DE3855864T2

DE3855864T2 - Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene

Info

Publication number: DE3855864T2
Application number: DE3855864T
Authority: DE
Inventors: John Dagle; Paul Eder; Joseph Walder; Roxanne Walder
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 1987-11-30
Filing date: 1988-10-31
Publication date: 1997-09-25
Anticipated expiration: 2008-11-01
Also published as: US5962425A; US5491133A; EP0348458A4; EP0348458A1; EP0348458B1; US6197944B1; WO1989005358A1; DE3855864D1; JPH02502516A; CA1339935C; JP3019994B2; ATE151467T1

Description

Die Erfindung betrifft DNA- und RNA-Moleküle, die durch Modifikationen der 3'-terminalen Phosphodiesterbindung stabilisiert sind, und ihre In-vitro-Verwendung zur Blockierung der Expression spezifisch gerichteter Gene.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Es ist gut bekannt, daß Nucleinsäuren, d.h. Desoxyribonucleinsäuren (DNA), und Ribonucleinsäuren (RNA), essentielle Bausteine in lebenden Zellen sind. Diese Verbindungen sind hochmolekulare Polymere, die aus vielen "Nucleotid"-Einheiten aufgebaut sind, wobei eine jede solche Nucleotideinheit besteht aus einer Base (einem Purin oder einem Pyrimidin), einem Zucker (der entweder Ribose oder Desoxyribose ist) und einem Phosphorsäuremolektil. Die DNA enthält Desoxyribose als Zuckergruppierung und die Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin (die als A, G, C bzw. T dargestellt werden können). Die RNA enthält Ribose anstelle von Desoxyribose und Uracil (U) anstelle von Thymin.
Die Nucleotideinheiten in der DNA und RNA sind in definierten linearen Sequenzen aneinandergereiht, die die spezifischen biologischen Funktionen bestimmen. In der normalen Säugerzelle repliziert die DNA sich selbst und dient auch als Templat zur Synthese von RNA-Molekülen, deren Nucleotidsequenz die durch die DNA kodierte Information tragen. RNA-Moleküle dienen mehreren unterschiedlichen Funktionen in der Zelle. Die Messenger-RNA (mRNA) steuert die Proteinsynthese.
Gemäß dem gut bekannten Watson-Crick-Modell bestehen DNA-Moleküle aus zwei Polynucleotidsträngen, die schraubenförmig um eine gemeinsame Achse gewunden sind. Die resultierende Doppelhelix wird durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren in jedem Strang zusammengehalten. Die Wasserstoffbrückenbindungen werden nur zwischen Adenin (A) und Thymin (T) und zwischen Guanin (G) und Cytosin (C) gebildet. Daher werden innerhalb der Doppelhelix Adenin (A) und Thymin (T) als komplementäre Basen angesehen, die als A-T aneinander binden. Dasselbe trifft zu für Guanin (G) und Cytosin (C) als G-C.
In einem einzelnen Polynucleotidstrang ist jede Sequenz von Nucleotiden möglich. Ist jedoch die Reihenfolge der Basen innerhalb eines Stranges eines DNA-Moleküls einmal festgelegt, ist gleichzeitig die genaue Sequenz des anderen Stranges aufgrund der angegebenen Basenpaarung bestimmt. Demgemäß ist jeweils ein Strang eines DNA-Moleküls komplementär zu dem anderen. Bei dem Verfahren der DNA-Replikation wirken die beiden Stränge als Template zur Synthese zweier neuer Ketten mit komplementären Nucleotidsequenzen. Das Nettoergebnis besteht in der Produktion zweier neuer DNA-Moleküle, die jeweils einen der ursprünglichen Stränge plus einen neu synthetisierten Strang, der zu ihm komplementär ist, enthalten. Dieses Verfahren wird als semikonservative Replikation bezeichnet und erlaubt, daß die genetische in der DNA kodierte Information, die durch die Nucleotidsequenz festgelegt ist, von einer Generation an die nächste weitergegeben wird.
Kollektiv wird die genetische Information eines Organismus als Genom bezeichnet. Das Genom von Bakterien und von allen höheren Spezies besteht aus DNA. Das Genom von Viren kann entweder aus DNA oder RNA bestehen. In jedem Fall besitzt das Genom einer jeden bestimmten Spezies, gleich ob ein Virus, Bakterium oder ein höherer Organismus, eine charakteristische Nucleotidsequenz, die einfach ausgedrückt als "Fingerabdruck" dieser Spezies angesehen werden kann.
Bei dem Verfahren der Transkription wird die DNA kopiert oder in die RNA transcribiert. Das RNA-Molekül, das synthetisiert wird, ist einzelsträngig. Seine Nucleotidsequenz ist komplementär zu einem Segment von einem der beiden Stränge des DNA-Moleküls, und daher ist es eine exakte Kopie des entgegengesetzten Stranges, außer daß Thymin durch Uracil ersetzt ist. Die Länge der DNA, die kopiert wird, um ein einziges RNA-Molekül zu bilden, stellt ein Gen dar. Das menschliche Genom enthält ungefähr 50 000 Gene.
Die Messenger-RNAs (mRNAs) tragen die kodierende Information, die zur Proteinsynthese notwendig ist. Die Sequenz der Nudeotide in dem mRNA-Molekül legt die Aneinanderreihung der Aminosäuren in dem Protein fest, dessen Synthese durch diese mRNA gesteuert wird. Jeweils eine Serie von drei Nucleotiden, eine Einheit, genannt ein Kodon, legt eine bestimmte Aminosäure fest. Das Verfahren, durch das die mRNAs die Proteinsynthese steuern, wird als Translation bezeichnet. Die Translation der mRNAs findet auf den Ribosomen im Cytoplasma der Zelle statt.
Der Informationsfluß von Gen zu Protein kann somit durch das folgende Schema dargestellt werden. Transcription Translation Gen Protein
Für jedes durch einen Organismus hergestellte Protein existiert ein entsprechendes Gen.
Es ist auf dem Gebiete der Molekularbiologie allgemein bekannt, daß Oligodesoxyribonucleotide, kurz einzelsträngige DNA-Fragmente, die eine Komplementanät zu einem Teil einer bestimmten mRNA-Nucleotidsequenz aufweisen, zur Blockierung der Expression des entsprechenden Gens verwendet werden können. Dies erfolgt durch Hybridisierung (Bindung) des Oligonucleotids an die mRNA gemäß den Regeln der oben beschriebenen Basenpaarung, was sodann die Translation der mRNA verhindert. Es wurde nun gefunden, daß die Hemmung der Translation, die beobachtet wurde, auf der Spaltung der mRNA durch das Enzym RNaseH an der Stelle der RNA-DNA-Doppelhelix, die mit dem Nucleotid gebildet wird, beruht (siehe Figur 1). Die Hybridisierung des Oligonucleotids mit der mRNA reicht im allgemeinen allein nicht aus, um die Translation wesentlich zu hemmen. Offensichtlich kann ein an mRNA gebundenes Oligonucleotid bei dem Verfahren der Translation abgerissen werden. Ein wichtiger Folgesatz dieses Ergebnisses lautet, daß zur wirksamen Blockierung der Expression eines Gens durch irgendein modifiziertes Oligonucleotid das mit der ausgewählten mRNA gebildete Hybrid von der RNaseH und der von dem Enzym gespalteten mRNA erkannt werden muß.
Das Verfahren der Hybrid-gestoppten Translation, das in Figur 1 ausgeführt ist, besitzt offensichtliche Folgen für die Verwendung von Oligonucleotiden als Heilmittel. Durch das selektive Blockieren der Expression eines bestimmten Gens, welches für die Replikation eines bestimmten Virus oder Bakteriums essentiell ist, könnte ein Oligonucleotid als antimikrobielles Mittel dienen. Gleichermaßen wäre ein Oligonucleotid, das gegen ein Gen gerichtet ist, welches verantwortlich oder erforderlich ist für die unkontrollierte Proliferation einer Krebszelle, als Antikrebsmittel geeignet. Es existieren ferner Anwendungen bei der Behandlung von genetischen Krankheiten, wie Sichelzellkrankheit und Thalassämie, für die derzeit keine adäquate Behandlung existieren. Jedes Gen kann auf diesem Weg gerichtet werden. Das Problem der Arzneimittelspezifität, eine Haupthürde bei der Entwicklung von herkömmlichen chemotherapeutischen Mitteln, wird sofort durch die Wahl der geeigneten Oligonucleotidsequenz gelöst, die komplementär ist zu der gewählten mRNA. Dies verhindert die Toxizität, die sich aus einer mangelnden Selektivität des Arzneimittels ergibt, eine gravierende Einschränkung bei sämtlichen existierenden Antivirus- und Antikrebsmitteln.
Abgesehen von der Verwendung von Oligonucleotiden zur Blockierung der Expression ausgewählter Gene zur Behandlung von Krankheiten beim Menschen, sind auch andere Anwendungen bekannt. Zusätzliche Anwendungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Verwendung solcher Oligonucleotide in der Veterinärmedizin, als Pestizide oder Fungizide und bei industriellen oder landwirtschaftlichen Verfahren, bei denen es wünschenswert ist, die Expression eines bestimmten Gens durch einen bei diesem Verfahren verwendeten Organismus zu hemmen.
