äußerst empfindlich gegenüber GRO-Wirkungen sind (DE145, MDA-MB-231, HeLa) hohe Konzentrationen von p110 auf, während weniger empfindliche Zelllinien (HS27, MCF-7) oder resistente Zelllinien (ein Methotrexat-resistentes MCF-7-Derivat) niedrige oder nicht detektierbare Konzentrationen von p110 aufwiesen. Ferner wurde ermittelt, dass Nucleolinkonzentrationen durch GRO-behandelte Zellen und unbehandelte Zellen in Bezug auf das exponentielle Wachstum signifikant verändert waren, wie in 9 gezeigt ist, während eine Gesamtzunahme der Immunfluoreszenz für behandelte (B) gegenüber unbehandelten (A) MDA-MB-231-Zellen 72 h nach einer GRO29A-Behandlung unter Verwendung von Antinucleolinanfärbung ermittelt wurde und eine Translokation in das Cytoplasma ebenfalls beobachtet wurde.
Der TEL-Protein-Komplex erfährt äußerst wirksame Konkurrenz durch GRO29A und OMR29A (Bahnen 2 und 13), die zwei wirksame antiproliferative Oligonucleotide sind. Der Komplex erfährt keine Konkurrenz oder Konkurrenz in einem geringeren Ausmaß durch Verbindungen ohne antiproliferative Aktivität (beispielsweise Coffein, Polymyxin oder Heparin) oder durch üblicherweise verwendete Therapeutika, von denen bekannt ist, dass ihre Mechanismen aus anderen Eigenschaften als Nucleolinbindung resultieren (beispielsweise 5-FU, Taxol oder Cisplatin).
Alle in dieser Beschreibung genannten Patente oder Veröffentlichungen geben den Stand der Fachleute auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, an. Diese Patente und Veröffentlichungen werden hierin als Bezug in gleichem Ausmaß, als ob jede individuelle Veröffentlichung spezifisch und individuell als Bezug aufgenommen ist, aufgenommen.
Dem Fachmann ist ohne weiteres klar, dass die vorliegende Erfindung gut angepasst ist, um die Aufgaben durchzuführen und die genannten Ziele sowie die inhärent hierin vorhandenen Ziele und Aufgaben zu erreichen. Die hierin beschriebenen vorliegenden Verfahren, Prozeduren, Behandlungen, Moleküle und spezifischen Verbindungen sind derzeit repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen, sie sind Beispiele und sollen keine Beschränkungen des Umfangs der Erfindung sein. Änderungen hierbei und andere Verwendungsmöglichkeiten sind dem Fachmann geläufig, wobei diese von der Idee der Erfindung, die durch den Umfang der Ansprüche definiert ist, umfasst werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines guanosinreichen Oligonucleotids, das zur Bindung an mindestens ein ein G-reiches Oligonucleotid bindendes Protein oder Nucleolin fähig ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der Proliferation von malignen, dysplastischen und/oder hyperproliferativen Zellen in einem Subjekt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das guanosinreiche Oligonucleotid mindestens ein GGT-Motiv umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die guanosinreichen Oligonucleotide zur Bildung von Guanosin-Quartettstrukturen fähig sind.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid mindestens ein fortlaufendes Guanosinrepeat umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Oligonucleotid ein 3'-Ende und ein 5'-Ende aufweist, wobei das 3'-Ende zur Änderung einer Eigenschaft des Oligonucleotids modifiziert ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das 3'-Ende eine daran gebundene Propylamingruppe umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Oligonucleotid ein DNA-, RNA-, 2'-O-Methyl- oder Phosphorothioatgerüst umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid aus der Gruppe von Sequenzen, die aus den Sequenzen mit der Bezeichnung SEQ ID NO: 1–20 besteht, ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die ferner ein Chemotherapeutikum zusätzlich zu dem guanosinreichen Oligonucleotid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Chemotherapeutikum aus der Gruppe von Mitoxantron, Etoposid, Cisplatin, Camptothecin, 5-Fluoruracil, Vinblastin, Mithramycin A, Paclitaxel, Docetaxel, Dexamethason und Coffein ausgewählt ist.
An Nucleolin bindendes Oligonucleotid, das aus der Gruppe von Sequenzen mit der Bezeichnung SEQ ID NO: 1–20 ausgewählt ist.
An Nucleolin bindendes Oligonucleotid nach Anspruch 11, wobei das Oligonucleotid ein 3'-Ende und ein 5'-Ende aufweist, wobei das 3'-Ende modifiziert ist.
An Nucleolin bindendes Oligonucleotid nach Anspruch 12, wobei das 3'-Ende eine daran gebundene Propylamingruppe umfasst.
An Nucleolin bindendes Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Oligonucleotid ein DNA-, RNA-, 2'-O-Methyl- oder Phosphorothioatgerüst umfasst.
An Nucleolin bindendes Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Oligonucleotid zur Bindung an ein TEL bindendes Protein fähig ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein guaninreiches Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 11 bis 15 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16 zur Behandlung einer neoplastischen oder hyperproliferativen Erkrankung durch Hemmung der Nucleolinfunktion.