DE60318415T2

DE60318415T2 - Verfahren zur unterscheidung von metaplasien von neoplastischen oder präneoplastischen läsionen

Info

Publication number: DE60318415T2
Application number: DE2003618415
Authority: DE
Inventors: Peter Martin; Magnus Von Knebel Doeberitz
Original assignee: Roche MTM Laboratories AG
Current assignee: Roche MTM Laboratories AG
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2003-04-08
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2023-04-09
Also published as: JP4809408B2; US20190177804A1; US10246751B2; ATE382863T1; US20120052510A1; EP1493032B1; JP2005523039A; CN1643378A; ES2360342T3; US7422859B2; EP1493032A1; DE60335922D1; MXPA04009584A; WO2004005927A1; JP2009000127A; US20090104609A1; EP1821102B1; ES2297209T3; AU2003274105A1; EP1369694A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unterscheidung von p16^INK4a überexprimierenden Metaplasien von neoplastischen oder präneoplastischen p16^INK4a überexprimierenden Läsionen durch Bestimmung des Levels von Hochrisiko-HPV kodierten Genprodukten wie z. B. HPV E7 Molekülen in biologischen Proben im Verlauf von zytologischen Testverfahren. Das Verfahren ermöglicht somit eine Verringerung von falsch-positiven Ergebnissen beim p16^INK4a-basierten Nachweis von anogenitalen Läsionen in zytologischen Testverfahren.
Der Nachweis der Überexpression von p16^INK4a in biologischen Proben hat sich als nützlicher Marker zum Nachweis von anogenitalen Läsionen, wie zum Beispiel Karzinomen des Gebärmutterhalses (siehe WO00/01845 ; Klaes et al., Int. J. Cancer: 92, 276–284 (2001)) erwiesen. Das Verfahren, welches auf p16^INK4a-spezifischer immunochemischer Färbung basiert, ermöglicht eine empfindliche und genaue Identifikation von dysplastischen Zellen in Gewebesektionen und in zytologischen Proben.
Bei immunohistochemischen Untersuchungen von Gewebe, können dysplastische und neoplastische Zellen mit einem p16^INK4a-spezifischen Antikörper-vermittelten Färbeverfahren gefärbt werden. Die histologische Diagnose neoplastischer Läsionen kann so durch ein Färbeverfahren unterstützt werden, welches auf einem molekularen Marker basiert, der charakteristisch für die Transformation von Zellen in anogenitalen Läsionen ist. Die Diagnose, ob Zellen neoplastisch sind oder nicht, basiert in diesen Verfahren nicht nur auf die p16^INK4a spezifische Färbung sondern stützt sich auch auf die histologische Information.
Dies beruht auf der Tatsache, dass in ungefähr 30% der Proben metaplastische Zellen eine Immunoreaktivität mit p16^INK4a spezifischen Antikörpern aufweisen und so im Verlauf der Verfahren gefärbt werden. Dennoch unterscheidet sich das Färbemuster dieser metaplastischen Zellen von dem der neoplastischen Läsionen. Metaplastische Zellen verursachen ein fleckiges (patchy) oder fokales Färbemuster, wohingegen neoplastische Läsionen diffuse Färbemuster verursachen. Des Weiteren ist die Färbeintensität metaplastischer Zellen überwiegend geringer als die der neoplastischen Zellen.
Bei den üblichen Verfahren, die bei Screeningtests für die Früherkennung von Neoplasien eingesetzt werden, werden keine histologisch basierenden Tests verwendet, sondern werden eher auf zytologische Testverfahren gestützt. Jedoch besonders in Fällen, wo keine histologische Information bezüglich der Gewebearchitektur verfügbar ist, wie z. B. in zytologischen Untersuchungen, kann die alleinige Untersuchung auf p16^INK4a Überexpression zu falsch positiven Ergebnissen führen. Dies beruht auf der Tatsache, dass metaplastische Zellen, die p16^INK4a in nachweisbar erhöhten Konzentrationen exprimieren nicht anhand eines histologischen Färbemusters unterschieden werden können.
