DE19859912C2

DE19859912C2 - Testsystem zur Erkennung verschiedener Marker, seine Herstellung sowie Verwendung

Info

Publication number: DE19859912C2
Application number: DE19859912A
Authority: DE
Inventors: Thomas Wagner; Norbert Windhab
Original assignee: Aventis Research and Technologies GmbH and Co KG
Current assignee: Nanogen Recognomics GmbH
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2001-06-21
Anticipated expiration: 2018-12-24
Also published as: CA2353920A1; JP2002533724A; AU773046B2; WO2000039581A2; DE19859912A1; WO2000039581A3; AU2539000A; EP1141725A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem enthaltend mindestens zwei Erkennungs spezien, die mindestens zwei verschiedene Marker unter Ausbildung eines Komplexes erken nen, seine Herstellung sowie Verwendung in einem geeigneten Nachweisverfahren.

Die Anwendungsbereiche von Testsystemen, wie z. B. Diagnostika, sind in der Biologie, Bio chemie, Medizin und Pharmakologie weit verbreitet. Vor allem in der Medizin ist eine zu verlässige und eindeutige Diagnose von Krankheiten, wie z. B. virale Infektionen oder Krebs, von außerordentlicher Wichtigkeit zur Steigerung der Lebensqualität, da nur durch ein früh zeitiges Erkennen einer Krankheit eine rechtzeitige und effektive Behandlung erfolgen kann. Basierend auf der Erkennung krankheitsspezifischer Marker bzw. Liganden, wie z. B. Nu kleinsäuresequenzen, Proteine oder Antigene, wird der Erreger oder die Krankheit in der bio logischen Probe nachgewiesen. Weit verbreitet sind Diagnostiktests, in denen jeweils ein Marker oder eine Klasse von Markern nachgewiesen wird, wie z. B. bei ELISA oder bei Am plifizierungsmethoden, wie PCR, b-DNA, Southern-, Western- oder Northern-Blotting. Die verwendeten Detektionsarten reichen von einfachen Färbungsmethoden und kalorimetrischen Methoden über Fluoreszenz-Energy-Transfer (FRET) und Fluoreszenz-Quenching bis zum Scintillation Proximity Assay (SPA).

Aus der US 5,296,347 ist ein sogenanntes "Brücken-Immunoassay"-Verfahren bekannt, bei dem zunächst eine Bindung zwischen Analyt und markiertem Rezeptor (z. B. Fluorescein markierter Antikörper/Antigen-Bindung) in freier Lösung stattfindet, zum Beispiel in Form eines sogenannten "Sandwich-Formats". Dieses Sandwich wird dann über einen weiteren, sogenannten "Brücken-Rezeptor" (zum Beispiel einen Biotin-markierten anti-Fluorescein Antikörper) an ein universelles Bindesystem gebunden, das seinerseits aus einem ersten Re zeptor (zum Beispiel Avidin) besteht, der an eine feste Phase gebunden ist.

Aus der US 4,320,109 ist ein radiometrischer Immunoassay bekannt, bei dem ein Antigen mit seinem (eventuell an eine feste Phase gebundenen) spezifischen Antikörper komplexiert wird und dieser Komplex nach Abtrennung mit einem zweiten universellen Antikörper markiert wird. Der zweite universelle Antikörper trägt eine Chelatgruppe (zum Beispiel Transferrin), die radioaktiv markiert wird. Die gemessene Radioaktivität dient dann zur quantitativen Mes sung der vorhandenen Menge des Antigens.

In der DE 37 15 984 A1 wird ein Enzym-Immunoassay beschrieben, der zur Bestimmung eines Antigens verwendet wird. Dabei wird ein Immunkomplex, der dadurch erhalten wurde, daß gleichzeitig eine antigene Substanz, ein immobilisierter erster Antikörper, der die erste antigene Substanz erkennt und ein zweiter Antikörper, der die antigene Substanz erkennt und von einer anderen Tierart stammt, umgesetzt wird mit einem enzymmarkierten dritten Anti körper, der das Immunoglobulin erkennt, welches von der gleichen Tierart wie der zweite Antikörper stammt. Anschließend wird die feste von der flüssigen Phase getrennt und die Menge des in der festen Phase vorliegenden Enzyms mittels der Enzymaktivität bestimmt.

