DE69433520T2

DE69433520T2 - Antisense-nukleinsäure enthaltende pharmazeutische zusammensetzung zur vorbeugung und/oder behandlung von neuronalen verletzungen, entartungen und zelltod, und zur behandlung von neoplasmen

Info

Publication number: DE69433520T2
Application number: DE69433520T
Authority: DE
Inventors: Georg-F. Schlingensiepen; Reimar Schlingensiepen; Karl-Hermann Schlingensiepen; Wolfgang Brysch
Original assignee: Biognostik Gesellschaft fuer Biomolekulare Diagnostik mbH
Current assignee: Biognostik Gesellschaft fuer Biomolekulare Diagnostik mbH
Priority date: 1993-07-10
Filing date: 1994-07-06
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2014-07-07
Also published as: JPH08512300A; US20020037866A1; AU7345694A; EP0708829B1; EP0708829A1; DE69433520D1; ATE258596T1; US7326783B2; EP0708829B8; WO1995002051A2; WO1995002051A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung und ein diagnostisches Mittel, die eine wirksame Menge einer Verbindung umfassen, die neuronale Verletzungen, neuronalen Zelltod und/oder Neoplasmen verhindern und behandeln kann, wobei die Expression von c-jun eine kausale Rolle spielt, insbesondere Antisense-Nucleinsäure oder -Oligonucleotide, die mit einem Bereich des Messenger-RNA (mRNA) und/oder DNA hybridisieren, der die Gene für c-jun umfasst, die Verwendung der Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Neoplasmen und/oder für die Prävention und/oder Behandlung von neuronalen Verletzungen und neuronaler Degeneration, die mit der Expression von c-jun zusammenhängen.
Schlingensiepen et al. berichten in Proceedings of the American Association for Cancer Research, Vol. 32, S. 303, Abstract Nr. 1799, 82. Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, Houston, USA, 1991, dass das c-jun- und jun-B-Gen eine hohe Sequenzhomologie mit dem v-jun-Gen aufweisen. Sie gehören zur unmittelbar-frühen Gengruppe. C-jun bildet zusammen mit c-fos den DNA-bindenden Faktor AP-1. Die Expression von C-jun und jun-B wurde in verschiedenen Zelllinien unter Verwendung von Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotiden gehemmt. Durch die Inhibition von C-jun wurde der Einbau von ³H-Thymidin in zwei Mammakarzinom-Zelllinien stark reduziert, nämlich in der Ratten-Phäochromocytom-Zelllinie PC-12 und in NH-3T3-Maus-Fibroblasten. Die Hemmung der c-jun-Expression und der c-fos-Expression hatte in denselben Zelllinien sehr ähnliche Wirkungen: Die Hemmung der Expression von jun-B erhöht die Aufnahme von ³H-Thymidin drastisch auf das über Zehnfache. Man glaubt, dass 10-jun die Merkmale eines Protooncogens hat, aber jun-B scheint ein Antioncogen mit einer stark antiproliferativen Wirkung ähnlich der von p53 zu sein. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass jun-B und c-jun funktionelle Antagonisten in Bezug auf ihre Wirkung auf das Zellwachstum sind. Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um die Funktion der jeweiligen Gene und Proteine aufzuklären. In diesem Abstract wird kein therapeutisches Konzept vorgeschlagen.
Im Journal of Cellular Biochemistry, Abstract B 977, Keystone Symposia on Molecular & Cellular Biology, 1993, berichten Schlingensiepen et al. von zwei Homologen des Protooncogens c-jun, die in Säugern identifiziert wurden. In diesem Abstract wird spekuliert, dass jun-B möglicherweise eine Rolle in der Zelldifferenzierung spielt. Um funktionelle Fragen in Bezug auf das jun-B-Gen zu untersuchen, wurden Antisense-Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotide (S-ODN) verwendet, um die Expression von c-jun und jun-B in neuronal differenzierenden PC-12-Tumorzellen in primären neuronalen Zellkulturen aus dem Ratten-Hippocampus spezifisch zu hemmen. Die Western-Blot-Analyse zeigte nach der Anwendung von 2 μM S-ODN spezifische Reduktionen in den jeweiligen Jun-Protein-Niveaus um mehr als 90%. In neuronalen Zellkulturen wurde der Auswuchs von Neuriten nach der Hemmung der Expression von jun-B stark gehemmt, wurde jedoch nach der Anwendung von Anti-c-jun-S-ODN verstärkt. Noch drastischere Änderungen wurden bei neuronal differenzierenden PC-12-Tumorzellen beobachtet. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass jun-B eine entscheidende Rolle bei der Zelldifferenzierung spielt, während c-jun die Differenzierung zu hemmen scheint. Auch aus dieser Offenbarung ist kein therapeutisches Konzept erhältlich.
In Biomedicine & Pharmacotherapy, Abstract 38, vom 5. International Congress on Differentiation Therapy berichten Schlingensiepen et al. ebenfalls über die Ergebnisse, die im Journal of Cellular Biochemistry veröffentlicht sind.
