DE19610255B4

DE19610255B4 - Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuresequenzen und Verfahren zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen

Info

Publication number: DE19610255B4
Application number: DE19610255A
Authority: DE
Inventors: Christoph Prof. Dr. Cremer
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 2004-11-04
Anticipated expiration: 2016-03-16
Also published as: GB2311132A; US5922543A; DE19610255A1; GB2311132B; GB9705262D0

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure, die für einen Translokationsbruchpunkt auf einem Chromosom spezifisch ist, umfassend einen ersten Sequenzabschnitt, der zu einer DNA-Sequenz eines ersten Chromosoms komplementär ist, zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und mindestens eine erste Markierung aufweist, und einen zweiten Sequenzabschnitt, der zu einer DNA-Sequenz eines zweiten Chromosoms komplementär ist, zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und mindestens eine zweite Markierung aufweist, wobei die erste und die zweite Markierung unterschiedlich sind umfassend die Schritte:
(a) Spaltung von genomischer DNA, die mindestens einen Translokationsbruchpunkt zwischen zwei Chromosomen aufweist, in DNA-Fragmente,
(b) Denaturierung der DNA-Fragmente in Einzelstränge,
(c) Hybridisierung der Einzelstränge mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung aufweisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz,
(d) Synthese der...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure und ein Verfahren zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen und von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen.
Austausche von Material zwischen verschiedenen Chromosomen (Translokationen) sind für verschiedene Gebiete der medizinischen Forschung und Diagnostik von großer Bedeutung. Beispielsweise können strahlungsinduzierte Translokationen zur biologischen Dosimetrie auch lange zurückliegender oder kumulativer Strahlungsexpositionen benutzt werden. In der klinischen Diagnostik ist die Feststellung von Translokationen und der Translokationsbruchstellen bzw. von Translokationsereignissen auf den entsprechenden Chromosomen wesentlich, da ein enger Zusammenhang zwischen dem Auftreten von bestimmten Translokationen und Malignität besteht (z.B. bei Leukämien).

Zur Feststellung solcher Translokationsereignisse sind im Stand der Technik insbesondere drei Verfahren bekannt:

(1) Die Analyse von Metaphasezellen der zu untersuchenden Personen mithilfe von klassischer Bänderungstechnik (F. Vogel, Human Genetics; Springer, Heidelberg (1992)).
(2) Die Analyse von Zellen in Metaphase oder von Zellkernen der betroffenen Personen durch Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (FISH) mit einer FISH-Farbe, oder mit Mehrfarben-FISH (T. Cremer et al., Human Genetics 80: 235 (1988); T. Cremer et al., Cytometry 11: 110 (1990); D.C. Tkachuk et al., Science 250: 559 (1990); S.Popp & T. Cremer, J. of Radiation Research Japan (Suppl.) 33: 61 (1992); C. Cremer et al., J. Radiation Research Japan (Suppl.) 33: 189 (1992); J.N. Lucas et al., Cytogenetics & Cell Genetics 62: 11 (1993)).
(3) Die Analyse der DNA von Zellen betroffener Personen mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, "Polymerase Chain Reaction") unter Verwendung von Startern ("Primern") für bereits identifizierte Bruchpunktregionen (A.J. Fishleder et al., Leukemia 3: 746 (1989); C.R. Bartram et al., J. Exp. Med. 164: 1389 (1986); S. Hiroswa et al., Am. J. Hematol. 28: 133 (1988); M.S. Lee et al., Blood 73: 2165 (1989); E.S. Kawasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5698 (1988)).

Die vorstehend aufgeführten Verfahren sind unter geeigneten Bedingungen – d.h. (i) die Zellen der Spender können unter geeignet schonenden Bedingungen entnommen und für die Analyse kultiviert bzw. auf Objektträgern fixiert werden (vgl. Verfahren (1) und (2)), oder (ii) die DNA-Analyse kann auf einige wenige Bruchpunktregionen beschränkt werden, (vgl. Verfahren (2) und (3)) – anwendbar.

Diese Bedingungen sind jedoch vielfach nicht erfüllt. Beispielsweise stehen in klinisch weniger erschlossenen Regionen oftmals nur Blutproben zur Verfügung, die zwar noch eine DNA-Gewinnung erlauben, nicht aber eine zufriedenstellende Zellpräparation. Ferner wird das vorstehend aufgeführte Verfahren (3) unter Verwendung der PCR zur Analyse von isolierter DNA außerordentlich aufwendig, wenn eine große Zahl möglicher Bruchpunktregionen von Translokationsereignissen in Frage kommt, wie z.B. bei strahlengeschädigten Zellen oder bei einem noch nicht molekularbiologisch näher eingegrenzten Tumor.

EP-A-0 246 864 beschreibt ein Verfahren zur Unterscheidung einer spezifischen Basensequenz von einer davon variierenden Basensequenz.

WO-A-92/19775 beschreibt die Detektion einer Zielsequenz, welche beispielsweise eine Chromosomentranslokation einschließt, durch Reagieren der Zielsequenz unter Hybridisierungsbedingungen in homogener Phase mit einer Überschußmenge an Fänger- und Reporter-Oligonukleotidsonden, welche zu unterschiedlichen Bereichen der Zielsequenz komplementär sind.

EP-A-0 070 685 beschreibt einen Hybridisierungstest in homogener Phase unter Lichtemission, wobei erste und zweite einzelsträngige, mit einer Lichtemittierenden Markierung versehene Reagenzsegmente mit einem komplementären, einzelsträngigen Zielpolynukleotid derart hybridisiert werden, daß ein strahlungsloser Energietransfer zwischen den Licht-emittierenden Markierungen der beiden Reagenzsegmente auftritt.

Die im Stand der Technik bekannte CGH ("Comparative Genomic Hybridization")-Methode ermöglicht, ausgehend von reiner genomischer DNA eines Spenders, den Nachweis beliebiger Über- oder Unterrepäsentationen von DNA gegenüber dem normalen Zustand als Kontrolle bei einer Mindestgröße der zu detektierenden Abschnitte von derzeit jeweils einigen Megabasenpaaren (mbp) Länge in mindestens 30% der untersuchten Zellen. Jedoch können mit der CGH-Methode die klinisch und wissenschaftlich ebenfalls außerordentlich wichtigen Translokationen bzw. ihre Bruchpunkte nicht nachgewiesen werden (A.Kallionemi et al., Science 258: 818 (1992); S.du Manoir et al., Hum. Genet.90: 590 (1993); S. du Manoir et al., Cytometry 19: 27 (1995)).

Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues System zum Nachweis von insbesondere häufiger vorkommenden Translokationen zwischen Chromosomen bzw. von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen bei Vorliegen von isolierter, genomischer DNA eines Spenders bereitzustellen, das die vorstehend aufgeführten Nachteile der im Stand der Technik bekannten Nachweisverfahren beseitigt.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen 1 bis 11 gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird ein Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure, die für einen Translokationsbruchpunkt auf einem Chromosom spezifisch ist, bereitgestellt, umfassend einen ersten Sequenzabschnitt, der zu einer DNA-Sequenz eines ersten Chromosoms komplementär ist, zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und mindestens eine erste Markierung aufweist, und einen zweiten Sequenzabschnitt, der zu einer DNA-Sequenz eines zweiten Chromosoms komplementär ist, zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und mindestens eine zweite Markierung aufweist, wobei die erste und die zweite Markierung unterschiedlich sind, umfassend die Schritte:

(a) Spaltung von genomischer DNA, die mindestens einen Translokationsbruchpunkt zwischen zwei Chromosomen aufweist, in DNA-Fragmente,
(b) Denaturierung der DNA-Fragmente in Einzelstränge,
(c) Hybridisierung der Einzelstränge mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung aufweisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz,
(d) Synthese der Nukleinsäure unter Verwendung der Einzelstränge als Matrize in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nukleinsäuren geeigneten Agens und einem zur Verknüpfung von Nukleinsäuren geeigneten Agens,
(e) Isolierung der Nukleinsäure aus dem Reaktionsgemisch,

wobei der erste Sequenzabschnitt der Nukleinsäure eine DNA-Sonde vom ersten Satz und der zweite Sequenzabschnitt der Nukleinsäure eine DNA-Sonde vom zweiten Satz umfaßt.

Der Begriff "Translokationsbruchpunkt" bedeutet molekulargenetisch diejenige Stelle in der DNA-Sequenz eines Translokationschromosoms, an der Sequenzen eines ersten Chromosoms mit den Sequenzen eines zweiten Chromosoms kovalent verbunden sind; cytogenetisch bedeutet "Translokationsbruchpunkt" diejenige mikroskopisch identifizierbare Region, die diese Bindungsstelle enthält. Der Begriff "Translokationsereignis" bedeutet die durch den Materialaustausch zwischen einem ersten Chromosom und einem zweiten (ggf. auch weiteren Chromosomen) herbeigeführte neue Chromosomenkonfiguration.

Der Begriff "Nukleinsäure(sequenz)" bedeutet ein halbsynthetisches, synthetisches oder modifiziertes Nukleinsäuremolekül aus Desoxyribonukleotiden und/oder Ribonukleotiden und/oder modifizierten Nukleotiden, wie z.B. einen durch Oligonukleotidsynthese mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden gewonnenen Abschnitt aus einer bekannten Bruchpunktregion, oder ein durch Verwendung einer komplementären Nukleinsäure als Matrize unter Verwendung oder Mitverwendung modifizierter Nukleotide synthetisiertes Nukleinsäuremolekül.

Der Ausdruck "zur Hybridisierung an eine DNA-Sequenz eines Chromosoms befähigter Sequenzabschnitt" bedeutet einen spezifischen, einzelsträngig vorliegenden, vorzugsweise 100 bis 1000 Basenpaaren langen Sequenzbereich der Nukleinsäuresequenz, der sich an einen komplementären Bereich eines Chromosoms bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise bei 70 °C oder weniger, und bei einer geeigneten Salzkonzentra tion, die vorzugsweise 50 bis 300 mmol/l einwertige Ionen und 0 – 10 mmol/l zweiwertige Ionen enthält, unter Ausbildung von Wasserstoffbrücken anlagert.

Der Begriff "Markierung" bedeutet geeignete, direkt oder indirekt nachweisbare Atome oder Moleküle, die in die entsprechenden Sequenzabschnitte der Nukleinsäuresequenz eingebaut oder damit verbunden sind. Geeignete Markierungen sind beispielsweise solche, die an Nukleotide gekoppelte Fluoreszenzfarbstoffe und/oder Biotin und/oder Digoxigenin und/oder mit radioaktiven Isotopen markierte Nukleotide umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erste und die zweite Markierung Fluoreszenzfarbstoffe mit einem zur Detektion kleiner Substanzmengen ausreichenden Unterschied im Fluoreszenzverhalten der Emissionsspektren, wie z.B. Cumarine und Rhodamine, und/oder der Fluoreszenzlebensdauern, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanate und Europium-Chelat-markierte und/oder Porphyrin-markierte Avidine.

Der Ausdruck "Sequenzabschnitt mit einer Markierung" bedeutet eine kovalent verknüpfte lineare Sequenz von Nukleotiden mit einer oder mehreren der vorstehend definierten Markierungen innerhalb des Sequenzabschnitts. Bespielsweise kann ein 5'-endständig lokalisierter Sequenzabschnitt der Nukleinsäuresequenz nur eine 5'-endständige Markierung aufweisen oder alle Nukleotide des Sequenzabschnitts oder ein Teil von ihnen können markiert sein.

Die Begriffe "erster Sequenzabschnitt" und "zweiter Sequenzabschnitt" bedeuten, daß der erste Sequenzabschnitt bei geeigneten Stringenz-Bedingungen im wesentlichen nicht zur Hybridisierung an die für den zweiten Sequenzabschnitt komplementäre Sequenz in einem zweiten Chromosom bzw. an die aus einem zweiten Chromosom stammende, für den zweiten Sequenzabschnitt komplementäre Sequenz in einem ersten Chromosom befähigt ist. Dies gilt auch mutatis mutandis für den zweiten Sequenzabschnitt, d.h. der zweite Sequenzabschnitt lagert sich unter geeigneten Stringenz-Bedingungen im wesentlichen nicht an die für den ersten Sequenzabschnitt komplementäre Sequenz in einem ersten Chromosom bzw. an die aus einem ersten Chromosom stammende, für den ersten Sequenzabschnitt komplementäre Sequenz in einem zweiten Chromosom an. Die Sequenzabschnitte können innerhalb und/oder endständig in der erfindungsgemäßherzustellenden Nukleinsäure(sequenz) lokalisiert sein. Die Sequenzabschnitte sind direkt, vorzugsweise über eine 3',5'-Phosphodiesterbindung, oder über eine Bindung oder eine Nukleinsäuresequenz, welche die vorstehend definierte Hybridisierung des ersten und zweiten Sequenzabschnitts nicht nachteilig beeinflussen, verbunden.