Ein wesentlicher Nachteil bei der Verwendung von nur einem Marker bzw. einer Markerklas se ist, daß leicht fälschlicherweise positive Testergebnisse entstehen, die auch zu falschen Rückschlüssen bezüglich einer bestimmten Krankheit führen. Oftmals muß daher ein zweiter Test oder noch weitere Tests auf den gleichen oder komplimentären Analyten durchgeführt werden, um eine zuverlässige Aussage bezüglich krank/gesund treffen zu können. Dies führt zu mehreren Tests, deren Ergebnisse miteinander zu vergleichen sind, was zugleich aufwen dig und kostenintensiv ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, qualitativ bessere, weniger aufwendigere und kostengünstigere Analytentests als die bereits bekannten zu entwickeln.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Verknüpfung von zwei oder mehreren Testergebnissen auf molekularer Ebene im Sinne der Bool'schen Verkettung einen qualitativ sehr guten, einfachen und kostengünstigen Analytentest erlaubt, wobei sich die verschiedenen Testergebnisse untereinander nicht im wesentlichen stören.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Nachweisverfahren enthaltend folgende Schritte:

a) Behandlung einer Probe enthaltend einen ersten und einen zweiten Marker mit einer ersten Erkennungsspezie, die den ersten Marker erkennt,
b) Behandlung der Probe mit einer zweiten Erkennungsspezie, die sowohl den ersten Marker, wie auch den zweiten Marker erkennt,
c) Behandlung der Probe mit einer dritten Erkennungsspezie, die den zweiten Marker erkennt,
d) Nachweis von Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes aus den genannten Erkennungsspezien und Markern.

Des Weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Nachweisverfahren enthaltend folgende Schritte:

a) Behandlung einer Probe enthaltend einen ersten und einen zweiten Marker mit einer ersten Erkennungsspezie, die den ersten Marker erkennt,
b) Behandlung der Probe mit einer zweiten Erkennungsspezie, die den ersten Marker, und eine dritte Erkennungsspezie erkennt,
c) Behandlung der Probe mit einer dritten Erkennungsspezie, die den zweiten Marker und die zweite Erkennungsspezie erkennt,
d) Nachweis von Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes aus den genannten Erkennungsspezien und Markern.

Zur Erhöhung der Spezifität ist es in einer weiteren Ausführungsform vorteilhaft, daß weitere Erkennungsspezien, die weitere Marker erkennen, in weiteren Behandlungsschritten einge setzt werden, was bei einer Erweiterung auf n-Liganden mit n gleich eine natürliche Zahl n + 1 Erkennungsspezien zur Folge hat.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird das Nachweisverfahren in homogener, teil homogener (modularer) oder immobilisierter Form durchgeführt. Bei einer homogenen Aus führungsform werden schrittweise die Bindungsereignisse erzeugt und der sich eventuell ge bildete Komplex in einem sogenannten Proximity Assay nachgewiesen. Dabei werden die erste und die letzte Komponente vorzugsweise so markiert, daß sie nur bei gegenseitiger Nähe ein Signal erzeugen können. Bevorzugte Detektionsverfahren sind z. B. LOCI (Ullmann, E. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426), Fluoreszenz-Energy-Transfer (FRET) Car dullo, R. A. (1992) in "Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules", 414-423, Springer Verlag), Fluoreszenz-Quenching (Ladokhin, A. S. (1997) "Distribution analysis of depth-dependent fluorescence quenching in membranes: a practical guide", Methods- Enzymol., 278, 462-473) oder Scintillation Proximity Assay (SPA) (Picardo, M. & Hughes, K. T. (1997) "Scintillation proximity assays. High Throughput Screening"; Ed. Devlin, J. P.; Verlag Dekker, New York, N. Y., 307-316).

