JP4290118B2 - 異形成と新生物病巣または前新生物病巣を区別するための方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞学的な試験手順の過程において、生物学的サンプルにおけるハイリスクのＨＰＶをコードする遺伝子産物（例えば、ＨＰＶ Ｅ２分子またはＥ７分子）のレベルを決定することにより、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する異形成と、新形成性または前形成性のｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する病巣を区別する方法に関連する。従って、この方法は、細胞学的試験手順における肛門性器の病巣の、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}をベースにした検出における偽陽性の結果の軽減を可能にする。

生物学的サンプルにおけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現の検出は、肛門性器の病巣（例えば、子宮頚部の癌）の検出において有用なマーカーとして立証されている（ＷＯ ００／０１８４５；Ｋｌａｅｓら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：９２，２７６〜２８４（２００１）を参照のこと）。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な免疫化学染色に基づいた方法は、組織標本おおよび細胞学的サンプルにおける形成異常細胞の感度が高くそして特異的な同定を可能にする。

組織の免疫組織化学的な実験において、新生物細胞は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}特異的抗体により媒介される染色手順を使用して染色され得る。従って、新生物病巣の組織学的診断は、肛門性器病巣中の細胞の形質転換に特徴的な分子マーカーに基づいた染色によって支持され得る。これらの手順における、細胞が新形成であるか否かの診断は、単にｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な染色に基づくのではなく、組織学的な情報にも依存する。

これは、サンプルの約３０％において、異形成細胞が、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な抗体とのいくらかの免疫反応性を示し、従って、手順の過程で染色されるという事実に起因する。さらに、これらの異形成細胞から生じる染色パターンは、新生物病巣から与えられる染色パターンとは異なる。異形成細胞は、斑点状または焦点上の染色パターンを生じる一方で、新形成の病巣は、広汎性の染色パターンを生じる。さらに、異形成細胞の染色強度は、主に新形成細胞の染色強度より低い。

新形成の初期検出のためのスクリーニング試験において使用される通常の方法は、試験に基づいた組織学を利用せず、むしろ細胞学的な試験手順に依存する。この場合においてさらに詳細には、例えば細胞学的な実験の際に組織の構築に関する利用可能な組織学的な情報が存在しない場合、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の単独の過剰発現についての試験は、偽陽性の結果を導き得る。これは、検出可能な程度に評価されるレベルでｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を発現する異形成細胞が、組織学的な染色パターンによって分化され得ないという事実に起因する。

ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現を示す細胞のパーセンテージは、異形成の発生の過程で増加する。そのため、新生物段階または前新生物段階において、新生物細胞または前新生物細胞の限定された集団のみがサンプル中に存在する場合、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の免疫反応は、弱くあり得る。この弱い免疫反応は、およそ異形成細胞によって引き起こされるレベルくらいのレベルであり得る。異形成の後期段階において、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の全体的な免疫反応はより強く、その結果、新生物病巣は、細胞学的試験様式においてでさえ異形成とは容易に区別可能である。これは、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を発現する異形成の存在が、新生物細胞の存在と混同され得る場合を導き得、従って、偽陽性の結果を産生する。

特にスクリーニング試験（ここで、新生物形成の初期段階の検出が所望される）において、この状態は、全く不快である。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ベースの診断が、組織学的な実験において価値ある手段であることが立証され、そして細胞学ベースのスクリーニング手順における適用が、これらの確立された手順を拡張し得る場合、これは特に真実である。

細胞学的試験様式における偽陽性の結果を減らし、そしてさらにｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}媒介性の肛門性器の病巣の診断の忠実性を高めるために、異形成と新生物病巣および形成異常病巣を区別するための方法が望ましい。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現を示す細胞のパーセンテージがなお、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現している増殖性の異形成細胞を正常に発生しているレベルを混同され得るレベルである場合、当該分野における問題は、新形成生物の初期段階に特に関連する。従って、本問題を解決するための有用な手段は、パラメーターを含まなければならず、このパラメーターは、肛門性器道の新生物形成の初期段階を特徴付ける。腫瘍形成の進行の間に現れ、従って高い悪性度分類の異形成についての診断道具として立証し、そして腫瘍形成の初期段階に限定される異形成および／または新生物形成の任意の特徴は、本発明に従う方法に関して適切ではない。

異形成と新生物病巣および前新生物病巣とを区別する方法が、本発明に従って権利主張される実施形態の範囲で提供される。

ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}過剰発現に基づく試験手順において、異形成と新生物病巣との区別を支持するために、マーカー分子が望ましく、このマーカー分子は、新生物細胞および組織ならびに／または前形成細胞および組織中で発現され、このマーカー分子は、異形成細胞中では発現されない。