Die Begriffe "erste Markierung" und "zweite Markierung" bedeuten, daß sich die erste Markierung in mindestens einem, für einen Nachweis geeigneten Parameter, beispielsweise einer unterschiedlichen Wellenlänge der Fluoreszenz, oder der Fluoreszenzlebensdauer, oder dem emittierten Fluoreszenzspektrum, so stark unterscheidet, daß eine Detektion der ersten Markierung auch bei Gegenwart einer großen Menge ("Überschuß") der zweiten Markierung möglich ist. Wird beispielsweise bei der Detektion eine herkömmliche Epifluoreszenzoptik mit einer Auflösung von 150 nm verwendet, so ergibt sich, daß eine Detektion der ersten Markierung auch bei Gegenwart einer bis zu vier Größenordnungen größeren Menge, gemessen z.B. in Anzahl markierter Nukleotide, möglich sein muß.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend definierten Nukleinsäure(sequenz), umfassend die Schritte:

(a) Spaltung von genomischer DNA, die mindestens einen Translokationsbruchpunkt zwischen zwei Chromosomen aufweist, in DNA-Fragmente,
(b) Denaturierung der DNA-Fragmente in Einzelstränge,
(c) Hybridisierung der Einzelstränge in Lösung mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung aufweisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz,
(d) Synthese der Nukleinsäure unter Verwendung der an die DNA-Fragmente hybridisierten DNA-Sonden als Starter in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nukleinsäuren geeigneten Agens und einem zur Verknüpfung ("Ligierung") von Nukleinsäuren, vorzugsweise über 3',5'-Phosphodiesterbindungen, geeigneten Agens, und
(e) Isolierung der synthetisierten Nukleinsäure(sequenz) aus dem Reaktionsansatz, insbesondere von dem zu seiner Synthese verwendeten DNA-Fragment,

wobei der erste Sequenzabschnitt der Nukleinsäure(sequenz) eine DNA-Sonde vom ersten Satz und der zweite Sequenzabschnitt der Nukleinsäure(sequenz) eine DNA-Sonde vom zweiten Satz umfaßt.

Der Begriff "Spaltung von genomischer DNA" bedeutet chemische und/oder physikalische und/oder enzymatische Spaltung von genomischer DNA eines Spenders, beispielsweise von homo sapiens sapiens.

Die genomische DNA kann vor Schritt (a) durch Isolation aus einem geeigneten Spenderorganismus gewonnen werden. Die Isolierung von genomischer DNA umfaßt die Abtrennung der DNA aus Spenderzellen von den Proteinen der Spenderzellen. Die genomische DNA kann nach den im Stand der Technik bekannten Methoden aus kernhaltige Zellen enthaltenen Bestandteilen, wie Blut-oder Gewebeproben des Spenders, isoliert werden (z.B. A. Kallionemi et al., Science 258:818 (1992). Es sind auch im Handel erhältliche Verfahrenweisen etabliert, wie z.B. Quiagen-DNA-Isolationskit von DIAGEN. Die genomische DNA des Spenders kann nach der Isolierung gegebenenfalls in geeigneter Weise amplifiziert werden, beispielsweise mithilfe von DOP ("Degenerated Oligo-Primer-PCR")-PCR (H. Telenius et al., Genes, Chromosomes & Cancer 4: 257 (1992).

Als Beispiele zur Spaltung von genomischer DNA können alkalische Verbindungen, die Anwendung von Scherkräften oder Ultraschall, Endonukleasen oder andere Nukleinsäure-spaltende Agentien genannt. werden. Bei Vorliegen nur geringer vom Spender direkt isolierter genomischer DNA kann die gesamte DNA zunächst auch durch PCR mit degenerierten Primern nach bekannten Verfahren (H. Telenius et al., Genes, Chromosomes & Cancer 4: 257 (1992)) amplifiziert werden.

Der Begriff "Denaturierung" bedeutet die Überführung von doppelsträngig vorliegender DNA in Einzelstränge, beispielsweise durch thermische Behandlung unter geeigneten Pufferbedingungen (J. Marmur & P. Doty, J. Mol. Biol.(1962) 5:109) und/oder durch denaturierende chemische Agentien.

Der Begriff "Hybridisierung" bzw. "Anlagerung" bedeutet die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Bereichen von verschiedenen Nukleinsäuremolekülen, insbesondere zwischen den erfindungsgemäß verwendeten DNA-Sonden und den DNA-Fragmenten bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise bei 70 °C oder weniger, und bei einer geeigneten Salzkonzentration, die vorzugsweise 50 bis 300 mmol/l einwertige Ionen und 0 – 10 mmol/l zweiwertige Ionen enthält. Die Bedingungen sind so zu wählen, daß die Gesamtzahl der zwischen komplementären Basen gebildeten Wasserstoffbrücken ausreichend ist, um bei den gewählten Stringenzbedingungen eine stabile Bindung zu ermöglichen.

Der Begriff "Satz von DNA-Sonden" bedeutet DNA-Moleküle, die von einem spezifischen, zu untersuchenden Chromosom stammen, beispielsweise von einer im Handel erhältichen chromosomenspezifischen DNA-Bibliothek von homo sapiens sapiens, wobei dieses Chromosom als "normales Chromosom" keine Translokationen aufweist. Die DNA-Sonden sind gemäß der vorstehenden Definition zur Hybridisierung bzw. Anlagerung befähigt und liegen im Reaktionsansatz vor der Hybridisierung einzelsträngig vor. Ferner können die DNA-Sonden flankierende Sequenzen aufweisen, die im wesentlichen keinen Beitrag zur Anlagerung bzw. Hybridisierung leisten.

Ferner können chromosomenspezifische DNA-Bibliotheken auch durch laseraktivierte flußzytometrische Sortierung oder Mikrodissektionsverfahren von spezifischen Chromosomen und nachfolgender Amplifikation der chromosomalen DNA gewonnen werden. Statt chromosomenspezifischen DNA-Bibliotheken von homo sapiens sapiens können auch Bibliotheken anderer Spezies eingesetzt werden. Beispielsweise können für die erfindungsgemäße Herstellung der Nukleinsäure(sequenz) für Untersuchungen mit menschlicher genomischer Spender-DNA auch Chromosomenbibliotheken nahe verwandter Spezies verwendet werden.

Die Begriffe "erster Satz von DNA-Sonden" und "zweiter Satz von DNA-Sonden" bedeuten, daß die beiden Sätze jeweils von einem unterschiedlichen Chromosom der Gattung des Spenders stammen, z.B. homo sapiens sapiens. Beispielsweise kann der erste Satz von DNA-Sonden von einem menschlichen Chromosom 9 und der zweite Satz von DNA-Sonden von einem menschlichen Chromosom 22 stammen, oder der erste Satz von DNA-Sonden stammt von einem menschlichen Chromosom 1 und der zweite Satz von DNA-Sonden stammt von einem menschlichen Chromosom 2. Die Sätze von DNA-Sonden können nach bekannten Verfahren gewonnen werden (K.E.Davies et al., Nature 293: 374 (1981); C.R. Müller et al., Hum. Genet. 64: 110 (1983); C. Cremer et al., Cytometry 5: 572 (1984); J.C. Fuscoe et al., Cytogenet. Cell Genet. 43: 79 (1986); M.A. van Dilla et al., Biotechnology 4: 537 (1986), P. Lichter et al., Genet. Anal. Technol. Appl. 8: 24 (1991); B.Trask, Trends Genet. 7: 149 (1991)), oder sind im Handel erhältlich (z.B. von Oncor oder Vysis). Erfindungsgemäß können als Sätze von DNA-Sonden auch DNA von Chromosomen anderer Spezies verwendet werden. Beispielsweise kann es für tierexperimentelle strahlenbiologische oder onkologische Studien wünschenswert sein, chromosomenspezifische DNA-Bibliotheken der untersuchten Tierart zu verwenden. Auch für die erfindungsgemäße Herstellung einer Nukleinsäuresequenz für die Untersuchung menschlicher Spender DNA kann es vorteilhaft sein, als Sätze von DNA-Sonden DNA von Chromosomen anderer, insbesondere nahe verwandter Spezies, zu verwenden. Im letzteren Falle besteht der Verfahrensvorteil in einer vereinfachten Eliminierung ubiquitärer repetitiver Sequenzen.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können statt zwei Sätzen von DNA-Sonden mit einer ersten und einer zweiten Markierung weitere Sätze von DNA-Sonden mit einer dritten, vierten Markierung usw., die von einem dritten, vierten usw. Chromosom stammen, verwendet werden.

Der Begriff "Reaktionsansatz" bedeutet ein Reaktionsgemisch, das neben den Nukleotiden und ATP mindestens ein zur Synthese der Nukleinsäure(sequenz) geeignetes Agens, mindestens ein zur Verknüpfung von Nukleinsäuren geeignetes Agens, mindestens eine oder mehrere DNA-Sonden von einem ersten Satz und eine oder mehrere DNA-Sonden von einem zweiten oder weiteren Satz und ein oder mehrere DNA-Fragmente als Matrizen enthält, wobei weitere, nicht an dem erfindungsgemäßen Verfahren beteiligte Nukleinsäuren vorhanden sein können. Die Konzentrationen der DNA-Sonden und/oder der DNA-Fragmente im Reaktionsansatz werden nach bekannten Verfahren eingestellt (P. Lichter et al., Hum. Genet. 80: 224 (1988); B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3rd edition, Garland Publ., New York & London (1994)).

Der Begriff "Synthese der Nukleinsäure(sequenz)" umfaßt (i) die Herstellung eines "Verlängerungsprodukts", das an die 5'-endständige, an die komplementäre Sequenz eines DNA-Fragments angelagerte DNA-Sonde vom ersten oder zweiten Satz als Starter über beispielsweise eine Phosphodiester-, Thioester- oder Amidbindung kovalent gebunden ist, und (ii) das Verknüpfen des Verlängerungsprodukts mit einer an die komplementäre Sequenz des DNA-Fragments angelagerten DNA-Sonde des entsprechenden anderen Satzes, wobei die Primärsequenz des resultierenden Reaktionsprodukts komplementär zu der entsprechenden Sequenz des DNA-Fragments als Matrizenmolekül ist. Als Nukleotide bei dieser Reaktion können nichtmarkierte und/oder markierte Nukleotide verwendet werden. Das Reaktionsprodukt dieser "Synthese" ist somit die erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäuresequenz, welche mindestens eine DNA-Sonde vom ersten Satz, eine DNA-Sonde vom zweiten Satz und ein zwischen diesen DNA-Sonden angeordnetes, "synthetisiertes" Verlängerungsprodukt enthält. Vor der Isolierung bzw. Gewinnung aus dem Reaktionsgemisch bildet die erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäuresequenz mit der entsprechenden komplementären Sequenz des als Matrize verwendeten DNA-Fragments ein doppelsträngiges Molekül.

Der Begriff "ein zur Synthese der Nukleinsäure(sequenz) geeignetes Agens" bedeutet ein natives Enzym oder ein synthetisch hergestelltes Agens, welches bei der Synthese des Verlängerungsproduktes als Katalysator wirkt, in Verbindung mit geeigneten Pufferbedingungen und anderen für die Reaktion erforderlichen, bekannten Verbindungen. Beispiele für native Enzyme sind die Taq-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, die E. coli DNA-Polymerase I und die Reverse Transkriptase. Beispiele für "geeignete Pufferbedingungen" sind die im Stand der Technik bekannten Pufferbedingungen der PCR. Beispiele für "andere Verbindungen" sind Salze wie MgCl₂.

Der Begriff "ein zur Verknüpfung von Nukleinsäuren, vorzugsweise über 3',5'-Phosphodiesterbindungen, geeignetes Agens" bedeutet ein natives Enzym oder ein synthetisch hergestelltes Agens, welches bei der Verknüpfung von zwei Molekülen als Katalysator wirkt. Beispiele für native Enzyme sind DNA-Ligasen wie T4-DNA Ligase oder E. coli Ligase.

Der Begriff "Isolierung der Nukleinsäure(sequenz)" bedeutet ein Verfahren, nach dessen Durchführung die Nukleinsäuresequenz für eine in situ Hybridisierungsreaktion an Chromosomen oder chromosomaler DNA (im folgenden auch "Targets" genannt) eingesetzt werden kann. Nachfolgend werden als Beispiele zwei Isolierungsverfahren näher erläutert.

