DE60031320T2

DE60031320T2 - Verfahren zur Erfassung von Antisense-Oligonucleotiden und Peptidnucleinsäuren

Info

Publication number: DE60031320T2
Application number: DE60031320T
Authority: DE
Inventors: Gota Hunebashi-shi Kawai; Akira Hukuoka-shi Wada; Hiroshi Hunebashi-shi Takaku
Original assignee: Taiyo Nippon Sanso Corp
Current assignee: Taiyo Nippon Sanso Corp
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2020-04-01
Also published as: US20030104433A1; EP1041145A3; US7038036B2; JP2000290291A; EP1041145B1; US20030073075A1; DE60031320D1; US20060051804A1; EP1041145A2

Description

Diese Anmeldung beansprucht den Prioritätsvorteil der Japanischen Anmeldung Seriennummer 11-094323, eingereicht am 31. März 1999.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Technischer Bereich der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Erfassung von Antisense-Oligonucleotiden und Peptidnucleinsäuren, welche mit stabilen Isotopen markiert sind und fremden Antisense-Ketten.
Hintergrund der Erfindung:
In vergangenen Jahren haben Antisense-Medikamente, die Antisense-Technologie verwenden, Aufmerksamkeit als therapeutische Mittel für Krankheiten wie Krebs, genetische Erkrankungen und AIDS auf sich gezogen. Ein Antisense-Medikament bezieht sich auf ein Oligonucleotid oder dergleichen, das eine komplementäre Sequenz (Antisense) zu einem Teil der Sequenz eines spezifischen Gens, welches eine bestimmte Krankheit verursacht, hat. Wenn es in den Körper (Zielzellen) eingebracht wird, bildet das Antisense-Medikament eine spezifische Doppelstrangkette mit mRNA, welche ein Transskriptionsprodukt des ursächlichen Gens ist, oder einem Vorläufer davon, um Translation oder Verarbeitung der Vorläufer-mRNA zu inhibieren. Demnach kann diese Inhibition den Ausbruch der Krankheit kontrollieren. Die Wirksamkeit der Antisense-Medikamente hängt stark vom Verfahren zum Einbringen der Oligonucleotide an den Zielort ab. Dies liegt daran, dass Nucleasen, die Nucleinsäuren spalten, grundsätzlich im Körper anwesend sind und die eingeführten Oligonucleotide abbauen, bevor sie den Zielort erweichen, was die Bildung der komplementären Doppelstrangketten am Zielort unterbindet, so dass keine Wirkung erzielt wird. Beispielsweise wird eine Nucleinsäure, die von einer Zelle mittels Endozytose aufgenommen wurde in ein Lyosom in der Zelle aufgenommen und dann durch eine Nuclease in dem Lyosom abgebaut. Folglich kann das eingebrachte Oligonucleotid keine Doppelstrangkette mit dem Zieltransskriptionsprodukt im Kern oder Cytoplasma bilden, was zu keine Wirkung führt. Ein Beispiel eines brauchbaren Einbringungsverfahrens, um dieses Problem zu lösen, ist die Verwendung von intrazellularen Leitagenzien, typischerweise vertreten durch ein Liposomenpräparat, welche einen gewissen Erfolgsgrad geboten hat.
Ein anderer Ansatz zum Verbessern der Wirkung von Antisense-Medikamenten beinhaltet Steigern der Stabilität der Antisense-Ketten durch Modifizierung der Nucleotide, der strukturellen Einheiten der Oligonucleotide, zu unnatürlichen modifizierten Nucleotiden, welche weniger empfindlich gegenüber dem Abbau durch Nucleasen sind.
Bei der Entwicklung therapeutischer Medikamente, werden pharmakokinetische Tests auf Aufnahme, Verstoffwechselung und Ausscheidung der Medikamente durchgeführt. Bei pharmakokinetischen Tests werden zu testende Substanzen (Medikamente) mit radioaktiven Isotopen oder dergleichen markiert und Versuchstieren verabreicht und die Konzentration und Radioaktivität der Medikamente werden mit dem Lauf der Zeit quantitativ gemessen. Antisense-Medikamente bilden keine Ausnahme und Antisense-Oligonucleotide, die mit radioaktiven Isotopen oder dergleichen markiert sind, werden pharmakokinetischen Tests unterworfen.
Bei der Verwendung von Antisense-Medikamenten müssen Sequenz und Länge der Nucleotide in Körperzellen beibehalten werden, um sie vollständig zur Wirkung zu bringen. Allerdings stellen gebräuchliche pharmakokinetische Tests, welche Radioisotope oder dergleichen verwenden, Informationen über die Verteilung im Körper, die Aufnahmerate und Ausscheidungsrate der Oligonucleotide, aber nicht über die Beibehaltung ihrer Sequenz und Länge, zur Verfügung. Entsprechend muss der Erhaltungszustand von Oligonucleotiden durch Extrahieren einer Nucleinsäurefraktion aus Blut, Organen oder dergleichen, die den Versuchstieren entnommen wurden, um Oligonucleotide in der Fraktion durch Hochdruckflüssigchromatographie, Southern Blotting, Northern Blotting, Kapillarelektrophorese oder dergleichen zu analysieren, bestätigt werden. Ferner war es praktisch unmöglich, die Änderung in der Länge der verabreichten Antisense-Nucleotide mit dem Lauf der Zeit (dem Fortschritt des Abbaus) zu sehen. Ferner gibt es kein Mittel zu bestätigen, ob die Ziel-mRNA oder Vorläufer-mRNA und das, in Zellen eingeführte, Oligonucleotid komplementäre Doppelstrangketten bilden. Außerdem kann die Wirksamkeit der Einführung des Oligonucleotids nur cytologisch, basierend auf physiologischen oder morphologischen Änderungen der Zellen, in welche das Oligonucleotid eingeführt wird, beurteilt werden. Ferner ist die Verwendung von Radioisotopen in gebräuchlichen pharmakokinetischen Tests unvermeidbar, was eine spezielle Anlage, gemäß spezifischen Vorschriften und gut ausgebildete Techniker notwendig macht.