Der Prozentanteil von Zellen, die eine Überexpression von p16^INK4a aufweisen, steigt im Verlauf der Entstehung von Dysplasien. In neoplastischen oder preneoplastischen Stadien, wenn nur eine begrenzte Population von neoplastischen oder preneoplastischen Zellen in der Probe präsent ist, kann die Immunoreaktivität von p16^INK4a schwach sein. Diese schwache Immunoreaktivität kann ungefähr den gleichen Level aufweisen, wie der Level, der durch metaplastische Zellen verursacht wird. In späteren Stadien der Dysplasien ist die gesamte Immunoreaktivität von p16^INK4a stärker und deswegen sind neoplastische Läsionen leicht von Metaplasien zu unterscheiden, sogar in einem zytologischen Testformat. Dies könnte zu Fällen führen, wo die Anwesenheit von metaplastischen Zellen, die p16^INK4a exprimieren mit der Anwesenheit von neoplastischen Zellen verwechselt werden könnte und so ein falsch positives Ergebnis produziert wird.
Besonders bei Screeningtests, wo der Nachweis früher Stadien von Neoplasien wünschenswert ist, ist dieser Zustand ziemlich unangenehm. Dies ist vor allem deswegen der Fall, da sich die p16^INK4a basierende Diagnose als wertvolles Hilfsmittel in histologischen Untersuchungen herausgestellt hat und die Anwendung in zytologisch basierten Screeningverfahren diese etablierten Verfahren verbessern könnte.
Um falsch positive Ergebnisse in zytologischen Testformaten zu verringern und somit die Zuverlässigkeit von p16^INK4a-vermittelten Diagnosen von anogenitalen Läsionen weiter zu verbessern, wäre ein Verfahren zur Unterscheidung der Metaplasien von neoplastischen und dysplastischen Läsionen wünschenswert. Das in der Technik vorliegende Problem bezieht sich hauptsächlich auf frühe Stadien von Neoplasien, wo der Level von p16^INK4a-überexprimierenden Zellen noch mit Level normal auftretender p16^INK4a überexprimierender proliferierender metaplastischer Zellen verwechselt werden könnte. Deswegen muss man zur Lösung des vorliegenden Problems Parameter involvieren, die frühe Stadien von Neoplasien des anogenitalen Trakts charakterisieren.
Zum Stand der Technik gehören verschiedene Publikationen, die den Nachweis von p16 sowie den Nachweis von HPV E7 in histologischen Proben von Tumorgewebe beschreiben.
Milde Langosch et al, Virchows Arch (2001) 439: 55–61 beschreibt Studien über histologische Schnitte zervikaler Adenokarzinome. Die immunhistochemische Färbung wird unter anderem zum Nachweis der p16-Expression durchgeführt. Des Weiteren wird die Analyse von histologischen Proben durch In-Situ-Hybridisierungsfärbung zum Nachweis der Expression von HPV-E6/E7-Nukleinsäuren beschrieben.
Riethdorf et al., Virchows Archiv (2001) 439: 338 beschreibt den Nachweis von p16 und Ki67 in formalinfixierten, paraffineingebetteten Histologie-Proben zervikaler Adenokarzinome in-situ. Der Nachweis von HPV-E7-Transkription wird in diesem Zusammenhang als Goldstandard für den Nachweis von HPV-bezogenen glandulären Neoplasien verwendet. Informationen über HPV und p16-Expression werden in diesem Zusammenhang als unabhängige Ergebnisse behandelt und es gibt keine Entscheidung hinsichtlich des Nachweises von HPV und p16 in einer Probe.
Stattdessen wird dargestellt, dass p16 und Ki67 eingesetzt werden können, um ACIS von gutartigen Läsionen zu unterscheiden. Dementsprechend kann ACIS von gutartigen Läsionen durch den alleinigen Nachweis von p16 unterschieden werden.
Doorbar, John et al. beschreibt in WO0208764 ein diagnostisches Verfahren, welches den gleichzeitigen Nachweis eines Proliferationsmarker und eines HPV-Expressionsprodukts umfasst. Die Autoren schlagen vor, dass der gleichzeitige Einsatz von HPV E4 und p16 nützlich für die Diagnose von zervikalen Neoplasien sein könnte. Es wird weder ein Hinweis bezüglich des Einsatzes von anderen HPV-Genen in Verbindung mit p16 gegeben, noch zu spezifische Anwendungen in der Zytologie.
Ein Verfahren zur Unterscheidung von Metaplasien von neoplastischen und präneoplastischen Läsionen wird innerhalb der beanspruchten Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung geliefert.