In Developmental Genetics 14: 305–312 (1993) berichten Schlingensiepen et al. über die Induktion der jun-B- und/oder c-jun-Transcriptionsfaktoren. Die Induktion bildet einen Teil der unmittelbar-frühen Reaktion auf verschiedene Reize, die Veränderungen in Zellprogrammen induzieren. Um die funktionelle Bedeutung der jun-B- und/oder c-jun-Transcription zu bestimmen, wurden Antisense-Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotide verwendet, um die Expression der Gene in proliferierenden und neuronal differenzierenden Zellen zu hemmen. In Zellkulturstudien zeigte sich, dass die Hemmung der jun-B-Expression die morphologische Differenzierung merklich reduzierte. Umgekehrt verstärkte die Hemmung der Synthese von c-jun-Proteinen die morphologische Differenzierung sowohl von primären Neuronen als auch von PC-12-Tumorzellen.
EP-A-0 305 929 betrifft Membranen mit gebundenen Oligonucleotiden und direkt auf die Membran gebundene Peptide. Das Verfahren zum Synthetisieren von Oligonucleotiden, die direkt auf eine Membran gebunden sind, liefert ein Mittel, um Träger mit Membranaffinität zu erzeugen. Eine modifizierte Membran für das Verfahren der direkten Synthese wird ebenfalls bereitgestellt.
WO 92/15680 betrifft ein Verfahren und Zusammensetzungen für die selektive Hemmung der Genexpression. Offenbart werden Verfahren und Zusammensetzungen für die selektive Hemmung der Genexpression durch die Anwendung von Antisense-RNA-Technologie. Bei Antisense-RNA-Konstrukten wird Antisense-Intron-DNA verwendet, die bestimmten Intronbereichen des Gens entsprechen, dessen Expression herunterreguliert werden soll. In einer beispielhaften Ausführungsform wurde eine Human-Lungenkrebs-Zelllinie (NCI-H460a) mit einer homozygoten spontanen K-ras-Mutation mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert, das ein genomisches Segment von K-ras in Antisense-Orientierung synthetisiert. Die Translation der mutierten K-ras-mRNA wurde spezifisch gehemmt, während die Expression von H-ras und N-ras unverändert blieb. In H460a-Zellen fand eine dreifache Wachstumshemmung statt, wenn die Expression des mutierten ras-p2l-Proteins durch Antisense-RNA herunterreguliert wurde, und die Zellen blieben lebensfähig. Das Wachstum von H460a-Tumoren in nu/nu-Mäusen wurde durch exprimierte K-ras-Antisense-RNA wesentlich reduziert.
Dan Mercola beschäftigt sich in Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, S. 83–114, mit der Verwendung von Antisense-fos-RNA und in geringerem Maße mit Antisense-jun-RNA. Diese Antisense-RNA hat zum Verständnis der Rollen von Genprodukten in der Zellcyclusregulation, Differenzierung usw. beigetragen. Ein Fortschritt in der Anwendung von Antisense-RNA und -Oligonucleotiden auf diese Themen und Implikationen für diagnostische und therapeutische Ansätze werden in Betracht gezogen.
S. van den Berg beschäftigt sich in Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, S. 63–70, 1991, mit Antisense-fos-Oligodesoxyribonucleotiden, die die Erzeugung von chromosomalen Aberrationen unterdrücken. Die schnelle Induktion des Expressionsprodukts FOS-nukleares-Oncoprotein durch Serumbehandlung von ausgehungerten Zellen wurde verwendet, um die funktionelle Stabilität von Antisense-Oligodesoxyribonucleotiden zu testen. Unmodifizierte Oligodesoxyribonucleotide verloren ihre blockierende Wirkung mit einer Halbwertszeit von etwa 2 Stunden, während eine Modifikation des Gerüsts durch Thioester die Halbwertszeit auf etwa 4 Stunden verlängerte. Die modifizierten Oligodesoxyribonucleotide wurden verwendet, um eine entscheidende Rolle von FOS in einem komplexen physiologischen Ereignis zu entschlüsseln: der Induktion von chromosomalen Aberrationen bei Überexpression von Oncogenen wie ras und mos nach Bestrahlung von Fibroblasten mit UV-Licht.
Die Induktion der c-Fos-, Jun-B- und/oder c-Jun-Transcriptionsfaktoren ist ein Teil der unmittelbar-frühen Reaktion auf verschiedene Reize, die Veränderungen in Zellprogrammen induzieren. C-jun und c-fos sind Protooncogene, deren Expression für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist, während die Funktion des Jun-B-Transcriptionsfaktors unklar blieb.
Neuronale Zellverletzungen und neuronaler Zelltod aufgrund von z. B. Hypoxie oder Hypoglycämie können aufgrund von Reaktionen der Zelle auf verschiedene Reize stattfinden, die Veränderungen in Zellprogrammen induzieren.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Prävention und/oder Behandlung von neuronalen Verletzungen und/oder neuronalem Zelltod bereitzustellen. Überraschenderweise spielt die Expression des c-jun-Gens eine kausale Rolle bei neuronaler Zellverletzung und neuronalem Zelltod aufgrund von z. B. Hypoxie oder Hypoglycämie.