„Comparative Pharmacokinetics, Tissue Distribution, and Tumor Accumulation of Phosphothioate, Phosphodithioate, and Methylphosphonate Oligonucleotides in Nude Mice" (DeLong, R. K. et. al., ANTISENSE & NUCLEIC ACID DRUG DEVELOPMENT ; Vol. 7, 1997, Seiten 71–77) offenbart ein Antisense-Oligomer umfassend, das mit mindestens einem Schwefelatom oder einer Methylgruppe modifizierte Phosphat, d.h. Phosphorthioat, Phosphordithioat oder Methylphosphonat, 15 Basen und ein radioaktives Isotop ¹⁴C. Dieses Antisense-Oligomer besitzt die Fähigkeit zur Bildung, eines Doppelstranges mit einer gewünschten Zielsequenz. Zudem kann die Anwesenheit des Antisense-Oligomers durch Messen des ¹⁴C, mit dem es markiert ist, mittels eines Szintillationszählers, bestätigt werden. Allerdings offenbaren R. K. DeLong et. al. nur die Verwendung des radioaktiven Isotops ¹⁴C, welches Isotop sowohl eine geradzahlige Massenzahl, als auch eine geradzahlige Kernladungszahl besitzt und demnach nicht als ein Marker angesehen werden sollte, der für NMR-Spektroskopie geeignet ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wurde unter Berücksichtigung des oben erwähnten Problems gemacht und eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Antisense-Oligonucleotidsequenzen und Antisense-Peptidnucleinsäuresequenzen, die mit stabilen Isotopen markiert sind, was die Messung der Verteilung, des Erhaltungszustandes und der Struktur von Antisense-Oligonucleotidmedikamenten im Körper mit dem Lauf der Zeit ermöglicht, und ein Verfahren zur Erfassung dieser Sequenzen zur Verfügung zu stellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Proben 1–4.
2 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren austauschbarer Protonen für Proben 1–4.
3 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 1.
4 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren austauschbarer Protonen für Probe 1.
5 zeigt 500 MHz ¹³C-¹H-HMQC Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 1.
6 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 2.
7 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren austauschbarer Protonen für Probe 2.
8 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 3.
9 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren austauschbarer Protonen für Probe 3.
10 zeigt 500 MHz ¹³C-¹H-HMQC Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 3.
11 zeigt 500 MHz ¹⁵N-¹H-HMQC Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 3.
12 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 4.
13 zeigt 500 MHz ¹H-NMR Spektren austauschbarer Protonen für Probe 4.
14 zeigt 500 MHz ¹³C-¹H-HMQC Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 4.
15 zeigt 500 MHz ¹⁵N-¹H-HMQC Spektren nichtaustauschbarer Protonen für Probe 4.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Um das oben erwähnte Problem zu lösen und das oben erwähnte Ziel zu erreichen, ist die Erfindung wie folgt ausgeführt. Und zwar sind eine Antisense-Oligonucleotidsequenz und Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung Einzelstrang-RNAs oder Einzelstrang- oder Doppelstrang-DNAs, die mindestens ein Nucleotid oder eine Peptidnucleinsäure als Struktureinheit enthalten, bei der mindestens ein strukturelles C-Atom durch ¹³C substituiert ist und mindestens ein strukturelles N-Atom durch ¹⁵N substituiert ist, aufweisend 10 bis 100 Basen, die komplementär zu der gewünschten zu hybridisierenden Zielsequenz sind. In diesen Antisense-Oligonucleotidsequenzen und Antisense-Peptidnucleinsäuresequenzen ist das Oligonucleotid

1) ein natürliches Oligonucleotid, wobei 3'-OH und 5'-OH der Ribose oder Deoxyribose über Phosphodiesterbindungen vernetzt sind,
2) ein Phosphorothioat-Oligonucleotid, wobei ein oder zwei nicht vernetzte Sauerstoffatome in den Phosphodiesterbindungen in dem natürlichen Oligonucleotid durch Schwefelatome substituiert sind, oder
3) ein Methylphosphonat-Oligonucleotid, wobei Sauerstoffatome in den Hydroxylgruppen in den Phosphodiesterbindungen in dem Oligonucleotid der natürlichen Art durch Methylgruppen substituiert sind, und

In einer Antisense-Oligonucleotidsequenz und einer Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass in allen strukturellen Einheiten, d.h. Nucleotiden und Peptidnucleinsäuren, alle Kohlenstoffatome durch ¹³C substituiert sind und alle Stickstofatome durch ¹⁵N substituiert sind.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst die oben erwähnte Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Ein Verfahren zum Erfassen einer Antisense-Oligonucleotidsequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Oligonucleotidsequenz bestehen, oder eine Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz bestehen, umfasst
einen Schritt des Messens des Antisense-Oligonucleotids oder der Antisense-Peptidnucleinsäure, die von einem Probenmaterial stammen, durch Kernresonanzspektrometrie bzw. -spektroskopie,
wobei das Probenmaterial mindestens ein zu messendes Material ist, d.h. Blut, Gewebe, Organe, Körperflüssigkeiten, Zellen oder Ausscheidungen, genommen von einem Versuchstier, dem eine Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, oder
wobei das Probenmaterial, das durch Probenehmen von Versuchskulturzellen erhalten wurde, denen eine Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, und
wobei die Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz die oben genannte Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung ist.