ＨＰＶのＥ２は、より低い悪性度分類のＣＩＮ病巣において特に発現され、そしてこの発現は、ＣＩＮ悪性度の上昇とともに減少する（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１，１８２５〜３２（２０００））。ほとんどの侵襲性の癌において、Ｅ２タンパク質の発現は、検出不可能である。これは、このＥ２遺伝子の一部分が、ＨＰＶ ＤＮＡが宿主細胞のゲノムへ統合される間に消失される事実に起因し得る。従って、統合されたＨＰＶ ＤＮＡを有する持続性のＨＰＶ感染中に、Ｅ２発現は検出され得ないか、または低いレベルで検出され得る。

これらの事実に起因して、Ｅ２タンパク質は、ハイリスクのＨＰＶ感染に関連する病巣の初期段階に関するマーカーであることを立証する。対照的に、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}は、肛門性器の病巣の初期段階でさえ過剰発現されるマーカーであり、この発現レベルは、形成異常病巣の進行の過程において増加する。Ｅ２が、新形成生物の初期段階で特に発現するという事実は、Ｅ２タンパク質を、初期の検出方法に関して特に有用とする。ＨＰＶ感染の初期段階におけるＥ２タンパク質の高発現レベルは、試験細胞中に存在するウイルスの多数のコピーが存在する前に、感染細胞の同定を可能にする。

Ｌ１遺伝子産物およびＬ２遺伝子産物はまた、統合が生じる以前のウイルス感染の初期段階において優勢な高発現レベルに起因して、本発明に従う方法に関して有用である。これらの遺伝子産物の発現はまた、ＨＰＶの持続感染中に減少する。

ここで、本発明者は、例えばＨＰＶ Ｅ２のようなハイリスクのＨＰＶ遺伝子産物を発現する細胞は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}特異的免疫化学染色により検出可能な初期の新生物病巣または形成異常病巣と、異形成を区別するために働き得、この細胞はまた、細胞学的な試験手順の過程におけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}と免疫反応する細胞を含み得る。

ＨＰＶによってコードされる他の遺伝子産物（新形成段階または前新形成段階において、ｍＲＮＡまたはポリペプチドと同じくらいに発現レベルに関して検出可能である）を発現する細胞はまた、本発明に従い、新生物病巣および／または前新生物病巣と、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する異形成との区別のために働き得る。このようなＨＰＶによってコードされる遺伝子産物の例としては、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質もしくはｍＲＮＡ、Ｅ７タンパク質もしくはｍＲＮＡ、Ｌ１タンパク質もしくはｍＲＮＡまたはＬ２タンパク質もしくはｍＲＮＡが挙げられる。

本発明は、前記生物学的サンプル中のハイリスクＨＰＶ遺伝子産物を発現している細胞の存在または非存在の検出に基づく細胞学的な試験手順での、生物学的サンプルにおける新生物病巣、前新生物病巣および／または形成異常病巣と、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}過剰発現細胞を含む異形成を区別する方法に関連する。本明細書中で記載される方法に有用なＨＰＶ遺伝子産物は、新生物病巣および前新生物病巣の初期段階で、特に高度に発現する遺伝子産物である。本発明の１つの実施形態において、ＨＰＶ Ｅ２タンパク質またはｍＲＮＡは、サンプル中の異形成と初期の新生物病巣または前新生物病巣との区別のためのマーカーとして働き得る。さらに、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質および／またはｍＲＮＡ、Ｅ７タンパク質および／またはｍＲＮＡ、Ｌ１タンパク質および／またはｍＲＮＡあるいはＬ２タンパク質および／またはｍＲＮＡもまた、本明細書中で記載される本発明に従う区別を実行するために適切であることを立証した。

本発明との関連で使用される場合、区別は、サンプルが１つまたは他の方法で分類されるべきであるか否かの判定を含む。本発明の好ましい実施形態において、区別は、組織またはその成分が、新生物であるかまたは異形成であるかの評価に関する。従って、本明細書中で使用される場合、この区別は、サンプル中の細胞の増殖特性に関する判断である。

本発明に従う区別は、ハイリスクＨＰＶの遺伝子産物を発現する細胞の存在または非存在に基づき、そして該サンプル中の、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞の存在または非存在に基づく。ハイリスクのＨＰＶ遺伝子産物（例えば、Ｅ２）を発現する細胞は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞と同じ細胞である必要はないが、両方のマーカー分子の発現は、同じ細胞中で生じ得る。