Weiterhin verstärkt die Hemmung der Expression des c-Jun-Proteins überraschenderweise die Differenzierung solcher Zellen. Auf der Grundlage dieses Ergebnisses stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Neoplasmen durch Hemmung der c-jun-Expression bereit.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Antisense-Nucleinsäuren oder wirksame Derivate davon umfasst, die mit einem Bereich der mRNAs oder DNA hybridisieren, der die Gene für c-jun umfasst, ist in der Lage, die oben angesprochenen Probleme zu lösen. Die Antisense-Nucleinsäure kann mit Bereichen der c-jun-mRNAs hybridisieren. Der Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass Fragmente der Antisense-Nucleinsäuren sowie Antisense-Nucleinsäuren, die diese Sequenzen enthalten, gemäß der Erfindung funktionieren, solange die Produktion des c-Jun-Proteins reduziert oder gehemmt wird.
Gemäß der Erfindung sind die Antisense-Oligonucleotide erhältlich durch Festphasensynthese unter Verwendung von Phosphittriesterchemie durch Verlängerung der Nucleotidkette in 3'→5'-Richtung, wobei das jeweilige Nucleotid an das erste Nucleotid gekoppelt wird, das kovalent an die feste Phase gebunden ist, mit den folgenden Schritten:

– Abspalten der 5'DMT-Schutzgruppe des vorherigen Nucleotids;
– Hinzufügen des jeweiligen Nucleotids für die Kettenverlängerung;
– Modifizieren von Phosphitgruppen und anschließendes Verkappen von nicht umgesetzten 5'-Hydroxygruppen; und
– Abspalten des Oligonucleotids vom festen Träger;
– anschließend Aufarbeiten des Syntheseprodukts.

Die chemischen Strukturen von Oligodesoxyribonucleotiden sind in 1 angegeben, und die jeweiligen Strukturen von Antisense-Oligoribonucleotiden sind in 2 angegeben. Die Oligonucleotidkette ist als Detail aus einer längeren Nucleotidkette zu verstehen.
In 1 bedeutet B eine organische Base, wie Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T), die über N9(A,G) oder N1(D,T) an die Desoxyribose gekoppelt sind. Die Sequenz der Basen ist das reverse Komplement der genetischen Zielsequenz (mRNA-Sequenz). Die verwendeten Modifikationen sind:

1. Oligodesoxyribonucleotide, bei denen alle R¹ substituiert sind durch:
1.1 R¹ = O^–/OH
1.2 R¹ = S^–/SN
1.3
1.4 R¹ = CH₃
1.5 R¹= OEt
2. Oligodesoxyribonucleotide, bei denen R¹ an den Internucleotidphosphaten innerhalb eines Oligonucleotids variiert sind:
wobei B = Desoxyribonucleotid dA, dC, dG oder dT, je nach der Gensequenz; p = Internucleotidphosphat; (B-p-)_n = ein Stück Oligodesoxyribonucleotid mit einer Länge von 6 bis 20 Basen;
2.1 R^1a = S^–/SH; R^1b = O^–/OH;
2.2 R^1a = CH₃; R^1b = O^–/OH;
2.3 R^1a = S^–/SH; R^1b = CH₃;
2.4 R^1a = CH₃; R^1b = S^–/SH.
3. Oligodesoxyribonucleotide, bei denen R¹ an den Internucleotidphosphaten innerhalb eines Oligonucleotids abwechselt:
wobei B = Desoxyribonucleotid dA, dC, dG oder dT, je nach der Gensequenz; p = Internucleotidphosphat; (B-p-B-p-)_n = ein Stück Oligodesoxyribodinucleotid mit einer Länge von 4 bis 12 Dinucleotiden;
3.1 R^1a = S^–/SH; R^1b = O^–/OH;
3.2 R^1a = CH₃; R^1b = O^–/OH;
3.3 R^1a = S^–/SH; R^1b = CH₃.
4. Jede der Verbindungen 1.1–1.5, 2.1–2.4, 3.1–3.3, die an R² mit den folgenden Verbindungen gekoppelt sind, welche kovalent gekoppelt sind, um die Aufnahme in die Zelle zu erhöhen:
4.1 Cholesterin
4.2 Poly(L)lysin
4.3 Transferrin
4.4 Folsäure
5. Jede der Verbindungen 1.1–1.5, 2.1–2.4, 3.1–3.3, die an R³ mit den folgenden Verbindungen gekoppelt sind, welche kovalent gekoppelt sind, um die Aufnahme in die Zelle zu erhöhen:
5.1 Cholesterin
5.2 Poly(L)lysin
5.3 Transferrin
5.4 Folsäure

Im Falle der RNA-Oligonucleotide (2) sind die Basen (Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), Uracil (U)) über N9 (A, G) bzw. N1 (C, U) an die Ribose gekoppelt. Die Sequenz der Basen ist das reverse Komplement der genetischen Zielsequenz (mRNA-Sequenz). Die in der Oligonucleotidsequenz verwendeten Modifikationen sind wie folgt:

6. Oligoribonucleotide, bei denen alle R¹ substituiert sind durch:
6.1 R¹ = O^–/OH
6.2 R¹ = S^–/SH
6.3
6.4 R¹ = CH₃
6.5 R¹ = OEt
7. Oligoribonucleotide, bei denen R¹ an den Internucleotidphosphaten innerhalb eines Oligonucleotids variiert sind:
wobei B = Ribonucleotid A, C, G oder T, je nach der Gensequenz p = Internucleotidphosphat (B-p-)_n = ein Oligoribonucleotid-Stück einer Länge von 4–20 Basen
7.1 R^1a = S^–/SH; R^1b = O^–/OH;
7.2^R1a = CH₃; R^1b = O^–/OH;
