DE3717212A1

DE3717212A1 - Verfahren zur untersuchung einer azellularen biologischen fluessigkeit auf zellulare onkogen-transkripte bzw. deren fragmente

Info

Publication number: DE3717212A1
Application number: DE19873717212
Authority: DE
Inventors: Viktor Dr Dr Med Balazs; Margit Dr Rer Balazs-Froehlich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1987-05-22
Publication date: 1988-12-08
Also published as: WO1988009385A1; EP0360822A1; JPH03502518A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zellularen Onko gen-Transkripten, bzw. deren Fragmente, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Verfahren zur Feststellung der zellularen Onkogen-(RNA-)Transkripten einschließlich Trennung von RNA, mRNA, Denaturierung und Hybridisierung und dgl. sind auf dem Gebiet der molekularbiologischen Forschung be kannt. Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit, Spezifität und extreme Sensitivität der in vitro Hybridisierung zwischen DNA und DNA, sowie zwischen RNA und DNA sind aus der Literatur bekannt, die als Standardme thode für spezifische Problemlösungen Anwendung gefunden hat.

Die RNA-Hybridisierung mit DNA unter Verwendung von festem Substrat zur Immobilisierung ist seit 1965 bekannt (J. Mol. Biol, 12: 829-942; 1965). Seitdem wurden mehrere Verbesserungen dieser Methode sowie der Methoden der Trennung der RNA aus Zellen und Geweben veröffentlicht.

Die Aktivierung von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen durch er höhte Transkription oder durch Mutation wird allgemein als ein sehr wichtiger Schritt in der Verursachung, Aufrechterhaltung und in der Progression der bösartigen Transformationen betrachtet. Diese Erhöhung der Transkription kann mehrfach, sogar das 100fache der normalen Werte erreichen.

Die folgenden wichtigsten Hauptursachen bzw. Umstände kann man als maßgebend betrachten, die für den erhöhten und veränderten RNA-Inhalt des Blutplasmas in bösartigen Zuständen verantwortlich sein können:

1. Erhöhte Transkription von zwei oder mehreren zellularen Onkogenen (siehe oben)
2. Gesteigerter Zellumsatz in bösartigen Zuständen
3. Erhöhte Sekretion von RNA bzw. Poly(A)⁺RNA (mRNA) durch die leben den bösartigen Zellen, wie das Experiment mit in vitro gezüchteten malignen Zellkulturen schon bewiesen haben.
4. Erhöhte Mobilisierung der RNA, insbesondere der mRNA aus dem Zell kern durch krebsspezifische Produkte wie "Cancer-Associated Protein" etc.
5. Erhöhte RNA-Densität in peripheralen Zonen der malignen Zellen.
6. Erhöhte Leckage der lebendigen bösartigen Zellen, aber besonders sterbenden und nekrotischen bösartigen Zellen.
7. Gesteigerte Sterberate der bösartigen Zellen.
8. Erhöhte Vaskularisation der malignen Tumore.
9. Erhöhte Permeabilität der Kapillaren und der Gefäße in den bösarti gen Tumoren für Makromoleküle und Zellkomponenten wegen der unge eigneten und unvollständigen Entwicklung der sonst reichlich vorhan denen Gefäße.
10. Akkumulation der bösartigen Zellen, hauptsächlich sterbenden Zellen, in den Kapillaren und Arteriolen maligner Tumore, so können Zellele mente leichter direkt in die Blutbahn gelangen.
11. Erhöhte Resistenz der RNA, mRNA, und deren Fragmente gegen degra dierende Enzyme wie RNase wegen
- a) der Bindung an Proteine, Mukoproteine, Lipoproteine bzw., Schutz durch eine Lipoproteinhülle, und
- b) Anwesenheit der RNA bzw. deren Fragmente in ds.RNA Form (ds für Doppeltstrang-RNA).
12. Möglicher längerer Aufenthalt der RNA bzw. deren Fragmente in der Blutbahn wegen Ausschöpfung der Aufräumungsmechanismen (Clearance mechanismen), die für die Entfernung der RNA bzw. deren Fragmente verantwortlich wären, möglich wegen der ständigen "Überflutung" der Blutbahn mit diesen Substanzen in der bösartigen Zuständen, oder wegen anderer, noch nicht bekannter Ursachen.

Die oben erwähnten Ursachen und Umstände sind in verschiedenen Kombina tionen und verschiedenen Maßen in den verschiedenen Sorten und Stadien von bösartigen Zuständen für den erhöhten, veränderten RNA-Inhalt im Blutplasma verantwortlich. Die erhöhte Transkription von zellularen Onko genen ist die grundlegende Voraussetzung, aber allein nicht genügend. In präkanzerosen Zuständen, wie in Polypose des Kolons kann zum Beispiel die Transkription einer der zellularen Onkogene sogar 90fach erhöht sein, trotzdem erscheint kein RNA-Transkript des so hoch aktivierten Onkogens im Blutplasma. Andere und mehrere von den oben angegebenen, für die bösartigen Zustände charakteristischen Umständen müssen gleichzeitig anwesend und mitwirkend sein.

Die molekulare Hybridisierung in vitro ist nicht nur äußerst spezifisch, sondern auch hochgradig sensitiv. Es kann bereits 1 pg RNA in einer Komplex-Population von RNA-Molekülen nachgewiesen werden.

Da die Früherkennung die wichtigste Voraussetzung für eine Remission bzw. für die Heilung bösartiger Krankheiten ist, ist ein Universal-Malig nitätstest notwendig, der im breiten Spektrum bösartiger Krankheiten schon kleine Mengen maligner Zellen aufspüren bzw. nachweisen kann, die durch die üblichen heutigen diagnostischen Maßnahmen noch nicht entdeckt werden können.