In einer Antisense-Oligonucleotidsequenz und einer Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung, ist es bevorzugt, dass in jeder Struktureinheit, d.h. Nucleotid oder Peptidnucleinsäure mehr als 90 % der Kohlenstoffatome durch ¹³C substituiert sind und mehr als 90 % der Stickstoffatome durch ¹⁵N substituiert sind.
Ein Verfahren zum Erfassen einer Antisense-Oligonucleotidsequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Oligonucleotidsequenz bestehen, oder einer Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz bestehen, umfassent
einen Schritt des Messens des Antisense-Oligonucleotids oder der Antisense-Peptidnucleinsäure, die von einem Probenmaterial stammen, durch Kernresonanzspektrometrie,
wobei das Probenmaterial mindestens ein zu messendes Material ist, d.h. Blut, Gewebe, Organe, Körperflüssigkeiten, Zellen oder Ausscheidungen, genommen von einem Versuchstier, dem eine Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, oder
wobei das Probenmaterial, das durch Probenehmen von Versuchskulturzellen erhalten wurde, denen eine Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, und
wobei die Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz die oben genannte Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung ist, und es bevorzugt ist, dass in jeder Struktureinheit, d.h. Nucleotid oder Peptidnucleinsäure mehr als 90 % der Kohlenstoffatome durch ¹³C substituiert sind und mehr als 90 % der Stickstoffatome durch ¹⁵N substituiert sind.
Eine Antisense-Oligonucleotidsequenz und Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung sind im Folgenden beschrieben.
Die Nucleotidsequenz und Peptidnucleinsäure (auf die in Folgenden gelegentlich als eine Antisense-Kette in dieser Erfindung Bezug genommen wird), die strukturelle Einheit jeweils einer Antisense-Oligonucleotidsequenz und Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung, ist ein natürliches Nucleotid oder ein unnatürliches Nucleotid oder eine Peptidnucleinsäure. Beispiele eines natürlichen Nucleotides umfassen Purin-Nucleotide, wie beispielsweise Adenosin- und Guanosin-Nucleotide, und Pyrimidin-Nucleotide, wie beispielsweise Thymidin-, Uridin- und Cytidin-Nucleotide. Beispiele unnatürlicher Nucleotide umfassen Phosphorothioat-Nucleotide, in welchen ein oder zwei Sauerstoffatome der Phosphorylgruppe durch Schwefelatome substituiert sind, und Methylphosphonat-Nucleotide, in welchen ein Sauerstoffatom einer Hyroxylgruppe in der Phosphorylgruppe durch eine Methylgruppe substituiert ist, und Peptidnucleinsäuren, künstliche Nucleotide, in welchen eine Base in ein 2-Aminoethyl-glycin-Gerüst eingeführt ist.
Ferner ist in diesen Struktureinheiten zumindest ein Kohlenstoffatom, ein strukturelles Atom, durch ¹³C substituiert, und zumindest ein Stickstoffatom, ein strukturelles Atom, ist durch ¹⁵N-substituiert. Durch Substituieren von Kohlenstoffatomen in einer Antisense-Kette kann die Anwesenheit der Antisense-Kette in einem zu vermessenden Material durch Kernresonanzspektrometrie, wie beispielsweise ¹³C-¹H-Heterokernmultiquantenkoherenz-Spektrometrie (im Folgenden als HMQC-Verfahren bezeichnet) und ¹³C-¹H-Heterokerneinzelquantenkoherenzspektrometrie (im Folgenden als HSQC-Verfahren bezeichnet). Ferner kann, durch Substituieren von Stickstoffatomen in einer Antisense-Kette, durch Kernresonanzspektrometrie, wie beispielsweise durch das ¹⁵N-¹H-HMQC-Verfahren und das ¹⁵N-¹H-HSQC-Verfahren, bestätigt werden, ob die Antisense-Kette Basenpaare gebildet hat.