Zur Unterstützung der Unterscheidung von Metaplasien von neoplastischen Läsionen in Testverfahren basierend auf der Überexpression von p16^INK4a, wäre ein Markermolekül wünschenswert, welches in neoplastischen und/oder präneoplastischen Zellen und Geweben exprimiert wird und welches in metaplastischen Zellen nicht exprimiert wird.
Die Erfinder haben herausgefunden, dass Zellen, die Hochrisiko-HPV-Genprodukte wie HPV E7 exprimieren, im Verlauf von zytologischen Testerverfahren nützlich sein können zur Unterscheidung früher neoplastischer oder dysplastischer Läsionen, die durch ein p16^INK4a-spezifisches Färbeverfahren nachweisbar sind, von Metaplasien, die auch Zellen umfassen können, welche mit p16^INK4a immunreaktiv sind.
Zellen, die andere HPV-kodierte Genprodukte exprimieren, welche auf einem Expressionslevel als mRNA oder Polypeptid in neoplastischen oder präneoplastischen Stadien nachweisbar sind, können auch für die Unterscheidung von neoplastischen und/oder präneoplastischen Läsionen von p16^INK4a überexprimierenden Metaplasien gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Beispiele für solche HPV-kodierten Genprodukte beinhalten HPV-E7-Proteine oder mRNA.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unterscheidung von neoplastischen, präneoplastischen und/oder dysplastischen Läsionen von p16^INK4a überexprimierenden Metaplasien in biologischen Proben innerhalb eines zytologischen Testverfahrens basierend auf dem Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zellen, die ein Hochrisiko-HPV-Genprodukt in besagten biologischen Proben exprimieren. HPV-Genprodukte, die für das hier offenbarte Verfahren nützlich sind, sind Genprodukte, welche stark exprimiert werden, besonders in frühen Stadien neoplastischer und präneoplastischer Läsionen. In einer Ausführungsform der Erfindung können HPV-E7-Proteine oder mRNA als Marker zur Unterscheidung von Metaplasien von frühen neoplastischen oder präneoplastischen Läsionen in Proben nützlich sein.
Unterscheidung im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine Beurteilung hinsichtlich der Klassifizierung einer Probe umfassen. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich die Unterscheidung auf die Beurteilung, ob ein Gewebe oder dessen Bestandteile neoplastisch oder metaplastisch ist. Somit ist die Unterscheidung im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Beurteilung der Wachstumseigenschaften einer Zelle in einer Probe.
Die Unterscheidung gemäß der vorliegenden Erfindung basiert auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zellen, die ein Hochrisiko-HPV-Genprodukt exprimieren und auf der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zellen, die p16^INK4a in besagter Probe überexprimieren. Die Zellen, welche die Hochrisiko-HPV-Genprodukte wie z. B. E7 exprimieren, müssen nicht unbedingt die gleichen Zellen sein wie diejenigen, die p16^INK4a überexprimieren, obwohl die Expression beider Markermoleküle in den gleichen Zelle vorkommen kann.
Somit ist die Anwesenheit von Zellen, die E7-Genprodukte in einer Zelle exprimieren und die gleichzeitige Anwesenheit von p16^INK4a überexprimierenden Zellen (andere Zellen oder die gleichen Zellen, die gleichzeitig beide Marker exprimieren) gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich zur Unterscheidung neoplastischer oder präneoplastischer Läsionen von Metaplasien.
HPV-kodierte Genprodukte im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen beliebige mRNA sein, die von einem Gen eines HPV-Genomes transkribiert werden oder beliebige Polypeptide, welche von solcher mRNA translatiert werden. HPV-Genprodukte, die sich für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eignen, sind Genprodukte, welche von dem E7-Gen kodiert werden.
HPV gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet Humanes Papillomavirus. HPV im Sinne der vorliegenden Erfindung soll jeden beliebigen Hochrisiko-Subtyp von HPV umfassen. In einer weiteren Ausführungsform der voliegenden Erfindung ist der HPV-Subtyp ein Krebs-assoziierter HPV-Subtyp wie z. B. HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 and 58. In einer anderen Ausführungsform sind die HPV-Hochrisiko-Subtypen HPV 16, 18, 39 oder HPV 45. HPV-Subtyping soll beliebiges Verfahren umfassen, welches für die Bestimmung des bestimmten in einer biologischen Probe vorhandenen HPV-Subtyps geeignet ist.