Isolierungsverfahren I:

Die Nukleinsäuresequenz und die übrigen in dem Reaktionsgemisch enthaltenen, doppelsträngigen Sequenzen werden durch thermische Behandlung unter geeigneten Pufferbedingungen und/oder der Zugabe von chemischen denaturierenden Agentien von ihrer Matrize bzw. von ihren komplementären Sequenzen gelöst und mit den ebenfalls denaturierten Targets bzw. Zielsequenzen zum Zwecke der in situ Hybridisierung in Verbindung gebracht, ggf. unter Zugabe nicht-markierter repetitiver DNA (z.B. menschliche Cot I DNA) zum Zwecke der Suppression nach bekannten Verfahren (P. Lichter et al., Hum. Genet. (1988) 80: 224; T. Cremer et al., Hum. Genet. (1988) 80: 235)). Die Zugabe von supprimierender DNA kann unterbleiben, wenn die zur Herstellung der Nukleinsäuresequenz verwendeten DNA-Sequenzen eines ersten und zweiten Chromosoms keine repetitiven Sequenzen enthalten, die unter den gewählten in situ Hybridisierungsbedingungen an komplementäre Sequenzen der Targets binden würden. Verfahren zur Isolierung und in situ Hybridisierung solcher DNA Sequenzen sind bekannt (M.Schardin et al., Hum. Genet.(1985) 71:281; D. Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 2934; J. Wienberg et al., III. Plenary workshop of the European Concerted Action "Automation in Molecular Cytogenetic Analyses", Ghent, 16 – 18 November, 1995)).

Isolierungsverfahren II:

Es wird eine Abtrennung der Nukleinsäuresequenz von den übrigen Sequenzen des Reaktionsgemisches vorgenommen, um die in situ Hybridisierungseffizienz zu erhöhen. Dafür können verschiedene Methoden angewandt werden:

(i) Die Markierung wird so vorgenommen, daß nach Denaturierung der doppelsträngigen DNA Sequenzen des Reaktionsgemisches eine Trennung der doppelt markierten Nukleinsäuresequenz von den nicht-markierten Sequenzen und von den einfach markierten Sequenzen durch Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt wird.
(ii) Die Markierung wird so vorgenommen, daß die Nukleinsäuresequenz durch säulenchromatographische Verfahren abgetrennt wird. In einer Ausführungsform von Punkt (ii) werden zunächst diejenigen DNA Sequenzen säulenchromatographisch gebunden, die eine erste Markierung tragen. Damit erfolgt die Isolierung derjenigen DNA Sequenzen, die entweder keine Markierung oder eine zweite Markierung tragen. Die gebundenen DNA Sequenzen tragen entweder nur eine erste Markierung oder eine erste und eine zweite Markierung. Diese DNA Sequenzen werden anschließend eluiert und dann einer zweiten säulenchromatographischen Trennung unterworfen, bei der die DNA-Sequenzen gebunden werden, bei denen eine Affinität zwischen Säule und zweiter Markierung besteht. Damit erfolgt die Isolierung derjenigen DNA-Sequenzen, die nur eine erste Markierung tragen, von denjenigen, im zweiten Schritt gebundenen DNA-Sequenzen, die eine erste und eine zweite Markierung haben. Mit der Eluierung der letzteren DNA-Sequenzen ist die Isolierung der erfindungsgemäßherzustellenden Nukleinsäuresequenz gemäß dieser Ausführungsform abgeschlossen. Erfindungsgemäß kann die isolierte Nukleinsäure(sequenz) gegebenenfalls vor der in situ Hybridisierung noch mithilfe von PCR-Methoden (H. Telenius et al., Genes, Chromosomes & Cancer 4: 257 (1992)) amplifiziert werden. In einer anderen Ausführungsform von Punkt (ii) werden die erste und zweite Markierung so gewählt, daß zusätzlich zu den erfindungsgemäß gewählten optischen Ei genschaften Unterschiede in der elektrophoretischen Beweglichkeit auftreten. Die Trennung erfolgt dann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren der zweidimensionalen Gelelektrophorese.

Erfindungsgemäß kann das Isolierungsverfahren II so modifiziert werden, daß Isolierungen von Nukleinsäure(sequenze)n möglich sind, bei denen erste und zweite Markierungen bzw. dritte und vierte Markierungen usw. auftreten. Das Isolierungsverfahren kann für diesen Fall zum Beispiel so modifiziert werden, daß parallel oder seriell in einer ersten Säule alle Nukleinsäuren mit einer ersten Markierung gebunden werden, in einer zweiten Säule alle Nukleinsäuren mit einer zweiten Markierung gebunden werden, in einer dritten Säule alle Nukleinsäuren mit einer dritten Markierung gebunden werden, usw. In einem zweiten Verfahrensschritt werden Säulen verwendet, in denen die im ersten Schritt abgetrennten Nukleinsäuren mit einer ersten Markierung verwendet und von diesen alle Nukleinsäuren gebunden werden, die auch eine zweite Markierung oder auch eine dritte Markierung usw. enthalten. In einer weiteren Säule werden die Nukleinsäuren mit einer dritten, vierten usw. Markierung abgetrennt, die im ersten Verfahrensschritt aufgrund einer zweiten Markierung abgetrennt wurden, usw. Insgesamt sind alle Verfahren erfindungsgemäß, die zu einer Trennung von erfindungsgemäßhergestellten, Nukleinsäure(sequenze)n mit einer ersten und zweiten Markierung, mit einer ersten und dritten Markierung usw., mit einer zweiten und dritten Markierung, mit einer zweiten und vierten Markierung usw., von DNA-Molekülen mit nur einer Art von Markierung führen.

Nachfolgend werden, soweit erforderlich, die einzelnen Verfahrensschritte (a) bis (e) näher erläutert.

In Schritt (a) wird die, ggf. amplifizierte, genomische DNA mit beispielsweise geeigneten Restriktionsendonukleasen in genügend lange, z.B. etwa 1 – 2 kbp, doppelsträngige DNA- Fragmente in einer geeigneten Pufferlösung, z.B. 1x SSC, PBS etc., nach bekannten Verfahren (A. Kallionemi et al., Science 258: 818 (1992); S. du Manoir et al., Hum. Genet. 90: 590 (1993)) in DNA-Fragmente gespalten.

In Schritt (b) wird die DNA-Fragmente enthaltende Lösung von Schritt (a), vorzugsweise ohne Zugabe denaturierender Agentien, denaturiert, z.B. durch Erhitzen auf etwa 85 – 95 °C, wobei nach der Denaturierung die DNA-Fragmente im wesentlichen einzelsträngig vorliegen.

In Schritt (c) wird die einzelsträngige DNA-Fragmente enthaltende Lösung von Schritt (b) einer Hybridisierung in Lösung unterworfen. Die zugefügten Hybridisierungpartner sind beispielsweise etwa 100 bis 300 Basen lange, markierte DNA-Sonden von mindestens zwei unterschiedlichen Sätzen, z.B. aus chromosomenspezifischen DNA-Bibliotheken normaler Chromosomen. Die "Hybridisierung" bzw. "Anlagerung" erfolgt bei einer Temperatur, die jeweils von der Art der im Reaktionsansatz vorliegenden Nukleinsäuren abhängt. Beispielsweise kann die Hybridisierung bei etwa 50 bis 70 °C erfolgen. Bei Vorliegen von Translokationsbruchpunkten in den untersuchten Chromosomen des Spenders liegen in der "Hybridisierungslösung" u.a. Translokationsbruchpunkte enthaltende DNA-Fragmente vor, an welche sich eine oder mehrere DNA-Sonden aus einem ersten Satz von DNA-Sonden und eine oder mehrere DNA-Sonden aus einem zweiten Satz von DNA-Sonden angelagert haben, wobei die angelagerten DNA-Sonden unterschiedlich markiert sind.

Die erfindungsgemäße Hybridisierung kann auch mit mehr als zwei Sätzen von DNA-Sonden durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein mit einer ersten Markierung versehener Satz von DNA-Sonden aus einer chromosomenspezifischen DNA-Bibliothek eines ersten Chromosoms, ein mit einer zweiten, dritten, vierten, usw. Markierung versehener Satz von DNA-Sonden aus einer chromosomenspezischen DNA-Bibliothek eines zweiten, dritten, vierten, usw. Chromosoms gleichzeitig für die Hybridisierung verwendet werden. In diesem Falle lagern sich DNA-Sonden unterschiedlicher Markierung an Translokationsbruchpunkte enthaltende DNA-Fragmente der betreffenden Chromosomen an. Beispielsweise befinden sich in der Lösung bei Vorliegen eines Translokationsbruchpunktes zwischen einem dritten und vierten Chromosom DNA-Fragmente, bei denen eine Nukleotidsequenz eines dritten Chromosoms mit einer Nukleotidsequenz eines vierten Chromosoms über kovalente Bindungen verknüpft ist. Im Verlauf der Hybridisierungsreaktion lagern sich an diese DNA-Fragmente DNA-Sonden eines dritten Chromosoms mit einer dritten Markierung sowie DNA-Sonden eines vierten Chromosoms mit einer vierten Markierung an.

In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform können die Schritte (a), (b) und (c) im gleichen Reaktionsgefäß durchgeführt werden.

In Schritt (d) wird die Synthese des Verlängerungsproduktes ("Elongation") bei einer Temperatur durchgeführt, die insbesondere von dem zur Synthese geeigneten Agens abhängt, wobei Reaktionsprodukte gemäß der vorstehend aufgeführten Definition erhalten werden. Beispielsweise erfolgt die Synthese bei Verwendung der Taq-Polymerase bei einer Temperatur zwischen etwa 70 bis etwa 80 °C, vorzugsweise 72 °C, für etwa 1 bis 15 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten.

Insbesondere werden mithilfe von beispielsweise spezifischen Polymerasen und der Zugabe von Nukleotiden und ATP die Lücken zwischen den angelagerten DNA-Sonden von Schritt (c) geschlossen, wobei ein kovalent verbundener, aber zwei unterschiedliche Markierungen aufweisender, an das als Matrize dienende DNA-Fragment angelagerter DNA-Strang als Reaktionsprodukt entsteht.

Der Reaktionsansatz hat ein geeignetes Volumen, beispielsweise 20 bis 200 μl, und enthält (1) eine für die Synthese des Verlängerungsproduktes geeignete Konzentration an gewünschten Nukleotiden, vorzugsweise 5 bis 100 nmol, mehr bevorzugt etwa 20 nmol, (2) für die Synthese des Verlänge rungspruduktes ausreichende Einheiten eines synthetisierenden Agens, beispielsweise 1 bis 15 Einheiten, vorzugsweise 5 Einheiten Taq-Polymerase, (3) für die Verknüpfung der Nukleinsäuren ausreichende Einheiten eines geeigneten Agens (z.B. eine im Handel erhältliche Ligase) sowie DNA-Sonden und DNA-Fragmente in einer geeigneten Reaktionslösung unter Verwendung bekannter Verfahrensprotokolle (P. Leder et al., Science 196: 175 (1977); C.R. Müller et al., Hum. Genet. 64:110 (1983). Außer den genannten Verbindungen enthält die Reaktionslösung MgCl₂ (1 bis 200 mmol, bevorzugt 1 bis 50 mmol, mehr bevorzugt 1 bis 20 mmol und am meisten bevorzugt 3 mmol), NaCl (30 bis 300 mmol, bevorzugt 50 bis 250 mmol, mehr bevorzugt 100 bis 200 mmol und am meisten bevorzugt 160 mmol) und/oder KCl (10 bis 70 mmol, bevorzugt 30 bis 70 mmol, mehr bevorzugt 40 bis 60 mmol und am meisten bevorzugt 50 mmol) und/oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan ("Tris"; 5 bis 50 mmol, bevorzugt 5 bis 30 mmol, mehr bevorzugt 5 bis 20 mmol und am meisten bevorzugt 10 mmol) und/oder Tween 20 (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat) (0,01 bis 0,1 Vol.-%, bevorzugt 0,01 bis 0,06 Vol.-%, mehr bevorzugt 0,01 bis 0,04 Vol.-% und am meisten bevorzugt 0,02 Vol.-%) und gegebenenfalls Gelatine (0,1 bis 1 mmol). Der pH-Wert der Reaktionslösung liegt in einem geeigneten, insbesondere von dem synthetisierenden Agens abhängigen Bereich, vorzugsweise zwischen 6 und 8.

In Schritt (d) kann gegebenenfalls als positive Kontrolle der Synthese ein Teil der Nukleotide im Reaktionsansatz markiert sein. Geeignete Markierungen sind beispielsweise mit Biotin, Digoxigenin oder Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. Rhodaminfarbstoffe, Cumarinfarbstoffe) gekoppelte Nukleotide. Diese Markierungen der bei der Synthese verwendeten Nukleotide können zu den Markierungen der Sequenzabschnitte unterschiedlich sein. Erfindungsgemäß können die Nukleotide im Reaktionsansatz auch in ihrer nativen Form verwendet werden.

In Schritt (e) werden die im Reaktionsgemisch enthaltenen, erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäuresequenzen von der zu ihrer

Synthese verwendeten Matrizenmolekülen und gegebenenfalls auch von den anderen im Reaktionsgemisch enthaltenen Sequenzen abgetrennt. Dies kann nach den oben beschriebenen Isolierungsverfahren I oder II durchgeführt werden. Erfindungsgemäß kann auch eine Denaturierung, wie in Schritt (b) beschrieben, durchgeführt werden. Von Vorteil für eine erfindungsgemäße in situ Hybridisierung ist insbesondere eine Isolierung der Nukleinsäuresequenzen aufgrund ihrer Doppelmarkierungen.