従って、本発明に従い、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞（両方のマーカーを同時発現している他の細胞または同じ細胞）が同時に存在するサンプル中のＥ２遺伝子産物を発現する細胞の存在は、新生物病巣または前新生物病巣と異形成を区別ために働く。

本発明との関連で使用される場合、ＨＰＶによってコードされる遺伝子産物は、ＨＰＶゲノムの遺伝子から転写される任意のｍＲＮＡまたはこのようなｍＲＮＡから翻訳された任意のポリペプチドである。本発明に従う方法に適切なＨＰＶ遺伝子産物は、Ｅ６遺伝子、Ｅ７遺伝子、Ｌ１遺伝子およびＬ２遺伝子によってコードされる遺伝子産物である。本発明の１つの特に好ましい実施形態において、ＨＰＶ遺伝子産物は、ＨＰＶ Ｅ２遺伝子によってコードされる。

本明細書中のＨＰＶは、ヒトパピローマウイルスを意味する。本明細書中で使用される場合、ＨＰＶは、任意のＨＰＶのハイリスクなサブタイプを含む。本発明の好ましい実施形態において、ＨＰＶサブタイプは、癌に関連するＨＰＶサブタイプ（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６およびＨＰＶ５８）である。特に好ましい実施形態において、ＨＰＶのハイリスクなサブタイプは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３９またはＨＰＶ４５である。ＨＶＰのサブタイプ決定は、生物学的サンプル中に存在する特定のＨＰＶサブタイプの決定に適切な任意の方法を含む。

本発明に従う、ＨＰＶによってコードされる遺伝子産物のレベルの検出方法は、任意の方法であり、この方法は、生物学的サンプルの特異的な生物学的分子のごく少量を検出するために好都合である。本発明に従う検出反応は、核酸のレベルまたはポリペプチドのレベルのいずれかに関する検出である。

このＨＰＶ遺伝子産物は、これらの分子を特に認識する試薬を使用して検出され得る。ＨＰＶ遺伝子産物についての遺伝子反応は、最初のマーカー分子を認識するか、または他の分子を認識するために使用される重要な分子を認識する薬剤を検出する工程を伴う１つ以上の反応を含み得る。

検出反応は、ＨＰＶ遺伝子産物の存在または非存在および／あるいはＨＰＶ遺伝子産物のレベルを示すレポーター反応を含み得る。このレポーター反応は、例えば、彩色された化合物を産生する反応、生体発光反応、蛍光反応、一般的には放射線放射反応などを含み得る。

好ましい実施形態において、異なるマーカー分子は、薬剤によって認識され得、この薬剤は、異なるレポーターシグナルを産生し、それ故、マーカー分子を言及するこのシグナルは、区別され得た。本発明の１つの好ましい実施形態において、ハイリスクのＨＰＶ遺伝子産物の発現の検出は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現の検出と同時に実行される。この場合、このレポーター反応は、例えば、検出された異なる分子のために異なる蛍光標識を利用し得る。

本発明に従う検出反応に適用可能な様式は、ブロット技術（例えば、ウェスタンブロット、サザンブロット、ノーザンブロット）であり得る。このブロット技術は、当業者に公知であり、そして例えば、電気ブロット、半乾燥式ブロット、減圧ブロットまたはドットブロットとして実行され得る。増幅反応はまた、例えば、核酸分子の検出に適用可能である。

本発明の１つの好ましい実施形態において、ＨＰＶ遺伝子産物のレベルの検出は、サンプル中に存在するそれぞれのｍＲＮＡまたはそれらのフラグメントの検出によって実行される。核酸分子の検出方法は、当業者に公知である。核酸検出の手順は、例えば、検出されるべき分子と、相補的な核酸プローブ、この核酸に対する結合特異性を有するタンパク質、またはこの核酸を特異的に認識し、そして結合する任意の他の実体との結合反応によって実行され得る。

本方法は、例えば、染色反応を検出する過程で、直接インサイチュと同様にインビトロで実行され得る。本発明に従う方法において実行されたサンプル中のＨＰＶ ｍＲＮＡを検出する別の方法は、核酸の増幅反応であり、この増幅反応は、定量的な方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）で実行され得る。本発明の好ましい実施形態において、リアルタイムＲＴ ＰＣＲが、腫瘍サンプル中のＨＰＶ ｍＲＮＡのレベルを定量するために使用され得る。

本発明の別の好ましい実施形態において、ＨＰＶ遺伝子産物のレベルの検出は、タンパク質発現のレベルを測定することによって実行される。タンパク質のレベルに関するＨＰＶ遺伝子産物の測定は、例えば、特定のＨＰＶポリペプチドの検出に特異的な結合剤を含む反応で実行され得る。