Bei einer teilhomogenen oder modularen Ausführungsform werden die Bindungsereignisse schrittweise und in Lösung erzeugt, und, sobald der Komplex sich ausgebildet hat, über eine der Komponenten an einen festen Träger gebunden. Der sich bildende Komplex wird durch eine Markierung, insbesondere eine nicht-radioaktive Markierung oder radioaktive Markie rung, vorzugsweise über eine Fluoreszenzmarkierung, enzymatische Markierung, Redoxmar kierung oder Spinmarkierung nachgewiesen (Kessler, C. (Ed.) Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules (1992), Springer Verlag, 414-423).

Bei einer immobilisierten Ausführungsform wird eine Erkennungsspezie, vorzugsweise die erste Erkennungsspezie an einen festen Träger gebunden und nachfolgend durch schrittweise Zugabe der weiteren Komponenten der Komplex aufgebaut. Die Markierung erfolgt vor zugsweise nach gleichen oder ähnlichen Methoden wie bei der teilhomogenen Ausführungs form.

Als Träger für die Immobilisierung eignen sich vor allem festes oder gelartiges Material, ins besondere Chipmaterial und/oder dünne Schichten des Materials, vorzugsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien oder (bio)molekulare Filamente, insbesondere Zellulose oder Gerüstproteine.

Die in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren eingesetzten Erkennungsspezien und/oder Marker sind insbesondere eine synthetische Substanz, ein Naturstoff und/oder ein Naturstoff derivat, vorzugsweise ein Peptid, Peptoid, Protein, Saccharid oder eine Nukleinsäure. Beson ders bevorzugt sind beispielsweise ein Rezeptor oder ein funktioneller Teil davon, insbeson dere ein funktioneller Teil, der aus der extrazellulären Domäne eines membran-ständigen Re zeptors entstammt, ein Antikörper oder ein funktioneller Teil davon, insbesondere ein Fv- Fragment (Skerra & Plückthun (1988), Science 240, 1038), ein einzelkettiges Fv-Fragment (scFv; Bird et al. (1988), Science 242, 423; Huston et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5879) oder ein Fab-Fragment (Better et al. (1988), Science 240, 1041), ein Aptamer, bei spielsweise ein DNA- oder RNA-Aptamer oder Derivate davon, beispielsweise mit in der Nukleinsäurechemie üblichen Schutzgruppen versehene Aptamere, ein Zellbestandteil, insbe sondere ein Lipid, Glykoprotein, Filamentbestandteil, Lektin, Liposom, Mitogen, Antigen, sekundärer Matabolit oder Hapten, eine Zelle, insbesondere eine lymphoide Zelle, oder ein Virus, insbesondere ein Virusbestandteil, vor allem ein Kapsid, oder ein Viroid oder ein Deri vat, insbesondere ein Acetat, oder deren wirksame Teile, oder eine einzelsträngige oder dop pelstängige Nukleinsäure, insbesondere DNA, RNA, p-RNA (Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta. (1993), 76, 2161; Pitsch, S. et al., Helv. Chim. Acta. (1995), 78, 1621), p-DNA (DE 198 37 387.2), PNA (peptidische Nukleinsäure (Nielsen, P. E. et al. (1991) Science, 254, 1497), CNA (Aminocyclohexylnukleinsäure; PCT/EP98/06002) oder ein Aptamer (siehe z. B. Bock, L. C. et al. (1992) Nature, 355, 564) oder Hybride der genannten Substanzen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung zählen Aptamere aufgrund ihrer Bindungseigenschaften an spezifische von Nukleinsäuren unterschiedliche Moleküle, wie z. B. Proteine, nicht zu den Nukleinsäuren, sondern zu Antikörper-Derivaten. Bevorzugt sind DNA-Aptamere oder RNA-Aptamere.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren einschließlich Aptamere können auch modifiziert sein. Hierzu sind die dem Fachmann aus der Nukleinsäurechemie bekannten Methoden an wendbar. Bevorzugt sind Modifikationen, die zu einer Stabilisierung der Nukleinsäuren füh ren (siehe z. B. Uhlmann, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90. 543, No. 4).