Die erfindungsgemäßherzustellende Nukleinsäure(sequenz) kann auch bei Kenntnis der Primärsequenz, beispielsweise durch Sequenzierung einer durch das vorstehend aufgeführte Verfahren hergestellten Nukleinsäure(sequenz) mit im Stand der Technik bekannten Methoden, chemisch synthetisiert werden. Beispielsweise können jeweils 1 kbp lange, synthetisierte Marker-Sequenzen aus einem ersten Chromosom mit einem Abstand von jeweils ca. 2 Mpb voneinander in durch molekularbiologische Verfahren in statistischer Weise mit jeweils 1 kbp langen, synthetisierten Markersequenzen aus einem zweiten Chromosom mit einem Abstand von ebenfalls ca. 2 Mbp kombiniert werden. Das so entstandene Gemisch enthält dann einen großen oder den größten Teil der cytogenetisch nachweisbaren möglichen Translokationsbruchpunkte zwischen dem ersten Chromosom und dem zweiten Chromosom. Solche erfindungsgemäßhergestellten, synthetischen, Nukleinsäure(sequenze)n sind beispielsweise für in situ Hybridisierungen nach dem unten beschriebenen COMET ASSAY von Interesse.

In Verbindung mit in situ Hybridisierungsverfahren kann die erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenz) zum Nachweis von Translationsbruchpunkten auf Chromosomen verwendet werden. Insbesondere kann die erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenz) zum Nachweis strahlungsinduzierter ("biologische Dosimetrie") oder von chemisch induzierten Translokationsbruchpunkten sowie von Translokationsbruchpunkten in Zellen von Tumorgeweben oder in vereinzelten Tumorzellen verwendet wer den. Translokationsbruchpunkte sind u.a. ein Maß für Translokationen. Beispielsweise werden zwei Sätze von markierten DNA-Sonden eingesetzt, wobei der erste Satz mit einer ersten Markierung von einem normalen Chromosom 9 und der zweite Satz mit einer zweiten Markierung von einem Chromosom 22 stammt. Bei Verwendung von DNA-Fragmenten von einem Spender mit einer Translokation von Chromosom 9 auf 22 und von Chromosom 22 auf Chromosom 9, wie es bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie typisch ist, werden bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf einem normalen Chromosom 9 eine Nukleinsäuresequenz mit einer zweiten Markierung und auf einem normalen Chromosom 22 eine Nukleinsäuresequenz mit einer ersten Markierung detektiert. Dies zeigt entsprechende Translokationsbruchpunkte in den Chromosomen 9 und 22 des Spenders an.

Die Häufigkeit von Translokationen nimmt mit der applizierten Dosis ionisierender Strahlung zu (Awa et al., J. Radiat. Res. (Japan) 19: 126 (1978)). Daraus ergibt sich die Möglichkeit einer Dosisabschätzung, wenn die physikalische Dosis nicht bekannt ist. Translokationen werden auch nach Einwirkung chemischer Verbindungen beobachtet (G.A. Folle & G. Obe, Intern. J. Radiat. Biol. 68: 437 (1995)). Da bestimmte Translokationen bzw. Translokationsbruchstellen eng mit der Bildung bösartiger Tumoren korreliert sind (D.C. Tkachuk et al., Science 250: 559 (1990)), hat die Analyse von Translokationen bzw. Translokationsbruchstellen ferner eine hohe klinisch-diagnostische Bedeutung bei der Diagnostik, Prognose und Verlaufskontrolle von Krebserkrankungen.

In situ Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von DNA-Sonden eines ersten (oder mehrerer) Chromosomen mit einer ersten Markierung und einer zweiten (oder weiteren) DNA-Sonden mit einer zweiten (oder weiteren) Markierung(en) eines zweiten (oder weiterer) Chromosomen zur direkten Identifizierung von Translokationen auf Chromosomen von Zellen nach Einwirkung ionisierender Strahlung oder von Tumorzellen sind bekannt (T. Cremer et al., Hum. Genet. 80: 235 (1988); T. Cremer et al., Cytometry 11: 110 (1990); S. Popp et al., Kerntechnik 55: 204 (1990); Lucas et al., Intern. J. Radiat. Biol. 62: 53 (1992); C. Cremer et al., J. Radiat. Res. (Japan) 33 (Suppl.): 189 (1992); Lucas et al., Cytogenet. Cell Genet. 62: 11 (1993)).

Im Gegensatz zu den genannten in situ Hybridisierungsverfahren erlaubt die erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenz) jedoch die Identifizierung von Translokationsbruchstellen, die in Zellen des Spenders vorliegen, beispielsweise nach Einwirkung von Strahlen und/oder chemischen Agentien und/oder aufgrund des Vorhandenseins von Tumoren, durch in situ Hybridisierung an "normale" Chromosomen bzw. an "normale" DNA. Damit wird eine erfindungsgemäße Detektion von Translokationen auch in denjenigen Fällen durchführbar, bei welchen nur DNA-Material gewonnen werden kann, beispielsweise bei Populationen in Katastrophengebieten ohne die Möglichkeit einer ausreichenden Zellpräparation.

Eine andere Anwendung betrifft die Verwendung von isolierter DNA von Tumorgewebe oder Tumorzellen enthaltenden Geweben zur Gewinnung der erfindungsgemäßherzustellenden Nukleinsäure(sequenz). Mithilfe der in situ Hybridisierung der Nukleinsäuresequenz an normale Chromosomen bzw. an normale DNA können die Translokationsbruchpunkte der gewählten ersten und zweiten Chromosomen (ggf. auch weiterer Chromosomen) identifiziert werden, die in den Zellen des untersuchten Gewebes vorliegen. Dies ist von erheblicher klinischer Bedeutung für Diagnose, Prognose, und Therapie-Verlaufskontrolle bei Tumorerkrankungen. Ferner ist dieses Verfahren von erheblicher Bedeutung für a posteriori Untersuchungen von Translokationen an Archivmaterial von Zellen nach Einwirkung ionisierender Strahlen und/oder chemischer Agentien, oder an Archivmaterial von Tumorzellen enthaltenden Geweben. Dies ist zum Beispiel für die Tumorforschung von großem Interesse.

Erfindungsgemäß kann durch Vielfarbenmarkierung der gleichzeitige Nachweis von Translokationsbruchpunkten an mehr als zwei Chromosomen durchgeführt werden. Hierzu werden DNA-Sonden eines ersten Chromosoms mit einer ersten Markierung, DNA-Sonden eines zweiten Chromosoms mit einer zweiten Markierung, DNA-Sonden eines dritten Chromosoms mit einer dritten Markierung etc. verwendet. Die Markierungen haben so zu erfolgen, daß jede Markierung von allen anderen unterschieden werden kann. Die erfindungsgemäße Synthese der Nukleinsäuresequenzen erfolgt in der oben beschriebenen Weise, mit dem Unterschied, daß mehr als zwei Typen von markierten DNA-Sonden im Reaktionsgemisch vorhanden sind. Bei Verwendung von DNA-Sonden eines ersten bis vierten Chromosoms beispielsweise und Translokationsbruchpunkten zwischen erstem und zweitem sowie zwischen drittem und viertem Chromosom erhält man Nukleinsäuresequenzen mit einer ersten und zweiten Markierung, sowie mit einer dritten und vierten Markierung. Das Isolierungungsverfahren I kann wie oben beschrieben durchgeführt werden. Das Isolierungsverfahren II ist entsprechend zu modifizieren. Beispielsweise können bei dem ersten säulenchromatographischen Trennschritt die Sequenzen mit einer ersten und dritten Markierung gebunden werden, bei dem zweiten säulenchromatographischen Trennschritt die Sequenzen mit einer zweiten und vierten Markierung. Nach erfolgtem Trennverfahren werden für eine nachfolgende in situ Hybridisierung erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenze)n verwendet, die entweder eine erste und zweite Markierung, oder eine dritte und vierte Markierung aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand ist ein Kit zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen und von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen. Die Anwendung eines solchen Kits führt zu einer in situ Hybridisierungsmixtur, die mindestens die vorstehend definierte Nukleinsäure(sequenz) in einem geeigneten Puffer enthält.

Ferner ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen und von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen, umfassend die Schritte:

(a) Isolierung von zu untersuchender genomischer DNA aus geeignetem zellulären Material eines Spenders, vorzugsweise eines Säugers wie homo sapiens sapiens,
(b) Spaltung der genomischen DNA in doppelsträngige DNA-Fragmente,
(c) Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Fragmente in Einzelstränge,
(d) Hybridisierung der Einzelstränge mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung aufweisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz,
(e) Synthese von Nukleinsäuren unter Verwendung der einzelsträngig vorliegenden DNA-Fragmente als Matrize und der DNA-Sonden als Starter in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nukleinsäuren geeigneten Agens und einem zur Verknüpfung von Nukleinsäuren, vorzugsweise über 3',5'-Phosphodiesterbindungen, geeigneten Agens, wobei doppelsträngig vorliegende Reaktionsprodukte hergestellt werden,
(f) Denaturierung der doppelsträngig vorliegenden Reaktionsprodukte in Einzelstränge, wobei nach der Denaturierung im Reaktionsgemisch einzelsträngige Nukleinsäuren mit der ersten Markierung, einzelsträngige Nukleinsäuren mit der zweiten Markierung und, bei Vorhandensein einer Translokation zwischen der DNA des ersten Chromosoms und der DNA des zweiten Chromosoms in de zu analysierenden Zellen des Spenders, erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenze)n vorliegen,
(g) in situ Hybridisierung der gegebenfalls durch weitere Verfahrensschritte angereicherten, in der Hybridisierungsmixtur vorliegenden einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen, mit einem ersten und zweiten Kontroll-Chromosom ohne Translokationen oder mit durch Einzelzellgelelektrophorese aufgetrennter DNA und
(h) Auswertung der in situ Hybridisierung über die unterschiedlichen Markierungen der in Schritt (f) abgetrennten Nukleinsäure(sequenze)n, vorzugsweise mit Methoden der Fluoreszenzlebensdauermikroskopie oder Verfahren der konfokalen Laserscanningfluoreszenzmikroskopie oder Verfahren der Fluoreszenznahfeldmikroskopie.

Der Begriff "in situ Hybridisierung" bedeutet allgemein die durch Wasserstoffbrücken realisierte, sequenzspezifische Anlagerung von DNA-Sonden und/oder RNA-Sonden und/oder DNA-Analog-Sonden, an DNA-Targets oder RNA-Targets, oder chromosomale Targets in situ. DNA-Sonden sind Desoxyribonukleinsäuren geeigneter Länge mit einer für die in situ Hybridisierung geeigneten Basenabfolge und mit einer für den gewählten Nachweis adäquaten Markierung. RNA-Sonden sind Ribonukleinsäuren geeigneter Länge mit einer für die in situ Hybridisierung geeigneten Basenabfolge und mit einer für den gewählten Nachweis adäquaten Markierung. DNA-Analog-Sonden sind lineare Moleküle mit einer für die in situ Hybridisierung geeigneten Abfolge von Basen (z.B. Adenin, Thymin/Uracil, Guanin, Cytosin), bei denen die kovalente Verbindung zwischen den Basen strukturell homomorph ist mit einem Desoxyribose- oder einem Ribose-Rückgrat, und mit einer für den jeweiligen Nachweis adäquaten Markierung. Eine bevorzugte Ausführungsform von DNA-Analog-Sonden sind PNA-Moleküle, bei denen die Basen mit einem Rückgrat aus N-(2-ami noethyl)glycin-Einheiten verbunden werden (M. Egholm et al., Nature 365:566 (1993)).

Der Begriff "in situ" bedeutet, daß die Hybridisierungsreaktion direkt am Ort des Targets in den einzelnen biologischen Untersuchungsobjekten (z.B. Zellen, Chromosomen) oder in ihrer unmittelbarer Nähe (im Bereich bis zu etwa 300 μm) durchgeführt wird. Beispielsweise ist eine in situ Hybridisierung dann gegeben, wenn eine Sonde an ein Chromosom in der Metaphase oder an einen Chromosomenbereich in der Interphase hybridisiert wird (T. Cremer et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 58: 777 (1993)). Von in situ Hybridisierung spricht man auch, wenn als Target nicht Chromosomen, sondern von Histonen und Nichthistonproteinen weitgehend freie Nukleinsäuren außerhalb der Chromosomen dienen, sofern noch ein unmittelbarer räumlicher Zusammenhang mit dem biologischen Untersuchungsobjekt (z.B. auch normale Zellen, normale DNA) besteht.