Einen derartigen universalen Suchtest gibt es noch nicht. Nur zwei Ver fahren haben bis jetzt als Verlaufskontrolltest routinemäßig Anwendung gefunden: Der Alpha-Foto-Proteintest für Leberkrebs und Teratocarzinom und das carcionoembryonale Antigen (CEA) für Krebssorten des digestiven Systems.

In 1985 wurde ein Flotationsverfahren nach 16stündigem Ultrazentrifu gieren des Serums bekannt, das eine auf Krebs charakteristische Lipopro tein-Fraktion nachweisen kann, die auch RNA mit Poly(A)⁺RNA-Komponenten enthält. Dieses Verfahren wurde aber inpräkanzerösen Zuständen, in beginnenden monoklonalen Gammapathien und in vielen anderen Zuständen noch nicht erprobt. Die Sensitivität dieses Flotationsverfahrens ist relativ gering, 0,2 mikrogramm/ml, im Vergleich zu dem hochgradig sensitiven Hybridisierungsverfahren. Damit kann man vielleicht erklären, daß das Flotationsverfahren in einigen klinisch gesicherten Krebsfällen negativ ausgefallen ist. Es ist sehr wahrscheinlich, daß die RNA in der Lipopro tein-Fraktion nur ein Teil der Gesamt-Plasma-RNA ist, die aus den bösar tigen Zellen in die Blutbahn gelangt sind. (Gesamt-Plasma-RNA bösartigen Ursprungs). Ferner ist die lange Ultrazentrifugation ein großer Nachteil des Flotationsverfahrens.

Jüngstens wurden auch zwei Immuntests als diagnostische Krebs-Tests vor geschlagen. Ein Verfahren für die Isolierung des sogenannten "Cancer Associated Protein" (CAP) wurde veröffentlicht mit der Absicht der Ver wendung als ein Krebstest (Immuntest).

In 1985 wurde als Möglichkeit für Krebstests der Nachweis im Urin von Onkogen-Polypeptiden durch monoklonalen Antikörper mittels Immunoblot gedacht. Mit Polypeptiden von drei Onkogenen durchgeführte Untersuchungen haben gezeigt, daß der Unterschied zwischen normalen und pathologischen Werten nicht sehr groß ist und die Schwangerschaft höhere Werte produ ziert als eine bösartige Krankheit. Für die vollständige Beurteilung muß jedes Onkogen-Polypeptid für verschiedene Größen untersucht werden, was ein sehr großer Zeit- und Materialaufwand ist.

Ferner zeigten die normalen Werte eine große Streuung und so kann ein bedeutendes Überlappen der normalen und der pathologischen Werte vorkom men. Zum Beispiel Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern gegen nur ein Onkogen-Polypeptid zeigten positive Werte in 25-29% der bösartigen und in 6-9% der nichtbösartigen Fälle.

Ein sehr wesentlicher Nachteil dieses wie jeder anderen Methode, die auf dem immunologischen Nachweis der Proteine oder Polypeptiden von Krebs zellursprung basieren, ist, daß die Anwesenheit von spezifischen Anti körpern, die durch den Wirt gebildet, oder für Therapiezwecke eingeführt werden, unrealistische Ergebnisse verursachen und überhaupt ein bedeu tender Störfaktor sein können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis der RNA-Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen in einer azellularen biologischen Flüssigkeit, wie Blutplasma anzugeben. Da es hierfür notwendig ist, erst die RNA aus dem Blutplasma zu trennen, ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein zuverlässiges Verfahren zur Trennung der RNA aus dem Blutplasma anzugeben.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1. Durch die Verwendung zuverlässiger, wirkungsvoller, potenter RNase-Hemmer, durch Vermeidung der Vermischung des ubiquitären, hochgradig resistenten RNase- Enzyms aus exogenen Quellen während des ganzen Verfahrens, durch Behand lung des Blutplasmas zur Trennung des RNA-Inhaltes, durch Immobilisierung der RNA in denaturierter Form an einem festen Substrat und durch Kontakt des festen Substrats mit der markierten denaturierten Onkogen-DNA um diese miteinander, wenn die Plasma-RNA und Onkogen-DNA komplementäre Sequenz(en) haben, zu binden (zu hybridisieren), wird ein zuverlässiges Nachweisverfahren erreicht. Diese Tatsache wird durch den Nachweis der Markierungssubstanz, oder im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie bestimmt.

Erfindungsgemäß werden die Gesamt-Plasma-RNA wie die in die Blutbahn gelangte RNA, mRNA, bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma von Patienten mit bösartigen Krankheiten isoliert und auf die Anwesenheit der RNA- Transkripte zellularer Onkogene mit in vitro molekularer Hybridisierung untersucht.

Die praktische Verwendbarkeit des Verfahrens zur Feststellung der RNA- Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen aus mensch lichem Blutplasma ist ein Universal-Malignitätstest für den Nachweis bös artiger Prozesse, (als Betätigungstest), für Früherkennung der Bösar tigkeit (als Suchtest) und für Früherfassung der Rezidiven und Metastasen nach Therapiemaßnahmen (als Verlaufskontrolltest).