Ein Hauptproblem, das die Brauchbarkeit von Oligonucleotiden als Heilmittel einschränkt, ist der schnelle Abbau des Oligonucleotids im Blut und in den Zellen. Die Enzyme, die DNA oder RNA abbauen, werden als Nucleasen bezeichnet. Solche Enzyme hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen, die die Nucleotide innerhalb einer DNA- oder RNA-Kette zusammenhalten, und spalten dadurch die Moleküle in kleinere Bruchstücke.
In der Vergangenheit hat ein gewisser Fortschritt in der Entwicklung von Oligonucleotid-Analoga stattgefunden, die gegenüber dem Nucleaseabbau resistent sind, jedoch hatte die Verwendung solcher Derivate zur Blockierung der Expression speziell gerichteter Gene einen eingeschränkten Erfolg. Siehe beispielsweise Ts'o et al., U.S.-Patentschrift 4 469 863, ausgegeben am 4. September 1984, Miller et al., U.S.-Patentschrift 4 507 433, ausgegeben am 26. März 1985, und Miller et al., U.S.-Patentschrift 4 511 713, ausgegeben am 16. April 1985. Die obigen Patentschriften haben jeweils die Aufgabe der Blockierung der Expression ausgewählter Gene gemeinsam, jedoch war der eingeschlagene Weg weniger erfolgreich, wenn die hohen Konzentrationen an Oligonucleotid, die erforderlich sind, und der entsprechende Mangel an Selektivität betrachtet werden. Die beschriebene Arbeit in jeder der drei vorhergehenden Patentschriften, die erwähnt worden sind, umfaßt die Verwendung von Oligonucleotiden, in denen alle Phosphatgruppen in Form der Methylphosphonate modifiziert worden sind: normaler Nucleotidphosphodiester Methylphosphonatdiester
B und B&sub2; sind die Nucleinsäurebasen (entweder A, G, C oder T).
Insbesondere umfaßt die U.S.-Patentschrift 4 469 863 unter anderem die Methylphosphonat-Modifikation von Oligonucleotiden. Die U.S.-Patentschrift 4 507 433 umfaßt ein Verfahren zur Synthese von Desoxyribonucleotidmethylphosphonaten an Polystyrolträgern, und die U.S.-Patentschrift 4 511 713 umfaßt die Bestimmung der Basensequenz einer Nucleinsäure und die Hybridisierung an sie eines geeignet synthetisierten Oligonucleotid-Methylphosphonates, um ihre Funktion zu beeinflussen.
Das geringe beobachtete Aktivitätsniveau bei der Verwendung dieser voll modifizierten Methylphosphonat-Analoga führte uns zu dem Verdacht, daß sie keine wirksamen Substrate bilden würden für die RNaseH bei einer Hybridisierung mit mRNAs. Die in Beispiel 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß dies der Fall ist.
In einem Versuch, neue Nucleotid-Analoga von größerem Nutzen als Heilmittel zu entwerfen, unternahmen wir eine Studie der Wege, auf denen die Oligonucleotide im Blut und in den Zellen abgebaut werden. Wir haben gefunden, daß der einzige Abbauweg im Blut (Beispiel 3) und der vorherrschende Weg in den Zellen (Beispiel 4) über einen sequentiellen Abbau von dem 3'-Ende zu dem 5'-Ende der DNA-Kette erfolgt, bei dem jeweils ein Oligonucleotid entfernt wird. Dieser Abbauweg ist in Figur 2 erläutert. Diese Ergebnisse stellten das erste Mal eine rationale Grundlage für den Entwurf von Oligonucleotid-Analoga bereit, die modifiziert sind, so daß ihr Abbau gehemmt wird, ohne ihre Fähigkeit zur Bildung von Substraten für RNaseH zu beeinflussen.
Es wurde nun gefunden, daß Oligodesoxynucleotide, die nur an der 3'-nächsten Internucleotidbindung modifiziert worden sind, deutlich vor einem Abbau im Blut und in den Zellen geschützt sind (Beispiele 5 und 6). Außerdem haben wir gefunden, daß solche Derivate normale Hybridisierungseigenschaften besitzen und mit mRNAs Substrate bilden, die von der RNaseH erkannt und gespalten werden, wodurch die Expression des gerichteten Gens verhindert wurde (Beispiel 7).
Das Erreichen der Hemmung der Expression ausgewählter Gene durch Oligonucleotide, die gegenüber einem Abbau resistent und darum wirksamer sind, wenn sie therapeutisch angewendet werden, ist die Hauptaufgabe der Erfindung.
Weitere Aufgaben der Erfindung umfassen die Herstellung von Oligodesoxynucleotiden, die an der 3'-Phosphodiesterbindung modifiziert worden sind, und die Formulierung des modifizierten Oligodesoxynucleotids in einer zur therapeutischen Anwendung geeigneten Weise.
Erfindungsgemäß wird ein Oligodesoxynucleotid bereitgestellt, dessen Nucleotidsequenz eine Komplementarität besitzt für und hybridisierbar ist an eine Nucleotidsequenz innerhalb der mRNA, die von einem gerichteten Gen transcribiert worden ist, die aufweist: (a) eine modifizierte 3'-terminale Internucleotid-Phosphodiesterbindung, wobei die modifizierte 3'-terminale Internucleotid-Phoshodiesterbindung resistent ist gegenüber einem 3'-nach-5'-Exonucleaseabbau, (b) eine oder mehrere zusätzliche modifizierte Internucleotid-Phosphodiesterbindungen, wobei die zusätzlichen modifizierten Internucleotid- Phosphodiesterbindung(en) resistent ist/sind gegenüber einem Nucleaseabbau, und (c) eine kontinuierliche Sequenz aus wenigstens vier Internucleotid-Phosphodiesterbindungen, die unmodifiziert sind.
Erfindungsgemäß wird auch ein Oligodesoxynucleotid aus fünf oder mehr Internucleotidbindungen bereitgestellt, welches aufweist: (a) Komplementarität für und hybridisierbar an eine Nucleotidsequenz innerhalb der mRNA-Sequenz eines gerichteten Gens, und (b) eine modifizierte 3'-terminale Internucleotid- Phosphodiesterbindung, wobei die modifizierte 3'-terminale Internucleotid-Phosphodiesterbindung resistent ist gegenüber einem 3'-nach-5'-Exonucleaseabbau.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 ist eine schematische Erläuterung, um zu zeigen, wie die Expression eines ausgewählten Gens durch das erfindungsgemäße Verfahren durch Hybridisierung eines Oligonucleotids an seine Komplementärsequenz innerhalb der mRNA und Spaltung der mRNA durch das Enzym RNaseH an der Stelle der RNA-DNA- Doppelhelix blockiert wird.
Figur 2 erläutert den Abbau eines einzelsträngigen DNA-Moleküls durch die Wirkung einer Nuclease, die nacheinander jeweils ein Nucleotid von dem 3'- zu dem 5'-Ende der Kette entfernt.
Figur 3 ist eine Zeichnung eines Autoradiogramms, das zeigt, daß der ausschließliche Abbauweg der DNA-Fragmente im menschlichem Blut durch exonucleolytische Spaltung von dem 3'- zu dem 5'-Ende der DNA-Kette erfolgt. Das bei diesem Experiment verwendete Oligonucleotid, MA-15, besitzt die Sequenz: 5'-GAGCACCATGGTTTC. In den Spuren 1 bis 5 wurde das Oligonucleotid an dem 5'-Ende des Moleküls mit ³²P radioaktiv markiert. In den Spuren 6-10 befindet sich die ³²P-Markierung an der 3'-terminalen Internucleotidbindung. Das markierte Oligonucleotid wurde bei 37 ºC in Menschenblut inkubiert. Aliquote wurden zu den angegebenen Zeiten entnommen und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die markierten Banden in dem Gel wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Figur 4 ist eine Zeichnung eines Autoradiogramms, die zeigt, daß ein Oligonucleotid, in dem nur die 3'-nächste Internucleotidbindung modifiziert ist, vollständig gegenüber einem Abbau in Menschenblut resistent ist. Das Oligonucleotid ist ein MA-15-Derivat, in dem die 3'-terminale Internucleotidbindung ein 2,2,2-Trichlor-1,1-dimethylethylphosphotriester ist. Spur 1 ist das Oligonucleotid vor der Inkubation. Die Spuren 2-5 sind Aliquote, die nach der Inkubation des Oligonucleotids in Blut nach 15 min, 1 Stunde, 4 Stunden bzw. 18 Stunden entnommen worden sind. Die Abnahme der Intensität der ursprünglichen Bande beruht einfach auf der Entfernung der 5'-Enden-Markierung statt auf dem Abbau des Oligonucleotids, Pi bedeutet anorganisches Phosphat.