7.3 R^1a = S^–/SH; R^1b = CH₃;
7.4 R^1a = CH₃; R^1b = S^–/SH.
8. Oligoribonucleotide, bei denen R¹ an den Internucleotidphosphaten innerhalb eines Oligonucleotids abwechselt:
wobei B = Ribonucleotid A, C, G oder T, je nach der Gensequenz p = Internucleotidphosphat (B-p-B-p)_n = ein Oligoribodinucleotid-Stück einer Länge von 4–12 Dinucleotiden
8.1 R^1a = S^–/SH; R^1b = O^–/OH
8.2 R^1a = CH₃; R^1b = O^–/OH
8.3 R^1a = S^–/SH; R^1b = CH₃
9. Jede der Verbindungen 6.1–6.5, 7.1–7.4, 8.1–8.3, die an R² mit den folgenden Verbindungen gekoppelt ist, welche kovalent gekoppelt sind, um die Aufnahme in die Zelle zu erhöhen:
9.1 Cholesterin
9.2 Poly(L)lysin
9.3 Transferrin
10. Jede der Verbindungen 6.1–6.5, 7.1–7.4, 8.1–8.3, die an R³ mit den folgenden Verbindungen gekoppelt ist, welche kovalent gekoppelt sind, um die Aufnahme in die Zelle zu erhöhen:
10.1 Cholesterin
10.2 Poly(L)lysin
10.3 Transferrin
11. Jede der Verbindungen 6.1–6.5, 7.1–7.4, 8.1–8.3, 9.1–9.3, 10.1–10.3, wobei alle R⁴ substituiert sind durch:
11.1 R⁴ = O^–/OH
11.2 R⁴ = F
11.3 R⁴ = CH₃

Die c-jun-Antisense-Nucleinsäuren der Erfindung umfassen die Sequenzen, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 1–42, 44–55 und 174–177 identifiziert sind und die eine Länge von 11–27 Basen haben, oder bestehen aus SEQ ID Nr. 43.
Es ist möglich, dass eine einzige individuelle Sequenz, wie sie oben genannt ist, als Antisense-Nucleinsäure oder Oligonucleotidstruktur gemäß der Erfindung funktioniert. Es ist jedoch auch möglich, dass ein Strang von Nucleotiden mehr als eine der oben genannten Sequenzen umfasst, wobei diese direkt kovalent miteinander verknüpft sind oder andere Nucleotide kovalent dazwischen gebunden sind. Vorzugsweise werden individuelle Oligonucleotide der Sequenzen, wie sie im Sequenzprotokoll skizziert sind, angesprochen.
Die Sequenz
5' GTCCCTATAC GAAC 3'
diente als randomisierte Kontrollsequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Oligonucleotide handelt es sich um Phosphorothioat-Derivate.
Modifikationen der Antisense-Oligonucleotide sind vorteilhaft, da sie, wenn man sie anwendet, von endogenen Faktoren nicht so schnell zerstört werden wie natürlich vorkommende Nucleotidsequenzen. Der Fachmann ist sich jedoch darüber im Klaren, dass auch natürlich vorkommende Nucleotide mit der offenbarten Sequenz gemäß der Erfindung verwendet werden können. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform ist die Modifikation eine Phosphorothioat-Modifikation.
Die Synthese des Oligodesoxynucleotids der Erfindung wird wie folgt ausführlicher als Beispiel beschrieben.
Oligodesoxynucleotide wurden durch schrittweise 5'-Addition von geschützten Nucleosiden unter Verwendung von Phosphonsäuretriesterchemie synthetisiert. Das Nucleotid A wurde als 5'-Dimethoxytrityldesoxyadenosin(N-benzoyl)-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidit (0,1 M) eingeführt; C wurde als 5'-Dimethoxytrityldesoxycytidin(N⁴-benzoyl)-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidit eingeführt; G wurde als 5'-Dimethoxytrityldesoxyguanosin(N⁸-isobutyryl)-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidit eingeführt; und T wurde als 5'-Dimethoxytrityldesoxythymidin-N,N'-diisopropyl-2-cyanoethylphosphoramidit eingeführt. Die Nucleoside wurden vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 M, gelöst in Acetonitril, angewendet.
Die Synthese erfolgte auf Glasteilchen mit kontrollierter Porengröße mit einem Durchmesser von ungefähr 150 μm (Porendurchmesser 500 Å), an die das am weitesten 3' liegende Nucleosid über einen langkettigen Alkylamin-Linker kovalent gebunden wird (mittlere Beladung 30 μmol/g fester Träger).