Der Begriff "Auswertung" bedeutet den optischen Nachweis der erfindungsgemäßen Nukleinsäure(sequenz) auf normalen ersten und/oder zweiten Chromosomen (Kontroll-Chromosomen) A und/oder B oder auf durch Einzelzellgelelektrophorese aufgetrennter normaler DNA von A und/oder B (auch als "COMET ASSAY" bezeichnet) nach in situ Hybridisierung. Liegt beim Spender z.B. eine reziproke Translokation (gegenseitiger Austausch von chromosomalem Material) zwischen A und B vor, so werden die Targets an den Orten, die den jeweiligen Translokationsbruchpunkten entsprechen, bei Analyse einer ausreichenden Anzahl von Chromosomen/DNA-Strängen in situ durch die erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäure(sequenz) markiert. Der Nachweis erfolgt vorzugsweise mit Verfahren der digitalen Mikroskopie. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Methoden der Fluoreszenzlebensdauermikroskopie oder der konfokalen Laserscanningfluoreszenzmikroskopie oder der optischen Fluoreszenznahfeldmikroskopie oder eine Kombination dieser Verfahren verwendet. Bei Verwendung weiterer Nukleinsäuresequenzen mit dritten, vierten Markierungen usw. bedeutet der Begriff "Auswertung" die Identifizierung und Lokalisierung der weiteren Nukleinsäuresequenzen auf den Kontrollchromosomen bzw. der DNA-Stränge beim COMET ASSAY. Die Identifizierung geschieht aufgrund einer unterscheidenden Markierung, zum Beispiel einer unterscheidenden Fluoreszenzlinie und/oder eines unterscheidenden Fluoreszenzspektrums und/oder einer oder mehrerer unterscheidenden Fluoreszenzlebensdauern oder einer Kombination dieser Verfahren.

Nachfolgend werden die einzelnen Verfahrensschritte weiter erläutert.

In Schritt (a) wird genomische DNA aus geeignetem zellulären Material eines Spenders, vorzugsweise eines Säugers wie ein Mensch, oder z.B. auch Maus, Ratte, Chinesischer Hamster, nach im Stand der Technik bekannten Verfahren isoliert; vgl. auch vorstehende Ausführungen zum Begriff "Isolierung von genomischer DNA". Beispielsweise wird bei einem Patienten mit Verdacht auf einen noch nicht näher eingegrenzten Bluttumor eine Blutprobe entnommen und die genomische DNA isoliert und gegebenenfalls amplifiziert.

Für die Schritte (b) bis (e) wird auf das vorstehend aufgeführte Verfahren, insbesondere auf die Ausführungen zu den Schritten (a) bis (d) und dessen bevorzugte Ausführungsformen zur erfindungsgemäßen Herstellung der Nukleinsäure(sequenz) verwiesen.

Zu Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird angemerkt, daß die ersten und zweiten Chromosomen zwei beliebige normale Chromosomen des Genoms der Spezies des Spenders sind. Erfindungsgemäß können ferner auch DNA-Sonden dritter, vierter oder weiterer Chromosomen mit einer dritten, vierten oder weiteren Markierungen verwendet werden.

Zu Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird angemerkt, daß die Denaturierung der doppelsträngig vorliegenden Reaktionsprodukte in Einzelstränge auf Grundlage der Ausführungen zu Schritt (b) des vorstehend aufgeführten Verfahrens und dessen bevorzugte Ausführungsformen zur erfindungsgemäßen Herstellung der Nukleinsäuresequenz durchgeführt werden kann. Bei Verwendung dritter, vierter und weiterer unterscheidbare Markierungen haltender DNA-Sonden liegen zusätzlich erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäuresequenzen mit dritten, vierten und weiteren Markierungen vor.

Insbesondere werden in Schritt (f) als Vorbereitung für die Durchführung von Schritt (g) beispielsweise im vorstehend beschriebenen Isolierungsverfahren I die im Reaktionsgemisch doppelsträngig vorliegenden Reaktionsprodukte in einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle nach im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie Hitze-Denaturierung oder pH-abhängige Denaturierung mit HCl oder NaOH, überführt. Vorzugsweise wird eine Denaturierung ohne denaturierende Agentien durchgeführt. Beispielsweise kann das Trennen. der Reaktionsprodukte in Einzelstränge durch Erhitzen. des Reaktionsgemisches ("Denaturierung") auf etwa 90 bis 100 °C, vorzugsweise 95 °C, für etwa 1 bis 15 Minuten, vorzugsweise 5 Minuten, erreicht werden.

In einer anderen Ausführungsform kann es nach Beendigung von beispielsweise. Isolierungsverfahrens II für die Durchführung von Schritt (g) erforderlich sein, eine Denaturierung der angereicherten Nukleinsäuresequenzen wie oben beschrieben durchzuführen.

In Schritt (g) wird eine in situ Hybridisierung an normale erste und/oder zweite Chromosomen oder an normale DNA aus ersten und/oder zweiten Chromosomen durchgeführt. Bei Vorliegen einer Translokation zwischen DNA einer ersten und DNA eines zweiten Chromosoms in den zu analysierenden Zellen des Spenders enthält die in situ Hybridisierungsmixtur mindestens die erfindungsgemäßhergestellte einzelsträngige Nukleinsäuresequenz in einem für die in situ Hybridisierung geeigneten Puffer.

Im COMET ASSAY erfolgt die in situ Hybridisierung an elektrophoretisch in situ getrennte DNA-Fragmente aus Spender-DNA bzw. an elektrophoretisch in situ getrennte Kontroll-DNA von Zellen ohne Translokationsbruchpunkte zwischen den betreffenden Chromosomen.

Bei zusätzlicher Verwendung von Nukleinsäuresequenzen mit dritten, vierten und weiteren Markierungen erfolgt die in situ Hybridisierung zusätzlich mit dritten, vierten und weiteren Kontrollchromosomen, bzw. mit in situ getrennten DNA-Fragmenten.

Die Kontrollchromosomen können sich in Metaphasepräparaten befinden, die von sich teilenden Zellen der Spenderspezies nach bekannten Verfahren gewonnen wurden. Ein anderes erfindungsgemäßes Verfahren besteht in der Verwendung von Kontrollchromosomen, die nach flußzytometrischer Sortierung isolierter Chromosomen auf Objektträgern deponiert wurden. Die Deponierung erfolgt in der Weise, daß die Kontrollchromosomen der verschiedenen Typen räumlich voneinander getrennt werden. Erfindungsgemäß können die Chromosomen zur besseren Lokalisierung der Nukleinsäuresequenzen zusätzlich markiert werden, z.B. mit DNA-Farbstoffen ohne Sequenzspezifität, oder durch in situ Hybridisierung mit Kontroll-DNA-Sonden, die eine bei der Synthese der Nukleinsäuresequenz nicht verwendete Markierung tragen. Beispielsweise ist es nützlich, die Zentromerregion sowie die Telomerregionen von langem und kurzem Chromosomenarm unterschiedlich zu markieren.

Bei Verwendung des vorstehend beschriebenen Isolierungsverfahrens I für die Nukleinsäuresequenz enthält die in situ Hybridisierungsmixtur zusätzlich zu der erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäuresequenz noch andere Nukleinsäuren. Bei zwei Markierungen sind dies insbesondere die im Reaktionsgemisch Schritt (f) vorliegenden nicht-markierten DNA-Fragmente, markierte DNA-Sonden eines ersten und eines zweiten Chromosoms, sowie weitere einfach markierte Nukleinsäuren als Ergebnis des Reaktionsprozesses von DNA-Sonden und DNA-Fragmenten. In diesem Falle ist die Konzentration der erfin dungsgemäßhergestellten Nukleinsäure(sequenz) in der in situ Hybridisierungsmixtur wesentlich geringer. als die Gesamtkonzentration der übrigen hier genannten Nukleinsäuresequenzen.

Bei Verwendung des vorstehend beschriebenen Isolierungsverfahrens II für die Nukleinsäuresequenz liegt diese in einer im Vergleich zu Isolierungsverfahren I stark angereicherten Konzentration vor.