Ein Ziel einer Antisense-Kette der vorliegenden Erfindung ist eine bekannte Sequenz und kann, abhängig vom Zweck, entsprechend ausgewählt werden. Unter Berücksichtigung der besten Ausgewogenheit zwischen Kosten für die Synthese der Antisense-Kette und der Fähigkeit zur stabilen Hybridisierung mit der Zielsequenz, beträgt die Länge der Antisense-Kette bevorzugt 10 bis 100 Basen, besonders bevorzugt 15 bis 50 Basen. Wenn die Länge der Antisense-Kette weniger als 10 Basen beträgt, ist stabile Hybridisierung mit der Zielsequenz in vitro ziemlich schwierig. Wenn die Länge der Antisense-Kette andererseits mehr als 100 Basen beträgt, kostet die Synthese der Antisense-Kette, die stabile Isotope enthält, sehr viel, was nicht bevorzugt ist. Eine Antisense-Kette der vorliegenden Erfindung wird unter Verwendung einer Sequenz synthetisiert, in welcher Kohlenstoffatome und Stickstoffatome der strukturellen Einheit, d.h. eines Nucleotides oder einer Peptidnucleinsäure, gemäß einem dem Fachmann bekannten Verfahren, durch konzentriertes ¹³C und ¹⁵N substituiert sind. Die in der Synthese verwendete strukturelle Einheit ist beispielsweise von der Nippon Sanso Corporation erhältlich und ein Verfahren zu ihrer Synthese ist detailliert in der Japanischen Patentanmeldung, Offenlegungsnummer Hei 6-319581 und der Japanischen Patentanmeldung, Offenlegungsnummer Hei 7-115987 beschrieben. Dementsprechend enthält eine, gemäß diesem Verfahren synthetisierte, Antisense-Kette der vorliegenden Erfindung, ¹³C und ¹⁵N in einem höheren Anteil als die entsprechende natürliche Kette. Es ist bevorzugt, dass mehr als 90 % der Kohlenstoffatome und Stickstoffatome in dem Molekül durch ¹³C und ¹⁵N substituiert sind.
In der Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequen ist es bevorzugt, dass strukturelle Atome, d.h. Kohlenstoffatome und Stickstoffatome in jeder Struktureinheit (Nucleotid oder Peptidnucleinsäure) durch ¹³C oder ¹⁵N substituiert sind. Durch Substitution aller Kohlenstoffatome durch ¹³C können sich aus einer ¹³C-markierten Antisense-Kette ergebende Signale selektiv erfasst werden, ohne viele andere Substanzen, in denen strukturelle Kohlenstoffatome ¹²C sind, zu erfassen. Andererseits können durch Substituieren aller Stickstoffatome durch ¹⁵N können sich aus einer ¹⁵N-markierten Antisense-Kette ergebende Signale selektiv erfasst werden, ohne viele andere Substanzen, in denen strukturelle Stickstoffatome ¹⁴N sind, zu erfassen. Ferner kann, wenn mit ¹⁵N markiert, ein Imminogruppen-Proton für jedes Basenpaar erfasst und unterschieden werden, was Informationen über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen jedem Basenpaar zur Verfügung stellen kann (Sekundärstruktur).
Ein Verfahren zum Erfassen einer Antisense-Kette der vorliegenden Erfindung wird im Folgenden beschrieben werden.
Zuerst wird von zumindest einem zu vermessenden Material, d.h. Blut, Gewebe, Organe, Körperflüssigkeiten, Zellen oder Ausscheidungen, von einem Versuchstier genommen, dem eine isotopenmarkierte Antisense-Oligonucleotidsequenz oder Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, oder von Versuchskulturzellen denen die selbe Sequenz appliziert wurde. Ein Verfahren zum Applizieren der Antisense-Kette an Versuchstieren oder Versuchskulturzellen ist nicht besonders eingeschränkt und verschiedene intrazellulare Leitagenzien, wie beispielsweise Liposome, beispielsweise Lipofectin und verschiedene Medikamentenzuführungssysteme, wie beispielsweise ein System, das eine Histon-Untereinheit verwendet, können verwendet werden. Die zu applizierende Antisense-Kette ist nicht auf die isotopenmarkierte Antisense-Oligonucleotidsequenz und Antisense-Peptidnucleinsäuresequenz beschränkt, und Zusammensetzungen, welche diese Sequenzen und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfassen, können verwendet werden. Beispiele eines pharmazeutisch geeigneten Trägers umfassen Liposome, wie beispielsweise Lipofectin und nucleotidbindende Proteine, wie beispielsweise Histon-Protein.
Der Zeitpunkt des Probennehmens des zu vermessenden Materials vom Versuchstier oder den Versuchskuturzellen wird abhängig vom Zweck bestimmt. Und zwar kann die Probennahme sofort nach der Applikation der Antisense-Kette durchgeführt werden oder ungefähr einige bis 10 Tage nach der Applikation, unter Berücksichtigung der benötigten Zeit, um die Antisense-Kette vom Liposom oder dergleichen in die Zellen freizusetzen.
Das zu vermessende Material wird dann mittels Kernresonanzspektrometrie vermessen. In einigen Fällen wird eine geeignete Vorbehandlung durchgeführt. Wenn das zu vermessende Material beispielsweise eine Flüssigkeit ist, wie beispielsweise Blut oder eine Körperflüssigkeit, ist es bevorzugt, die Kernresonanzspektrometrie nach Entfernen von Feststoffen durch Zentrifugieren durchzuführen. Wenn das zu vermessende Material ein Feststoff ist, wie beispielsweise Gewebe oder Zellen, ist es vor dem Vermessen mittels Kernresonanzsspektrometrie notwendig, das Gewebe und die Zellen in einer Pufferlösung zu homogenisieren, in welcher pH, Salzkonzentration und dergleichen angepasst sind, um die Nucleinsäurekomponente zu extrahieren. Die Pufferlösung und Bedingungen für die Homogenisierung können, abhängig vom zu vermessenden Material, von einem Fachmann entsprechend bestimmt werden.