Das Verfahren zum Nachweis des Levels der HPV-kodierten Genprodukte gemäß der vorliegenden Erfindung ist beliebige Methode, die sich dafür eignet sehr kleine Mengen spezifischer biologischer Moleküle in biologischen Proben nachzuweisen. Die Nachweisreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Nachweis auf der Nukleinsäurenebene oder Polypeptidebene.
Die HPV-Genprodukte können anhand von Reagenzien nachgewiesen werden, welche diese Moleküle spezifisch erkennen. Die Nachweisreaktion für die HPV-Genprodukte können eine oder mehrere Reaktionen mit Nachweisagenzien umfassen, welche entweder die anfänglichen Markermoleküle erkennen oder die vorherigen Moleküle, die verwendet wurden um andere Moleküle zu erkennen.
Die Nachweisreaktion kann weiterhin eine Reporterreaktion umfassen, welche die Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder den Level des HPV-Genprodukts angibt. Die Reporterreaktion kann zum Beispiel eine Reaktion sein, die eine farbige Verbindung produziert, oder eine biolumineszente Reaktion, eine fluoreszente Reaktion oder generell eine strahlenabgebende Reaktion etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform können Markermoleküle von Agenzien erkannt werden, die verschiedene Reportersignale produzieren, so dass die Signale, die sich auf die Markermoleküle beziehen unterschieden werden könnten. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis der Expression von Hochrisiko-HPV-Genprodukten und der Nachweis der p16^INK4a-Überexpression gleichzeitig durchgeführt. In diesem Fall kann die Reporterreaktion zum Beispiel verschiedene fluoreszente Markierungen für die verschiedenen nachgewiesenen Moleküle hervorrufen.
Geeignete Formate für die Nachweisreaktion im Sinne der vorliegenden Erfindung können Blot-Techniken, wie Western-Blot, Southern-Blot oder Northern Blot sein. Die Blot-Techniken sind in der Technik dem Durchschnittsfachmann bekannt und können zum Beispiel als Elektro-Blut, Semidry-Blot, Vakuum-Blot oder Dot-Blot durchgeführt werden. Eine Amplifikationsreaktion kann auch für den Nachweis von z. B. Nukleinsäuremolekülen geeignet sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis des Levels der HPV-Genprodukte durch den Nachweis der jeweiligen in der Probe anwesenden mRNA oder Fragmente davon durchgeführt. Die Mittel zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen sind dem Fachmann in der Technik bekannt. Das Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren kann zum Beispiel durch eine Bindereaktion des nachzuweisenden Moleküls an komplementäre Nukleinsäuresonden, Proteine mit Bindeeigenschaft für die Nukleinsäuren oder an jegliche andere Gebilde, die spezifisch besagte Nukleinsäuren erkennen und binden durchgeführt werden.
Dieses Verfahren kann sowohl in-vitro als auch direkt in-situ durchgeführt werden, z. B. im Verlauf einer nachweisenden Färbereaktion. Eine anderer Möglichkeit zum Nachweis der HPV-mRNAs in einer Probe, die in der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, ist eine Nukleinsäure-Amplifikations-Reaktion, die quantitativ ausgeführt werden kann, wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Beispiel kann RealTime-RT PCR eingesetzt werden, um den Level der HPV-RNA in Proben von Tumoren zu messen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis des Levels von HPV-Genprodukten durch die Bestimmung des Expressionslevels eines Proteins durchgeführt. Die Bestimmung des HPV-Genprodukts auf der Proteinebene kann zum Beispiel in einer Reaktion ausgeführt werden, die ein Bindungsagens beinhaltet, das spezifisch für den Nachweis des bestimmten HPV-Polypeptids ist.
Die Bindungsagenzien können in vielen verschiedenen Nachweistechniken eingesetzt werden, wie z. B. beim Western-Blot, bei ELISA oder bei der Immunoprezipitation. Generell kann ein Nachweis auf der Ebene von Polypeptidbindeagenzien sowohl in-vitro als dirket in-situ zum Beispiel im Verlauf einer immunochemischen Färbereaktion durchgeführt werden. Es kann ein beliebig anderes Verfahren zum Nachweis der Menge von bestimmten Polypeptiden in biologischen Proben gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
Bindungsagenzien im Sinne der vorliegenden Erfindung zum Nachweis des Levels von HPV-Polypeptiden oder p16^INK4a-Polypeptiden können Antikörper und antigenbindende Fragmente, bifunktionale Hybridantikörper, Peptidomimetiks, die minimale antigenbindende Epitope etc. enthalten umfassen.