Figur 5 ist eine Zeichnung eines Autoradigramms eines Northern-Blots, die zeigt, daß die an der 3'-Internucleotidbindung modifizierten Oligonucleotide Substrate mit mRNAs bilden, auf die die RNaseH einwirkt, was zu einer Spaltung dermRNA an der Stelle der RNA-DNA-Doppelhelix führt. Spur 1 ist Mäuse-Globin-mRNA allein. Spur 2 ist Mäuse-Globin-mRNA, inkubiert mit RNaseH in Abwesenheit von Oligonucleotid. Spur 3 ist Globin-mRNA, hybridisiert mit MA-15 und gespalten mit RNaseH. In Spur 4 wird das Substrat für die RNaseH mit dem Derivat von MA-15 gebildet, in dem die 3'-terminale Internucleotidbindung ein Trichlordimethylethylphosphotriester ist. In Spur 5 war das verwendete Oligonucleotid außerdem mit Naphthylisocyanat an der 5'-OH-Gruppe des Moleküls modifiziert. Die Proben wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf Gene Screen Plus (DuPont) geblottet, und die Banden wurden unter Verwendung von ³²P-markiertem MA-15 als Sonde für α-Globin-mRNA lokalisiert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung umfaßt das Verfahren, Mittel und eine Zusammensetzung, die zusammen die Verwendung von Oligodesoxynucleotiden ermöglichen, die an der 3'-terminalen Phosphodiesterbindung modifiziert sind und die dadurch resistent gemacht werden gegenüber einem Abbau in den Zellen und in Körperflüssigkeiten, um die Expression eines bestimmten Gens selektiv zu blockieren. Das Verfahren umfaßt die Hybridisierung des modifizierten Oligodesoxynucleotids zu der entsprechenden mRNA unter Bildung eines Substrates, welches vollständig in der Lage ist, von dem Enzym RNaseH erkannt zu werden, gefolgt von der Spaltung der mRNA an der Stelle der RNA-DNA-Doppelhelix, so daß die Expression des gerichteten Gens blockiert wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Im weitesten Sinne werden die Aufgaben der Erfindung erfüllt durch Modifizierung von Oligodesoxynucleotiden nur an der 3'-terminalen Phosphodiesterbindung. Ist dies erreicht, wurde gefunden, daß das Oligodesoxynucleotid deutlich resistent ist gegenüber einem Abbau durch Nudeasen in den Zellen und im Blut. Gleichermaßen wichtig, hybridisieren solche modifizier ten Oligodesoxynucleotide normalerweise mit den komplementären Nucleinsäuresequenzen und bilden Substrate mit mRNAs, die von der RNaseH erkannt und gespalten werden. Als Ergebnis der Spaltung der mRNA ist die Expression des entsprechenden Gens selektiv blockiert, wie es bei verschiedenen therapeutischen Anwendungen erwünscht ist.
Jüngste Fortschritte in der Molekularbiologie, die DNA-Rekombinationstechniken einsetzen, haben zu neuen therapeutischen Strategien, die DNA umfassen, geführt. In den DNA-Therapeutika wird ein Oligonucleotid zur Blockierung der Expression eines speziell gerichteten Gens durch Hybridisierung an eine Koplementärsequenz innerhalb der entsprechenden mRNA und Verhinderung einer Translation der mRNA verwendet. Auf diese Weise wird die Synthese des von dem Gen kodierten Proteins blockiert. So ist das Grundkonzept, das bei jeder der drei oben erwähnten früheren Patentschriften eingesetzt wird.
Jüngste Studien, die das Grundkonzept der Erfindung bildeten, haben jedoch gezeigt, daß die Blockierung der Expression des gerichteten Gens nicht nur einfach durch die Hybridisierung des Oligonucleotids an die mRNA erfolgt, sondern erfordert, daß die RNA-DNA-Doppelhelix, die so gebildet worden ist, als Substrat für das Enzym RNaseH dient. Die RNaseH, ein ubiquitäres zur DNA-Replikation erforderliches Enzym, baut dann die mRNA an dem RNA-DNA-Doppelstrang ab. Nur die mRNA wird gespalten. Das Oligonucleotid wird intakt freigesetzt und kann wiederholt mit anderen mRNA-Molekülen, wie durch die gestrichelte Linie in Figur 1 angegeben ist, reagieren. Die Wirkung eines jeden Moleküls des Oligonucleotids wird dadurch vergrößert und verstärkt die Wirksamkeit, durch die die Expression des gerichteten Gens blockiert wird.
Die RNaseH wirkt nur auf RNA-DNA-Doppelhelices ein. RNA-DNA-Doppelstränge dienen dem Enzym nicht als Substrate. Darum werden Oligodesoxyribonucleotide (kurz einzelsträngige DNA-Fragmente) anstelle von RNA-Molekülen als Heilmittel bevorzugt.
Es ist auf dem Gebiet der Molekularbiologie allgemein bekannt, daß die Phosphodiesterbindungen, die normalerweise einer enzymatischen Spaltung durch Nucleasen unterworfen sind, durch Modifizieren der Phosphatgruppe geschützt werden können. Frühere Anstrengungen, wie die drei erwähnten Patentschriften, haben sich auf die Derivate konzentriert, in denen sämtliche Phosphatgruppen innerhalb des Stranges modifiziert sind, oder auf Derivate, in denen die Phosphatgruppen im Anschluß an die Synthese des Oligonucleotids umfassend statistisch modifiziert worden sind (Tullis, R.H., P.C.T. WO83/∅1451, 1983). Solche Modifikationen beeinflussen jedoch oft die Hybridisierung der DNA zu ihrer Zielsequenz und schränken folglich ihre Brauchbarkeit für therapeutische Anwendungen ein.
Außerdem wurde gefunden, daß DNA-Fragmente, in denen die Phosphatgruppen umfassend modifiziert worden sind, keine Substrate für die RNaseH bilden (Beispiel 2). Dies hebt ihre Verwendung als Heilmittel auf.
Obschon es nicht gewünscht ist, an irgendeine Theorie gebunden zu sein, sind die wichtigen Entdeckungen, die der Erfindung zugrunde liegen: (1) daß der Mechanismus, durch den die Oligonucleotide, die als Heilmittel verwendet werden, die Expression speziell gerichteter Gene blockieren, über eine Hybridisierung an die entsprechende mRNA verläuft, wobei sich ein Substrat für die RNaseH bildet, welche anschließend die mRNA spaltet, und (2) daß der ausschließliche Abbauweg für Oligonucleotide im Blut und der vorherrschende Weg in den Zellen über einen stufenweisen Abbau von dem 3'- zu dem 5'-Ende der Kette verläuft, wie in Figur 2 aufgeführt. Es hat sich somit als möglich erwiesen, die Stabilität Von DNA-Fragmenten durch die Modifikation nur der ersten Internucleotidbindung ab dem 3'-Ende des DNA-Moleküls stark zu erhöhen. Wird dies vorgenommen, so wird die Spaltung der ersten Nucleotideinheit blockiert, und es kann kein weiterer Abbau ablaufen. Eine Vielzahl von Substitutionen an der 3'-terminalen Internucleotidbindung, wie nachstehend erklärt, dient diesem Zweck, wobei die Position der Modifikation ein sehr wichtiger Faktor ist. Wie in Beispiel 7 gezeigt, besitzen solche modifizierten Derivate normale Hybridisierungseigenschaften und bilden Substrate mit den mRNAs, die von der RNaseH erkannt und gespalten werden. Solche modifizierten Oligonucleotide sind somit für therapeutische Anwendungen geeignet.
Oligonucleotide, obwohl stark negativ geladene Moleküle, treten nicht mit einer endlichen Geschwindigkeit in die Zelle ein. Dies wurde zuerst durch eine Studie nahegelegt, die von Zamecnik und Stephenson (Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1978) 75, 280-284 und 285-288) durchgeführt wurde, in der gefunden wurde, daß ein Oligonucleotid, das zu den 5'- und 3'-Wiederholungssequenzen des Rous-sarcoma-Virus komplementär ist, die virale Replikation und Synthese der viralen Proteine in Hühnerembryo-Fibroblasten hemmt. In diesen Studien wurde der Wirkmechanismus des Oligonucleotids nicht aufgestellt, noch wurde die Möglichkeit ausgeschlossen, daß die beobachteten Wirkungen auf Abbauprodukte des Oligonucleotids zurückgehen. Dennoch zeigt diese Studie mit einer jüngsten Arbeit, Heikkila et al., Nature (1987) 328, 445-449, daß die Oligonucleotide doch in die Zellen eintreten. Zamecnik und Stephenson zeigten auch, daß die Aktivität des Oligonucleotids wesentlich vergrößert werden konnte durch die Modifizierung der 3'-OH- und 5'-OH-Gruppen mit großen apolaren Substituenten, d.h. Phenyl- und Naphthylgruppen. Diese großen apolaren Gruppen verstärken die Bindung des Oligonucleotids an die Zellmembran und den Transport in die Zelle. Der Einbau dieser Gruppen kann auch den Abbau des Oligonucleotids durch Exonucleasen gehemmt haben. Nur durch direkte Modifizierung der Phosphodiestergruppe ist es jedoch möglich, die Spaltung der Internucleotidbindung innerhalb eines DNA- oder RNA-Stranges auszuschließen. Weder der Abbau des nativen Oligonucleotids noch der modifizierten Derivate wurde in dieser Arbeit studiert. Sogar die neueste Studie über den Abbau von Oligonucleotiden bewahrt vollkommenes Stillschweigen bezüglich des Weges, auf dem der Abbau abläuft (Wickstrom, E. (1986) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 13, 97-102).
Somit war bisher nicht bekannt, daß, obschon bereits eine Studie über den Abbau von DNA und RNA durch endogene Nucleasen in menschlichem und anderem Säugergewebe durchgeführt wurde, der Abbau von einzelsträngigen DNA-Molekülen überwiegend durch einen exonucleolytischen 3'-nach-5'-Mechanismus auftritt. Daher konnte der einzigartige Wert der modifizierten Derivate, die hier beansprucht werden, nicht vorhergesagt werden. Anders ausgedrückt, da der Abbauweg bisher nicht aufgestellt worden ist, existierte keine Grundlage für den Entwurf von DNA-Molekülen, in denen nur ausgewählte Phosphatgruppen innerhalb der Kette modifiziert worden sind, um eine Steigerung in der Stabilität zu bewirken, so daß das resultierende Oligonucleotid immer noch an mRNAs unter Bildung von Substraten hybridisierte, die von der RNaseH erkannt und gespalten werden, wie es zur Verwendung des Oligonucleotids bei therapeutischen Anwendungen erforderlich ist.