この結合剤は、多くの異なる検出技術（例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降）で使用され得る。一般的に、ポリペプチド結合剤ベースの検出は、例えば、免疫組織化学染色反応の過程で、直接インサイチュと同様にインビトロで実行され得る。生物学的サンプル中の特定のポリペプチドの量を測定する任意の他の方法は、本発明に従って使用され得る。

本発明の状況において使用される場合、ＨＰＶポリペプチドまたはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}ポリペプチドのいずれかのレベルを検出するために使用される結合剤は、抗体および抗原結合フラグメント、二重特異性ハイブリッド抗体、最小の抗原結合エピトープを含むペプチド模倣体などを含み得る。

抗体または抗原結合剤は、これが本明細書中で開示されるタンパク質と検出可能レベルで反応する場合、このタンパク質と特異的に反応すると言われ、そして他のタンパク質とは有意に反応しない。本発明に従う抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。本明細書中で使用される場合、用語抗体またはモノクローナル抗体は、インタクトな分子および抗体フラグメントを含むことが意味される。さらに、本発明の抗体は、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体を含む。

本発明に従って、結合剤は、単一で、または組み合わせて使用され得る。組み合わせによって、より高い程度の感度を達成することが可能である。用語抗体は、好ましくは、本質的に異なるエピトープ特異性を有する、プールされたモノクローナル抗体および異なるモノクローナル調製物からなる抗体に関連する。

モノクローナル抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術を使用して、本発明のポリペプチドのフラグメントを含む抗原から作られる；例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。１つのこのような技術において、抗原性ポリペプチドまたはその合成部分を含む免疫原は、初めに、あらゆる幅広い哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ）に注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変されることなく免疫原として働き得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドに関して、本ポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合する場合、優位な免疫応答が誘発される。この免疫原は、好ましくは、前もって決定されたスケジュール（１つ以上の追加免疫を組み込む）に従って動物宿主に注射され、そしてこの動物は、周期的に採血される。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固相支持体に結合体化したポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。

本発明に従う、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現の存在または非存在の検出のために使用される方法は、ＨＰＶ遺伝子産物の検出に関する上記と同じ方法である。

ＨＰＶ遺伝子産物は、本発明に従って、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現の存在または非存在と同時に検出され得る。この状況において、本発明に従う同時は、全く同時の試験手順または同じ試験手順の範囲内を意味し、これによって、単一の検出工程が、一時的に連続する。

本発明の方法に従うサンプルは、肛門性器起源の細胞を含む任意のサンプルを含み得る。サンプルとしては、例えば、分泌サンプル、スメアサンプル、体液サンプル、および細胞サンプルが挙げられ得る。

本発明の１つの実施形態において、サンプルは、子宮頚部の癌を含む。本発明の好ましい実施形態において、子宮頚部細胞のサンプルは、古典的なパパニコラウスミアに従って調製され得る。本発明のさらに好ましい実施形態において、サンプルは、細胞学的試料の単層調製物または薄層調製物として調製され得る。

サンプルの調製は、例えば、患者からの組織サンプル、体液サンプル、細胞サンプルを得ることを含み得る。本発明に従って、サンプルの調製はまた、サンプルのさらなる調製のいくつかの工程（例えば、切開し、マイクロスライド上に試験されるべき細胞を塗布するかまたは適用するための調製、組織アレイの調製、ポリペプチドまたは核酸の単離、ペプチドまたは核酸を固定した固相の調製あるいは測定されるべき分子が、共有結合するかまたは非共有結合するビーズ、膜またはスライドの調製）を含み得る。

本発明に従う方法が適用され得る新生物病巣は、任意の肛門性器の病巣を含み、この肛門性器は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現によって特徴付けられ、さらにＨＰＶ遺伝子産物の発現を示す。本発明の１つの好ましい実施形態において、この肛門性器病巣は、子宮頚部の病巣である。

本発明の別の局面は、本発明に従う方法を実行する試験キットである。このキットは、例えば、診断キットまたは研究キットであり得る。

本発明に従うキットは、ＨＰＶ遺伝子産物の検出に適切な少なくとも１つの薬剤およびｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現の存在または非存在の検出に適切な薬剤を含む。