Der feste Träger wurde in eine zylindrische Synthesesäule geladen, an beiden Enden mit Filtern verschlossen, die ein ausreichendes Fließen von Reagentien zulassen, aber den festen Syntheseträger zurückhalten. Reagentien wurden unter Verwendung eines Überdrucks von Inertgas in die Synthesesäule geleitet und aus dieser entfernt. Die Nucleotide wurden in 3'→5'-Richtung an die wachsende Oligonucleotidkette addiert. Jedes Nucleotid wurde unter Verwendung einer Runde des folgenden Synthesecyclus angekuppelt:
Man spalte die 5'-DMT-(Dimethoxytrityl)-Schutzgruppe des vorigen Nucleotids mit 3-Chloressigsäure in Dichlormethan ab und wasche die Säule anschließend mit wasserfreiem Acetonitril. Dann wurde je nach der Sequenz eine der Basen gleichzeitig in Form ihres geschützten Derivats plus Tetrazol in Acetonitril hinzugefügt. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch entfernt, und das Phosphit wurde mit einem Gemisch von Schwefel (S₈) in Schwefelkohlenstoff/Pyridin/Triethylamin oxidiert. Nach der Oxidationsreaktion wurde das Gemisch entfernt, und die Säule wurde mit Acetonitril gewaschen. Die nicht umgesetzten 5'-Hydroxygruppen wurden durch gleichzeitige Zugabe von 1-Methylimidazol und Essigsäureanhydrid/Lutidin/Tetrahydrofuran verkappt. Danach wurde die Synthesesäule mit Acetonitril gewaschen, und der nächste Cyclus wurde begonnen.
Der Aufarbeitungsvorgang und die Reinigung der Syntheseprodukte erfolgten wie folgt.
Nach der Zugabe des letzten Nucleotids wurden die Desoxynucleotide durch Inkubation in Ammoniaklösung von dem festen Träger abgespalten. Schutzgruppen an exocyclischen Basen wurden durch weitere Inkubation in Ammoniak entfernt. Dann wurde der Ammoniak im Vakuum verdampft. Syntheseprodukte der vollen Länge, die noch die 5'-DMT-Schutzgruppe tragen, wurden mit Hilfe von Umkehrphasen-HPLC (high performance liquid chromatography) auf einer stationären C₁₈-Phase von kürzeren Ausschusskontaminanten getrennt. Eluenten aus dem Produktpeak wurden aufgefangen, im Vakuum getrocknet, und die 5'-DMT-Schutzgruppe wurde durch Inkubation in Essigsäure abgespalten, welche danach im Vakuum verdampft wurde. Die Syntheseprodukte wurden im entionisierten Wasser solubilisiert und dreimal mit Diethylether extrahiert. Dann wurden die Produkte im Vakuum getrocknet. Eine weitere HPLC-AX-Chromatographie wurde durchgeführt, und die Eluenten aus dem Produktpeak wurden gegen einen Überschuss von Tris-Puffer dialysiert, und eine zweite Dialyse erfolgte gegen entionisiertes Wasser. Die Endprodukte wurden lyophilisiert und trocken gelagert.
Die Antisense-Nucleinsäuren der Erfindung sind Zwischenprodukte für die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Medikament der Erfindung. Dieses Medikament kann für die Behandlung und/oder Prävention von neuronalem Zelltod oder für die Behandlung von Neoplasmen, bei denen die Expression von c-jun für die Pathogenität relevant ist, verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann neben den wirksamen Verbindungen noch geeignete Trägerstoffe, Lösungsmittel und andere Bestandteile, die in der Technik für die Herstellung von Medikamenten bekannt sind, umfassen. Vorzugsweise erleichtern diese Mittel die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung. Typischerweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung als intravenöse Infusion oder intravenöse Bolusinjektion verabreicht. Die zu verabreichende Menge des Wirkstoffs liegt typischerweise im Bereich von 0,2 bis 50 mg des Oligonucleotids pro kg Körpergewicht pro Tag, insbesondere 1–12 mg pro kg Körpergewicht pro Tag.
Die Wirkung von für c-jun spezifischen Antisense-Oligonucleotiden auf den Schutz vor neuronalem Zelltod wurde untersucht. Es wurde gezeigt, dass c-jun eine kausale Rolle beim neuronalen Zelltod spielt. Außerdem wurde die Rolle dieser Gene bei der Differenzierung und Proliferation von neoplastischen Zellen untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung der Synthese von c-Jun-Protein die Differenzierung von neoplastischen Zellen verstärken konnte. Es wurde gezeigt, dass Antisense-Oligodesoxynucleotide sowie Phosphorothioatmodifizierte Nucleinsäuren, die zu den mRNAs von c-jun komplementär sind, die Expression der jeweiligen Proteine spezifisch hemmen.
Im Prinzip kann die Verbindung, die als aktive Verbindung in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden kann, als diagnostisches Werkzeug verwendet werden, um zu bewerten, ob die jeweiligen Gene exprimiert werden. Typischerweise werden radioaktiv markierte Nucleotide nach dem Northern-Blotting-Verfahren, das in der Technik wohlbekannt ist, oder in situ mit einer zu untersuchenden Probe hybridisiert. Der Grad der Hybridisierung ist ein Maß für den Grad der Expression der jeweiligen Gene.
3 (nicht gemäß der Erfindung)
Western-Blot-Analyse von Ratten-PC-12-Zelllysaten. Wirkungen von verschiedenen Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotiden auf die Expression von c-Fos-Protein. Die Inkubationszeit mit Oligodesoxynucleotid betrug 6 h. Spur 1: randomisierte Kontrolle S-ODN; Spur 2; Anti-c-fos S-ODN-180; Spur 3: Anti-c-fos S-ODN-182. Pro Spur wurden 10 Fg Gesamtprotein verwendet.