Ein Antikörper oder antigenbindendes Agens soll spezifisch reagieren, wenn es in einem nachweisbaren Level mit einem hier offenbarten Protein reagiert und nicht signifikant mit anderen Proteinen reagiert. Die Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Im Sinne der vorliegenden Erfindung soll die Bezeichnung „Antikörper" oder „monoklonaler Antikörper" intakte Moleküle sowie Antikörperfragmente beinhalten. Darüber hinaus beinhalten Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können chimerische Antikörper, Einkettenantikörper und humanisierte Antikörper.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Bindungsagenzien isoliert oder in Kombination eingesetzt werden. Durch Kombination ist es möglich einen höheren Sensitivitätsgrad zu erreichen. Die Bezeichnung Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die im Wesentlichen aus konzentrierten monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen Epitopspezifitäten sowie aus verschiedenen monoklonalen Anitkörperpräparaten bestehen.
Monoklonale Antikörper werden aus antigenenthaltenden Fragmenten des Polypeptids dieser Erfindung gemacht, unter Einsatz einer beliebigen Vielfalt von Techniken, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, wie z. B. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einer solchen Technik wird ein Immunogen, welches das Antigenpolypeptid oder einen synthetischer Teil davon enthält, zunächst einer beliebig großen Vielfalt von Säugetieren (wie z. B. Mäusen, Ratten, Hasen, Schafen und Ziegen) injiziert. Bei diesem Schritt können die Polypeptide dieser Erfindung als das Immunogen ohne Modifikation dienen. Alternativ, besonders bei relativ kurzen Polypeptiden, kann eine höhere Immunreaktion ausgelöst werden, wenn das Polypeptid zu einem Trägerprotein verbunden wird, wie z. B. Bovin Serum Albumin oder Keyhole Limpet Hemacyanin. Das Immunogen wird in den Tierwirt injiziert, vorzugsweise gemäß einem vorher festgelegten Zeitplan, der eine oder mehrere Booster-Immunisierungen einschließt, und den Tieren wird periodisch Blut entnommen. Polyklonale Antikörper, die spezifisch für das Polypeptid sind, können dann von diesem Antiserum durch z. B. eine Affinitätschromatographie unter Einsatz des Polypeptids, das an einen geeigneten Feststoff gekoppelt ist, aufgereinigt werden.
Die Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der p16^INK4a-Überexpression gemäß der vorliegenden Erfindung sind die gleichen Verfahren sie die oben erwähnten zum Nachweis von HPV-Genprodukten.
Die HPV-Genprodukte können gemäß der vorliegenden Erfindung gleichzeitig mit der Anwesenheit oder Abwesenheit der p16^INK4a-Überexpression nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang soll „gleichzeitig" im Sinne der vorliegenden Erfindung entweder wörtlich im gleichen Augenblick oder während des gleichen Testverfahrens bedeuten, wobei die einzelnen Schritte des Nachweises vorübergehend konsekutiv sind.
Eine Probe gemäß der vorliegenden Erfindung kann beliebige Probe umfassen, die Zellen des Anogenitaltrakts enthält. Proben können z. B. Sekrete, Ausstriche, Körperflüssigkeiten und Zellproben umfassen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Proben Zellen der Zervix uteri. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Probe zervikaler Zellen gemäß einem klassischen Pap-Abstrich präpariert werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Probe als eine Monoschicht- oder Dünnschichtpräparation einer zytologischen Probe hergestellt werden.
Die Präparation einer Probe kann zum Beispiel die Gewinnung einer Gewebeprobe, einer Körperflüssigkeitsprobe oder einer Zellprobe eines Patienten umfassen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Präparation der Probe auch verschiedene Schritte weiterer Probenpräparationen umfassen, wie z. B. die Präparation von Dissektionen, von Zellsuspensionen, das Auftragen oder Applizieren der zu untersuchenden Zellen auf mikroskopischen Objektträgern, die Präparation von Gewebearrays, die Isolation von Polypeptiden oder Nukleinsäuren, die Präparation von festphasenfixierten Peptiden oder Nukleinsäuren, die Präparation von Beads, Membranen oder Objektträgern, an welche die zu bestimmenden Moleküle kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt sind.