Üblicherweise erfolgt die Erkennung eines Markers durch eine Erkennungsspezie über nicht- kovalente Wechselwirkungen, insbesondere über Wasserstoffbrücken, Salzbrücken, Stape lungen, Metalligandierungen, Charge-Transfer-Komplexe, Van-der-Waals-Kräfte oder hydro phobe Wechselwirkungen. Beispielsweise wird eine Nukleinsäure als Marker durch eine voll ständig oder teilweise komplementäre Nukleinsäure erkannt oder eine synthetische Substanz, wie z. B. eine Chemikalie, ein Naturstoff und/oder ein Naturstoffderivat als antigene Stoffe werden von einem entsprechenden Antikörper oder Antikörper-Derivat erkannt. Gemäß dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren können die Marker jeder beliebigen Substanzklasse angehören, vorzugsweise jedoch aus mindestens zwei verschiedenen.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren ist des Weiteren mindestens eine Erken nungsspezie markiert, vorzugsweise sind alle Erkennungsspezien markiert, vor allem sind mindestens zwei Erkennungsspezien unterschiedlich markiert. Wie bereits oben näher erläu tert, kann die Markierung je nachdem ob es sich um eine homogene, teilhomogene (modulare) oder immobilisierte Ausführungsform handelt, nicht-radioaktiv oder radioaktiv sein, vor zugsweise LOCI, FRET, Fluoreszenz-Quenching, SPA, eine Fluoreszenzmarkierung, enzy matische Markierung, Redoxmarkierung oder Spin-Markierung.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann der Marker und/oder das Signal ampli fiziert werden, was zu einer Erhöhung der Sensitivität des Nachweisverfahrens führt. Die Amplifizierung des Markers betrifft insbesondere die Amplifizierung von Nukleinsäuren, beispielsweise durch PCR, NASBA, LCR, SDA, Qβ-Replikation oder RT-PCR (Kessler, C. (1992) supra). Die Signalamplifizierung wird beispielsweise durch sog. Cross-Linking von Bindungspartnern, Antikörper- oder Nukleinsäure-Bäumen (z. B. b-DNA), katalytische Sub stratumsetzung (z. B. alkalische Phosphatase, Peroxidase, β-Galaktosidase) oder Signalkaska den erreicht.

Neben der genannten in vitro Amplifizierung ist auch eine in vivo Amplifizierung, z. B. De tektion von r-RNA, indirekte Detektion von Antigenen, möglich.

Grundsätzlich kann man die Marker in zwei Klassen aufteilen. Bei sog. Positivmarkern wird das Fehlen dieser Marker nachgewiesen, z. B. über das Fehlen eines Signals. Positive Marker beziehen sich im allgemeinen auf in einem gesunden Organismus vorhandene Marker, z. B. m-RNA. Als negative Marker werden im allgemeinen die Substanzen eines Pathogens oder eines kranken Organismus bezeichnet, der über das erfindungsgemäße Nachweisverfahren bestimmt werden kann.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren können entweder zwei oder mehrere negative, zwei oder mehrere positive oder zwei oder mehrere positive und negative Marker nachgewiesen werden. Der Nachweis erfolgt somit entweder über das Auftreten oder über das Fehlen eines Signals. Ebenso ist eine Verdrängung eines Signals z. B. durch das Verdrängen eines Moleküls aus einem Komplex oder aus seiner bindenden Konformation (z. B. Molecular Beacons, S. Tyaki, Kramer F. R., Nature Biotechnology 14, 303-308, 1996, R. P. Ekins, Clini cal Chemistry, 44/9, 2015-2030, 1998) in einem kompetitiven Assay möglich. Hierzu wird eine Substanz dem Testsystem zugegeben, die einen der nachzuweisenden Marker verdrängt, wobei der aus Markern und Erkennungsspezien aufgebaute Molekülkomplex und damit auch das damit verbundene Signal verschwindet. Über eine Titration läßt sich somit auf einfache Art und Weise die Konzentration des verdrängten Markers bestimmen.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann nun in mindestens einer der folgenden alter nativen Ausführungsformen vorliegen, die besonders bevorzugt sind:

1. Mindestens ein Marker ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure und jeder weitere Marker ist eine von einer Nuklein säure verschiedene synthetische Substanz, Naturstoff oder Naturstoffderivat, vorzugs weise ein Antigen.
2. Der erste Marker und jeder weitere Marker ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure oder alternativ eine von einer Nu kleinsäure verschiedene synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderi vat, vorzugsweise ein Antigen.
3. Eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nuklein säure als Marker wird von einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure als Erkennungsspezie erkannt.
4. Eine synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat wird von einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat, vorzugsweise von einem Antikörper oder einem Antikörper-Derivat als Erkennungsspezie erkannt.
5. Mindestens eine Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzel strängige oder doppelsträngige Nukleinsäure und jede weitere Erkennungsspezie ist eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Natur stoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder ein An tikörper-Derivat.
6. Die erste Erkennungsspezie und jede weitere Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelstränge oder doppelsträngige Nukleinsäure oder alternativ eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Natur stoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder ein An tikörper-Derivat.
7. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht- natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nuklein säure.
8. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat und einer anderen synthetischen Sub stanz, einem anderen Naturstoff oder einem anderen Naturstoffderivat.
9. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht- natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, einem verschiedenen Naturstoff oder einem verschiedenen Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Anti körper-Derivat.
10. Eine erste Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure, eine zweite Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nu kleinsäure und einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoff derivat, vorzugsweise einem Antikörper oder Antikörper-Derivat.
11. Eine erste Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure, eine zweite Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nu kleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure, und die dritte Erkennungsspezie ist eine weitere ande re natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure.
12. Eine erste Erkennungsspezie ist eine synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat, eine zweite Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat, vorzugsweise einem Antikörper oder Antikörper- Derivat, und einer anderen synthetischen Substanz einem anderen Naturstoff oder ei nem anderen Naturstoffderivat, vorzugsweise einem anderen Antikörper oder Anti körper-Derivat, und eine dritte Erkennungsspezie ist eine weitere andere synthetische Substanz, ein weiterer anderer Naturstoff oder ein weiteres anderes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein weiterer anderer Antikörper oder ein weiteres anderes Antikörper- Derivat.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Testsystem enthaltend mindestens zwei Erkennungsspezien, die mindestens zwei verschiedene Marker unter Ausbildung eines Komplexes erkennen, vorzugsweise die oben bereits beschriebenen Erkennungsspezien bzw. Marker. In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eine Erkennungsspezie an ei nen Träger, wie vorzugsweise oben bereits näher beschrieben, immoblisiert.

Das erfindungsgemäße Testsystem kann in folgenden bevorzugten Ausführungsformen einge setzt werden:

1. Mindestens eine Erkennungsspezie ist eine natürliche oder nicht-natürliche, einzel strängige oder doppelsträngige Nukleinsäure und mindestens eine andere Erkennungs spezie ist eine andere natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppel strängige Nukleinsäure.
2. Mindestens eine Erkennungsspezie ist eine von einer Nukleinsäure verschiedene syn thetische Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Naturstoffde rivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat, und mindestens eine an dere Erkennungsspezie ist eine andere von einer Nukleinsäure verschiedene syntheti sche Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vor zugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat.
3. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht- natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörperderivat.
4. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht- natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäu re.
5. Mindestens eine Erkennungsspezie ist ein Hybrid aus einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat und einer an deren von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat.

Das erfindungsgemäße Testsystem läßt sich beispielsweise dadurch herstellen, daß die für die einzelnen Ausführungsformen notwendigen Erkennungsspezien zusammengestellt werden, bzw. daß mindestens eine Erkennungsspezie an einen Träger, wie oben bereits vorzugsweise beschrieben, nach dem Fachmann allgemein bekannten Verfahren immobilisiert wird.