Bei der Vermessung mittels Kernresonanzspektrometrie ist es bevorzugt, dass die Konzentration der zu vermessenden Antisense-Kette 0,1 mM bis 10 mM beträgt, und dass die Konzentration vor der Messung entsprechend angepasst wird. Etwa 5 bis 10 % schweres Wasser muss dem vorbehandelten Material zugesetzt werden, um für das lock-Signal gemessen zu werden.
Kernresonanzspektrometrie wird vorzugsweise durch die eindimensionale oder zweidimensionale Messung unter Verwendung von entweder HMQC-Verfahren oder HSQC-Verfahren für ¹⁵N-¹H und ¹³C-¹H durchgeführt. In diesem Fall ist es besonders bevorzugt, Koheränzauswahl durch das Pulsfeldgradientenverfahren (PFG) durchzuführen oder Lösungsmittelsignale zu entfernen.
Messen von ¹³C-¹H durch HMQC-Verfahren oder HSQC-Verfahren gibt an, ob die Antisense-Kette im vermessenen Material enthalten ist, und, wenn enthalten, kann die Konzentration bestimmt werden. Messen von ¹⁵N-¹H durch HMQC-Verfahren oder HSQC-Verfahren gibt an, ob im vermessenen Material Basenpaare gebildet wurden. Bei Verwendung dieser Verfahren werden ein zuvor gemessenes Spektrum der Gesamtlängen-Antisense-Kette und ein Spektrum der Antisense-Kette im, vom Versuchstier genommenen, Material verglichen, um zu analysieren, ob die vermessene Antisense-Kette durch Abbau verkürzt wurde, oder über ihre gesamte Länge erhalten geblieben ist. Ferner werden ein zuvor gemessenes Spektrum einer Doppelstrangkette der Geamtlängen-Antisense-Kette mit einer Zielsequenz, die in vitro gebildet wird und ein Spektrum der Antisense-Kette im, vom Versuchstier genommenen, Material verglichen, um zu bestimmen, ob die vermessene Antisense-Kette eine Doppelstrangkette mit der Zielsequenz bildet. Ferner kann die Kombination mit einer quantitativen Analyse die Analyse vorteilhafterweise empfindlicher machen.
In der vorliegenden Erfindung kann Kernspintomographie anstelle der oben erwähnten Kernresonanzspektrometrie verwendet werden. Nach Applikation wird das Versuchskulturzellen-Konjugat einem Kernspintomographen zur Messung ohne die Isolation des zu vermessenden Materials vom Versuchstier oder jeder Vorbehandlung ausgesetzt.
Eine Antisense-Kette und ein Verfahren zum Erfassen der Antisense-Kette kann, neben dem oben erähnten pharmakokinetischen Test, auf verschiedenen Wegen verwendet werden. Beispiele anderer Anwendungen umfassen die Diagnose und Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise Krebs, genetische Erkrankungen, AIDS und Grippe und die Beurteilung neuer intrazellularer Leitagenzien und Medikamentenzuführungssysteme.
Wenn zur Diagnose von Krankheiten verwandt, kann das Erfassungsverfahren der vorliegenden Erfindung in derselben Weise durchgeführt werden, wie bei pharmakokinetischen Tests. Kernresonanzspektrometrie kann in Fällen, in denen die Diagnose unter Verwendung von Probezellen oder Blut, das dem Körper entnommen werden kann, durchgeführt wird, verwendet werden, um zu messen, ob die Antisense-Kette in Zellen oder Blut eine Doppelstrangkette mit einer Zielsequenz bildet. Kernspintomographie kann in Fällen, in denen die Diagnose unter Verwendung von Gewebe oder Organen, die nicht operativ aus dem Körper entfernt werden können, durchgeführt wird, verwendet werden, um zu messen, ob die Antisense-Kette in Gewebe oder Organen einen Doppelstrang mit einer Zielsequenz bildet.
Zur Behandlung der oben erwähnten Krankheiten kann eine Antisense-Kette der vorliegenden Erfindung entsprechend verwendet werden, um durch Kernresonanzspektrometrie oder Kernspintomographie zu bestätigen, ob die Behandlung wirksam ist oder nicht. Entsprechend kann die vorliegende Erfindung bei der Behandlung von Krankheiten verwendet werden und ist zur Bestimmung der Menge und des Intervalls der Applikation des Antisense-Medikaments an Patienten brauchbar.
Bei der Entwicklung eines neuen intrazellularen Leitagens oder Medikamentenzuführungssystems ist eine Beurteilung seiner Wirksamkeit notwendig. Die Wirksamkeit der Medikamenteneinführung kann mit dem Erfassungsverfahren der vorliegenden Erfindung, unter Verwendung einer Antisense-Kette der vorliegenden Erfindung, beurteilt werden.
BEISPIELE
Ein Experiment wurde durchgeführt, um zu bestätigen, ob eine mit stabilen Isotopen markierte RNA durch NMR erfassbar war, wenn die RNA Mäusen appliziert wurde.
Materialien
Vier weibliche SPFNAF Mäuse (BALBcAnNCr, 8 Wochen alt, Nr. 1 bis Nr. 4), bereitgestellt von Charles Rive Japan, Inc. wurden für das Experiment verwendet.