Die neoplastischen Läsionen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen beliebige anogenitale Läsionen, welche durch die Überexpression von p16^INK4a charakterisiert sind und welche des Weiteren eine Expression von HPV-Genprodukten aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die anogenitale Läsion eine Läsion der Zervix uteri.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit zur Durchführung der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Kit kann zum Beispiel ein diagnostisches Kit oder ein Forschungskit sein.
Ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst zumindest ein Agens, das sich für den Nachweis der HPV-Genprodukte eignet sowie ein Agens, welches sich für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der Überexpression von p16^INK4a eignet.
Somit umfasst ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung:

a) Reagenzien für den Nachweis des HPV-Genprodukts
b) Reagenzien für den Nachweis der p16^INK4a-Überexpression
c) Reagenzien und Puffer die allgemein für die Durchführung einer Nachweisreaktion eingesetzt werden, wie Puffer, Detektionsmarker, Trägersubstanzen und andere
d) eine p16^INK4a-Probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion
e) eine Probe des HPV-Genprodukts zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion

Die Reagenzien zum Nachweis der HPV-Genprodukte und/oder p16^INK4a können jedes Agens enthalten, welches das HPV-Genprodukt und/oder das p16^INK4a-Molekül binden kann. Solche Reagenzien können Proteine, Polypeptide, Nukleinsäuren, Peptidnukleinsäuren, Glykoproteine, Proteoglykane, Polysaccharide oder Lipide enthalten.
Das HPV-Genprodukt und/oder die p16^INK4a-Probe zur Durchführung einer positiven Kontrolle können beispielsweise Nukleinsäuren in geeigneter Form, wie in Lösung oder Salz, Peptide in geeigneter Form, Gewebesektionsproben oder positive Zellen beinhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis der HPV-Genprodukte und/oder p16^INK4a auf der Ebene von Polypeptiden durchgeführt. In dieser Ausführungsform können die Bindungsagenzien zum Beispiel Antikörper sein, die spezifisch für die HPV-Genprodukte oder p16^INK4a oder deren Fragmente sind.
In einer weiteren Ausführungsform des Testkits wird der Nachweis der HPV-Genprodukte und/oder p16^INK4a auf der Ebene von Nukleinsäuren durchgeführt. In dieser Ausführungsform der Erfindung kann das Reagenz zum Nachweis zum Beispiel eine Nukleinsäurensonde sein oder ein Primer, der revers-komplementär zu dem besagten HPV-Genprodukt und/oder p16^INK4a-Nukleinsäuren ist.
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Unterscheidung von neoplastischen und präneoplastischen anogenitalen Läsionen, die durch die Beurteilung der Überexpression von p16^INK4a identifizierbar sind, von metaplastischen Zellen, welche im Verlauf von zytologischen Testverfahren p16^INK4a nachweisbar exprimieren. Das Verfahren basiert auf dem Nachweis von exprimierten Hochrisiko-HPV-Genprodukten. Es hat sich herausgestellt, dass Hochrisiko-HPV-Genprodukte, die in hoher Konzentration in den frühen Stadien von Neoplasien und Präneoplasien für diese Unterscheidung geeignet sind. Dies ist darauf zurück zu führen, dass der Anteil an p16^INK4a überexprimierenden Zellen in biologischen Proben aus frühen Stadien von Neoplasien einen Gehalt an p16^INK4a liefert, der möglicherweise auch von metaplatischen Zellen herrühren könnte.
Deshalb war das zu lösende Problem ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen neoplastischen und metaplastischen Zellen zu liefern, besonders in frühen Stadien von Neoplasien, wenn zytologische diagnostische Verfahren basierend auf der p16^INK4a Überexpression weitere Informationen zur Identifizierung von metaplastischen Zellen benötigen.