Für die allgemeinen Reaktionsbedingungen einer in situ Hybridisierung sind zahlreiche Protokolle bekannt. Im Folgenden sollen zur Durchführung der in situ Hybridisierungsreaktion einige Beispiele aufgeführt werden:
In situ Hybridisierungsbeipiel 1 (vgl. D. Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9138 (1988); P. Lichter u. T. Cremer, Human Cytogenetics, D.E. Rooney and B.H. Czepulkowski, eds., IRL Press Oxford, pp. 157ff (1992); C. Lengauer et al., Cancer Res. 52: 2590 (1992); A. Hagemeijer et al., Genes, Chromosomen & Cancer 8: 237 (1993); P.M. Kroisel et al., Cytogenet. Cell Genet. 65:97 (1994); H. Yokota et al., J. Cell Biology 130: 1239 (1995)):
Chromosomenpräparationen nach Methanol/Eisessigfixierung auf Glasobjektträgern oder Deckgläsern werden mit RNase A und Pepsin vorbehandelt, für 10 min in 3% Paraformaldehyd nachfixiert, und in 70% Ethanol aufbewahrt. Für die in situ Hybridisierungsreaktion wird eine 10 μl bis 30 μl Hybridisierungsmixtur 25 – 50 ng, oder 100 – 150 ng der erfindungsgsgemäßhergestellten, fluoreszenzmarkierten Nukleinsäure(sequenz) in Gegenwart von 3 bis 5 μg, oder 10 μg, oder 30 bis 100 μg unmarkierter, im Handel erhältlicher Cot1 DNA in 50% Formamid, 10% Dextransulfat in 1x SSC oder 2x SSC verwendet. 1xSSC ist eine wässrige Lösung von 150 mM NaCl und 15 mM Natriumcitrat. Die Hybridisierungsmixtur wird nach einer Behandlung von 2 bis 5 Minuten bei 70 °C zur Denaturierung der DNA für 1–3 Stunden bei 37 °C für das "Preannealing" belassen. Die Chromosomenpräparationen werden für 2 bis 5 Minuten bei 65 –75 °C in einer Denaturierungsmixtur von 50 – 70% deionisier tem Formamid in 1x bis 2x SSC, pH 7 – 7,5, behandelt und anschließend mit einer Alkoholreihe von 70%, 90% und 100 Ethanol bei 0 bis 10 °C dehydratisiert und luftgetrocknet. Statt der Alkohol-Dehydratisierung können die Chromosomenpräparationen auch in 70% Formamid/2x SSC aufbewahrt werden. Die in situ Hybridisierungsreaktion erfolgt anschließend durch Kombination der Chromosomenpräparation mit der Hybridisierungsmixtur nach Ende des "Preannealing" bei etwa 37 bis 42 °C für etwa 12 bis 96 Stunden. Anschließend erfolgen Waschschritte, z.B. dreimal je 10 Minuten in 50% Formamid, 2x SSC und 0,5% Tween 20 bei 44 °C, gefolgt von jeweils 5 Minuten-Waschungen in 4x SSC, 0,05% Tween 20 bei 44 °C sowie bei Raumtemperatur.
In situ Hybridisierungsbeispiel 2 (vgl. DE-A-47 69 546; D. Celeda et al., Cytometry 17: 13 (1994); F. Haar et al., Biotechniques 17: 346 (1994); M. Durm et al. Exp. Techn. Physics, im Druck; M. Durm et al., Z. f. Naturforsch., im Druck; M. Durm et al., zur Veröff. eingereicht)):
Es werden herkömmliche Chromosomenpräparationen nach Methanol/Eisessig Fixierung 1:3 verwendet. Die 10 bis 30 μl Hybridisierungsmixtur enthält 10 – 50 ng der erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäure(sequenz) in 10 mmol/l Tris-HCl, 3 mmol/l MgCl₂, 50 mmol/l KCl, 1 mg/l Gelatine, 2x SSC in deionisiertem Wasser (pH 7–8). Die Hybridisierungsmixtur wird bei 15 bis 25 °C auf die auf einem Objektträger befindliche Chromosomenpräparation aufgebracht, mit einem Deckglas bedeckt und das Deckglas mit einem Gummimaterial abgedichtet. Das so erhaltene, Chromosomenpräparation und Hybridisierungsmixtur enthaltende Präparat wird in einem Wasserbad für 5 Minuten auf etwa 85 – 95 °C erhitzt; alternativ oder zusätzlich kann auch elektromagnetische Mikrowellenstrahlung eingesetzt werden. Anschließend wird das Präparat in geeigneter Weise auf Temperaturen über 55 °C aber unter 77 °C für etwa 15 bis 150 Minuten abgekühlt. Nach der Hybridisierungsreaktion wird das Deckglas entfernt und die hybridisierte Chromosomenpräparation für 5 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Waschpuffer von 1x SSC oder mit 1x PBS ("Phos-phate buffered Saline", Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung): 0,2 g/l KCl, 0,2 g/l KH₂PO₄, 8g/l NaCl, 2,16 g/l Na₂HPO₄×7H₂O; pH 7) und 0,2 Tween 20 behandelt, oder für 5 Minuten in einer Lösung von 0,9% NaCl und 0,2% Tween 20 gewaschen.
In situ Hybridisierungsbeispiel 3 (vgl. M. Durm et al., Exp. Technique of Physics, im Druck; M. Kraus et al., Exp. Technique of Physics, im Druck):
Dieses Niedrigtemperaturverfahren eignet sich nur für bestimmte erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäuren, insbesondere für solche, die mit doppelsträngiger DNA Triplestränge ausbilden können.
Nach Standardverfahren fixierte Chromosomenpräparationen werden nach Behandlung mit Methanol/Eisessig 1:3 mit 100 Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Die Hybridisierungsmixtur (siehe in situ Hybridisierungsbeispiel 2) wird für 5 Minuten bei 94 °C, oder für 10 Minuten bei 84 °C erhitzt. Die Chromosomenpräparation wird auf Temperaturen zwischen etwa 37 und 52 °C erwärmt. Die Hybridisierungsmixtur (pH 7 –7,5) wird nach Abkühlung auf ≤ 52 °C hinzugegeben (siehe in situ Hybridisierungsbeispiel 2). Die Hybridisierungsreaktion des Präparates bestehend aus Chromosomenpräparation und Hybridisierungsmixtur wird ebenfalls bei Temperaturen zwischen etwa 37 und 52 °C durchgeführt. Die Waschprozedur erfolgt gemäß in situ Hybridisierungsbeispiel 2.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die im Reaktionsgemisch vorliegenden einfach markierten Nukleinsäuren und, bei Vorliegen einer Translokation, doppelmarkierten Nukleinsäuresequenzen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und somit wird eine Fluoreszenz-in situ Hybridisierung ("FISH") durchgeführt.
Die oben genannten in situ Hybridisierungsbeispiele sollen bei der Vielzahl der bekannten Möglichkeiten lediglich Auskunft über die Ausführbarkeit des Verfahrens geben und sind in keiner Weise als Beschränkung der vorliegenden Erfindung anzusehen. Die dabei verwendete FISH-Technik wird vorzugsweise ohne die Verwendung denaturierender Agentien durchgeführt (siehe in situ Hybridisierungsbeispiele 2 und 3). Es können jedoch auch herkömmliche FISH-Verfahren angewendet werden (siehe in situ Hybridisierungsbeispiel 1).
Als Targets für derartige "Mehrfarben-in situ Hybridisierungen" können normale Metaphasechromosomen aus normalen Zellen (Metaphasepräparate) oder normale Metaphasechromosomen aus normalen Zellen nach Anreicherung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung verwendet werden. Die erfindungsgemäße in situ Hybridisierung kann formal durch die Stringenz der in situ Hybridisierungsreaktion beschrieben werden. Der Begriff "Stringenz" umfaßt hier das Ausmaß der komplementären Paarung der Nukleinsäuresequenz oder eines zusammenhängenden Teiles von ihr mit der DNA des chromosomalen Targets bzw. der Target-DNA beim COMET ASSAY. Eine Stringenz von beispielsweise 90% bedeutet, daß von 100 aufeinanderfolgenden Basen der Nukleinsäuresquenz 90 in komplementärer Weise gepaart sind. Durch die Kinetik der in situ Hybridisierungsreaktion kann die Stringenz in ihrem zeitlichen Verlauf geändert werden. Die Parameter der Reaktion sind so zu wählen, daß nach der Hybridisierungszeit t die zeitabhängige Stringenz S(t) zu der erfindungsgemäßen in situ Hybridisierungsmarkierung führt.
Die Stringenz S(t) der in situ Hybridisierung kann zum Beispiel durch die Konzentration der zugesetzten Menge an denaturierenden Agentien variiert werden. Bei in situ Hybridisierungsverfahren ohne denaturierende Agentien kann die Stringenz insbesondere durch Abänderung der Parameter (i) Hybridisierungstemperatur und (ii) Hybridisierungszeit variiert werden. Weitere Parameter sind zum Beispiel die Ionenstärke der Hybridisierungsmixtur, der Kondensationsgrad der Targets, die Länge der DNA-Sonden, sowie deren Markierungsart. Bei in situ Hybridisierung an Kontrollchromosomen wird die Stringenz der in situ Hybridisierung so geregelt, daß eine komplementäre Paarung eines zusammenhängenden Teiles der Basensequenz der Nukleinsäuresequenz für die Bindung ausreichend ist. Beispielsweise kann die Stringenz so gewählt werden, daß die Bindung von 300 – 500 aufeinander folgenden Basen der Nukleinsäuresequenz genügt.
Bei in situ Hybridisierung an elektrophoretisch getrennte DNA-Targets im COMET ASSAY wird die Stringenz so hoch gewählt, daß eine stabile Bindung der erfindungsgemäßen, nach beispielsweise Isolierungsverfahren II isolierten Nukleinsäuresequenz nur dann zustande kommt, wenn die Nukleinsäuresequenz in ihrer gesamten Länge mit hoher Komplementarität hybridisiert.
Außer chromosomalen Targets wird als ein weiteres Target für die in situ Hybridisierung auch die mithilfe des COMET ASSAY oder verwandter Verfahren präparierte DNA individueller Zellen angesehen. Bei dem COMET ASSAY (O. Östling and K.J. Johanson, Biochem. Biophys. Res. Commun. 123: 291. (1984); P.L. Olive and J.P. Banath, Exp. Cell Res. 221: 19 (1995)) werden Zellen nach Einbettung in flüssige Agarose auf einem Träger ausplattiert und nach Ausbildung eines Agarose-Gels in situ lysiert. Die DNA der einzelnen Zellen wird dann in einem elektrischen Feld in situ getrennt. Je kleiner die Fragmentlänge ist, umso größer ist der Anteil der migrationsfähigen DNA. Für die in situ Hybridisierung der erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäuresequenzen an die elektrophoretisch aufgetrennten DNA-Targets nach Durchführung der COMET ASSAY Präparation werden beispielsweise nach Isolierungsverfahren II gewonnene Nukleinsäuresequenzen verwendet. Die Denaturierung der DNA-Targets bzw. die in situ Hybridisierungsreaktion kann hier ohne weitere Maßnahmen nicht bei hohen Temperaturen (siehe in situ Hybridisierungsbeispiele 1 und 2 zur FISH-Technik) erfolgen, da sonst das Agarose-Gel. schmilzt und die Zellen sowie die elektrophoretisch getrennten DNA-Targets weggespült werden können. Eine ausführbare Lösung besteht darin, die Denaturierung der DNA-Targets unterhalb von etwa 40 bis 45 °C mithilfe von chemi schen Agentien durchzuführen, z.B. 0,1 mol/l HCl oder 1 mol/l NaOH. Die Denaturierung der erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäuresequenz erfolgt getrennt; vgl. in situ Hybridisierungsbeispiele 1 und 2 zur FISH-Technik. Die Stringenz der in situ Hybridisierungsbedingungen wird so gewählt, daß nur solche Nukleinsäuresequenzen an das DNA-Target binden, die mit der überwiegenden Mehrheit ihrer Basen eine komplementäre Verbindung eingegangen sind. In diesem Falle zeigt eine Detektion einer zweifach markierten Nukleinsäuresequenz in der DNA der Zellen nach dem COMET ASSAY einen Translokationsbruchpunkt an. Dieser Translokationsbruchpunkt ist identisch mit einem Translokationsbruchpunkt in den Zellen, aus welchen die für die Synthese der Nukleinsäuresequenz verwendeten genomischen DNA Fragmente isolier wurden.
Beispielsweise werden erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenze)n unter Verwendung von DNA aus Tumorgewebe T1 isoliert. Nach dem COMET ASSAY werden Zellen aus einem Tumorgewebe T2 isoliert und als Target für die in situ Hybridisierung, wie oben beschrieben, verwendet. Eine Bindung der durch ihre Markierung detektierbaren Nukleinsäuresequenz zeigt das Vorhandensein der spezifischen Translokation von T1 auch in T2 an. Dies ist zur vergleichenden Charakterisierung von Tumorgewebe von erheblichem, auch klinischem Interesse. Ein Anwendungsbeispiel wäre die Kontrolle von therapeutischen Maßnahmen. Zum Beispiel kann die erfindungsgemäßhergestellte Sequenz nach beispielsweise Isolierungsverfahren II aus DNA von Tumorgewebe eines Patienten vor Beginn der Behandlung isoliert werden, sowie zu verschiedenen Zeiten während der Therapie. Der Vorteil des COMET ASSAY besteht darin, daß hier keine Chromosomenpräparationen benötigt werden. Der damit verbundene Verzicht auf chromosomale Zuordnung kann in bestimmten Fällen hingenommen werden.
In Schritt (h) wird die in situ Hybridisierung ausgewertet. Beispielsweise werden bei in situ Hybridisierung an Chromosomen in Metaphasepräparaten unter Verwendung von beispielsweise nach Isolierungsverfahren I gewonnenen Nukleinsäurese quenzen in einem ersten Auswertungsschritt die Chromosomen identifiziert, die überwiegend eine erste Markierung, eine zweite Markierung, usw., tragen. Bei Verwendung sortierter Kontrollchromosomen kann dieser Auswertungsschritt entfallen, da die Chromosomen bereits aufgrund des Sortierungsverfahrens identifiziert wurden. In diesem Falle oder bei Verwendung anderweitig identifizierter Kontrollchromosomen ist es vorteilhaft, nach Isolierungsverfahren II gewonnene Nukleinsäureserquenzen einzusetzen. In einem zweiten Verfahrensschritt werden die Orte der erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäuresequenzen auf den Kontrollchromosomen detektiert. Die Identifikation einer Nukleinsäuresequenz auf einem ersten Kontrollchromosom erfolgt beispielsweise aufgrund seiner zweiten Markierung, gegebenfalls auch weiterer, von der ersten unterscheidbaren Markierungen. Die Identifikation einer Nukleinsäuresequenz auf einem zweiten Kontrollchromosom erfolgt beispielsweise aufgrund seiner ersten Markierung, ggf. auch weiterer, von der zweiten Markierung unterscheidbaren Markierungen, usw. Die Ortsbestimmung der Nukleinsäuresequenzen auf den Kontrollchromosomen erfolgt durch Angabe ihrer relativen Position auf langem bzw. kurzem Arm in Bezug auf Zentromer, Telomere, sowie ggf. weiterer Kontrollmarkierungen.