Erfindungsgemäß wurde ein Merkmal oder eine Komponente für Blutplasma-RNA gefunden, das zwischen Bösartigkeits- und Nichtbösartigkeitsursprung differenzieren kann. Messenger-Aktivität der RNA, getestet im zellfreien protein-synthetisierenden System hat sich dafür als nicht geeignet erwiesen, weil diese Aktivität in bösartigen sowie in nichtbösartigen Zuständen beobachtet werden konnte. Durch die Anwesenheit der Onkogen-Trans kripte bzw. deren Fragmente in der Plasma-RNA konnte aber diese Differen zierung erreicht werden. Schon bei den ersten blindausgeführten Ver suchsreihen wurde in allen Plasma-RNAs aus bösartigen Fällen Onkogen- Transkripten bzw. deren Fragmente entdeckt, während sie in keinen aus Plasma-RNAs aus nichtbösartigen Zuständen nachweisbar waren. Weitere Untersuchungen bestätigten diese Tendenz und wiesen darauf hin, daß dieses Verfahren fähig ist, kleinere Mengen von bösartigen Zellen, die durch heute übliche diagnostische Maßnahmen noch nicht erfaßbar sind, zu erkennen.

Der wesentlichste Vorteil dieser Erfindung ist es, daß sie ein Verfahren angibt, das als Universal-Malignitätstest dienen kann: Dieser Test beruht auf den Grundprinzipien der bösartigen Transformation durch die Aktivie rung von zellularen Onkogenen und der Besonderheiten der bösartigen Zellen und Tumore.

Der zweite bedeutende Vorteil dieses Verfahrens ist die große Empfind lichkeit (1-5 pg/ml).

Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Erfindung ist im Gegenteil zu Immuntests, daß die spezifischen Antikörper, die sich durch den Wirt gebildet haben, oder die für Therapiezwecke in die Blutbahn eingeführt wurden, die Ergebnisse nicht beeinflussen können.

Gegenüber Nachweisverfahren, die auf immunologischem Nachweis der Pro teine oder Polypeptiden von Krebszellursprung basieren, hat das erfin dungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß eine Störung des Ergebnisses durch spezifische Antikörper entfällt.

Der Nachweis zellularer Onkogen-Transkripte bzw. deren Fragmente aus dem Blutplasma bietet über den eigentlichen Malignitätstest hinaus weitere, für die Therapie maßgebende Informationen:

1. a) Der Grundcharakter maligner Prozesse und ihr Verhalten im Wirt ist wesentlich dadurch bestimmt, welche Onkogene aktiviert wurden (Ge netic Scripture, Zell-Onkogenprofil). Dies konnte bisher nur hi stologisch in Tumorgeweben durch in vitro Nukleinsäure-Hybridisie rung bestimmt werden. Der erfindungsgemäße Malignitätstest kann diese Auskunft zumindest teilweise aus dem Blutplasma liefern (Plasma-Onkogen-Profil), lange bevor die relativ kleine Tumorzell masse visualisierbar und für histologische Untersuchungen erreich bar ist.
1. b) Während der malignen Prozesse in vitro sowie während des Bestehens der bösartigen Krankheit in Patienten können neue Onkogene zusätz lich aktiviert werden, was zu einer bedeutenden Progression der Bösartigkeit führen kann. Diese Gefahr kann mit dem Malignitätstest während der Verlaufskontrolle frühzeitig dadurch erkannt werden, daß ein neues Onkogen-Transkript aus dem Blutplasma identifiziert wird, welches bisher im Plasma nicht vorhanden war.
1. c) Während des Krankheitsablaufs kann eine Verstärkung (Amplifikation) der aktivierten Onkogene auftreten, wodurch eine wesentlich erhöhte Aggressivität und Progression der bösartigen Zellen verursacht werden kann. Das Auftreten einer solchen Verstärkung kann mit dem quantitativ ausgeführten Malignitätstest schon frühzeitig während der Verlaufskontrolle beobachtet werden. Das bedeutet, daß ein Subklon der Tumorzellen, der das amplifizierte Onkogen hat, früh zeitig, bevor er sich ausbreiten konnte und die Prognose sehr verschlechtern könnte, erkannt werden kann. Dieser Subklon kann im Frühstadium durch spezifische Immuntherapie oder Immunochemothera pie beeinflußt und gegebenenfalls vernichtet werden. Amplifi kation der zellularen Onkogene (auf das Zwei- bis Hundertfache) tritt entweder im Primärtumor oder während der Progression und Diversifikation der bösartigen Zellen und in ungefähr 30% bis 50% der bösartigen Krankheiten auf.
2. Genprodukte der aktivierten zellularen Onkogene spielen eine wichtige, sogar vitale Funktion in den transformierten bösartigen Zellen, viele von ihnen fungieren als Protein-Kinase-Enzyme in der Zellmembran. Die Veränderung bzw. Beeinträchtigung dieser Funktion durch Angriff auf die bösartigen Zellen immunspezifisch, gezielt auf ihre Onkogen produkte mit monoklonalen Antikörpern allein oder gebunden mit radio aktiv oder chemotherapeutisch wirkenden Substanzen kann zur heilenden Wirkung führen, bevor die Tumorzellmasse sich verbreiten konnte. Ein Plasma-Onkogenprofil bei Früherkennung zeigt die spezifischen Thera piemöglichkeiten. Die Verlaufskontrolle mit neuen Onkogen-Proben er möglicht es, neu aufgetretene Onkogen-Transkripte zu erkennen. Ein quantitativ durchgeführter Malignitätstest bietet während des Krank heitsverlaufs eine Früherfassung einer eventuellen Amplifizierung eines zellularen Onkogens und gibt spezifische Hinweise, wie man die sen neuen Subklon von bösartigen Zellen unterdrücken bzw. vernichten kann, bevor eine größere Progression oder Agressivität verursacht ist.