Weiterhin liefert das vorliegende Verfahren ein Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 Metaplastische Zellen immunchemisch gefärbt mit einen p16^INK4a-spezifischen Antikörper; für Details des Versuchs siehe Beispiel 1; die Zellen reagieren eindeutig mit den gegen p16^INK4a gerichteten Antikörpern
2 Metaplastische Zellen immunchemisch gefärbt mit einem HPV E7 spezifischen Antikörper; für Details des Versuchs siehe Beispiel 1; die Zellen zeigen keine Immunreaktivität mit den monoklonalen Antikörpern, die gegen das HPV E7 Protein gerichtet sind
3 Dysplastische Zellen immunchemisch gefärbt mit einem p16^INK4a-spezifischen Antikörper; für Details des Versuchs siehe Beispiel 1; die Zellen reagieren eindeutig mit den gegen p16^INK4a gerichteten Antikörpern
4 Dysplastische Zellen immunchemisch gefärbt mit einem HPV E7 spezifischen Antikörper, für Details des Versuchs siehe Beispiel 1, die Zellen reagieren eindeutig mit den gegen das HPV E7 Protein gerichteten Antikörpern.
5 Dysplastische Zellen immunchemisch doppelgefärbt mit HPV E7 spezifischen Antikörpern, für Details des Versuchs siehe Beispiel 1; die Zellen reagieren eindeutig mit den Antikörpern, die sowohl gegen HPV E7 als auch gegen p16^INK4a Proteine gerichtet sind.
Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich der Veranschaulichung und sollen nicht den Umfang der hier offenbarten Erfindung einschränken.
Beispiel 1: Immunzytochemischer Nachweis der HPV E7 und p16^INK4a Expression in Proben der Zervix uteri
ThinPrep^® Dünnschichtpräparate zervikaler Ausstriche wurden immunzytochemisch mit p16^INK4a-spezifischen Antikörpern und mit HPV E7-spezifischen monoklonalen Antikörpern gefärbt.
Zur Rehydrierung wurden die auf Objektträgern Spray-fixierten Ausstriche auf einem Schüttler in frischen 50% EtOH inkubiert. Der PEG Film, der durch die Fixierung produziert wurde, wurde durch intensives Spülen entfernt. Anschließend wurden die Ausstriche in Aquabidest gespült. Die Antigenrückgewinnung wurde mit 10 mM Zitratpuffer (pH 6.0) durchgeführt. Dafür wurden die Objektträger in einem Wasserbad 40 Minuten bei 95°C–98°C erhitzt. Die Objektträger wurden dann 20 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt, in Waschpuffer gewaschen (Dakocytomation, S3006) und zum Schluss wurden die Proben mit einem Fettstift umkreist.
Zur Inaktivierung der endogenen Peroxidase wurden die Proben bei Raumtemperatur 5 Minuten mit 3% H₂O₂ inkubiert (Dakocytomation; S2O23) und anschließend 5 Minuten in Waschpuffer gewaschen (Dakocytomation, S3006). Danach wurden die Proben mit einem p16^INK4a-spezifischen Primärantikörper oder gegen das Hochrisiko-(HPV16)-E7-Protein gerichtete monoklonale Antikörper inkubiert. Die Proben wurden dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, 5 Minuten mit Waschpuffer gewaschen und anschließend mit dem EnVision-System (Dakocytomation, K4001) bestehend aus an ein Dextran-Polymer und Peroxidase-Enzym konjungierende Ziege-anti-Maus-Antikörpern 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und noch mal 5 Minuten in Waschpuffer gewaschen (3 Mal).
Der Signalnachweis wurde mit dem Substrat-Chromogen-Complex (DAB+, Dakocytomation, K3468) durch 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt. Dann wurde die Reaktion in destilliertem Wasser gestoppt. Zum Schluss wurde eine Gegenfärbung mit Mayers Hematoxylin durchgeführt und die Objektträger wurden mit Faramount (DakoCytomation, S3025) eingedeckt.
Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger zeigte, dass Zellen, die immunoreaktiv mit dem p16^INK4a-Antikörper und dem HPV-E7-Proteinanktikörper sind, nur in Proben gefunden werden konnten, die mikroskopisch als Proben neoplastischer Läsionen identifiziert wurden. Zellen, die durch die p16^INK4a spezifische Reaktion gefärbt wurden und von Metaplasien stammen, wurden nicht durch die für das HPV-E7-Protein spezifische Reaktion gefärbt.
Zur Validierung der Ergebnisse wurde eine Doppelfärbung der zytologischen Proben mit einem FITC-markierten HPV-E7-Antikörper (Antikörper wie oben beschrieben) in Kombination mit dem wie oben verwendeten p16^INK4a-Antikörper durchgeführt. Die Färbung wurde wie oben beschrieben durchgeführt und an ein Doppelfärbungsverfahren angepasst. Die benötigten Variationen sind dem Fachmann bekannt.