従って、本発明に従うキットは、以下を含み得る：
ａ）ＨＰＶ遺伝子産物の検出のための試薬
ｂ）ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}過剰発現の検出のための試薬
ｃ）検出反応を成し遂げるために通常使用される試薬および緩衝液（例えば、緩衝液、検出マーカー、キャリア物質など）
ｄ）ポジティブコントロール反応を成し遂げるためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}サンプル
ｅ）ポジティブコントロール反応を成し遂げるためのＨＰＶ遺伝子産物
ＨＰＶ遺伝子産物および／またはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の検出のための試薬は、ＨＰＶ遺伝子産物および／またはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}分子に結合し得る任意の薬剤を含み得る。このような試薬としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、ペプチド核酸、糖タンパク質、プロテオグリカン、多糖類または脂質が挙げられる。

ポジティブコントロールを成し遂げるためのＨＰＶ遺伝子産物および／またはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}サンプルとしては、例えば、適用可能な形態（例えば、溶液または塩）の核酸、適用可能な形態のペプチド、組織切片サンプルまたはポジティブ細胞が挙げられる。

本発明の好ましい実施形態において、ＨＰＶ遺伝子産物および／または^{ｐ１６ＩＮＫ４ａ}の検出は、ポリペプチドのレベルについて実行される。この実施形態において、この結合剤は、例えば、ＨＰＶ遺伝子産物もしくはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}もしくはそれらのフラグメントに特異的な抗体であり得る。

試験キットの他の実施形態において、ＨＰＶ遺伝子産物および／またはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の検出は、核酸レベルについて検出される。本発明のこの実施形態において、検出のための試薬は、例えば、核酸プローブあるいは該ＨＰＶ遺伝子産物および／またはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}核酸に対して逆向きに相補的なプライマーであり得る。

本発明は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現の評価により同定可能な新生物または前新生物の肛門性器病巣と、異形成細胞を区別する方法を提供し、この異形成細胞は、細胞学的試験手順の過程でｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を検出可能に発現する。この方法は、ハイリスクＨＰＶが発現した遺伝子産物の検出に基づく。新生物形成の初期段階および前新生物形成において、ハイレベルで発現したハイリスクＨＰＶ遺伝子産物が、この区別に適切であることが立証される。これは、新形成の初期段階において、生物学的サンプル中のｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞のパーセンテージは、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}分子のレベルを反映するという事実に起因し、このレベルは、新生物細胞よりも異形成細胞に起こる可能性が残っている。従って、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現に基づく細胞学的診断方法が、異形成細胞の同定のためにさらなる情報を必要とする場合、解決されるべき問題は、特に新生物形成の初期段階において、新生物細胞と異形成細胞との間を区別する方法を提供することであった。

さらに本発明は、本発明に従う方法を実行するためのキットを提供する。

以下の実施例が、例示の目的のためにのみ与えられ、そして本明細書中で記載される本発明の範囲を限定しないことが意図される。

（実施例１：子宮頚部サンプル中のＨＰＶ Ｅ２、Ｌ１およびｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の発現の免疫化学的検出）
子宮頚部のスミアを、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な抗体およびＨＰＶ Ｅ２タンパク質に特異的なポリクローナル抗体を使用して、免疫細胞学的に染色した。

再水和のために、スプレー固定したスミアを、振動デバイス上にある新鮮な５０％ＥｔＯＨ中でインキュベートする。この固定手順により産生したＰＥＧフィルムを、激しい洗浄により除去する。次に、このスミアを水ビデ（ａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔ）ですすぐ。抗原回復を、１０ｍＭのクエン酸塩緩衝剤（ｐＨ６．０）で実行する。従って、このスライドを、水浴中で４０分間９５℃で暖め、２０分間室温に冷まし、洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に移し、そして最終的にリピッドペン（ｌｉｐｉｄ−ｐｅｎｃｉｌ）で囲む。

内在性のペルオキシダーゼの不活性化のために、このサンプルを、３％Ｈ_２Ｏ_２とともに２０分間ＲＴでインキュベートし、その後ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０中で５分間洗浄する。このタンパク質ブロックを、ウマ血清（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）−キット）（ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で１：５０に希釈する）で実行する。このスミアを２０分間ＲＴでインキュベートし、次いでピペットで注意深く洗浄する。次いで、アビジン−試薬の非特異結合のブロッキングを、以下のように実行する：サンプルを、アビジンブロッキング溶液（要時調整／Ｖｅｃｔｏｒ）とともに１５分間ＲＴでインキュベートし、次いでピペットで注意深く洗浄する。ビオチン−試薬の非特異的結合をブロックするために、このスミアを、ビオチンブロッキング溶液（要時調整／Ｖｅｃｔｏｒ）とともに１５分間ＲＴでインキュベートし、次いで、注意深く洗浄する。