Im folgenden wird die Erfindung genauer erläutert. Das frischgewonnene Blut wird sofort mit einer RNase-Enzym-hemmenden Substanz gemischt und das Plasma schnell separiert. Dann wird das Blutplasma in Anwesenheit des RNase-Hemmers mit einem Detergens, wie Natriumduodecylsulfat (SDS) und einem proteolytischen Enzym, wie Proteinase K (Boehringer, Mannheim) mit einem wäßrigen Medium vermischt und wird dann bei 37 Grad C für 60 min in einer Pufferlösung (pH 7,5) inkubiert. Danach wird mit 4 M Guanidinium-isothiocyanat vermischt, um die Proteindenaturierung sowie die Abspaltung der Proteine von der RNA zu bewirken. Danach wird mit organischem Lösungsmittel wie Phenol und Chloroform bei 60 Grad C extra hiert um der organischen Phase den größten Anteil der Proteine zu entzie hen, was zu einer wäßrigen Phase führt, die im wesentlichen die gesamte RNA enthält. Diese wäßrige Phase wird mit Phenol/Chloroform reextrahiert. Dann wird mit Chloroform noch zweimal extrahiert. Die RNA wird durch Vermischung mit zwei vol Äthanol bei -20 Grad C precipitiert. Die RNa wird in Tris.-Cl-Puffer (pH 7,4) mit EDTA und SDS aufgelöst und mit Proteinase K bei 37 Grad C für eine h in Anwesenheit von RNase-Hemmern behandelt. Dann wird mit Phenol und Chloroform zweimal extrahiert bei 60 Grad C. Bei Zimmertemperatur wird zweimal mit Chloroform extrahiert, mit Äthanol die RNA precipitiert, gewaschen und in 70% Äthanol bei -70 Grad C aufbewahrt.

Entweder wird die Poly(A)⁺RNA aus der RNA durch Affinitätsadsorptions- und Eluationsverfahren mit oligo (dT) Cellulose selektiert, oder wird die RNA einer DNase-Enzym-Behandlung unterzogen, um die eventuell vorhandene DNA abzubauen und zu entfernen.

Die denaturierte RNA oder die Poly(A)⁺RNA wird auf reines Nitrocellu lose-Papier als festes Substrat aufgetragen und um eine Immobilisierung der RNA auf dem festen Substrat zu bewirken, wird für 2 h bei 80 Grad C im Vakuumofen behandelt. Das gebackene feste Substrat wird anschließend behandelt, um ein weiteres Binden von Nukleinsäuren an das feste Substrat zu verhindern.

Eine Menge von gereinigten molekularisch klonierten DNA, die die Sequenz als Kode für Onkogen enthält, wird entweder radioisotopisch oder nicht radioisotopisch markiert. Die radioisotopische Markierung wird durch Nick-Translation nach Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113: 237-251, 1977) durchgeführt, um hohe spezifische Aktivität zu erreichen. Für diese Verfahrensweise verwendbare Radioisotope sind beispielsweise beson ders 32^P aber auch I¹²⁵, I¹³¹ und H³.

Für die nichtradioisotopische Markierung der Onkogen-DNA-Proben wurde beispielsweise Biotin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633-6637, 1981) und jüngstens Photobiotin (Nucleic Acid Research 13: 745-761, 1985) verwen det. Die Markierung mit Photobiotin ist besonders unkompliziert, schnell und preisgünstig. Ein Photobiotin-Markierungs- und Nachweis-Kit wird kommerziell angeboten (BRESA, Adelaide, South Australia).

Onkogen-DNA-Proben, markiert oder unmarkiert, sind kommerziell erhältlich (ONCOR, Inc. Gaithersburgh, Ma. USA 20877; ONCOGENE SCIENCE Inc. Mineola, NY. 11501 USA).

Die markierte Onkogen-DNA-Probe wird denaturiert und in einer Lösung mit dem festen Substrat, auf dem die Plasma-RNA immobilisiert ist, in Kontakt gebracht, um damit zu hybridisieren. So wird bewirkt, daß die markierte Onkogen-DNA-Probe durch Wasserstoffverbindungen mit der komplementären Sequenz(en) der Plasma-RNA, die auf dem festen Substrat immobilisiert ist, verbunden (hybridisiert) wird.

Nach einem vorbestimmten Zeitraum wird das feste Substrat einer Wäsche unterzogen, um nicht spezifisch gebundene markierte Onkogen-DNA-Probe zu entfernen.

Das feste Substrat wird anschließend einer Analyse unterzogen, um das Stattfinden der Hybridisierung zwischen der Plasma-RNA und der markierten Onkogen-DNA-Probe nachzuweisen. Das wird im Falle der radioisotopischen Markierung durch Autoradiographie, im Falle der Biotin-Markierung durch Biotin-Nachweis mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion bestimmt.

Das folgende Beispiel dient zur weiteren Erläuterung der Erfindung ohne sie zu beschränken.

Beispiel

Es wird 20 ml Blut mit 20 IE/ml Heparin entnommen und sofort mit einer Lösung von RNase-Enzym-hemmender Substanz wie RNasin (Promega Biotec. Maidison, Wi. USA) (Endkonzentration: 2000 E/ml) oder eines Vanadyl ribonucleosid-Komplexes (Bethesda Research Lab. Gaithersburgh, MD. USA) (Endkonzentration: 10 mM) vermischt. Das Blutplasma wird so schnell wie möglich separiert. Es wird in zwei Einweg-Plastik-Zentrifugen-Röhrchen je 5 ml Blutplasma pipettiert, eines wird tiefgekühlt für eventuelle Wieder holung, oder für ergänzende Untersuchungen als Reserve aufbewahrt. Das andere wird gleich in Bearbeitung genommen.