In doppelt gefärbten Proben wurden keine doppelt gefärbten metaplastischen Zellen gefunden. Im Gegensatz hierzu wiesen dysplastische Zellen eine p16^INK4a- und HPV-E7-Doppelfärbung auf.
Die Ergebnisse zeigen, dass es die Färbung mit HPV-E7-spezifischen Reagenzien ermöglicht p16^INK4a überexprimierende Metaplasien von Dysplasien zu unterscheiden.

Claims

Verfahren zur Unterscheidung von p16^INK4a überexprimierenden Metaplasien von p16^INK4a überexprimierenden neoplastischen oder präneoplastischen Läsionen in biologischen Proben im Verlauf von zytologischen Testverfahren umfassend: a. Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zellen in besagter biologischer Probe, die p16^INK4a überexprimieren; b. Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zellen in besagter biologischer Probe, die ein Hochrisiko-HPV-E7-Genprodukt exprimieren; c. Bestimmung der gleichzeitigen Anwesenheit von Zellen, die Hochrisiko-HPV-E7-Genprodukte exprimieren und Zellen, die p16^INK4a überexprimieren oder der Anwesenheit von Zellen, die allein p16^INK4a überexprimieren; d. wobei die gleichzeitige Anwesenheit von Zellen, die Hochrsiko-HPV-E7-Genprodukte exprimieren und Zellen, die p16^INK4a überexprimieren ein Anzeichen für neoplastische oder präneoplastische Läsionen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das HPV-E7-Genprodukt ein Polypeptid oder ein RNA-Molekül ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei die neoplastischen oder präneoplastischen Läsionen Läsionen des Anogenitaltrakts sind.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Läsion des Anogenitaltrakts eine Läsion der Zervix uteri ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei die biologische Probe eine Probe ist, die Zellen aus dem Anogenitaltrakt enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Zellen Zellen aus der Zervix uteri sind.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die biologische Probe ein Pap-Ausstrich oder ein zytologisches Präparat aus der Zervix uteri ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei der Nachweis des HPV-E7-Genprodukts und der p16^INK4a Moleküle mit mindestens einer Sonde durchgeführt wird, die für das nachzuweisende Molekül spezifisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Sonde eine nachweisbare Markierung trägt.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Markierung ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Radioisotope, biolumineszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, fluoreszierende Verbindungen, Metall-Chelate, oder Enzyme.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Sonde ein Protein und/oder eine Nukleinsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei mindestens eine Sonde ein Antikörper ist, der gegen ein Hochrisiko-HPV-E7 kodiertes Genprodukt oder p16^INK4a gerichtet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, welches ein immunzytochemisches Färbeverfahren umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei mindestens eine Sonde eine Nukleinsäure ist, welche spezifisch an ein Hochrisiko-HPV-Genprodukt hybridisiert.
Verfahren gemäß Anspruch 14, welches eine In-Situ-Hybridisierungsreaktion umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 14, welches eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Nukleinsäureamplifikationsreaktion eine PCR oder LCR ist.
Verfahren gemäß eines beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei Nachweisreaktionen unter Verwendung von Nukleinsäuresonden und Polypeptidsonden gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren gemäß eines beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei die Hochrisiko-HPV-Genprodukte Genprodukte der Krebs-assoziierten HPV-Untergruppen HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 und 58 sind.
Verfahren gemäß eines beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei die Überexpression von p16^INK4a gleichzeitig mit der Expression von mindestens einem Hochrisiko-HPV-E7-Genprodukt in mindestens einer einzigen Zelle bestimmt wird.
Kit, welches ein diagnostisches Kit oder ein Forschungskit ist, zur Ausführung des Verfahrens gemäß eines beliebigen der vorgehenden Ansprüche bestehend aus: a. Sonden für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der Überexpression von p16^INK4a in biologischen Proben b. eine oder mehrere Sonden für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der Expression von einem oder mehreren HPV-E7-Genprodukten in biologischen Proben c. Reagenzien und Puffer zur Durchführung der Nachweisreaktion.
Kit gemäß Anspruch 21 des weiteren umfassend a. p16^INK4a Probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion b. eine oder mehrere Proben des HPV-E7-Genprodukts zur Durchführung positiver Kontrollreaktionen.