Das erfindungsgemäße Testsystem läßt sich in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren, wie oben näher beschrieben, einsetzen. Insbesondere dient es zum Nachweis von An- und/oder Abwesenheit von mindestens zwei verschiedenen Markern in einer Probe. Vor zugsweise liegt es in Form eines Diagnostikums oder eines Analyten vor. Es dient daher ins besondere für den Nachweis von Erkrankungen oder für die Umweltanalytik, insbesondere zum Nachweis von Toxinen und/oder Allergenen.

Die folgenden Figuren und Beispiele sollen die Erfindung näher beschreiben, ohne sie zu be schränken.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt schematisch den Nachweis von zwei Analyten (A und B) in einem Assay in der immobilisierten Ausführungsform.

Fig. 2 zeigt schematisch den Nachweis von zwei Analyten (Antigene A und B) in einem As say in der immobilisierten Ausführungsform.

Fig. 3 zeigt schematisch den Nachweis von zwei Analyten (Nukleinsäure A und B) in einem Assay in der immobilisierten Ausführungsform.

Fig. 4 zeigt schematisch den Komplex aus Markern und Erkennungsspezien gemäß Beispiel 1.

Fig. 5 zeigt schematisch den Komplex aus Markern und Erkennungsspezien gemäß Beispiel 2.

BEISPIELE Gleichzeitige Detektion einer Desoxyribonucleinsäure und eines markierten Antikörper- Antigens Ausgangsverbindungen

Die für das Beispiel benötigten Reagenzien, wie Texas-Red® markiertes Oligonukleotidkon jugat (24-mer DNA; Fa. Interactiva; DNA1), ein biotinyliertes Oligonukleotidkonjugat (24- mer DNA; Fa. Interactiva; DNA3); ein synthetisches Oligonukleotid (57-mer DNA; Fa. In teraktiva; DNA2), das zu den beiden anderen DNAs komplementäre Sequenzen besitzt, Streptavidin-konjugiertes anti-Human IgG F(ab')₂ (Ziege; Fa. Rockland) und ein Fluoresceinmarkiertes human IgG F(ab')₂-Fragment (Fa. Rockland) als Antigen, sind alle käuflich er hältlich

Tabelle 1

Verwendete Erkennungsspezien und Marker

Beispiel 1

1 nmol TexasRed-markiertes Oligonucleotidkonjugat (DNA1), 1 nmol Biotin-markiertes Oligonucleotidkonjugat (DNA3) und 1 pmol des 57-meren Oligonucleotids (DNA2 wurden in jeweils 150 µl Hybridisierungspuffer (5 × SSC, 0,02% SDS) aufgenommen. Anschließend wurde für 30 min auf 60°C erwärmt, miteinander vermischt und 3 h bei 37°C inkubiert. Man ließ auf Raumtemperatur (RT) abkühlen, addierte 1 nmol des Streptavidin-anti-Human-IgG F(ab')₂-Konjugats und 1 nmol des Fluorescein-markierten IgG F(ab')₂-Fragments und ließ über Nacht bei RT stehen. Der sich bildende Komplex wurde durch eine gelbe Bande in ei nem nicht-denaturierenden Gel (15%-iges TEB-Gel, Fa. BioRad) nachgewiesen.

Beispiel 2

1 nmol Biotin-markiertes Oligonucleotidkonjugat (DNA1), 1 nmol Biotin-markiertes Oligo nucleotidkonjugat (DNA3) und 1 pmol des 57-meren Oligonucleotids (DNA2) wurden in jeweils 150 µl Hybridisierungspuffer (5 × SSC, 0,02% SDS) aufgenommen. Es wurde für 5 min auf 60°C erwärmt, miteinander vermischt und 3 h bei 37°C inkubiert. Man ließ auf Raumtemperatur (RT) abkühlen und gab die Lösung auf einer mit Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatte (Fa. BIOTEZ, Best.-Nr. 040298920). Die überstehende Lösung wurde abpi pettiert und der Träger 5 × mit 500 µl 0,9% NaCl-Lösung gewaschen. Nun addierte man 200 µl einer, bei RT für 2 h vorinkubierten Lösung aus 200 µl Streptavidin-anti-Human-IgG F(ab')₂ (Ziege)-Lösung (1,6 mg/ml) und 40 µl des Fluorescein-markierten IgG F(ab')₂- Fragment-Lösung (5,0 mg/ml) und ließ 1-2 h bei RT inkubieren. Die überstehende Lösung wurde wiederum abpipettiert und der Träger 5 × mit 500 µl 0,9% NaCl-Lösung gewaschen. Durch das Messen der Fluorescenz des Fluoresceins (λ_max,A: 494 nm, λ_max,E: 525 nm) wurde die Bildung des Komplexes nachgewiesen.