Wie hier bereits erwähnt, ist die genaue chemische Modifikation an der 3'-Phosphodiesterbindung nicht so wichtig, wie daß die Modifikation an genau dieser Stelle erfolgt. Eine begrenzte Anzahl von anderen Stellen im Molekül kann auch modifiziert werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen.
Für Anwendungen in DNA-Therapeutika kann das Oligonucleotid abgesehen von der 3'-Phosphodiesterbindung an Positionen modifiziert werden, um seine Stabilität weiter zu erhöhen oder um seinen Transport in die Zellen zu erleichtern. Der Transport des Oligonucleotids in die Zielzelle kann durch Anknüpfung an ein Trägermolekül verstärkt werden, welches normalerweise von der Zelle aufgenommen wird, wie Transferrin, das Plasma-Eisenbindungsprotein, oder der epidermale Wachstumsfaktor, oder das Oligonucleotid kann an einen Antikörper gegen ein Oberflächenprotein der Zielzelle angeknüpft werden, wie im Falle der sog. Immunotoxine. Alternativ können zusätzliche Phosphatgruppen des Oligonucleotids modifiziert werden, um die negative Ladung auf dem Molekül zu verringern und um dadurch seinen Transport über die Lipid-Doppelschicht der Zellmembran zu erleichtern. Mit solchen Modifikationen können auch apolare Substituenten wie Kohlenwasserstoffketten oder aromatische Gruppen in das Molekül eingebaut werden, um die intrazelluläre Aufnahme weiter zu vergrößern. Die Modifikation von zusätzlichen Phosphatgruppen innerhalb der Kette kann ebenfalls die Stabilität des Oligonucleotids weiter steigern, indem die Aktivität der 5'-nach-3'-Exonucleasen und -Endonucleasen, die in bestimmten Zellen vorhanden sind, blockiert wird (siehe Beispiel 4). Obwohl der Abbau über diese Wege viel weniger schnell ist als der Abbau von dem 3'-Ende der Kette, kann die zusätzliche Wirkung der Blockierung auch dieser Aktivitäten, insbesondere der exonucleolytischen 5'-nach-3'-Spaltung, in vielen Fällen förderlich sein. Bei diesen verschiedenen Anwendungen ist es jedoch nützlich, daß die Modifikationen auf eine begrenzte Anzahl der Phosphodiestergruppen begrenzt werden. Falls der größte Teil oder alle Phosphodiesterbindungen in der Kette modifiziert werden, beeinflußt dies häufig die Hybridisierungseigenschaften des Oligonucleotids, und wichtiger, schließt die Verwendung solcher Derivate als Heilmittel aus, da sie mit den gerichteten mRNAs keine Substrate mehr bilden, auf die die RNaseH einwirkt. Es ist essentiell, daß eine oder mehrere kontinuierliche Abschnitte in der Oligonucleotidkette vorhanden sind, in denen die Phosphodiesterbindungen unmodifiziert sind. Die Länge dieses unmodifizierten Teils der Kette muß wenigstens 4 Nucleotide betragen und vorzugsweise in der Länge größer sein als 7 Nucleotide. Ist dies erreicht, so ist das Oligonucleotid vor einem Abbau aufgrund der Modifikation der 3'-terminalen Phosphodiesterbindung geschützt und hybridisiert auch mit den mRNAS unter Bildung von Substraten für die RNaseH, die die mRNA über den unmodifizierten Teil des Oligonucleotids spaltet und die Verwendung solcher Derivate als Heilmittel zur Blockierung der Expression ausgewählter Gene ermöglicht. Es wird nun das Verfahren der Modifizierung der 3'-Phosphodiesterbindung beschrieben.
Die modifizierende Gruppierung ist nicht kritisch. Sie kann ausgewählt werden aus irgendeiner der Funktionaltiäten: Alkyl- oder Arylphosphotriester Alkyl- oder Arylphosphonate Hydrogenphosphonate Alkyl- oder Arylphosphoramidate Phosphorthioate Phosphorselenate
Falls die Synthese in Lösung statt an einem festen Träger durchgeführt wird, wird das 3'-OH des ersten Restes durch eine Schutzgruppe blockiert, die auf dem Höhepunkt der Synthese entfernt wird. Im allgemeinen wird jeweils eine Nucleotideinheit an die 5'-OH-Gruppe der wachsenden Kette addiert. Alternativ kann ein Block aus mehreren Resten während einer einzigen Reaktion addiert werden. Es existieren mehrere Methoden, durch die die Internucleotidbindung zu der 5'-OH-Gruppe gebildet werden kann. Diese Verfahrensweisen sind in einer übersicht dargestellt in der folgenden Monographie "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (Gait, M.J., Hrsg.) IRL Press, Oxford (1984).
Das folgende Reaktionsschema erläutert die Phosphoramidit- Methode, derzeit die bevorzugte Chemie. Kupplung Oxidation
DMT steht für die Dimethoxytrityl-Schutzgruppe. S.S. steht für den festen Träger, an dem die Synthese durchgeführt wird, B&sub1; und B&sub2; stehen für Nucleinsäurebasen (entweder A, G, C oder T).
Das unmittelbare Produkt dieser Reaktion ist ein Phosphotriester. Am Ende der Synthese wird die Schutzgruppe R entfernt, um eine Phosphodiesterbindung zu ergeben. Typischerweise wird die β-Cyanoethylgruppe für diesen Zweck verwendet. Alternativ kann R eine Gruppe sein, die nicht entfernt wird, in welchem Falle das Endprodukt ein Phosphotriester ist, wobei die Gruppe R dauerhaft an das Phosphoratom angeknüpft bleibt. Auf diese Weise kann ein modifizierter Phosphotriester an der ersten Internucleotidbindung von dem 3'-Ende der Kette eingebaut werden. Durch im wesentlichen dieselbe Chemie kann ein Alkyl- oder Arylphosphonat speziell an dieser Stelle eingebaut werden, in welchem Falle die Gruppe R direkt an das Phosphoratom statt über den Sauerstoff angeknüpft wird. Gleichermaßen kann an dieser Stelle ein Hydrogenphosphonat eingebaut werden. Solche Derivate können direkt oder oxidiert verwendet werden, um Phosphotriester oder Phosphoramidate zu ergeben, die an der 3'-terminalen Internucleotidbindung eingebaut werden. Die folgende Referenz offenbart die Modifikationen der Hydrogenphosphonatgruppe, Froehler, B.C. Tetrahedron Letters, (1986), 27, 5575-5578. Eine Phosphorthioatoder Phosphorselenatgruppe kann an der 3'-terminalen Internucleotidbindung eingebaut werden, indem die Oxidationsstufe bei der Phosphoramidit-Methode mit Schwefel bzw. KSCN durchgeführt wird, Stec. et al., Journal of the American Chemical Society, (1984), 106, 6077-6079. Am Ende der Synthese, auf die die Entfernung sämtlicher Schutzgruppen folgt, kann das Endprodukt direkt oder weiter gereinigt durch gaschromatographische Methoden, die den Fachleuten gut bekannt sind, siehe beispielsweise "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (Gait, M.J., Hrsg.) IRL Press, Oxford (1984), verwendet werden.
Die soeben beschriebenen Verfahrensweisen sind allgemein auf die Synthese von Oligonucleotiden bis zu ungefähr 100 Resten in der Länge anwendbar. Um ein längeres DNA-Molekül zu modifizieren, in dem die 3'-terminale Phosphodiestergruppe modifiziert ist, wird eine Kombination aus sowohl chemischen als auch enzymatischen Methoden angewendet. Zur Durchführung der Synthese mit einer solchen Abfolge wurde ein kurzes Oligonucleotid, in dem die 3'-terminale Phosphodiesterbindung modifiziert war, hergestellt durch chemische Verfahren, enzymatisch an die 3'-OH-Gruppe einer längeren DNA- oder RNA-Kette ligiert.
Die Methoden der Formulierung und Verabreichung der modifizierten Oligonucleotide, die hier beschrieben sind, sind für Fachleute der Medizintechnik klar, siehe beispielsweise Avis, K. (1985) in Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A.R., Hrsg.) Ss. 1518-1541, Mack Publishing Company, Easton, Pa.
Solche Methoden der Verabreichung können je nach Krankheitszustand topische, orale oder parenterale Wege umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Geeignete Hilfsstoffe zur parenteralen Verabreichung umfassen 5 % Dextrose, normale Salzlösung, Ringer's Lösung und Ringer's Lactat. Das Material muß natürlich steril und im wesentlich Endotoxin-frei sein, Es kann in bestimmten Fällen möglich sein, das Produkt als lyophilisiertes Pulver zu lagern, welches anschließend rekonstituiert werden würde, wenn es benötigt wird, indem eine geeignete Salzlösung zugesetzt wird.
Die folgenden Beispiele sind zur weiteren Erläuterung, jedoch nicht zur Einschränkung, des erfindungsgemäßen Verfahren, des erfindungsgemäßen Produktes und der erfindungsgemäßen medizinischen Techniken angegeben und dienen zur Heraushebung der einzigartigen Charakteristika der Erfindung, die es ermöglicht, die Einschränkungen der früheren Beiträge auf diesem Gebiet zu beheben.