4 (Analyse von jun-B: nicht gemäß der Erfindung)
Wirkungen von verschiedenen Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotiden auf die Expression von c-Jun- und Jun-B-Protein. A: Western-Blots von NIH-3T3-Zelllysat, sondiert mit einem Anti-c-jun-Antikörper. B: SK-BR3-Zelllysate, sondiert mit einem Anti-jun-B-Antikörper.
Die Inkubationszeiten mit dem Oligodesoxynucleotid betrugen: Spuren 1–3: 6 h; Spuren 4–6: 24 h. Spuren 1 und 4: randomisierte Kontrolle S-ODN; Spuren 2 und 5: Anti-jun-B S-ODN-62; Spur 3 und 6: Anti-c-jun S-ODN-13. Pro Spur wurden 10 fg Gesamtprotein verwendet.
5 (Analyse von Jun-B, c-Fos: nicht gemäß der Erfindung)
Wirkungen von verschiedenen Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotiden auf die Expression von c-Jun-, Jun-B- und c-Fos-Protein.

A: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) von Ratten-PC-12-Zelllysaten, die mit c-jun-(rattenspezifischen)-Antisense-Oligodesoxynucleotiden 174, 175, 176, 177 inkubiert wurden.
B: ELISA von humanen SK-Br-3-Zelllysaten, die mit c-jun-(humanspezifischen)-Antisense-Oligodesoxynucleotiden 1, 7, 13, 17, 20, 23, 26, 31, 31, 39, 45, 51 oder 54 inkubiert wurden.
C: ELISA von Ratten-PC-12-Zelllysaten, die mit jun-B-(rattenspezifischen)-Antisense-Oligodesoxynucleotiden 178 oder 179 inkubiert wurden.
D: ELISA von humanen SK-Br-3-Zelllysaten, die mit jun-B-(humanspezifischen)-Antisense-Oligodesoxynucleotiden 57, 62, 64, 69, 80, 85, 89, 92, 95 oder 97 inkubiert wurden.
E: ELISA von Ratten-PC-12-Zelllysaten, die mit c-fos-(rattenspezifischen)-Antisense-Oligodesoxynucleotiden 180, 181, 182, 183, 184 oder 185 inkubiert wurden.
F: ELISA von humanen SK-Br-3-Zelllysaten, die mit c-fos-(humanspezifischen)-Antisense-Oligodesoxynucleotiden 98, 99, 102, 103, 108, 116, 121, 130, 139, 144, 152, 158, 165, 170 oder 173 inkubiert wurden.

Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotide wurden in einer Konzentration von 2 μM verwendet. Kontrollzellen wurden unbehandelt gelassen (weiße Balken) oder mit 2 μM randomisierten Kontroll-Phosphorothioat-Oligonucleotiden behandelt (graue Balken).
6 (Anti-c-fos S-ODN ist nicht Bestandteil der Erfindung)
Überleben von Ratten-Cerebellum-Neuronen nach Hypoxie. Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotide wurden in einer Konzentration von 1 FM verwendet. Kontrollzellen wurden keiner Hypoxie unterzogen (weißer Balken). Hypoxie-Kontrollzellen wurden entweder nicht mit Oligonucleotid behandelt (schwarzer Balken, C) oder mit derselben Konzentration an randomisiertem Kontroll-Phosphorothioat-Oligonucleotid behandelt (grauer Balken). Die Fehlerbalken entsprechen einer Standardabweichung.
7 (Anti-jun-B S-ODN ist nicht Bestandteil der Erfindung)
Verstärkter Proliferationsstopp nach Unterdrückung von c-Jun-Proteinsynthese und fehlender Proliferationsstopp bei NGF-behandelten PC-12-Zellen nach der Unterdrückung der Jun-B-Proteinsynthese. Zahl der PC-12-Zellen nach 8 Tagen NGF-Behandlung. Die Balken stellen den Mittelwert von 4 Werten dar. Graue Balken: 2 FM randomisiertes Kontroll-S-ODN; weiße Balken: 2 FM Anti-c-jun S-ODN-174; schwarze Balken: 2 FM Anti-jun-B S-ODN-179. Die Fehlerbalken entsprechen einer Standardabweichung.
8 (Anti-jun-B S-ODN ist nicht Bestandteil der Erfindung)
Morphologische Differenzierung von NGF-behandelten PC-12-Zellen nach der Hemmung der c-jun- oder jun-B-Proteinsynthese.

A: Kontrollzellen, nicht mit Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotiden behandelt.
B: Zellen mit 2 μM Anti-jun-B S-ODN-179 inkubiert.
C: Zellen mit 2 μM Anti-c-jun S-ODN-174 inkubiert.

Die Erfindung wird weiterhin anhand der folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Zelllinien und Proliferationsassays
NIH-3T3-Maus-Fibroblasten und SK-Br-3-Human-Mammakarzinomzellen wurden in RPMI-Medium (Gibco) gezüchtet, das mit 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 5% FCS ergänzt worden war. PC-12-Ratten-Phäochromocytom-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM Medium Seromed) gezüchtet, das mit 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 5% FCS ergänzt worden war.