Tabelle 2

Verwendete Erkennungsspezien und Marker

Claims

1. Nachweisverfahren enthaltend folgende Schritte:

2. Nachweisverfahren enthaltend folgende Schritte:

3. Nachweisverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß weitere Er kennungsspezien, die weitere Marker erkennen, in weiteren Behandlungsschritten einge setzt werden.

4. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Erkennungsspezie, vorzugsweise die erste Erkennungsspezie, an einen Träger immobili siert wird.

5. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ausge wählt ist aus einem festen oder gelartigen Material, insbesondere Chipmaterial und/oder dünne Schichten des Materials, vorzugsweise Keramik, Metall, insbesondere Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien oder (bio)molekulare Filamente, insbesondere Cellulose oder Gerüstproteine.

6. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die ge nannte Erkennungsspezie und/oder der Marker eine synthetische Substanz, ein Naturstoff und/oder ein Naturstoffderivat ist, vorzugsweise ausgewählt aus einem Peptid, Peptoid, Protein, Saccharid oder einer Nukleinsäure.

7. Nachweisverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetische Sub stanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat ausgewählt ist aus einem Rezeptor oder einem funktionellen Teil davon, insbesondere aus der extrazellulären Domäne eines Membran-ständigen Rezeptors, einem Antikörper oder einem funktionellen Teil davon, insbesondere einem Fv-Fragment, einem einzelkettiges Fv-Fragment (scFv) oder einem Fab-Fragment, einem Zellbestandteil, insbesondere einem Lipid, Glykoprotein, Fila mentbestandteil, Lectin, Liposom, Mitogen, Antigen, sekundärer Metabolit oder Hapten, einer Zelle, insbesondere einer lymphoide Zelle, oder einem Virus, insbesondere einem Virusbestandteil, vor allem einem Kapsid, oder einem Viroid, oder einem Derivat, insbe sondere einem Acetat, oder deren wirksame Teile, oder einer einzelsträngigen oder dop pelsträngigen Nukleinsäure, insbesondere eine natürliche Nukleinsäure in Form einer DNA oder RNA oder eine nicht-natürliche Nukleinsäure, vorzugsweise p-RNA, p-DNA, PNA oder CNA, oder Hybriden der genannten Substanzen.

8. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Er kennung eines Markers durch eine Erkennungsspezie über nicht-kovalente Wechselwirkungen erfolgt, insbesondere über Wasserstoffbrücken, Salzbrücken, Stapelungen, Me talligandierungen, Charge-Transfer-Komplexe, Van-der-Waals-Kräfte oder hydrophobe Wechselwirkungen.

9. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß minde stens eine Erkennungsspezie markiert ist, insbesondere sind alle Erkennungsspezien mar kiert, vorzugsweise sind mindestens zwei Erkennungsspezien unterschiedlich markiert.

10. Nachweisverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung eine nicht-radioaktive Markierung oder radioaktive Markierung, vorzugsweise eine LOCI- Markierung, FRET-Markierung, Fluoreszenz-Quenching-Markierung, SPA-Markierung, Fluoreszenzmarkierung, enzymatische Markierung, Redoxmarkierung oder Spinmarkie rung ist.

11. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker und/oder das Signal amplifiziert wird.

12. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis gemäß Schritt (d) des Verfahrens kompetitiv erfolgt.

13. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß min destens ein Marker eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppel strängige Nukleinsäure und jeder weitere Marker eine von einer Nukleinsäure verschie dene synthetische Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Natur stoffderivat, vorzugsweise ein Antigen ist.

14. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Marker und jeder weitere Marker eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträn gige oder doppelsträngige Nukleinsäure oder alternativ eine von einer natürlichen Nu kleinsäure verschiedene synthetische Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein ver schiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antigen ist.

15. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure als Marker von einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträn gigen Nukleinsäure als Erkennungsspezie erkannt wird.

16. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-15, dadurch gekennzeichnet, daß eine synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat von einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat, vorzugsweise von einem Anti körper oder einem Antikörperderivat als Erkennungsspezie erkannt wird.

17. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß min destens eine Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure und jede weitere Erkennungsspezie eine von einer Nu kleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschie denes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.

18. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Erkennungsspezie und jede weitere Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht- natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure oder alternativ eine von ei ner Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Naturstoff oder ver schiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.

19. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß min destens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure ist.

20. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß min destens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat und einer anderen synthetischen Substanz, einem an deren Naturstoff oder einem anderen Naturstoffderivat ist.

21. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß min destens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, einem verschiedenen Naturstoff oder einem ver schiedenen Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.

22. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder dop pelsträngige Nukleinsäure ist, eine zweite Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürli chen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Naturstoffderivat, vorzugs weise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.

23. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder dop pelsträngige Nukleinsäure ist, eine zweite Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürli chen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure ist, und die dritte Erkennungsspezie eine weitere andere natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure ist.

24. Nachweisverfahren nach einem der Ansprüche 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Erkennungsspezie eine synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffde rivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist, eine zweite Erkennungs spezie ein Hybrid aus einer synthetischen Substanz, einem Naturstoff oder einem Natur stoffderivat, vorzugsweise aus einem Antikörper oder Antikörper-Derivat, und einem an deren Naturstoff oder einem anderen Naturstoffderivat, vorzugsweise ein anderer Anti körper oder Antikörper-Derivat ist, und eine dritte Erkennungsspezie eine weitere andere synthetische Substanz, ein Naturstoff oder ein Naturstoffderivat, vorzugsweise ein weite rer anderer Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.

25. Testsystem enthaltend mindestens zwei Erkennungsspezien, die mindestens zwei ver schiedene Marker unter Ausbildung eines Komplexes erkennen.

26. Testsystem nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erken nungsspezie an einen Träger immobilisiert ist.

27. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie eine natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppel strängige Nukleinsäure ist und mindestens eine andere Erkennungsspezie eine andere natürliche oder nicht-natürliche, einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure ist.

28. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie eine von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein An tikörper oder Antikörper-Derivat ist, und mindestens eine andere Erkennungsspezie eine andere von einer Nukleinsäure verschiedene synthetische Substanz, verschiedener Natur stoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper- Derivat ist.

29. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngi gen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und eine von einer Nukleinsäure verschiedenen synthetischen Substanz, ein verschiedener Naturstoff oder ein verschiedenes Naturstoff derivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.

30. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungsspezie ein Hybrid aus einer natürlichen oder nicht-natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure und einer anderen natürlichen oder nicht- natürlichen, einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure ist.

31. Testsystem nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungspezie ein Hybrid aus einer von einer Nukleinsäure verschiedenen syntheti schen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugs weise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist, und einer anderen von einer Nuklein säure verschiedenen synthetischen Substanz, verschiedener Naturstoff oder verschiedenes Naturstoffderivat, vorzugsweise ein Antikörper oder Antikörper-Derivat ist.

32. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems gemäß einem der Ansprüche 25-31, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Erkennungsspezien zusammengestellt werden.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Erkennungs spezie an einen Träger immobilisiert wird.

34. Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 25-31 zum Nachweis von An- und/oder Abwesenheit von mindestens zwei verschiedenen Markern in einer Probe.

35. Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 25-31 in Form eines Diagnosti kums oder eines Analyten.

36. Verwendung des Testsystems nach einem der Ansprüche 25-31 für den Nachweis einer Erkrankung oder für die Umweltanalytik, insbesondere zum Nachweis von Krankheitser regern, Markern von Krankheiten, Toxinen und/oder Allergenen.