BEISPIEL 1

Beweis, daß die Hemmung der Transiation einer gerichteten mRNA durch ein komplementäres Oligonucleotid abhängig ist von der Spaltung der mRNA durch RNaseH

Für den Zweck dieser Experimente wurden zwei Oligonucleotide synthetisiert: 5'-GAGCACCATGGTTTC, MA-15, und 5'-TGTCCAAGTGATTCAGGCCATCGTT, CODMB-25. Beide wurden auf einem automatischen Beckman-DNA-Synthesegerät unter Verwendung der Phosphoramidit-Methode hergestellt. MA-15 ist komplementär zu einer Sequenz innerhalb der Mäuse-α-Globin- mRNA, die das Startkodon umspannt. CODMB-25 hybridisiert an eine Sequenz innerhalb der kodierenden Region der Mäuse-β- Globin-mRNA. Die Mäuse-Globin-mRNA wurde aus Reticulocyten isoliert, die aus Mäusen erhalten worden waren, die durch Behandlung mit Phenylhydrazin anämisch gemacht wurden, wie beschrieben von Goosens und Kan (Methods in Enzymology (Antonini, E., Rossi-Bernadi, L., und Chiancone, E. Hrsg.) 76, 805-817, 1981). Die In-vitro-Translationsreaktionen wurden in dem Kaninchen-Reticulocytenlysatsystem durchgeführt. Die Reticulocytenlysate, die verwendet wurden, wurden von der Firma ProMega Biotec bezogen und enthalten die RNaseH. Die Translationsreaktionen wurden mit 1 µg Maus- Reticulocyten-Gesamt-RNA programmiert. Die Reaktionen wurden 1 Stunde bei 30 ºC ablaufen gelassen. Jede Probe enthielt 45 µCi [³&sup5;S]-Methionin (Amersham) in einem Gesamtvolumen von 25 µl. Die Proteinsynthese wurde durch Einbau von [³&sup5;S]- Methionin in Material gemessen, das in 10 % Trichloressigsäure ausfällbar ist. Bei Kontrollreaktionen in Abwesenheit von Oligonucleotid ist die Synthese von β-Globin für 60 % der eingebauten Zählungen verantwortlich; die α-Globinsynthese ist für 40 % der Radioaktivität, die in das Protein eingebaut worden ist, verantwortlich. Die Reaktionen wurden sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Poly-rA/Oligo dT (500 µg/ml) durchgeführt. Poly rA/Oligo dT ist ein kompetetiver Hemmer der RNaseH, und die Konzentration, die angewendet wird, blockiert fast vollständig die Aktivität des Enzyms. Sowohl MA-15 als auch CODMB-25 hemmten sehr wirksam die Transiation der gerichteten mRNA (siehe Tabelle 1). MA-15 ist komplementär zu 12 von 15 Resten in der entsprechenden Sequenz der β-Globin-mRNA und hemmt darum ebenfalls die β-Globinsynthese zu einem gewissen Ausmaß. Poly rA/Oligo dT blockiert vollständig die inhibitorische Wirkung der Oligonucleotide, was anzeigt, daß das Stoppen der Translation vollständig durch die Spaltung der mRNA durch die RNaseH ausgelöst wird. Tabelle 1. Rolle der RNaseH bei der Hybrid-gestoppten Translation

BEISPIEL 2

Oligodesoxynucleotidmethylphosphonate bilden keine Substrate für die RNaseH

Es wurden zwei verwandte Substrate für die RNaseH hergestellt. Poly rA/Oligo dt&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; und Poly rA/Oligo dT&sub1;&sub8;-Methylphosphonat (MP). Oligo dt&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; wurde bezogen von der Firma Pharmacia PL Biochemicals. Die Kettenlänge schwankt von 12 bis 18 Resten. Oligo dT&sub1;&sub8;MP wurden auf einem automatischen Beckman-DNA-Synthesegerät unter Anwendung der Phosphoramiditmethode hergestellt. Die 5'-terminale Internucleotidbindung ist ein normaler Phosphordiester. Die restlichen 16 Phosphatgruppen in der Kette sind Methylphosphonate. Poly rA, markiert mit Tritium, wurde von der Firma Amersham bezogen.
Jede Reaktion wurde in einem Endvolumen von 100 µl durchgeführt, welche 44 Picomol Substrat, entweder ³H-Poly rA/Oligo dT&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; oder ³H-Poly rA/Oligo dT&sub1;&sub8;MP in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 20 mM KCl, 9 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 25 µg Rinderserum-Albumin enthielten. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,3 Einheiten E.-Coli-RNaseH (Bethesda Research Laboratories) gestartet und 30 min lang bei 37 ºC ablaufen gelassen. Nach der Reaktion wurden jeder Probe 0,2 ml Träger-DNA-Lösung (0,5 mg/ml Lachssperma-DNA, 0,1 M Natriumpyrophosphat und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure) plus 0,3 ml 10 % Trichloressigsäure zugesetzt. Die Röhrchen wurden anschließend 20 min lang auf Eis inkubiert und danach bei 16 000 X g 15 min lang zentrifugiert. Die Spaltung des Poly-rA-Stranges durch die RNaseH setzt kleinere Fragmente frei, die durch Trifluoressigsäure nicht ausfällbar sind, und sie verbleiben daher im Überstand. Der Überstand wurde sorgfältig entfernt, mit flüssigem Scintillationscocktail vermischt und auf die Radioaktivität gezählt. Die Reaktion mit Poly rA/Olgio dT verlief nahezu vollständig - 85 % der radioaktiven Signale waren solubilisiert. Im Gegensatz dazu wurden weniger als 1 % der Poly rA/Oligo dT&sub1;&sub8;MP durch das Enzym abgebaut. Somit bildet sich, wenn viel oder alles der Phosphat-Hauptkette des Oligodesoxynucleotid-Analogon modifiziert ist, kein Substrat mit der komplementären RNA-Sequenz, das von der RNaseH erkannt und gespalten wird.