Ein, mit ¹³C und ¹⁵N markiertes, Nucleotid wurde mittels des Verfahrens, dass in der Japanischen Patentanmeldung, Offenlegungsnummer Hei 6-319581 und der Japanischen Patentanmeldung, Offenlegungsnummer Hei 7-115987 beschrieben ist synthetisiert. Eine Übersicht dieses Syntheseverfahrens wird im Folgenden beschrieben werden.
Zuerst wurde eine Kultur von Hefezellen von Candida utilis IFO-0369 in einem anorganischen Medium, unter Verwendung von ¹³C-markierter Essigsäure (¹³CH₃ ¹³COOH) als eine Kohlenstoffquelle und ¹⁵N-markiertem Ammoniumchlorid (¹⁵NH₄Cl) als eine Stickstoffquelle, angelegt und dann abgeerntet. Zellwände wurden durch ein zellwandauflösendes Enzym, Zymolyase (Kirin Breweries Ltd.) abgebaut, wonach der, durch Zentrifugieren erhaltene, Überstand erneut zentrifugiert wurde (100.000 g × 3 h), um eine Ribosomenfraktion als Niederschlag zu erhalten. Dann wurde diese Ribosomenfraktion mit einer äquivalenten Menge einer wässrgen gesättigten Phenollösung versetzt, um Proteine zu entfernen, und dann wurde Ethanol zugegeben, um eine ¹³C- und ¹⁵N-markierte RNA auszufällen.
Der Niederschlag wurde mit Ethanol gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um ¹³C- und ¹⁵N-markierte RNA von mehr als 90% Reinheit zu erhalten. Diese RNA wurde zu Ribonucleotid-5'-phosphaten unter Verwendung von Nuclease P1 (Yamasa Shoyu Co.) abgebaut und dann wurden die Ribonucleotid-5'-phosphate mit einer Anionenaustauscher-Säule AG1X8 Ameisensäuretyp (BioRad) fraktioniert, um AMP, CMP, UMP und GMP zu erhalten.
Als nächstes wurden, gemäß dem Verfahren von Whitesides et. al. (J. Org. Chem. 55, 1834-1841, 1990), zwei Phosphatgruppen enzymatisch, unter Verwendung von Phosphoenolpyruvinsäure als Phosphatdonator, an jedes der oben erwähnten AMP, CMP, UMP und GMP addiert, um mit ¹³C und ¹⁵N markierte Ribonucleotid-5'-triphosphate zu erhalten.
Das 43 Basen umfassende Oligonucleotid, welches in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, wurde, unter Verwendung des oben erwähnten, mit ¹³C und ¹⁵N markierten, Ribonucleotid-5'-triphosphates als Substrat, synthetisiert. Die Synthese wurde unter Verwendung einer synthetisierten DNA (ein Produkt von Hokkaido System Science; durch HPLC aufgereinigt) als Templat und T7RNA-Polymerase (Air Brown) durchgeführt. Nach der Synthese wurde die Reaktionslösung zur Aufreinigung Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen und die erhaltene Zielbande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, aus dem RNA extrahiert wurde. Die extrahierte RNA wurde zweimal mit Ethanol gefällt um Salze zu entfernen und die mit ¹³C und ¹⁵N markierte RNA wurde erhalten.
Eine Mischung von Histon-Untereinheiten H2A, H2B, H3 und H4 (Boehringer Mannheim GmbH) wurde als Medikamentenzuführungssystem verwendet.
Experimentelles Verfahren
Die oben erwähnten Oligonucleotide (6 mg) wurden in 120 μL einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst um vier 30 μL Proben herzustellen. Zwei Proben wurden ohne Medikamentenzuführungssystem appliziert. Die oben erwähnte Histon-Untereinheitenmischung wurde zu den verbleibenden zwei Proben gegeben um einen Komplex zu bilden.

Probe 1: ¹³C-¹⁵N-markierte RNA (eingeimpft in und als Probe genommen von Maus Nr. 1)
Probe 2: ¹²C-¹⁵N-markierte RNA (eingeimpft in und als Probe genommen von Maus Nr. 2)
Probe 3: Der Komlex der ¹³C-¹⁵N-markierten RNA und des Medikamentenzuführungssystems (eingeimpft in und als Probe genommen von Maus Nr. 3)
Probe 4: Der Komlex der ¹²C-¹⁵N-markierten RNA und des Medikamentenzuführungssystems (eingeimpft in und als Probe genommen von Maus Nr. 4)

Jede Probelösung (100 μL), welche auf 62,5 mg/kg eingestellt war, wurde in den Schwanz der oben erwähnten Mäuse eingeimpft. Drei Stunden nach der Einimpfung wurden die Mäuse mit Ether betäubt und ungefähr 1 mL Vollblut wurde aus dem Herzen entnommen. Diesem Vollblut wurde gestattet bei Raumtemperatur für 30 Minuten zu stehen, und dann wurde es bei 1.500 rpm bei Raumtemperatur für 15 Minuten zentrifugiert. Das, durch die Zentrifugation erhaltene, überstehende Serum wurde wie folgt NMR-Messung unterworfen.