Beispiel 2
Western-Blot
Zellen wurden 3 Tage lang unter Niederserumbedingungen in RPMI/2% FCS gehalten, trypsinisiert und 5 min lang in RPMI/5% FCS/2 μM S-ODN vorinkubiert. 3 × 10⁶ Zellen wurden in 260-ml-Kulturkolben ausgestrichen und während der angegebenen Zeitspannen in RPMI/5% FCS/2 μM S-ODN gezüchtet, trypsinisiert, abzentrifugiert und durch Einfrieren lysiert. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Blotting und Chemilumineszenznachweis wurden nach Standardtechniken durchgeführt. Blots wurden mit einem Kaninchen-Anti-Maus-c-jun-Antikörper (Oncogene Science) oder mit einem Kaninchen-Anti-Human-jun-B-Antikörper (Oncogene Science) oder mit einem Kaninchen-Anti-c-fos-Antikörper (Oncogene Science) sondiert, wobei Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Alkalische-Phosphatase-Konjugat (Boehringer Mannheim) als zweiter Antikörper und CSPD (Tropix) für den Chemilumineszenznachweis verwendet wurden.
Beispiel 3
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Zelllysate wurden in 50 mM Carbonatpuffer bei pH 9,0 verdünnt und über Nacht auf Immunon-II-Platten (Dynatech Laboratories, Inc.) immobilisiert. Die Antigenlösung wurde entfernt, und 200 μl/Napf phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)/1% BSA/0,02% Azid wurden hinzugefügt, um die unspezifische Proteinbindung zu blockieren. Nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung entfernt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Platten 3 h lang an der Luft getrocknet. Spezifische Antikörper für c-jun, jun-B oder c-fos (Oncogene, Santa Cruz, Biotechnology Inc.) wurden in 50 μl/Napf, verdünnt in Blockierpuffer, hinzugefügt. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur wurden Proben entnommen, und anschließend wurden die Näpfe viermal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen. Dann wurden 50 μl Konjugat von sekundärem Antikörper und Phosphatase hinzugefügt und nach 1 h wieder entfernt. Die Näpfe wurden mit Diethanolamin-Puffer (10 mM Diethanolamin, 0,5 mM MgCl₂, pH 9,5) gewaschen. Eine Tablette Sigma-104-Phosphatase-Substrat wurde in 5 ml Diethanolamin-Puffer gelöst. Pro Napf wurden 50 μl der Substratlösung hinzugefügt. Die Reaktion wurde mit 50 μl 0,1 M EDTA (pH 7,5) abgebrochen, und die Platten wurden mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen.
Beispiel 4
Neuronales Überleben
Cerebellen wurden unter sterilen Bedingungen aus den Hirnen von 8 Tage alten Ratten entnommen und 15 min lang bei 20°C in 0,1% Trypsin, 0,1% DNase in phosphatgepufferter Kochsalzlösung/Glucoselösung und anschließend 5 min lang in 1,5% Soja-Trypsin-Inhibitor (Sigma) übergeführt. Zellen wurden in einem Gemisch von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium und Hams F-12-Medium (50%/50%, v/v; DMEM F-12, Gibco), das mit 25 mM KCl, Penicillin (5 E/ml), Gentamycin (5 μg/ml) und 30 mM Glucose ergänzt worden war, dissoziiert. Zellen wurden 3 min lang mit 300 × g zentrifugiert und in demselben Medium, das mit 10% fetalem Kälberserum (Gibco) ergänzt worden war, resuspendiert. Die Zellen wurden in 3-cm-Schalen (0,5 ml pro Napf), die mit Poly-L-lysin (10 g/ml, Sigma) beschichtet waren, bis zu einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/Napf ausgestrichen und in einen Inkubator mit einer angefeuchteten Atmosphäre mit 95% O₂/5% CO₂ übergeführt. Cytosinarabinosid (40 μM) wurde nach 24 h hinzugefügt, um die Proliferation von Gliazellen zu hemmen. Am 16. Tag nach dem Aussäen wurden die Zellen 16 h lang einer Anoxie ausgesetzt, indem man sie in eine hermetische Kammer stellte, die eine angefeuchtete Atmosphäre mit 95% N₂/5% CO₂ enthielt. Die Kammer wurde bei 37°C in einen Inkubator übergeführt. Acht Stunden vor dem Einsetzen der Anoxie wurden Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotide in einer Konzentration von 1 μM hinzugefügt. Die neuronale Zellverletzung wurde 26 h später durch Anfärben mit Trypanblau-Farbstoffausschluss bestimmt (5 min Inkubation mit 0,4% Trypanblau).
Beispiel 5
Proliferation von PC-12-Zellen nach der Behandlung mit NGF und verschiedenen Phosphorothioat-Oligodesoxynucleotiden
PC-12-Zellen wurden in einer Dichte von 2500 Zellen/Napf in DMEM (Seromed), das mit 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 5% FCS/2 μM S-ODN ergänzt worden war, ausgestrichen. Sechs Stunden nach dem Ausstreichen wurden 2 M S-ODNs hinzugefügt. 24 h nach dem Ausstreichen wurden die Zellen 8 Tage lang mit 10 ng/ml der 2,5-5-Unterfraktion des Nervenwachstumsfaktors (NGF) (Boehringer Mannheim) inkubiert. Die Zahl der Zellen wurde bestimmt, indem man Trypanblau-Farbstoffausschluss verwendete (5 min Inkubation mit 0,4% Trypanblau) und die Zellen in einer Neubauer-Zählkammer zählt.