BEISPIEL 3

Oligonucleotide werden im Blut ausschließlich durch eine exonucleolytische 3'-nach-5'-Aktivität abgebaut

Zweck dieser Studie war Erstellung von Wegen, auf denen die Oligonucleotide im Blut abgebaut werden. Überraschenderweise wurde ein einziger Weg beobachtet: Der sequentielle Abbau von dem 3'- zu dem 5'-Ende des DNA-Moleküls.
Das in Beispiel 1 beschriebene Oligonucleotid MA-15 wurde mit ³²P am 5'-Ende des Moleküls unter Verwendung von γ-³²P-Adenosintriphosphat (γ-³²p-ATP, Amersham) und T4-Polynucleotidkinase (Bethesda Research Laboratories) radioaktiv markiert:
5-*GAGCACCATGGTTTC,
worin der Stern die radioaktive Markierung darstellt. Getrennt wurde ein radioaktiv markiertes Derivat hergestellt, in dem ³²P an der 3'-nächsten Internucleotidbindung unter Verwendung von α³²P-Desoxycytidintriphosphat (DCTP) und DNA-Polymerase I (Bethesda Research Laboratories) eingebaut wurde:
5'-GAGCACCATGGTTT*C.
Die Reaktion, die durch die DNA-Polymerase I katalysiert wird, erfolgt zwischen 5'-GAGCACCATGGTTT und DCTP und erfordert den komplementären DNA-Strang als Templat. Ein Sofacher Überschuß nichtmarkiertes MA-15 wurde nach der Reaktion zugegeben, um zu gewährleisten, daß das markierte Derivat einzelsträngig ist. Diese Verfahrensweisen sind Standardmethoden zur radioaktiven Markierung von DNA-Bruchstücken, siehe beispielsweise Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, Je, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Ss. 114-115 und 122-126, 1982, was hier als Referenz mitumfaßt ist.
Das radioaktiv markierte Oligonucleotid (5 X 10&sup5; Zählungen/min) pluß 2,5 nmol unmarkiertes MA-15 wurden zu 48 µl frisch abgenommenem menschlichem Blut, das mit Heparin gerinnungsstabil gemacht wurde, gegeben. Die Proben wurden bei 37 GC, Körpertemperatur, inkubiert, Aliquote von 6 µl wurden nach 15 min, 30 min, 1 Stunde und 2 Stunden entnommen&sub1; Ein Bruchteil eines jeden Aliquotes wurde auf ein Polyacrylamidgel gegeben und zur Trennung der Produkte auf der Grundlage der Größe einer Elektrophorese unterzogen. Um die radioaktiv markierten Produkte sichtbar zu machen, wurde das Gel über Nacht einem Röntgenfilm ausgesetzt. Eine Zeichnung des Autoradiogramms ist in Figur 3 gezeigt.
Der Abbau des am 5'-Ende des Moleküls markierten Oligonucleotids (Spuren 1-5) brachte eine Leiter von diskreten Produkten von abnehmender Größe hervor, was ein Anzeichen ist für die sequentielle exonucleolytische Spaltung des Stranges von dem 3'- in Richtung des 5'-Endes der Kette. Wäre die Spaltung in der Mitte des Stranges erfolgt, wären im Laufe der Zeit Produkte von intermediärer Länge aufgetreten. Wurde MA-15 am 3'-Ende des Moleküls markiert, so zeigte das resultierende Autoradiogramm, Spuren 6-10, im Laufe der Zeit ein Verschwinden des Vollängen-15-meren und eine entsprechende Zunahme in der Mononucleotid-pC. Dieses Ergebnis zeigt ebenfalls eine exonucleolytische 3'-nach-5'-Aktivität. Der Mangel an Produkten von intermediärer Größe schließt das Vorliegen einer exonucleolytischen 5'-nach-3'-Aktivität oder einer endonucleolytischen (internen) Spaltungsaktivität aus.
Durch dieselben Methoden wie soeben beschrieben zeigten wir, daß im Blut von anderen Säugerspezies, insbesondere von Maus, Kaninchen und Ratte, die Oligonucleotide ebenfalls ausschließlich durch die sequentielle Spaltung der Mononucleotide vom 3'-Ende der Kette abgebaut werden.

BEISPIEL 4

Der Hauptweg des Abbaus von Oligonucleotiden in menschlichen Zellen erfolgt durch sequentielle exonucleolytische Spaltung des Stranges von dem 3'- zu dem 5'-Ende der Kette

Zweck dieser Studien war die Bestimmung der Wege, auf denen die Oligonucleotide durch die in den menschlichen Zellen vorhandenen Nudeasen abgebaut werden. Die radioaktiv markierten Derivate von MA-15 wurden wie in Beispiel 3 hergestellt&sub1; Der Abbau des Oligonucleotids wurde in Extrakten studiert, die aus der menschlichen Erythroleukämiezellinie K562 hergestellt wurden. Die K562-Zellinie wurde zuerst von Lozzio, C.B&sub1; und Lozzio&sub1; B.B., Blood (1975) 45, 321-334 isoliert und wurde intensiv als Modell zur Erythrozyten-Differenzierung studiert&sub1; Die Zellen wurden in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,4, mit 5 mM MgCl&sub2;, 1 mM CaCl&sub2;, 100 mM NaCl und 0,1 % Triton X-100 suspendiert und mit einem kalten, motorbetriebenen Teflonpistill-Homogenisator 30 sec lang homogenisiert. Die Zellmembranen und Organellen wurden außerdem durch Ultraschallbehandlung von fünf 15-Sekunden-Stößen unter Verwendung eines Biosonic Ultraschallgerätes, das auf volle Stufe eingestellt war, aufgebrochen. Der verbleibende Zellabfall wurde aus den Extrakten durch 5minütiges Zentrifugieren bei 12 000 x g entfernt.
Das radioaktiv markierte Oligonucleotid wurde in K562-Zellextrakten unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 3 beschrieben inkubiert, und die Abbauprodukte wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Der Abbau des Oligonucleotids war viel schneller als derjenige im Blut. Der Hauptweg des Abbaus war wiederum eine exonucleolytische 3'-nach-5'-Aktivität. Die Halbwertszeit der Spaltung der 3'-terminalen Internucleotidbindung betrug 2 min. Eine langsamere exonucleolytische 5'-nach-3'-Aktivität wurde ebenfalls beobachtet. Die Halbwertszeit der Abspaltung der 5'-terminalen Nucleotideinheit von der Kette durch diesen Mechanismus betrug 20 min.
Unter Anwendung derselben Methoden wie oben wurden auch die Wege des Abbaus der Oligonucleotide in Extrakten, die aus anderen Säugerzellen hergestellt worden waren, studiert. Diese Systeme umfassen Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (COS-Zellen) und Mäuseleberzellen. Die Ergebnisse legen einen geringen Spiegel an endonucleolytischer Aktivität (Spaltung in der Mitte des Stranges) sowie eine 5'-nach-3'-Exonuclease nahe, jedoch erfolgte wiederum der Hauptweg des Abbaus des Oligonucleotids in jedem dieser Systeme durch eine 3'-nach-5'-Exonuclease.

BEISPIEL 5

Die Modifikation von Oligonucleotiden an der 3'-terminalen Internucleotidbindung blockiert vollständig ihren Abbau im menschlichen Blut

Es wurde ein Derivat des Oligonucleotids MA-15 hergestellt, in dem die erste Internucleotidbindung von dem 3'-Ende des Moleküls als 2,2,2-Trichlor-1,1-dimethylethylphosphotriester modifiziert wurde. Der Phosphotriester wurde in die Kette unter Verwendung des entsprechenden Phosphordichloridites eingebaut:
Zu 20 µmol 5'-Desoxythymidin, aufgelst in 1 cm³ 10 % Pyridin in Acetonitril, wurden 19 µmol des Phosphordichlordites gegeben. Die Reaktion wurde 5 min lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Das resultierende Monochlordit wurde zu 1 µmol Desoxycytidin, gebunden an Glasperlen von kontrollierter Porengröße (American Bionetics) gegeben. Die Kupplungsreaktion zur Erzeugung des Dinucleotidphosphortriesters wurde 15 min lang bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Überschüssige Reagentien und Nebenprodukte der Reaktion wurden mit wasserfreiem Acetonitril abgewaschen. Der restliche Teil des DNA-Stranges wurde durch das β-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahren auf einem automatischen Beckman-DNA- Synthesegerät synthetisiert. Es wird nur die 3'-terminale Internucleotidbindung modifiziert. Die verbleibenden 13 Phosphatgruppen in der Kette sind normale Phosphodiester.
Das modifizierte Oligonucleotid wurde an der 5'-terminalen OH-Gruppe unter Verwendung von γ-³²P-ATP und T4-Polynucleotidkinase, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit ³²P markiert. Das radioaktiv markierte Oligonucleotid wurde in menschlichem Blut bei 37 ºC inkubiert. Zu verschiedenen Zeiten wurden Aliquote entnommen und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Eine Zeichnung des Autoradiogramms des Gels ist in Figur 4 gezeigt. Es trat während eines Zeitraums von 18 Stunden kein Abbau des Oligonucleotids ein. Die stufenweise Abnahme in der Intensität der Bande aufgrund des Vollingenmoleküls beruhte auf der Entfernung der ³²P-Markierung aus dem Oligonucleotid durch eine im Blut vorhandene Phosphatase, nicht auf der Spaltung des Stranges.
Es wurden ähnliche Studien durchgeführt, in denen das modifizierte Oligonucleotid in Blut aus der Maus inkubiert wurde. Es wurde wiederum kein Abbau des Oligonucleotids beobachtet.