次いで、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な一次抗体もしくはＨＰＶ Ｅ２タンパク質に対して惹起するポリクローナル抗体もしくはハイリスクな（ＨＰＶ１６）ＨＰＶ Ｌ１タンパク質に対して生じるポリクローナル抗体とともにインキュベーションすることが続く；このサンプルを、６０分間ＲＴでインキュベートし、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０中で５分間（２回）洗浄し、そしてその後、ビオチン化二次抗体（ウマ−抗−マウスＩｇＧ）（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）−キット／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０＋ウマ血清で１：２００に希釈する）とともに３０分間ＲＴでインキュベートし、そしてＰＢＳ／０・１％ Ｔｗｅｅｎ２０中で５分間（２回）洗浄する。次に、ＡＢ−Ｃｏｍｐｌｅｘ（アビジン−ビオチン−ＨＲＰ）（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ（登録商標）−キット／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０で１：５０に希釈する）とのインキュベートを、３０分間ＲＴで実行し、次いで、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０中で５分間（２回）洗浄する。

シグナル検出を、基質−色素原複合体（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ−Ｃｏｍｐｌｅｘ）（Ｈ_２Ｏ_２／ＡＥＣ）を用いて以下のように実行する：第一に、サンプルを３０分間ＲＴで基質−色素原複合体とともにインキュベートし、この反応を、水ビデで停止させる。最終的に、メイヤーヘマトキシリンでの対比染色を実行し、そしてこのスライドをグリセリンゼラチン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎｇｅｌａｔｉｎｅ）でマウントする。

このスライドの顕微鏡実験は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}と免疫反応する細胞とＨＰＶ Ｅ２タンパク質と免疫反応する細胞とが、サンプル中に見出され得るのみであることを示し、このサンプルを、新形成の病巣サンプルとして顕微鏡的に同定し得る。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な反応により染色した細胞（異形成に起源する）は、ＨＰＶ Ｅ２タンパク質に特異的な反応によっては染色されない。ＨＰＶ Ｌ１染色したスライドの顕微鏡検査は、異形成細胞は、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質に対して惹起された抗体と免疫反応性しないことを示す。形成異常細胞を含むサンプルは、対照的に、ＨＰＶ Ｌ１と免疫反応する細胞およびｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}と免疫反応する細胞を含む。それゆえ、異形成における形成異常と対照的に、この細胞を、ＨＰＶ Ｌ１特異抗体を使用して染色し得ない。

この結果は、ＨＰＶ Ｅ２またはＬ１に特異的な試薬での染色は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}過剰発現する異形成と、形成異常を区別することを可能にすることを示す。

（実施例２：子宮頚部のサンプル中のＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｌ１またはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞の、インサイチュハイブリダイゼーションによる検出）
子宮頚部のスミアを、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}およびＨＰＶ Ｅ２およびＬ２のｍＲＮＡレベルについて、インサイチュ染色反応で、半定量的に分析し得る。この染色反応を、以下のように実行する：
再水和のために、スプレー固定したスミアを、振動デバイス上にある新鮮な５０％ＥｔＯＨ中でインキュベートする。この固定手順により産生したＰＥＧフィルムを、激しい洗浄により除去する。次に、このスミアを水中ですすぐ。このスミアを、プロテイナーゼＫ（ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍｌ）とともに１０分間３７℃で培養する。次いで、このスライドを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）に移し、そして最終的に脂質ペンで囲む。

このハイブリダイゼーション混合物を、５０μｌの要時調整ハイブリダイゼーション緩衝液（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄａｎｍａｒｋ）と、約５〜１０ピコモルのプローブと混合することによって調製する。このプローブは、それぞれのｍＲＮＡに対して相補的な配列の、フルオレセイン標識したオリゴヌクレオチドである。

このハイブリダイゼーション混合物を９５℃で暖め、そしてその後、３７℃に平衡化する。煮沸手順後、このスミアを、それぞれ５０μｌのハイブリダイゼーション混合物とともに４時間４２℃でインキュベートする。このサンプルを、過剰容量の洗浄緩衝液中（２×ＳＳＣ中）２回、３７℃で１５分間洗浄し、そして１回、１×ＳＳＣで３７℃１５分間洗浄する。次いで、このスミアを、２回室温で２×ＳＳＣですすぐ。この洗浄手順後、この標本を、３０分間ブロッキング緩衝液（ＮＥＮ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇｐｕｇｇｅｒ）とともに室温でインキュベートする。次いで、１：１００に希釈した（ブロッキング緩衝液中で。上を参照のこと）抗フルオレセイン−アルカリホスファターゼ（ＤＡＫＯ Ａ／Ｓ）との１時間のインキュベーションに続く。次いで、このスミアを、２回、１×ＰＢＳ／０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で１０分間室温で洗浄し、１×ＰＢＳ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２（ｐＨ９．２）を用いた１０分間室温での１回の洗浄が続く。次いで、この染色反応を、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）を用いて３０分間〜２時間室温で実行する。この染色反応を、ＰＢＳ中の１ｍＭ ＥＤＴＡとの短時間のインキュベーションにより停止する。最終的に、このスミアを、Ｈ_２Ｏ_ｄｅｓｔ中に浸し、そしてＡｑｕａＴｅｘ（Ｍｅｒｃｋ）で包埋する。次いで、この染色標本を、顕微鏡的に分析し得る。