Es wird ein Gemisch aus 0,2 M Tris. Cl (pH 7,5); 25 mM Äthylendiamino tetraessigsäure (EDTA); 0,3 M NaCl; 2% (Gew./Vol.) Natriumduodecylsulfat (SDS) und Proteinase K (Endkonzentration 200 mikrogramm/ml) hinzugefügt und in der Anwesenheit von RNase-Hemmern bei 37 Grad C für 60 min in kubiert. Dann wird mit 4 M Guanidinium-isothiocyanat gemischt. Bei 60 Grad C wird die schleimige Mixtur in eine Spritze, die mit einer 18-Gr- Nadel versehen ist, aufgezogen und kräftig zurück ausgestoßen, bis die Viskosität wesentlich vermindert ist. Anschließend wird ein gleiches Volumen Phenol und Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1) eingemischt und bei 60 Grad C für 10 bis 15 min durch kräftiges Schütteln extrahiert. Nach Zentrifugieren wird die wäßrige Phase noch zweimal mit Phenol-Chloroform und dann zweimal mit Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit 2 Vol. Äthanol vermischt und bei -20 Grad C für 1 bis 2 h wird die RNA precipitiert.

Nach Zentrifugieren wird die RNA in Tris.-Cl-Puffer (0,1 M, pH 7,4) Pufferlösung, die noch 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2% SDS und RNase-Hemmer enthält, aufgelöst und mit Proteinase K (Endkonzentration 200 mikro gramm/ml) bei 37 Grad C für 1 h inkubiert. Danach wird mit Phenol und Chloroform bei 60 Grad C und mit Chloroform bei Zimmertemperatur je zweimal extrahiert. Aus der wäßrigen Phase wird die RNA mit Äthanol precipitiert, mit 70% Äthanol gewaschen und jeweils in der notwendigen Lösung aufgelöst.

Die Extrahierung der RNA ist wesentlich und bedeutend erleichtert durch die Anwendung des Instruments "Nucleic Acid Extractor" (Applied Bio system, Foster City, Ca. USA). Das oben geschriebene Verfahren ist leicht adaptierbar für dieses Instrument.

Entweder wird die Poly(A)⁺RNA aus der isolierten Plasma-RNA mit Oligo- (dT-)Cellulose durch "Batch" Absorption und Elution selektiert, oder wird die Plasma-RNA einer DNase-Enzym-Behandlung unterzogen, um die eventuell vorhandene DNA abzubauen.

Für die Selektion der Poly(A)⁺RNA wird die Plasma-RNA in Steril-Wasser gelöst, bei 65 Grad C für 10 min inkubiert und mit 2 × Loading-Puffer vermischt und auf Zimmertemperatur gekühlt (Loading-Puffer: 20 mM Tris. Cl, pH 7,6; 0,5 M NaCl; 1 mM EDTA; 0,1% SDS). Dann wird mit 0,3 g (Trok kengewicht) von Oligo-(dT-)Cellulose für je 0,5 mg RNA gemischt, bei 1500 g für 4 min bei 15 Grad C zentrifugiert und die Oligo-(dT-)Cellulose 4-5mal mit 5 ml Loading-Puffer gewaschen (bei Zimmertemperatur). Die Poly(A)⁺RNA wird mit 1-ml-Wäsche von sterilen 10 mM Tris. Cl (pH 7,5; 1 mM EDTA; 0,05% SDS einer Elution unterzogen.

Es wird Na-azetat (3 M pH 5,2) zu 0,3 M vermischt und die RNA mit 2,2 Vol. Äthanol bei -20 Grad C precipitiert und das Precipitat mit 70% Äthanol gewaschen.

Wenn die Selektion der Poly(A)⁺RNA nicht durchgeführt wird, wird die Plasma-RNA einer DNase-Enzym-Behandlung unterzogen. In diesem Falle wird RNase-freie DNase-Enzym und MgCl₂ (zu 2 mM) zu der Plasma-RNA-Lösung (50 mM Tris. Cl, pH 7,5 in 1 mM EDTA) vermischt und in Anwesenheit von RNase- Hemmer bei 37 Grad C für 30 min inkubiert, dann wird mit Phenol/Chloro form extrahiert und in Anwesenheit von Na-azetat (pH 5,2, 0,3 M) wird die RNA mit 70% Äthanol bei -70 Grad C precipitiert.

Das folgende, gut bekannte, käufliche 18 molekularisch klonierte mensch liche Onkogen wurde als Onkogen-DNA-Probe gebraucht, die hier ungefähr nach Häufigkeit ihres Vorkommens mit erhöhter Aktivität in menschlichen Bösartigkeiten gruppiert sind:

Die Proben wurden entweder radioisotopisch mit P³² markiert (Spezifische Aktivität: 10⁸ cpm/mikrogramm) durch Nick-Translation nach Rigby et al (J. Mol. Biol. 133: 237-251, 1977) oder unmarkiert erhalten. Die unmar kierten DNA-Proben wurden entweder mit Biotin (nach Leary, siehe Seite 21) oder mit Photobiotin nach Vorschrift des Herstellers (BRESA, Adel aide, South Australia) markiert: nach kurzer Bestrahlung mit sichtbarem Licht geht Photobiotin eine stabile Bindung mit Nukleinsäuren ein. Die so mit Biotin markierte DNA kann mit 2-Butanol Extraktion mit Äthanol- Precipitation isoliert werden und kann als stabile markierte Probe für ein halbes Jahr in 0,1 mM EDTA bei -15 Grad C stabil aufbewahrt werden.