BEISPIEL 6

Die Modifikation der Oligonucleotide an der 3'-terminalen Internucleotidbindung hemmt deutlich ihren Abbau durch die in menschlichen Zellen vorhandenen Nucleasen

Die Derivate von MA-15, die in Beispiel 5 beschrieben worden waren, in denen die 3'-terminale Internucleotidbindung als 2,2,2-Trichlor-1,1-dimethylethylphosphotriester modifiziert worden war, wurden ebenfalls in dieser Studie verwendet. Die Extrakte aus den K562-Zellen wurden wie in Beispiel 4 hergestellt&sub1; Das modifizierte Oligonucleotid wurde in den Zellextrakten bei 37 ºC inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquote entnommen, und die Abbauprodukte wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Der Abbau dieses modifizierten Oligonucleotids durch die schnelle 3'-nach-5'-Exonuclease, die in den Zellextrakten vorhanden war, war vollständig blockiert. Dies führte zu einer deutlichen Zunahme in der Stabilität des modifizierten Derivates im Vergleich zu dem nativen Oligonucleotid&sub1; Die Halbwertszeit wurde um das 10fache verlängert. Der Abbau trat durch die langsamere exonucleolytische 5'-nach-3'-Aktivität, die in den K562-Zellextrakten vorhanden war, auf (siehe Beispiel 4). Die Halbwertszeit der Abspaltung des 5'-terminalen Nucleotids von der Kette betrug etwa 20 min.
Es wurden ähnliche Studien durchgeführt, in denen das modifizierte Oligonucleotid in Extrakten inkubiert wurde, die von COS-Zellen (Niere der afrikanischen grünen Meerkatze) und Mäuseleberzellen hergestellt wurden. In beiden Fällen wurde die Halbwertszeit des Derivates, das an der 3'-terminalen Internucleotidbindung modifiziert worden war, um das 10- bis 15fache im Vergleich zu dem nichtmodifizierten Oligonucleotid erhöht.

BEISPIEL 7

Oligonucleotide, modifiziert an der 3'-terminalen Internucleotidbindung, bilden Substrate mit mRNAs, die von der RNaseH gespalten werden

Mäuseglobin-mRNA wurde aus Mäusen isoliert, die durch eine Behandlung mit Phenylhydrazin wie in Beispiel 1 beschrieben anämisch gemacht wurden. Drei Oligonucleotide wurden in dieser Studie verglichen. MA-15, das Derivat von MA-15, verwendet in den Beispielen 5 und 6, in dem die 3'-terminale Internucleotidbindung als Trichlordimethylethylphosphotriester (MA-15-TCDM) modifiziert ist, und ein Derivat, das außerdem an der 5'-terminalen OH-Gruppe mit Naphthylisocyanat (NPH-MA-15-TCDM) modifiziert ist. Mäuseglobin-mRNA (2 µg) wurde zu 1,1 nmol des Oligonucleotids in einem Endvolumen von 22 µl gegeben, die 10 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 25 mM NaCl und 1 mM Dithiothreitol enthielten. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 2 Einheiten E.-Coli-RNaseH gestartet und wurden bei 37 ºC 30 min lang ablaufen gelassen, Die Reaktionen wurden durch Extraktion der Proben mit einem 1:1-Gemisch aus Phenol und Chloroform gestoppt. Die mRNA- Spezies, die nach dem Abbau mit RNaseH zurückblieben, wurden durch Ausfällen mit Ethanol isoliert und auf Northern-Blots analysiert.
Die RNA-Proben wurden mit 1 M Glyoxal in einem 1: 1-(Volumen/Volumen)-Gemisch aus 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 und Dimethylsulfoxid 1 Stunde lang bei 50 ºC umgesetzt und anschließend auf einem 1,5%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Die RNAs wurden von dem Gel auf ein Gene Screen Plus Filter (DuPont-NEN) durch Kapillarblotting gemäß dem vom Hersteller beschriebenen Verfahren übertragen. Die Vorhybridisierung des Filters erfolgte 2 Stunden lang bei 35 ºC in 1 % Natriumdodecylsulfat, 1 M NaCl, 10 % Dextransulfat und 50 mM Natriumphosphat, pH 6,5. Die Hybridisierung wurde in 5 ml des Vorhybridisierungspuffers, der 200 µg/ml denaturierte Lachssperma-DNA plus MA-15 mit 2 x 10&sup6; Zählungen/min, radioaktiv markiert mit P am 5'-Ende des Moleküls, enthielt, 24 Stunden lang bei 35 ºC durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurde das Filter in folgender Reihenfolge gewaschen: einmal in 2 x SSC (0,15 N NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) 5 min lang bei Raumtemperatur, zweimal in 2 x SSC plus 1 % Natriumdodecylsulfat 30 min bei 35 ºC und einmal in 0,1 x SSC 5 min lang bei Raumtemperatur. Das Filter wurde trocken getupft und für die Autoradiographie einem XAR-5-Film von Kodak ausgesetzt. Eine Zeichnung des Autoradiogramms ist in Figur 5 gezeigt.
Unter Verwendung von radioaktiv markiertem MA-15 als Sonde wurde eine einzige Bande aufgrund von α-Globin-mRNA auf dem Northern-Blot nachgewiesen. In Abwesenheit von Oligonucleotid trat keine Spaltung der mRNA während der Inkubation mit RNaseH (Spur 2) auf 1 Für die Reaktion in Gegenwart von MA-15 (Spur 3) wird eine deutliche Abnahme in der Intensität der Bande für α-Globin-mRNA aufgrund der Spaltung der mRNA durch die RNaseH an der Stelle der Hybridisierung mit der Sonde beobachtet. Eine ähnliche Abnahme in der Intensität der α-Globin-mRNA-Bande wurde für die Reaktionen mit jedem der modifizierten Oligonucleotide beobachtet (Spuren 4 und 5) was anzeigte, daß sie ebenfalls mit der mRNA unter Bildung eines Substrates hybridisierten, welches von der RNaseH erkannt und gespalten wird&sub1;

BEISPIEL 8

Hemmung der Expression des C-MYC-Oncogens in der Maus- Plasmacytom-Zellinie MOPC 315 mit komplementären Oligonucleotiden, modifiziert an der 3'-terminalen Internucleotidbindung