Da bei erfindungsgemäßer Hybridisierung jede Nukleinsäuresequenz nur eine Bindungsstelle pro individuellem Chromosom besitzt, sind in der Regel mehrere, ggf. auch viele Chromosomen auszuwerten, um zu einem sicheren Ergebnis über Vorhandensein und Ort einer Translokationsbruchstelle zu gelangen. Beispielsweise befinden sich bei dem Isolierungungsverfahren I für die Nukleinsäuresequenz noch weitere Nukleinsäuremoleküle in der Hybridisierungsmixtur, die mit der Nukleinsäuresequenz um dieselbe Bindungsstelle auf den Kontrollchromosomen konkurrieren. Bei der Bindungsstelle auf einem ersten Kontrollchromosom sind beispielsweise diese weiteren Nukleinsäuremoleküle: (i) die DNA-Sonde mit einer ersten Markierung und (ii) das zu der Bindungsstelle komplementäre, nicht-markierte DNA-Fragment. Wie häufig eine Bin dung der Nukleinsäuresequenz an die Bindungsstelle erfolgen kann, hängt von ihrer relativen Häufigkeit in der Hybridisierungsmixtur ab. Bei Verwendung des Isolierungsverfahrens II kann diese relative Häufigkeit erheblich vergrößert und damit die Anzahl der auszuwertenden Chromosomen erheblich reduziert werden. Die Auswertung kann durch Verfahren der automatischen digitalen Bildanalyse unterstützt werden, die eine Identifizierung von Chromosomen sowie einzelner Hybridisierungsorte ermöglichen (P. Emmerich et al., Exp. Cell Res. 181: 126 (1989); S.Popp et al., Kerntechnik 55: 204 (1990); C. Cremer et al., J. Radiat. Res. (Japan), Suppl., 33: 189 (1992); J.A. Fantes et al., Int. J. Radiat. Biol. 68: 263 (1995)).
Zur Auswertung gibt es im Stand der Technik bekannte Verfahren, z.B. auf cytochemischer Basis oder zeitaufgelöste mikroskopische Fluoreszenzverfahren (L. Seveus et al., Cytometry 13: 329 (1992); T. Gadella et al., Biophys. Chemistry 48: 221 (1993)). Diese Verfahren erlauben es, die Autofluoreszenz eines biologischen Objektes bzw. die Fluoreszenz eines anderen Farbstoffes mit Fluoreszenz-Emission gleicher Wellenlänge von der Fluoreszenz des Hybridisierungssignals zu trennen. Voraussetzung hierfür ist ein ausreichender Unterschied in den Fluoreszenzabklingzeiten. Beispielsweise beträgt die Fluoreszenzabklingzeit der Autofluoreszenz 100 Nanosekunden und weniger. Die Abklingzeiten von Fluoreszein und Rhodaminen beträgt weniger als 10 Nanosekunden. Die Fluoreszenzabklingzeiten von Lanthanid-Chelat-Verbindungen hingegen betragen 10 bis 1000 Mikrosekunden. Derartige Fluorochrome mit sehr unterschiedlichen Abklingzeiten können direkt oder indirekt an DNA-Sonden gekoppelt werden. Beispielsweise kann eine Europium-Verbindung bei einem Überschuß eines anderen Fluorochroms mit stark unterschiedlicher Abklingzeit noch bei einem Überschuß von 1×10⁶ detektiert werden. Ein normales Metaphasechromosom, beispielsweise das menschliche X-Chromosom, besteht aus etwa 160 Millionen Basenpaaren, die in Chromosomenpräparaten ein Volumen von ca. 10 μm³ einnehmen. Das bei einem herkommlichen Fluoreszenzmikroskop aufgrund der Auflösung detektierte Volumen des Metaphasechromosoms beträgt ca. 1 μm³, worin sich etwa 16 Millionen Basenpaare mit Autofluoreszenz oder anderer Markierung stark unterschiedlicher Abklingzeit befinden. Geht man beispielsweise von einer zu detektierenden, erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäuresequenz von 200 bis 500 Basenpaaren aus, so ist der Überschuß an anderweitig gefärbter DNA in dem zu analysierenden Volumen ca. 3×10⁴ mal bis 8×10⁴ mal, also um mehr als eine Größenordnung geringer als der tolerierbare Überschuß von 1×10⁶ mal. Durch konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenzverfahren kann das Detektionsvolumen und damit der zu tolerierende Überschuß noch erheblich weiter eingeschränkt werden. Dieses Beispiel soll lediglich die Ausführbarkeit des Detektionsverfahrens zeigen. Alternative Detektionsverfahren sind ebenfalls im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung, sofern sie zu einem Nachweis der Nukleinsäuresequenz auf Metaphasechromosomen bzw. in COMET ASSAY Präparationen führen.
Erfindungsgemäß verwendete Detektionsverfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Nachweis von fluoreszenzmarkierten DNA-Strängen von einigen hundert Basen und weniger bei Fluoreszenz-in situ Hybridisierungsverfahren (FISH) erlauben.
Beispielsweise können die an ein erstes Chromosom hybridisierten, mit Fluoreszenzfarbstoffen einfach markierten Nukleinsäuren und, bei Vorliegen einer Translokation, die hybridisierten, mit Fluoreszenzfarbstoffen doppelmarkierten Nukleinsäuresequenzen einer hochempfindlichen Fluoreszenzdetektion, wie oben beschrieben, unterworfen werden. Hierbei ist unter geeigneten Stringenzbedingungen und bei Vorliegen einer Translokation der nicht-hybridisierende Teil der doppeltmarkierten Nukleinsäuresequenz komplementär zu einem Abschnitt auf einem zweiten Chromosom; d.h. die an das chromosomale Target bzw. gebundene, doppelmarkierte Nukleinsäuresequenz stellt die Bruchpunktregion dar. In diesem Zusammenhang sollte angemerkt werden, daß auch bei hoher Stringenz eine Anlagerung eines nur in einem zusammenhängenden Teilabschnitt komplementären Moleküls erreicht werden kann. Dies ergibt sich aus der bekannten Tatsache, daß in situ Hybridisierungen mit Phagen-DNA, die komplementäre menschliche DNA-Abschnitte ("Inserts") enthalten, an menschliche chromosomale Targets zu in situ Markierungen mit hoher Stringenz der Hybridisierung des Inserts realisiert werden können.
Unter Verwendung höherer Stringenzbedingungen kann bei Verwendung des COMET ASSAY erreicht werden, daß eine nach Isolierungsverfahren II gewonnene, doppeltmarkierte Nukleinsäuresequenz mit der überwiegenden Mehrheit ihrer Basen auf ihrer ganzen Länge an das DNA-Target bindet. Auf diese weise werden Nukleinsäuremoleküle des Spenders markiert, die einen entsprechenden Translokationsbruchpunkt enthalten.
Mit hochempfindlichen Detektionsverfahren wird dann der Ort der gemischtfarbigen bzw. doppelmarkierten Moleküle auf den normalen Chromosomen detektiert. Die hierzu erforderliche Ausrüstung ("Hardware") kann in verschiedenen Ausführungen gewählt werden. Im folgenden werden einige Ausführungsbeispiele aufgezeigt.
Auswertungsbeispiel 1 (L. Seveus et al., Cytometry 13: 329 (1992)):
Es wird ein herkömmliches Epifluoreszenzmikroskop verwendet, das für zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion eingerichtet ist. Bei Markierung der erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäure(sequenz) mit langlebigen Fluorochromen im Bereich von einigen hundert Mikrosekunden wird beispielsweise eine gepulste Xenon-Blitzlampe zur Anregung verwendet. Im Strahlengang der Fluoreszenzemission befindet sich eine rotierende Chopperplatte. Diese erlaubt es, das Fluoreszenzlicht mit einer gewissen Zeitverzögerung nach dem Anregungspuls zu detektie ren. Zur Detektion kann eine gekühlte CCD ("Charged Coupled Device")-Kamera verwendet werden.
Auswertungsbeispiel 2 (T. Gadella et al., Biophys. Chemistry 48: 221 (1993)):
Es wird eine kontinuierliche Laseranregungsquelle in Verbindung mit einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop verwendet, die mit hoher Frequenz, z.B. 25 – 80 MHz, moduliert wird. Die Lebensdauer der modulierten Fluoreszenzemission kann aus der Phasenverzögerung und der Modulationstiefe des Fluoreszenzsignals relativ zu dem Signal des Anregungslichtes bestimmt werden, wobei zur Detektion eine gekühlte, hochsensitive CCD-Kamera mit Bildverstärker verwendet wird. Es sind hiermit Lebensdauermessungen im Bereich von wenigen Nanosekunden, zum Beispiel von Rhodamin-Farbstoffen, möglich.
Auswertungsbeispiel 3:
Es wird eine Epifluoreszenzbeleuchtungseinrichtung eingesetzt, bei der die Emission eines gepulsten Titan-Saphirlasers mit Pulsen im 100 Femtosekundenbereich (vgl. P. Hänninen et al., Appl. Phys. Lett. 66: 1698 (1995)) statt einer Xenonblitzlampe, und eine Streak-Kamera zur hoch-zeitaufgelösten Detektion der spektralen Fluoreszenzemission verwendet wird. Damit ist es ebenfalls möglich, Fluorochrome mit Lebensdauerhalbwertszeiten im Nanosekundenbereich, zum Beispiel Rhodaminderivate, zu verwenden.
Auswertungsbeispiel 4:
Zur Registrierung bzw. Aufzeichnung der Fluoreszenzemission der erfindungsgemäßhergestellten Nukleinsäuresequenz wird ein konfokales Laserscanning-Fluoreszenzmikroskop (vgl. C. Cremer u. T., Cremer, Microsc. Acta 81: 31 (1978); G. Brakenhoff et al., Nature 317: 748 (1985); R.W. Wijnaendts van Resandt et al., J. Microsc. 138: 29 (1985)) verwendet, wobei die Scanning-Geschwindigkeit, die Repetitionsrate, die Optik des Detektionsstrahlenganges, sowie die Lichtdetektionselemente und ihr Rauschverhalten so angepaßt werden, daß eine ausreichende Fluoreszenzquantenstatistik bei ausreichendem Signal/Rausch-Verhältnis realisiert wird. Geht man von einem effektiven konfokalen Detektionsvolumen von 0,02 μm³ aus, so wird bei Verwendung einer herkömmlichen Chromosomenpräparation die Fluoreszenzemission von insgesamt etwa 3×10⁵ Basenpaaren detektiert. Da mit der konfokalen Detektionsmethode auch bei Verwendung von Fluorochromen gleicher Fluoreszenzlebensdauer, aber verschiedener spektraler Fluoreszenzemission, ein DNA-Abschnitt mit einer Markierung "1" bei Vorliegen eines 1000-fachen Überschusses von DNA-Abschnitten einer Markierung "2" gemessen werden kann, kann eine erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenz) detektiert werden. Sofern im vorliegenden Beispiel von einem solchen Verhältnis ausgegangen wird, kann noch ein 300 bp langer DNA-Abschnitt mit einer Markierung "1" detektiert werden.
Auswertungsbeispiel 5:
Für die Fluoreszenzdetektion wird ein optisches Fluoreszenznahfeldmikroskop verwendet (vgl. E.Betzig et al., Bioimaging 1: 129 (1993); E. Monson et al., Ultramicroscopy 57: 257 (1995); G. Tarrach et al., Rev. Sci. Instr. 66:3569 (1995)). In einer bevorzugten Ausführungsform der Fluoreszenznahfeldmikroskopie wird das Objekt mithilfe einer feinen Spitzenapertur zur Bündelung des anregenden Laserlichtes Punkt für Punkt beleuchtet. Die Fluoreszenzemission wird von einem Mikroskopobjektiv hoher numerischer Apertur gesammelt und mit hochlichtempfindlichen Sensoren registriert.
Durch die Fluoreszenznahfeldmikroskopie kann das effektive Detektionsvolumen auf etwa 0,0003 bis 0,00003 μm³ eingeschränkt werden. Bei einer wie oben angenommenen DNA-Dichte von 16 Millionen Basenpaaren pro μm³ werden dann etwa 5.000 bis 500 Basenpaare registriert. Befindet sich die erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäuresequenz im Detektionsvolumen, so beträgt der Überschuß der nicht-informativen DNA-Moleküle bei einem Detektionsvolumen von 0,0003 μm³ höchstens einen Faktor von etwa zehnmal. Bei dem kleineren Detektionsvolumen von 0,00003 μm³ trägt praktisch nur noch die erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäuresequenz zur detektierten Fluoreszenzemission bei. In beiden Fällen ergibt sich ein besonders hoher Kontrast zwischen chromosomalen bzw. DNA-Orten mit und ohne die Bindung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure(sequenz).
Werden statt chromosomaler Targets die DNA COMET ASSAY-Targets untersucht, so kann die Detektion der erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenz) vereinfacht werden, wenn der Überschuß an anderen markierten DNA-Sequenzen wegen der geringeren Konzentration aufgrund der elektrophoretischen Trennung geringer ist.
Bei Vorliegen einer oder mehrerer Translokationen zwischen einem ersten und zweiten Chromosom. können auf dem ersten Chromosom der Ort bzw. die Orte einer bis hinunter zu einigen hundert by langen Sequenz der zweiten Fluoreszenzmarkierung und auf dem zweiten Chromosom der Ort bzw. die Orte einer bis hinunter zu einigen hundert by langen Sequenz der ersten Fluoreszenzmarkierung nachgewiesen werden. Die Bruchstellen können ggf. nunmehr isoliert, amplifiziert, und ihre Zuordnung zu anderen Sequenzen bzw. ihre Lokalisation auf diesen Chromosomen näher untersucht werden.
Liegt eine große Zahl zufallsverteilter Translokationsbruchpunkte vor, so kann zwischen dem ersten und dem zweiten Chromosomen ein Fluoreszenzverhältnis von zweiter Markierung/erster Markierung bzw. erster Markierung/zweiter Markierung berechnet werden, das von dem der anderen Chromosomen abweicht. Bei Auftreten von Häufungsstellen der Translokationsbruchpunkte wird die lokale Verteilung der zweiten Markierung auf dem ersten Chromosom bzw. der ersten Markierung auf dem zweiten Chromosom unterschiedlich sein, d.h. von einer homogenen Mischfärbung abweichen.
Die in situ Hybridisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mit verschiedenen DNA- oder Chromosomen-Präparaten durchgeführt werden. Beispielsweise werden bei der Einzelzell-Gelelektrophorese die Zellen nach Einwirkung DNA-schädigender Substanzen in situ lysiert und eine Elektrophorese durchgeführt (vgl. vorstehend beschriebenen COMET ASSAY). Liegt eine Fragmentierung von DNA der betreffenden Zellen vor, so entsteht eine Art "Kometenschweif" in der Nähe der betreffenden Zellen. Bislang wurde lediglich die Bruchstückverteilung gemessen. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere die in situ Hybridisierung nach Schritt (g) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann Aufschluss darüber geben, wie häufig in der fragmentierten DNA der "Kometenschweife" entsprechende Translokationen auftreten.
Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf normale Zellen eines Spenders (z.B. aus archiviertem Material) ist ebenfalls von Interesse. Bei bekannten Bruchpunktregionen bietet die herkömmliche Fluoreszenz-in situ Hybridisierung an Interphasekerne eine überlegene Möglichkeit der Analyse. Das Verfahren ist jedoch ohne Kenntnis der genauen Bruchpunktsequenzen nicht ökonomisch. Dieser Nachteil kann durch das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt werden, worin in Schritt (g) eine in situ Hybridisierung an normale Chromosomen des Spenders durchgeführt wird. Die in situ Hybridisierung an zelluläre DNA des Spenders (z.B. aus archiviertem Biopsie-Material) nach Durchführung des COMET ASSAY kann Informationen über die Variabilität des Auftretens von Translokationsereignissen in dem untersuchten Gewebe ergeben und so von prognostischer Bedeutung sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen kann auch mit mehr als zwei Chromosomen, insbesondere bei Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleinsäuresequenzen und Auswertung über Fluoreszenzlebensdauermessungen, durchgeführt werden.
Beispielsweise werden zur erfindungsgemäßen Herstellung der Nukleinsäure(sequenze)n außer DNA-Sonden, die für ein erstes Chromosom spezifisch sind und eine erste Markierung tragen, und DNA-Sonden, die für ein zweites Chromosom spezifisch sind und eine zweite Markierung tragen, zusätzlich noch DNA-Sonden eines dritten Chromosoms mit einer dritten Markierung, eines vierten Chromosoms mit einer vierten Markierung usw. genommen. Beispielsweise können fünf verschiedene Markierungen aufgrund ihres Fluoreszenzemissionsspektrums voneinander unterschieden werden. Damit können mindestens fünf verschiedene Markierungen durchgeführt werden. Eine Translokation liegt vor, wenn bei in situ Hybridisierung mit den in analoger weise wie bei zwei Markierungen hergestellten Nukleinsäuresequenzen auf einem normalen Chromosom mit einer bestimmten Markierung, z.B. einer dritten Markierung, eine hybridisierte DNA-Sonde mit einer ersten oder zweiten oder vierten oder fünften Markierung detektiert wird. Damit können gleichzeitig Translokationsbruchstellen von fünf verschiedenen Chromosomen nachgewiesen werden.
Bei zusätzlicher Verwendung von Markierungen mit unterschiedlichen Lebensdauern können noch weitere Translokationsbruchstellen detektiert werden. Eine erste Markierung kann z.B. mit einer Fluoreszenzemission F1 und einer Fluoresszenzlebensdauer T1 erfolgen; eine zweite Markierung kann mit F1 und einer Fluoreszenzlebensdauer T2 erfolgen; eine dritte Markierung mit F1, T3; eine vierte mit F1, T4; eine fünfte mit F1, T5; eine sechste mit einer Fluoreszenzemission F1, T1; eine sechste mit F1, T2; ... eine (n)te mit Fn, Tn. Translokationsbruchpunkte zwischen Material von beispielsweise einem 9. und einem 22. Chromosoms bei erfindungsgemäßer Hybridisierung an normale Chromosomenpräparate werden demgemäß dadurch detektiert, daß auf einem normalen Chromosom mit einer 9. Markierung eine hybridisierte DNA-Sonde mit einer 22. Markierung entdeckt wird, sowie auf einem normalen Chromosom mit einer 22. Markierung eine hybridisierte DNA-Sonde mit einer 9. Markierung nachgewiesen wird.
Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren derart modifiziert werden, daß gleichzeitig Translokationsbruchpunkte von bei spielsweise allen 24 menschlichen Chromosomentypen detektiert werden können.
1 ist eine schematische Darstellung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen.
Um eine möglichst große Klarheit der schematischen Darstellung zu ermöglichen, wird die zeichnerische Darstellung im folgenden auf DNA-Moleküle beschränkt, die von einem ersten normalen Chromosom (Chr A) und einem zweiten normalen Chromosom (Chr B) stammen. Die Erweiterung des Verfahrens auf weitere Chromosomen ist vorstehend ausführlich erläutert worden.
1A zeigt genomische, doppelsträngige DNA-Moleküle eines Spenders nach Isolierung und ggf. Amplifizierung. Doppelsträngige DNA-Moleküle, die nicht von Chr A oder Chr B stammen, werden als "übrige" DNA-Moleküle bezeichnet; vgl. Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1B zeigt doppelsträngige DNA-Bruchstücke der Spender-DNA nach Fragmentierung auf z.B. 1–2 kbp lange Bruchstücke, beispielsweise mithilfe von Restriktionsendonukleasen.
Die Lösung enthält: DNA-Fragmente (A) von Spender-DNA, die in ihrer Basenabfolge Sequenzen eines ersten normalen Chromosoms (Chr A) entsprechen; DNA-Fragmente (B) von Spender-DNA, die in ihrer Basenabfolge Sequenzen eines zweiten normalen Chromosoms (Chr B) entsprechen; DNA-Fragmente (AB) von Spender-DNA, in denen eine Fusion bzw. Translokation von Sequenzen aus Chr A und Chr B vorliegt; diese letzteren Stücke repräsentieren die Spender-DNA an einem Translokationsbruchpunkt zwischen DNA eines ersten Chromosom Chr A und DNA eines zweiten Chromosoms Chr B; übrige DNA-Fragmente, die weder von Chr A noch von Chr B stammen; vgl. Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1C zeigt die DNA-Fragmente der Spender-DNA von 1B nach der Denaturierung. Als Ergebnis befinden sich in der Lösung: einzelsträngige DNA-Moleküle (A*) aus der Denaturierung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten (A); einzelsträngige DNA-Moleküle, (B*) aus der Denaturierung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten (B); einzelsträngige DNA-Moleküle (A*B*) aus der Denaturierung von doppelsträngigen DNA-Fragmenten (AB); einzelsträngige DNA-Moleküle mit "übrigen" Sequenzen der Spender-DNA; vgl. Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1D zeigt die Hybridisierung unter Verwendung der in 1C dargestellten, denaturierten DNA-Fragmente, auch Einzelstränge genannt, als Matrize, sowie DNA-Sonden, die von einem ersten normalen Chromosom (Chr A) stammen und eine erste Markierung F1(A) tragen, sowie DNA-Sonden, die von einem zweiten normalen Chromosom (Chr B) stammen und eine zweite Markierung F1(B) tragen. Die DNA-Sonden von Chr A hybridisieren an denaturierte DNA-Fragmente (A*), sowie an den zu ihnen komplementären Abschnitt der denaturierten DNA-Fragmente (A*B*); die DNA-Sonden von Chr B hybridisieren an denaturierte DNA-Fragmente (B*), sowie zu den zu ihnen komplementären Abschnitt der denaturierten DNA-Fragmente (A*B*). Unter geeigneten Reaktionsbedingungen enthält die Lösung noch "übrige" DNA-Moleküle, die nach Ende der Reaktion meist doppelsträngig vorliegen und die weder eine Fluoreszenzmarkierung F1(A) noch eine Fluoreszenzmarkierung F1(B) tragen; vgl. Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1E zeigt die erfindungsgemäße Synthese der Nukleinsäure(sequenz) unter Verwendung der an die Einzelstränge (A*B*) hybridisierten DNA-Sonden von Chr A und Chr B; vgl. Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1F zeigt die erfindungsgemäße Isolierung der Nukleinsäure(sequenz). Als Beispiel ist das Isolierungsverfahren I dargestellt, das auf einer einfachen Denaturierung beruht. Insbesondere befindet sich in der Lösung nach Durchführung des Denaturierungschrittes die einzelsträngige, erfindungsgemäßhergestellte Nukleinsäure(sequenz) mit ersten Fluoreszenzmarkierungen F1(A) und zweiten Fluoreszenzmarkierungen F1(B); die Nukleinsäuresequenz hat eine zu dem als Matrize dienenden Einzelstrang (A*B*) komplementäre Basenabfolge. Darüber hinaus befinden sich bei Isolierungsverfahren I noch in der Lösung: mit F1(A) markierte DNA-Moleküle mit einer zu (A*) komplementären Basenabfolge; mit F1(B) markierte DNA-Moleküle mit einer zu (B*) komplementären Basenabfolge; sowie übrige nicht-markierte einzelsträngige Sequenzen anderer Chromosomen als Chr A oder Chr B. Sequenzen anderer Chromosomen mit einer auch auf Chr A oder Chr B vorkommenden Basenabfolge können ebenfall mit F1(A) oder F1(B) markiert sein. Dies betrifft insbesondere repetitive Sequenzen (R); vgl. Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1G zeigt das Ergebnis der Auswertung der gemäß Schritt (g) durchgeführten in situ Hybridisierung der nach Isolierungsverfahren I oder II gewonnenen Nukleinsäuresequenz an normale erste Chromosomen Chr A und zweite normale Chromosomen Chr B.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführung sind die Translokationsbruchstellen durch das Auftreten von zweiten Markierungen F1(B) auf ersten Chromosomen Chr A bzw. von ersten Markierungen F1(A) auf zweiten Chromosomen Chr B zu erkennen. Die übrigen Chromosomen, soweit in der Präparation vorhanden, tragen bei erfindungsgerechter Durchführung der in situ Hybridisierung keine erste oder zweite Markierung. Insbesondere bei Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach Isolierungsverfahren I ist hierzu die Suppression repetitiver Sequenzen vorteilhaft; vgl. Schritt (h) des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure, die für einen Translokationsbruchpunkt auf einem Chromosom spezifisch ist, umfassend einen ersten Sequenzabschnitt, der zu einer DNA-Sequenz eines ersten Chromosoms komplementär ist, zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und mindestens eine erste Markierung aufweist, und einen zweiten Sequenzabschnitt, der zu einer DNA-Sequenz eines zweiten Chromosoms komplementär ist, zur Hybridisierung an diese DNA-Sequenz befähigt ist und mindestens eine zweite Markierung aufweist, wobei die erste und die zweite Markierung unterschiedlich sind umfassend die Schritte: (a) Spaltung von genomischer DNA, die mindestens einen Translokationsbruchpunkt zwischen zwei Chromosomen aufweist, in DNA-Fragmente, (b) Denaturierung der DNA-Fragmente in Einzelstränge, (c) Hybridisierung der Einzelstränge mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung aufweisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz, (d) Synthese der Nukleinsäure unter Verwendung der Einzelstränge als Matrize in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nu kleinsäuren geeigneten Agens und einem zur Verknüpfung von Nukleinsäuren geeigneten Agens, (e) Isolierung der Nukleinsäure aus dem Reaktionsgemisch, wobei der erste Sequenzabschnitt der Nukleinsäure eine DNA-Sonde vom ersten Satz und der zweite Sequenzabschnitt der Nukleinsäure eine DNA-Sonde vom zweiten Satz umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zur Synthese von Nukleinsäuren geeignete Agens die Taq-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerse I, die E. coli DNA-Polymerase I oder die Reverse Transkriptase ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das zur Verknüpfung von Nukleinsäuren geeignete Agens die T4-DNA Ligase, E. coli Ligase, oder eine andere zur Verknüpfung geeignete Polymerase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Markierungen an Nukleotide gekoppelte Fluoreszenzfarbstoffe und/oder Biotin und/oder Digoxigenin und/oder mit radioaktiven Isotopen markierte Nukleotide umfassen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste und zweite Markierung unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe sind.
Verfahren zum Nachweis von Translokationen zwischen Chromosomen und von Translokationsbruchpunkten auf Chromosomen, umfassend die Schritte: (a) Isolierung von zu untersuchender genomischer DNA aus geeignetem zellulären Material eines Spenders, (b) Spaltung der genomischen DNA in doppelsträngige DNA-Fragmente, (c) Denaturierung der doppelsträngigen DNA-Fragmente in Einzelstränge, (d) Hybridisierung der Einzelstränge mit einem ersten Satz von DNA-Sonden, die eine erste Markierung aufweisen und für ein erstes Chromosom spezifisch sind, und mit einem zweiten Satz von DNA-Sonden, die eine zweite Markierung aufweisen und für ein zweites Chromosom spezifisch sind, in einem Reaktionsansatz, (e) Synthese von Nukleinsäuren unter Verwendung der Einzelstränge als Matrize in Gegenwart von Nukleotiden und mindestens einem zur Synthese von Nukleinsäuren geeigneten Agens und einem zur Verknüpfung von Nukleinsäuren geeigneten Agens, wobei doppelsträngig vorliegende Reaktionsprodukte hergestellt werden, (f) Denaturierung der doppelsträngig vorliegenden Reaktionsprodukte in Einzelstränge, wobei im Reaktionsgemisch einzelsträngige Nukleinsäuren mit der ersten Markierung, einzelsträngige Nukleinsäuren mit der zweiten Markierung und, bei Vorhandensein einer Translokation zwischen dem ersten und dem zweiten Chromosom des Spenders, Nukleinsäuren gemäß der Definition in Anspruch 1 vorliegen, (g) in situ Hybridisierung der einzelsträngigen Nukleinsäuresequenzen mit einem ersten und zweiten Kontroll-Chromosom ohne Translokationen, oder mit durch Einzelzellgelelektrophorese getrennter DNA und (h) Auswertung der in situ Hybridisierung über die unterschiedlichen Markierungen der Nukleinsäuren von Schritt (f).
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das zur Synthese von Nukleinsäuren geeignete Agens die Taq-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerse I, die E. coli DNA-Polymerase I oder die Reverse Transkriptase ist.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das zur Verknüpfung von Nukleinsäuren geeignete Agens die T4-DNA Ligase, E. coli Ligase, oder eine andere zur Verknüpfung geeignete Polymerase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die erste und zweite Markierung unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei der Spender ein Mensch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei der Spender nichtmenschlich ist und der Gruppe der Mammalia angehört.