Die Plasma-RNA oder die Poly(A)⁺RNA wir vor der Hydridisierung einer Behandlung, die sogenannte Prehybridisierung, unterzogen. Die RNA-Lösung bzw. die RNA-Verdünnungen werden erst durch Inkubierung der 65 Grad C für 15 min und dann rasche Abkühlung denaturiert. Dann wird die RNA auf dem festen Substrat, wie Nitrocellulose-Papier, das zuvor mit 20 × NaCl/Cit equilibriert und dann getrocknet wurde, aufgetragen.

Dabei wird ein entsprechendes Volumen von der denaturierten RNA-Lösung in eine Vertiefung der Mikrofilter-Platte (Bio-Dot Miocrofiltration Appa ratus, Bio-Rad Richmond, Ca. 94804 USA; Minifold Filtration & Incubation Plate, Schleicher & Schuel, Keene, New Hampshire. 03431, USA hineinge bracht und unter gelindem Vakuum unter Bildung eines Flecks von 3,0 mm Durchmesser filtriert. Quantität der aufgetragenen RNA: 10 mikrogramm, der Poly(A)⁺RNA: 2 mikrogramm.

Das Nitrocellulose-Papier wird dann für 2 h bei 80 Grad C im Vakuumofen getrocknet. Nach dem Backen wird in einer Lösung (Prehybridisierungspuf fer): Formamide (50% Vol./Vol.); 5 × NaCl/Cit; 50 mM Natriumphosphat pH 6,5; sonizierte, denaturierte Salmon Sperma DNA (250 mikrogramm/ml) und 0,02% je Bovine Serum Albumin (BSA), Ficoll und Polyvinylpyrrolidon, für 8-20 h bei 42 Grad C inkubiert.

Die radioisotopisch markierte menschliche Onkogen-DNA-Probe (2 × 10⁶ cpm/ml) wird erst bei 100 Grad C für 5-10 min denaturiert, rasch gekühlt und wird zu der Lösung (Prehybridisierungspuffer), die das Nitrocellulo se-Papier mit der immobilisierten Plasma-RNA enthält, gemischt. Die Hy bridisierung wird bei 42 Grad C für 20 h bewirkt. Danach wird das Nitro cellulose-Papier mit einer Lösung von 2 × NaCl/Cit, 0,1% SDS gewaschen, erst bei Zimmertemperatur, dann bei 50 Grad C viermal mit der Lösung von 0,1 × NaCl/Cit, 0,1% SDS.

Das Nitrocellulose-Papier wird zwischen klaren Azetatfolien eingesetzt und in die Nähe eines für die Röntgenstrahlen empfindlichen Filmes ge bracht. Ein Verstärkerschirm wird an der entgegengesetzten Seite ange bracht und lichtdicht verpackt. Nach einer bestimmten Zeit wird der Film entwickelt. Die Anwesenheit der RNA-Transkripten bzw. deren Fragmente, die mit der Onkogen-DNA-Probe hybridisierten, wird durch die Anwesenheit eines Flecks auf dem Film bestimmt.

Im Falle nichtradioisotopisch markierter Onkogen-DNA-Proben, wie im Falle der mit Photo-Biotin-markierten Onkogen-DNA-Proben werden die DNA- Proben in 0,1 M EDTA aufgetragen, sonst wird die Prehybridisierung so ausgeführt wie mit radioisotopisch markierten DNA-Proben, aber die Dauer der Prehybridisierung ist kürzer: 4-8 h. Die Hybridisierung wird durchge führt wie mit radioaktiven Proben, aber bei höherer Temperatur (55 Grad C) für 20 h in einer Lösung: 4 Vol. Prehybridisierungspuffer; 1 Vol. von etwa 0,5 g/ml Natrium Dextransulfat und 20 ng/ml Biotin-markierte DNA- Probe (Onkogen-DNA-Probe).

Die getrockneten Nitrocellulose-Papiere werden bei 42 Grad C 30 min in STMT-Puffer (1 M NaCl; Tris. Cl, pH 7,5; 2 mM MgCl₂ 0,05% v/v Triton X- 100) mit 30 mg von Bovin Serum Albumin inkubiert. Nachdem das Nitro cellulose-Papier getrocknet ist, wird es bei Zimmertemperatur für 10 min in STMT-Puffer mit 1 mikrogramm/ml Sigma Avidin-alkalische Phosphatase- Komplex in Kontakt gebracht, dann wird mit häufigem Schütteln in STMT- Puffer (3 × 10 min) und STMT-Puffer (1 m NaCl, Tris. Cl, pH 9,5, 5 mM MgCl₂) für 2 × 5 min inkubiert.

Für Farbreaktionen wird das Nitrocellulose-Papier bei Zimmertemperatur im Dunkeln mit Substrat-Lösung (STM-Puffer aber nur mit 0,1 M NaCl) mit 0,33 mg/ml Nitro-blau-tetrazolium, 0,17 mg/ml 5-Brom-4-Chloro-3-Indolyl Phos phat und 0,33% v/v N,N-dimethylformamid vermischt. Die Reaktion wird durch Waschen des Nitrocellulose-Papiers mit 10 mM Tris Cl, pH 7,5; 1 mM EDTA beendet.

Der Nachweis für die Anwesenheit von Onkogen-RNA-Transkripten, bzw. deren Fragmente ist positiv, wenn die Plasma-RNA oder die Poly(A)⁺RNA minde stens mit einer der Onkogen-DNA-Proben ein positives Signal (über dem Hintergrund oder über der negativen Kontrolle) gibt. Im Falle der radio aktiven Probe zeigt sich ein dunkler Fleck am Film nach Autoradiographie, im Falle mit Biotin-markierter Proben als ein Fleck mit Farbreaktion. Der Malignitätstest ist negativ, wenn aus dem Blutplasma keine RNA isolierbar ist, oder die Blutplasma-RNA mit keinen der Onkogen-Proben ein positives Signal gibt.