C-myc ist ein Zell-Onocogen, das entgegen den Regeln von einer Reihe von menschlichen und tierischen Tumorzellen sowohl in vivo als auch in Zellkultur exprimiert wird. Im Falle der Mäuse-Plasmacytom-Zellinie MOPC 315 wird das c-myc-Gen von seiner normalen Position auf Chromosom 15 zu dem Immunglobulin-Ort auf Chromosom 12 translociert und in einer abnorm hohen Konzentration exprimiert.
Die Oligonucleotid-Analoga, die zu der Sequenz der c-myc-mRNA komplementär sind, die für die Aminosäurereste 191-198 kodiert, wurden synthetisiert:
5'-G^TAGGGAAAGACCACTGAGGGT^C
5'-(PN)-GTAGGGAAAGACCACTGAGGGT^C
worin (^) einen Trichlordiemthylethylphosphotriester darstellt und (PN) =
Der TCDM-Phosphotriester wurde in die Kette durch die in Beispiel 5 beschriebene Verfahrensweise eingebaut. Der restliche Teil der Sequenz, die unmodifizierte Phosphodiestergruppen enthielt, wurde durch die Phosphoramidit-Methode synthetisiert. Die 5'-terminale Gruppe (PN) wurde unter Verwendung des Reagens Aminolink von der Firma Applied Biosystems gemäß der vom Hersteller beschriebenen Verfahrensweise eingebaut. Zum Vergleich wurden auch das unmodifizierte Oligonucleotid, das dieselbe Basensequenz aufweist, sowie ein Oligonucleotid, welches zu menschlicher Albumin-mRNA komplementär ist, hergestellt:
5'-T^CCCTTCATCCCGAAGTT^C,
worin (^) wiederum die TCDM-Gruppe darstellt.
MOPC-315-Zellen wurden bei 37 ºC mit 7 % CO&sub2; in RPMI-1640- Kulturmedium gehalten, welches 10 % fetales Kälberserum enthielt. Die log-Phasen-MOPC-315-Zellen wurden durch Zentrifugation (250 x g 19 min bei 23 ºC) geerntet und bei einer Dichte von 5 x 10&sup6;/ml in serumfreiem HB101 Medium (DuPont) resupendiert. 1-ml-Aliquote dieser Zellsuspension wurden in Gegenwart des Oligonucleotids 4 Stunden lang bei 37 ºC und 7 % CO&sub2; inkubiert. Gleichzeitig wurden zusätzliche 1-ml-Aliquote ohne Oligonucleotid inkubiert. Die Zellen aus jeder Gruppe wurden anschließend durch Zentrifugation gesammelt. Die zelluläre Gesamt-RNA wurde wie von Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294-5299 (1979), beschrieben hergestellt und durch Northern-Blots wie in Beispiel 7 beschrieben analysiert. Die Filter wurden mit einem Oligonucleotid sondiert, welches zu c-myc-mRNA, markiert mit ³²P, komplementär ist, indem Polynucleotidkinase und γ³²P-ATP wie in den vorherigen Beispielen verwendet wurden.
Beide Anti-c-myc-Oligonucleotide, die an der 3'-terminalen Internucleotidbindung mit der TCDM-Gruppe in einer Konzentration von 1 µmol modifiziert worden waren, verringerten die Konzentration der c-myc-mRNA um 75 % im Vergleich zu der Gleichgewichtskonzentration der mRNA in MOPC-315-Zellen, die in Abwesenheit des Oligonucleotids inkubiert worden sind&sub1; Das unmodifizierte Oligonucleotid gegen c-myc und das Anti- Albumin-Oligonucleotid besaßen keine Wirkung auf die c-myc- mRNA-Konzentrationen bei einer Konzentration von entweder 1 oder 5 µmolar. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den jüngsten Studien einer anderen lymphoiden Zellinie, in der keine Hemmung der Expression des c-myc-Gens bei Konzentrationen eines unmodifizierten Anti-c-myc-Oligonucleotids unter einer Konzentration von 15 µmolar gefunden wurde (Heikkila et al., (1987) Nature 328, 445-449). Die modifizierten hier beschriebenen Derivate sind somit bei der Hemmung der Expression eines gerichteten Gens in intakten Zellen zwischen 20- und 50fach wirksamer als das entsprechende unmodifizierte Oligonucleotid.
Zusammenfassend zeigen die angegebenen Ergebnisse, daß die Oligonucleotide, in denen die 3'-terminale Phosphodiesterbindung modifiziert worden ist, resistent sind gegenüber einem Nucleaseabbau in den Zellen und Körperfluiden, sie die normalen Hybridisierungseigenschaften mit komplementären Nucleinsäuresquenzen beibehalten und, wenn sie an speziell gerichtete mRNA-Spezies hybridisiert werden, Substrate bilden, die von dem Enzym RNaseH erkannt und gespalten werden, was es erlaubt, daß die Oligonucleotide zur Blockierung der Expression des entsprechenden Gens verwendet werden, wie es bei verschiedenen therapeutischen Anwendungen gewünscht ist.
Weitere Modifikationen des Oligonucleotids können erfolgen, ohne vom Umfang der Ansprüche abzuweichen, wobei der wichtige Faktor und der Beitrag in der Entdeckung besteht, daß die Modifikation der 3'-terminalen Phosphodiesterbindung allein ausreicht, um die Beständigkeit des Oligonucleotids gegenüber dem Abbau deutlich zu steigern, und daß die Derivate in der Lage sind, Substrate mit RNAs zu bilden, die von der RNaseH erkannt und gespalten werden. Zusätzliche Substituenten könnten zur weiteren Steigerung der Stabilität des Oligonucleotids gegen einen Abbau und zur Erleichterung des intracellulären Transports zugegeben werden. Es ist wichtig, daß solche weiteren Modifikationen auf eine begrenzte Anzahl von anderen Stellen am Molekül beschränkt werden. Falls die meisten oder alle Phosphatgruppen innerhalb der Kette modifiziert werden, können die Hybridisierungseigenschaften des Oligonucleotids nachteilig beeinflußt werden, und es werden keine Substrate mit mRNAs gebildet, auf die die RNaseH einwirkt. Diese letztere Tatsache verhindert die Verwendung von hochmodifizierten Oligonucleotid-Analoga als Heilmittel zur Blockierung der Expression speziell gerichteter Gene.
Es kann darum gesehen werden, daß die Erfindung wenigstens alle hier zuvor genannten Aufgaben erfüllt.

Claims

1. Oligodesoxynucleotid, dessen Nucleotidsequenz Komplementarität besitzt für und hybridisierbar ist mit einer Nucleotidsequenz innerhalb der mRNA, die von einem gerichteten Gen transcribiert wird, welches aufweist: (a) eine modifizierte 3'-terminale Internucleotid-Phosphodiesterbindung, wobei die modifizierte 3'-terminale Internucleotid-Phosphodiesterbindung resistent ist gegenüber einem 3'-nach-5'-Exonucleaseabbau, (b) eine oder mehrere zusätzliche modifizierte Internucleotid- Phosphodiesterbindungen, wobei die zusätzliche(n) modifizierte (n) Phosphodiesterbindung(en) resistent ist/sind gegenüber einem Nucleaseabbau, und (c) eine kontinuierliche Sequenz von wenigstens vier Internucleotid-Phosphodiesterbindungen, die unmodifiziert sind.

2. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, das außerdem eine oder mehrere zusätzliche modifizierte Internucleotid- Phosphodiesterbindungen aufweist, wobei die zusätzlichen modifizierten Internucleotid-Phosphodiesterbindung(en) den intracellulären Transport des Oligodesoxynucleotids erleichtern.

3. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, worin das Oligodesoxynucleotid in der Länge etwa 10 bis etwa 75 Nucleotide beträgt.

4. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, worin das Oligodesoxynucleotid an ein Trägermolekül gebunden ist, wobei das Trägermolekül in der Lage ist, von der Zelle aufgenommen zu werden.

5. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, worin sich die zusätzliche modifizierte Internucleotid-Phosphodiesterbindung an der 5'-terminalen Internucleotid-Phosphodiesterbindung befindet.

6. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, worin die kontinuierliche Sequenz der Internucleotid-Phosphodiesterbindungen, die unmodifiziert sind, größer ist als 7 Internucleotid-Phosphodiesterbindungen.

7. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, worin sämtliche Phosphodiesterbindungen außerhalb der kontinuierlichen Sequenz modifiziert sind.

8. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, worin die modifizierte 3'-terminale Internucleotid-Phosphodiesterbindung eine Phosphotriesterbindung, eine Phosphonatbindung, eine Phosphoramidatbindung, eine Phosphorthioatbindung oder eine Phosphorselenatbindung ist.

9. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, worin die zusätz liche(n) modifizierte(n) Internucleotid-Phosphodiesterbindung(en) eine Phosphodiesterbindung (en), Phosphonatbindung(en), Phosphoramidatbindung (en), Phosphorthioatbindung(en) oder eine Phosphorselenatbindung(en) ist (sind).

10. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, welches aufweist: (a) eine Phosphortriesterbindung an der 3'-terminalen Internucleotid-Position, (b) eine oder mehrere zusätzliche Phosphortriesterbindung(en) am 5'-Ende des Oligodesoxynucleotids und (c) eine kontinuierliche Sequenz von wenigstens 4 Internucleotid-Phosphodiesterbindungen, die unmodifiziert sind.

11. Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 1, welches aufweist: (a) eine Phosphoramidatbindung an der 3'-terminalen Internucleotid-Position&sub1; (b) eine oder mehrere zusätzliche Phosphoramidatbindung(en) am 5'-Ende des Oligodesoxynucleotids und (c) eine kontinuierliche Sequenz von wenigstens 4 Internucleotid-Phosphodiesterbindungen, die unmodifiziert sind.

12. Verfahren zur Blockierung der Expression eines gerichteten Gens in einer eukaryotischen Zelle, welche das gerichtete Gen exprimiert, umfassend Zusammenbringen der Zelle mit dem Oligodesoxynucleotid nach den Ansprüchen 1-11 unter In-vitro-Bedingungen, so daß das Oligodesoxynucleotid in ausreichender Menge in die Zelle eintritt, um die Expression des gerichteten Gens zu blockieren.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Verfahren zur Blockierung der Expression des gerichteten Gens ein industrielles oder landwirtschaftliches Verfahren verbessert.

14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die In-vitro-Bedingungen Zellkulturbedingungen sind.

15. Oligodesoxynucleotid von fünf oder mehr Internucleotidbindungen, welches aufweist: (a) Komplementarität für und hybridisierbar an eine Nucleotidsequenz innerhalb der mRNA-Sequenz eines gerichteten Gens und (b) eine modifizierte 3'-terminale Internucleotid-Phosphodiesterbindung, wobei die modifizierte 3'-terminale Internucleotid- Phosphodiesterbindung resistent ist gegenüber einem 3'-nach-5'-Exonucleaseabbau.

16. Verfahren zur Blockierung der Expression eines gerichteten Gens in einer eukaryotischen Zelle, welche das gerichteten Gen exprimiert, umfassend Zusammenbringen der Zelle mit dem Oligodesoxynucleotid nach Anspruch 15 unter In-vitro-Bedingungen, so daß das Oligodesoxynucleotid in ausreichender Menge in die Zelle eintritt, um die Expression des gerichteten Gens zu blockieren.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Methode der Blockierung der Expression des gerichteten Gens ein industrielles oder landwirtschaftliches Verfahren verbessert.

18. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die In-vitro- Bedingungen Zellkulturbedingungen sind.