Schweres Wasser (20 μL) wurde zu den, durch oben erwähnte Zentrifugation erhaltenen, Proben (400 μL) gegeben und die Messung von NMR-Spektren wurde bei 25°C durchgeführt. Für die Messung wurde ein DRX-500NMR Spektrometer (BRUKER) verwendet. Vorsättigung wurde für die Messung nicht austauschbarer Protonen durchgeführt und jump-and-return Pulse wurde für die Messung austauschbarer Iminioprotonenspektren verwendet.
Ergebnisse der Messungen
1 bis 15 zeigen Ergebnisse der Messungen. Die stabilen isotopenmarkierten Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung wurden in allen Fällen, in denen kein Komplex mit dem Medikamentenzuführungssystem gebildet wurde, kaum erfasst, während die gesamte Länge des Oligonucleotids erfasst wurde, wenn ein Komplex mit dem Medikamentenzuführungssystem gebildet wurde. Details werden unter Bezug auf die Zeichnungen erklärt werden.
Beurteilung
1 zeigt die Spektren von nicht austauschbaren Protonen für Proben 1 bis 4 gemessen bei 500 MHz-¹H. Markierungen 1 bis 4 kennzeichnen jeweils Probe 1 bis 4. Von Nucleinsäurebasen stammende Signale wurden hauptsächlich in dem Bereich von 9 bis 6,5 ppm beobachtet. Ein genauerer Blick auf diesen Bereich zeigt, dass nur sehr schwache Signale für Proben 1 und 2 erfasst wurden, welche ohne das Medikamentenzuführungssystem appliziert wurden. Andererseits wurden für Proben 3 und 4, welche mit dem Medikamentenzuführungssystem appliziert wurden, in diesem Bereich markante Signale erfasst. Folglich ist es offensichtlich, dass die Antisense-Kette für bis zu 3 Stunden im Blut vorlag, wenn das Medikamentenzuführungssystem verwendet wurde.
2 zeigt die Spektren von austauschbaren Protonen (Immino-Protonen) für Proben 1 bis 4 gemessen bei 500 MHz-¹H. Markierungen 1 bis 4 kennzeichnen jeweils Probe 1 bis 4. Von Basenpaaren stammende Signale, die durch Bildung einer Sekundärstruktur stabilisiert wurden, wurden in dem , in dieser Figur gezeigten Bereich beobachtet. Absolut kein Signal wurde für Proben 1 und 2 erfasst, aber ein Satz starker, scharfer Signale wurde für Proben 3 und 4 beobachtet. Folglich legen diese Ergebnisse nahe, dass die, im Blut anwesende, RNA keinem teilweisen Abbau unterliegt, wenn das Medikamentenzuführungssystem verwendet wurde. Solche scharfen Signale wären nicht beobachtet worden und die Spektren sollten komplexer gewesen sein, wenn die RNA teilweisem Abbau unterlegen hätte.
3, 6, 8 und 12 zeigen die 500 MHz ¹H-NMR-Spektren nicht austauschbarer Protonen für Proben 1 bis 4. Vergleich dieser Spektren zeigt, dass RNA für Proben 1 und 2 kaum erfasst wurde, aber für Proben 3 und 4 klar erfasst wurde. Vergleich von oberem und unterem Teil von 3 und 4 zeigt, dass das Spektrum im Bereich zwischen 9 und 6,5 ppm durch Entkoppelung geändert wurde, was anzeigt, dass die Signale in diesem Bereich von markierter RNA stammen. Ferner wurden die Signale, die bei 8,4 ppm in 8 und 12 beobachtet wurden, durch Entkoppelung nicht geändert, was nahe legt, dass die Signale vom Medikamentenzuführungssystem stammen.
4, 7, 9 und 13 zeigen die 500 MHz ¹H-NMR-Spektra austauschbarer Protonen für Proben 1 bis 4. Vergleich dieser Spektren zeigt, dass die RNA für Proben 1 und 2 kaum erfasst wurde, aber für Proben 3 und 4 klar erfasst wurde. Vergleich von oberem und unterem Teil von 9 und 13 zeigt, dass das gesamte Spektrum in diesem Bereich durch Entkoppelung geändert wurde, was zeigt, dass die Signale in diesem Bereich von markierter RNA stammen.
5 ,10 und 14 zeigen die ¹³C-¹H-HMQC-Spektren von nicht austauschbaren Protonen für Proben 1, 3 und 4. Die vertikale Achse ist die ¹³C chemische Verschiebung und die horizontale Achse ist die ¹H chemische Verschiebung. Nur Rauschen und kein von RNA stammendes Spektrum wurde für Probe 1 beobachtet. Andererseits zeigen Spektren für die Proben 3 und 4 typische RNA Muster.
11 und 15 zeigen die ¹⁵N-¹H-HMQC-Spektren von nicht austauschbaren Protonen für Proben 3 und 4. Die vertikale Achse ist die ¹⁵N chemische Verschiebung und die horizontale Achse ist die ¹H chemische Verschiebung. Diese Figuren zeigen, dass die vermessene RNA chemisch und strukturell homogen war.