Die Wiederverwendung der Blutplasma-RNA, die auf dem Nitrocellulose-Pa pier immobilisiert ist, ist möglich nach der Hybridisierung und Autora diographie (für Rehybridisierung). Die hybridisierte DNA-Probe kann durch Wäsche bei 65 Grad C für 1-2 h mit 0,1-0,05 × Waschpuffer (1 × Wasch puffer: 50 mM Tris. Cl, pH 8,0; 0,2 mM EDTA; 0,5% Natriumpyrophosphat und 0,02% je BSA, Ficoll, Polyvinyl, Pyrrolidon) entfernt werden. Die Behand lung des Nitrocellulose-Papiers, also die Prehybridisierung sowie die Rehybridisierung wird, so wie oben (originell) durchgeführt. Auf diese Weise kann die Rehybridisierung mit neuen Onkogen-DNA-Proben noch durchgeführt werden. Dies ist sehr wichtig, weil die Menge der Blutplas ma-RNA sehr limitiert ist.

Die erfindungsgemäße Arbeitsweise zum Nachweis der RNA-Transkripten, bzw. deren Fragmente, von zellularen Onkogenen im menschlichen Blutplasma umfaßt mehrere günstige Reaktionsweisen und Schritte, um eine hohe Zuver lässigkeit und Reproduzierbarkeit zu ergeben.

So erlaubt die Verwendung von zuverlässigen RNase-hemmenden Substanzen schon bei der Blutentnahme die Verhinderung des eventuellen Abbaus von RNA. Die Gefahr einer Vermischung (Zumischung) der ubiquitären, hochgra dig resistenten RNase aus exogenen Quellen wird während des ganzen Ver fahrensablaufs durch Gebrauch von gebackenen Glaswaren, autoklavierten Lösungen, gebackenen Spatulas, Werkzeugen, trockenen chemischen Präpara ten, von Glas destillierten, mit autoklavsterilisiertem Wasser, sowie Tragen von Handschuhen während aller Phasen und Etappen des Präparations- und Untersuchungsablaufs verringert.

Die Verwendung von Proteinase K erleichtert die Entfernung der Proteine, die Guanidinium-Isothiocyanat-Behandlung die Denaturierung der Proteine sowie die Spaltung der RNA-Protein-Komplexe. Der Rest der Proteine wird durch organische Extraktion entfernt. Der Abbau und das Entfernen der DNA wird durch DNase-Behandlung erreicht, weil die DNA sonst bei der Hybredi sierung interferieren könnte. Das Backen sorgt für die Zuverlässigkeit der festen Bindung der RNA an das Nitrocellulose-Filter. Die Behandlung des Nitrocellulose-Filters nach dem Backen verhindert unspezifische Bindungen und sorgt auch für Zuverlässigkeit. Die Wäsche des Nitrocellulose-Filters nach Hybridisierung entfernt überflüssige, oder unspezifisch gebundene, markierte Onkogen-DNA-Proben und trägt auch zur Zuverlässigkeit bei.

Es sind zahlreiche Modifizierungen möglich.

Eine quantitative Auswertung des positiven Tests ist möglich.

Eine semiquantitative Auswertung kann auch durchgeführt werden. In diesem Fall wird die Intensität des schwarzen Flecks am Röntgenfilm durch Densi tometrie gemessen und können quantitative Vergleiche gemacht werden. (Reflectance Densitometer, Bio-Rad, Richmond CA 94804, USA).

Quantitativer Test

Wenn ein Blutplasma-RNA mit einer Onkogen-Probe einen positiven Test gezeigt hat, kann die relative Menge durch das Dilutionsverfahren be stimmt werden. In diesem Fall wird aus der Blutplasma-RNA eine 1 : 2-Se rialverdünnung gemacht und wird jede Verdünnung durch Hybridisierung getestet. Die höchste Verdünnung, aus der noch ein positives Signal ausgeht, ist der Titer. So können bei der Verlaufskontrolle eines Patien ten, während der Beobachtungszeit, quantitative Vergleiche durchgeführt werden. Auf diese Weise kann man z. B. die Amplifizierung eines der aktivierten Onkogene beobachten: Wenn während der Verlaufskontrolle der Titer eines Onkogens unproportionell erhöht wird, im Vergleich zu anderen Onkogenen, bedeutet das die Amplifizierung dieses Onkogens.

Wenn man große Empfindlichkeit braucht, wie bei Screening von Personen, die durch familiäre, genetische oder wegen beruflicher Exposition beson ders krebsgefährdet sind, oder bei screening von Patienten, die wegen Chemo- oder Immunosuppressiv-Therapie beeinträchtigtes Immunsystem ha ben, kann man radioaktive Onkogen-Proben mit höherer Spezifität verwen den oder nach Leary und Mitarbeiter (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 4045-4049, 1983) mit Biotin markierte Onkogen-Proben und Enzym-Affinitätstest benutzen und diese - wenn es möglich ist - mit aus der Plasma-RNA selek tierten Poly(A)⁺RNA hybridisieren. So kann man eine Empfindlichkeit von 1 pg/ml RNA erreichen. Sonst ist die Verwendung für Hybridisierung die Plasma-RNA für differential diagnostische Zwecke (als Bestätigungstest), für Verlaufskontrolle, Monitoring, und Staging ausreichend.

Im allgemeinen bekommt man einen positiven Test im Fall einer bösartigen Krankheit meistens, wenn die Plasma-RNA erst nur mit der Onkogen-Gruppe A (siehe oben) hybridisierte, weil diese Onkogene in allen bzw. beinahe in allen Sorten von Bösartigkeiten aktiviert sind. Seltener braucht man die Hybridisierung auf die Gruppe B auzuweitern.