Beispiel 6
PC-12-Tumorzelldifferenzierung
PC-12-Zellen wurden in einer Dichte von 2500 Zellen/Napf (Seromed) in 96-Napf-Mikrotiterplatten, die mit Poly-L-lysin (10 μg/ml, Sigma) beschichtet waren, in 100 μl DMEM, das mit 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 5% FCS ergänzt worden war, ausgestrichen. Zwei Stunden nach dem Ausstreichen wurden S-ODNs in einer Konzentration von 2 μM hinzugefügt. 6 h nach dem Ausstreichen wurden die Zellen 11 Tage lang mit 40 ng/ml der 2,5-5-Unterfraktion des Nervenwachstumsfaktors (NGF) (Boehringer Mannheim) inkubiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antisense-Nucleinsäure oder effektives Derivat davon, die bzw. das in der Lage ist, die Produktion des c-jun-Proteins zu reduzieren oder zu hemmen, umfassend eine der Sequenzen, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 1–21, 23–42, 44–55 und 174–177 identifiziert sind und eine Länge von bis zu 27 Basen haben, oder bestehend aus der SEQ ID Nr. 22 oder 43.
Antisense-Nucleinsäure oder effektives Derivat davon gemäß Anspruch 1, wobei die Antisense-Nucleinsäuren modifizierte Antisense-Nucleinsäuren, wie Phosphorothioat-Derivate, sind.
Antisense-Oligonucleotide gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Modifikationen durch die jeweilige Struktur
gekennzeichnet sind, wobei R¹ = O^–/OH, S^–/SH, CH₃ oder OEt ist; R², R³ kovalent an Cholesterin, Poly(L)lysin, Transferrin gekoppelt sind; R⁴ = N, O^–/OH oder CH₃ ist; B = A, C, G, T oder U ist; und die Struktur als Ausschnitt aus einer längeren Nucleotidkette zu verstehen ist.
Antisense-Oligonucleotide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der Formel
wobei B = Desoxyribonucleotid dA, dC, dG oder dT oder die Ribonucleotide A, C, G und U, je nach der Gensequenz; p = Internucleotidphosphat; (B-p-)_n = ein Stück Oligodesoxyribonucleotid oder Oligoribonucleotid mit einer Länge von 6 bis 20 Basen; und R^1a = S^–/SN; R^1b = O^–/OH; R^1a = CH₃; R^1b = O^–/OH; R^1a = S^–/SH; R^1b = CH₃; R^1a = CH₃; R^1b = S^–/SH.
Antisense-Oligonucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 mit der Formel
wobei B = Desoxyribonucleotid dA, dC, dG oder dT oder die Ribonucleotide A, C, G und U, je nach der Gensequenz; p = Internucleotidphosphat; (B-p-B-p-)_n = ein Stück Oligodesoxyribodinucleotid oder Oligonucleotid mit einer Länge von 4 bis 12 Dinucleotiden; R^1a = S^–/SH; R^1b = O^–/OH; R^1a = CH₃; R^1b = O^–/OH; R^1a = S^–/SH; R^1b = CH₃.
Verfahren zum Synthetisieren der Antisense-Nucleinsäure oder -Oligonucleotide gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 durch Festphasensynthese unter Verwendung von Phosphittriesterchemie durch Verlängerung der Nucleotidkette in 3'→5'-Richtung, wobei das jeweilige Nucleotid an das erste Nucleotid gekoppelt wird, das kovalent an die feste Phase gebunden ist, umfassend die folgenden Schritte: – Abspalten der 5'DMT-Schutzgruppe des vorherigen Nucleotids; – Hinzufügen des jeweiligen Nucleotids für die Kettenverlängerung; – Modifizieren von Phosphitgruppen und anschließendes Verkappen von nicht umgesetzten 5'-Hydroxygruppen; und – Abspalten des Oligonucleotids vom festen Träger; – anschließend Aufarbeiten des Syntheseprodukts.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Antisense-Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Verwendung der Antisense-Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Prävention und/oder Behandlung von neuronalen Verletzungen und neuronaler Degeneration, die mit der Expression von c-jun zusammenhängen.
Verwendung der Antisense-Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Neoplasmen.
Diagnostisches Mittel, das die Antisense-Nucleinsäure der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
Verwendung von Antisense-Nucleinsäuren oder effektiven Derivaten davon, die in der Lage sind, die Produktion des c-jun-Proteins zu reduzieren oder zu hemmen und mit einem Bereich der Messenger-RNA (mRNA) und/oder DNA des c-jun-Gens hybridisieren, zur Herstellung eines Medi kaments für die Prävention oder Behandlung von neuronalen Verletzungen und/oder neuronaler Degeneration und/oder neuronalem Zelltod.
Antisense-Nucleinsäure oder effektive Derivate davon gemäß Anspruch 1, bestehend aus einer der Sequenzen 1 bis 55 und 174 bis 177.