Wirksamkeit der Erfindung
Da die Antisense-Kette der vorliegenden Erfindung ein natürliches oder unnatürliches Nucleotid oder Peptidnucleinsäure als strukturelle Einheit besitzt und Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome durch stabile Isotope, d.h. ¹³C oder ¹⁵N, substituiert sind, kann die Antisense-Kette quantitativ, mit dem Lauf der Zeit, durch Kernresonanzspektrometrie, wie beispielsweise ¹⁵N-¹H- und ¹³C-¹H-Heterokernmultiquantenkoherensspektrommetrie oder Kernspintomographie, gemäß des Erfassungsverfahrens der vorliegenden Erfindung, gemessen werden, und die Bildung von Doppelstrangketten kann auch erfasst werden. Ferner kann die Verteilung der Antisense-Kette in dem Körper oder dergleichen, mit dem Lauf der Zeit analysiert werden, ohne dem Versuchstier ein Material entnehmen zu müssen.

Claims

Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz, umfassend eine Einzelstrang-RNA oder Einzelstrang- oder Doppelstrang-DNA, die mindestens ein Nukleotid oder eine Peptidnukleinsäure als Struktureinheit enthält, bei der mindestens ein strukturelles C-Atom durch ¹³C substituiert ist und mindestens ein strukturelles N-Atom durch ¹⁵N substituiert ist, aufweisend 10 bis 100 Basen, die komplementär zu der gewünschten zu hybridisierenden Zielsequenz sind, wobei das Oligonukleotid 1) ein natürliches Oligonukleotid ist, wobei 3'-OH und 5'-OH der Ribose oder Deoxyribose über Phosphodiesterbindungen vernetzt sind, 2) ein Phosphorothioat-Oligonukleotid ist, wobei ein oder zwei nicht vernetzte Sauerstoffatome in den Phosphodiesterbindungen in dem natürlichen Oligonukleotid durch Schwefelatome substituiert sind, oder 3) ein Methylphosphonat-Oligonukleotid ist, wobei Sauerstoffatome in den Hydroxylgruppen in den Phosphodiesterbindungen in dem Oligonukleotid der natürlichen Art durch Methylgruppen substituiert sind, und wobei die Peptidnukleinsäure Basen aufweist, d. h. Purin oder Pyrimidin, und wobei die Basen miteinander über Peptidbindungen verbunden sind, um ein 2-Aminoethylglycin-Rückgrat zu bilden.
Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei in jeder Struktureinheit, d. h. Nukleotid oder Peptidnukleinsäure, alle Kohlenstoffatome durch ¹³C substituiert sind und alle Stickstoffatome durch ¹⁵N substituiert sind.
Zusammensetzung, umfassend die Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Zusammensetzung, umfassend die Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz aus Anspruch 2 und einen pharmazeutisch geeigneten Träger.
Verfahren zum Erfassen einer Antisense-Oligonukleotidsequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense- Oligonukleotidsequenz bestehen, oder eine Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz bestehen, umfassend einen Schritt des Messens des Antisense-Oligonukleotids oder der Antisense-Peptidnukleinsäure, die von einem Probenmaterial stammen, durch Kernspinresonanzspektrometrie, wobei das Probenmaterial mindestens ein zu messendes Material ist, d. h. Blut, Gewebe, Organe, Körperflüssigkeiten, Zellen oder Ausscheidungen, genommen von einem Versuchstier, dem eine Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, oder wobei das Probenmaterial, das durch Probenehmen von Versuchskulturzellen erhalten wurde, denen eine Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, und wobei die Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz die oben genannte Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 ist.
Verfahren zum Erfassen einer Antisense-Oligonukleotidsequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Oligonukleotidsequenz bestehen, oder einer Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz bestehen, umfassend einen Schritt des Messens des Antisense-Oligonukleotids oder der Antisense-Peptidnukleinsäure, die von einem Probenmaterial stammen, durch Kernspinresonanzspektrometrie, wobei das Probenmaterial mindestens ein zu messendes Material ist, d. h. Blut, Gewebe, Organe, Körperflüssigkeiten, Zellen oder Ausscheidungen, genommen von einem Versuchstier, dem eine Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, oder wobei das Probenmaterial, das durch Probenehmen von Versuchskulturzellen erhalten wurde, denen eine Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, und wobei die Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz die oben genannte Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 2 ist.
Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei in jeder Struktureinheit, d. h. Nukleotid oder Peptidnukleinsäure mehr als 90 % der Kohlenstoffatome durch ¹³C substituiert sind und mehr als 90 % der Stickstoffatome durch ¹⁵N substituiert sind.
Verfahren zum Erfassen einer Antisense-Oligonukleotidsequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Oligonukleotidsequenz bestehen, oder einer Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz, die stabile Isotope enthält, oder deren Zersetzungsprodukte, die aus einem Teil der Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz bestehen, umfassend einen Schritt des Messens des Antisense-Oligonukleotid oder der Antisense-Peptidnukleinsäure, die von dem Probenmaterial stammt, durch Kernspinresonanzspektrometrie, wobei das Probenmaterial mindestens ein zu messendes Material ist, d. h. Blut, Gewebe, Organe, Körperflüssigkeiten, Zellen oder Ausscheidungen, genommen von einem Versuchstier, dem eine Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, oder wobei das Probenmaterial, das durch Probenehmen von Versuchskulturzellen erhalten wurde, denen eine Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz appliziert wurde, die eine zu einer gewünschten Zielsequenz komplementäre Sequenz aufweist, um ein Hybrid zu bilden, und wobei die Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz die oben genannte Antisense-Oligonukleotidsequenz oder Antisense-Peptidnukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 7 ist.