Wenn man die Krebsart kennt (in der Verlaufskontrolle) oder Verdacht hat auf eine Krebsart, kann man solche Onkogene als Proben verwenden, die in dieser Krebsart besonders häufig aktiviert sind. Es werden noch immer neue Onkogene entdeckt. Diese kann man gegebenenfalls auch als Probe benutzen.

Wenn man aber wissen möchte, welche aktivierten Onkogene in der Blutbahn anwesend sind (Plasma-Onkogen-Profil), muß man die Blutplasma-RNA mit allen Onkogenen von Gruppe A und B und seltener von Gruppe C hybridisie ren. Dasselbe muß man tun, wenn man das Erscheinen von neuen Onkogenen in der Blutbahn während des Krankheitsablaufs erfassen möchte, was aufgrund der prognostischen und therapeutischen Bedeutung sehr wichtig ist.

Claims

1. Verfahren zur Untersuchung einer azellularen biologischen Flüssigkeit auf die Anwesenheit von zellularen Onkogen-(RNA-)Transkripten, bzw. deren Fragmente, bei dem man

a) aus der azellularen biologischen Flüssigkeit die RNA trennt und die RNA auf einem festen Träger in denaturierter Form immobili siert,
b) den festen Träger mit markierten Onkogen-DNA-Proben in Kontakt bringt, um diese mit der RNA zu hybridisierten, wenn komplementäre Sequenz vorliegt, und
c) das Produkt auf die Anwesenheit markierter DNA bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die azellulare biologische Flüssigkeit menschliches Blutplasma ist und die Trennung der RNA gemäß a) in ständiger Anwesenheit eines RNase-Hemmers erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe radioisotopisch markierte Onkogen-DNA ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe nicht radioisotopisch markierte, vorzugsweise mit Biotin markierte Onkogen-DNA ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Blutplasma vor der Trennung der RNA und der Immobilisierung der RNA auf dem festen Träger mit einem organischen Lösungsmittel behandelt wird, um Eiweißmaterial in einer organischen Phase zu entfernen und um die RNA in der wäßrigen Phase zu erhalten.

6. Verfahren nach Anspruch 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung auf Anwesenheit markierter DNA mittels autoradiographi scher Technik durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung auf Anwesenheit markierte RNA mittels Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Substrat reine Nitrocellulose verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Immo bilisierung ein Vakuum eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das Blut vor der Stufe a) mit einer Lösung einer wirkungsvollen RNase-Enzym-hemmenden Substanz vermischt, und das Plasma sepa riert;
b) das Produkt der Stufe a) (das Plasma) mit einem Detergens und proteolytischen Enzym in Kontakt bringt;
c) das Produkt der Stufe b) mit einer proteindenaturierenden Lösung, wie Guanidinium-isothiocyanat vermischt und behandelt;
d) das Produkt der Stufe c) mit einem organischen Lösungsmittel (bei 60 Grad C) extrahiert unter Bildung einer im wesentlichen protein freien wäßrigen Phase, die die RNA enthält;
e) das Produkt der Stufe d) mit einem Detergens und einem proteoly tischen Enzym in Kontakt bringt, inkubiert, und dann die Extrak tion der Stufe d) wiederholt;
f) das Produkt der Stufe e) mit (2 vol) Äthanol präzipitiert, wäscht und in sterilem Wasser löst;
g) das Produkt der Stufe f) einer DNase-Enzym-Behandlung unterzieht, um die vorhandene DNA abzubauen und zu entfernen, und dann die Extraktion der Stufe d) wiederholt; oder
h) das Produkt der Stufe f) einem Affinitätsadsorptions- und Elu tionsverfahren mit Oligo-(dT-)Cellulose unterzieht um die poly(A)⁺RNA (mRNA) zu isolieren.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das Produkt der Stufe g) oder h) behandelt dann denaturiert;
b) das Produkt der Stufe a) auf ein festes Substrat aufträgt und durch Backen im Vakuum immobilisiert;
c) das feste Substrat der Stufe b) mit einer Lösung von markierter Onkogen-DNA-Probe in Kontakt bringt, um sie mit der auf dem festen Substrat immobilisierten RNA zu hybridisieren;
d) das Produkt der Stufe c) im Fall radioisotopisch markierter Onko gen-DNA-Probe, durch Autoradiographie bestimmt;
e) das Produkt der Stufe c) im Fall nichtisotopisch markierter Onkogen-DNA-Probe durch Enzymaffinitätstest durch Farbreaktion be stimmt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das feste Substrat der Stufe b) behandelt, um eine weitere Bindung von Nuklein säure daran zu hindern.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das feste Substrat der Stufe c) wäscht, um nicht spezifisch gebundene markierte Onkogen-DNA zu entfernen.

14. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die verbliebene, mit der Plasma-RNA verbundene Radioaktivität durch Autoradiographie bestimmt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die verbliebene nichtradioaktive Markierungssubstanz der festen Substrate, die durch die Hybridisierung zwischen RNA und der markier ten Onkogen-DNA gebunden ist, mittels Enzymaffinitätstest durch Farb reaktion bestimmt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Onkogen-DNA, die mit der auf dem festen Substrat gebunde nen RNA hybridisierte, entfernt, um das feste Substrat mit der daran verbliebenen RNA mit einer neuen Onkogen-DNA-Probe wiederzuhybridi sieren (Rehybridisierung).

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als Onkogen-DNA-Probe eine individuelle Onkogen-DNA oder eine Mischung individueller Onkogen-DNAs nimmt.