顕微鏡的分析は、異形成がｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}のｍＲＮＡを発現する細胞を含むが、ＨＰＶ Ｌ１のｍＲＮＡを発現する細胞もＥ２のｍＲＮＡを発現する細胞も含まないことを示す。子宮頚部の形成異常病巣中で、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞およびさらにＨＰＶ Ｌ１のｍＲＮＡおよびＨＰＶ Ｅ２のｍＲＮＡを発現する細胞が見出され得る。

この結果は、本発明に従う方法は、異形成および新生物病巣の区別のために使用され得ることを示す。

（実施例３：子宮頚部のサンプル中のＨＰＶ Ｅ７およびｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現の免疫細胞学的検出）
子宮頚部のスミアのＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）薄層を、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な抗体およびＨＰＶ Ｅ７タンパク質に特異的モノクローナル抗体を使用して、免疫細胞学的に染色する。

再水和のために、スプレー固定したスミアを、振動デバイス上にある新鮮な５０％ＥｔＯＨ中でインキュベートする。この固定手順により産生したＰＥＧフィルムを、激しい洗浄により除去する。次に、このスミアを水中ビデですすぐ。抗原回復を、１０ｍＭのクエン酸塩緩衝剤（ｐＨ６．０）で実行する。
従って、このスライドを、水浴中で４０分間９５〜９８℃で温め、２０分間室温に冷まし、洗浄緩衝液（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｓ３００６）に移し、そして最終的に脂質ペンで囲む。

内在性のペルオキシダーゼの不活性化のために、このサンプルを、３％Ｈ_２Ｏ_２（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｓ２０２３）とともに５分間ＲＴでインキュベートし、その後洗浄緩衝液（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｓ３００６）中で５分間洗浄する。次いで、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な一次抗体またはハイリスクな（ＨＰＶ１６）Ｅ７タンパク質に対して惹起されたモノクローナル抗体とのインキュベーションが続く；このサンプルを、３０分間ＲＴでインキュベーションし、洗浄緩衝液中で５分間洗浄し、そしてその後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ系（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｋ４００１）（デキストランポリマーおよびペルオキシダーゼ酵素に結合体化するヤギ抗マウス抗体からなる）とともに３０分間ＲＴでインキュベーションし、そして洗浄緩衝液中で５分間（３回）洗浄する。

シグナル検出を、１０分間ＲＴでのインキュベーションにより、基質−色素原複合体（ＤＡＢ＋、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｋ３４６８）で実行する。この反応を、水ビデ中で停止させる。最終的に、メイヤーヘマトキシリンでの対比染色を実行し、そしてこのスライドをＦａｒａｍｏｕｎｔ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｓ３０２５）でマウントする。

このスライドの顕微鏡実験は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}と免疫反応する細胞とＨＰＶ Ｅ７タンパク質と免疫反応する細胞とが、サンプル中に見出され得るのみであることを示し、このサンプルを、新形成の病巣サンプルとして顕微鏡的に同定し得る。ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な反応により染色した細胞（異形成に起源する）は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質に特異的な反応によっては染色されない。

本明細書中で与えられた結果を確認するために、細胞学的試料の二重染色を、上記で使用されるようなｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}抗体と組み合わせて、ＦＩＴＣ標識したＨＰＶ Ｅ７抗体（上記で所定したような抗体）を使用して実行した。この染色を、上記で所定したように、二重染色手順に適用して実行した。必要なバリエーションは、当業者に公知である。

二重染色した試料において、二重染色した異形成細胞を見出し得る；対照的に、形成異常細胞は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}およびＨＰＶ Ｅ７タンパク質についての二重染色を示す。

この結果は、ＨＰＶ Ｅ７に特異的な試薬は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する異形成と形成異常との区別を可能にすることを示す。

ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な抗体で免疫化学的に染色した異形成細胞；実験的な詳細に関しては、実施例１を参照のこと；この細胞は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に対する抗体と明らかに反応する。 ＨＰＶ Ｅ２に特異的な抗体で免疫化学的に染色した異形成細胞；実験的な詳細に関しては、実施例１を参照のこと；この細胞は、ＨＰＶ Ｅ２タンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗体との免疫反応性を示さない。 ＨＰＶ Ｌ１に特異的な抗体で免疫化学的に染色した異形成細胞；実験的な詳細に関しては、実施例１を参照のこと；この細胞は、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗体との免疫反応性を示さない。 ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な抗体で免疫化学的に染色した形成異常細胞；実験的な詳細に関しては、実施例１を参照のこと；この細胞は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に対する抗体と明らかに反応する。 ＨＰＶ Ｅ２に特異的な抗体で免疫化学的に染色した形成異常細胞；実験的な詳細に関しては、実施例１を参照のこと；この細胞は、ＨＰＶ Ｅ２タンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗体との明らかな免疫反応性を示す。 ＨＰＶ Ｌ１に特異的な抗体で免疫化学的に染色した形成異常細胞；実験的な詳細に関しては、実施例１を参照のこと；この細胞は、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質に対して惹起されたポリクローナル抗体との明らかな免疫反応性を示す。 ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な抗体で免疫化学的に染色した異形成細胞；実験的な詳細に関しては、実施例３を参照のこと；この細胞は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に対する抗体と明らかに反応する。 ＨＰＶ Ｅ７に特異的な抗体で免疫化学的に染色した異形成細胞；実験的な詳細に関しては、実施例３を参照のこと；この細胞は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質に対して惹起されたモノクローナル抗体との免疫反応性を示さない。 ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な抗体で免疫化学的に染色した形成異常細胞；実験的な詳細に関しては、実施例３を参照のこと；この細胞は、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に対する抗体と明らかに反応する。 ＨＰＶ Ｅ７に特異的な抗体で免疫化学的に染色した形成異常細胞；実験的な詳細に関しては、実施例３を参照のこと；この細胞は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質に対する抗体と明らかに反応する。 ＨＰＶ Ｅ７に特異的な抗体およびｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に特異的な抗体で免疫化学的に二重染色した形成異常細胞；実験的な詳細に関しては、実施例３を参照のこと；この細胞は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質およびｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}タンパク質の両方に対する抗体と明らかに反応する。

Claims (23)

1. 細胞学的試験手順の過程で、生物学的サンプルにおけるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する異形成とｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する新生物病巣または前新生物病巣を区別する方法であって、以下、
   ａ．該生物学的サンプルにおける、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現細胞の存在または非存在を決定する工程；
   ｂ．該生物学的サンプルにおける、少なくとも１つのハイリスクなＨＰＶ遺伝子産物を発現する細胞の存在または非存在を決定する工程；
   ｃ．ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞とハイリスクのＨＰＶ遺伝子産物を発現する細胞が同時に存在すること、またはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞が単独で存在することを評価する工程；
   ｄ．ここで、該ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}を過剰発現する細胞とハイリスクのＨＰＶ遺伝子産物を発現する細胞の同時の存在が、新生物病巣または前新生物病巣を示し、少なくとも１つのＨＰＶ遺伝子産物が、ＨＰＶ Ｅ７遺伝子によってコードされるものである、工程
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ハイリスクのＨＰＶ遺伝子産物が、初期の新生物／前新生物病巣において優位に発現される、方法。
3. 請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ＨＰＶ遺伝子産物が、ポリペプチドまたはＲＮＡ分子である、方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記新生物病巣または前新生物病巣が、肛門性器道の病巣である、方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、ここで、前記肛門性器道の病巣が、子宮頚部の病巣である、方法。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、ここで、前記生物学的サンプルが、肛門性器由来の細胞を含むサンプルである、方法。
7. 請求項６に記載の方法であって、ここで、前記細胞が、子宮頚部に由来する細胞である、方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、ここで、前記生物学的サンプルが、パパニコラウスミアまたは前記子宮頚部の細胞学的調製物である、方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ＨＰＶ遺伝子産物およびｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}分子の検出は、検出される分子に特異的な少なくとも１つのプローブを使用して実行される、方法。
10. 請求項９に記載の方法であって、ここで、前記プローブが、検出可能に標識される、方法。
11. 請求項１０に記載の方法であって、ここで、前記標識が、ラジオアイソトープ、生体発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、または酵素からなる群から選択される、方法。
12. 請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記プローブが、タンパク質および／または核酸である、方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つのプローブが、ハイリスクのＨＰＶコード遺伝子産物またはｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}に対して励惹される抗体である、方法。
14. 免疫細胞化学的な染色手順を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 請求項１２に記載の方法であって、ここで、少なくとも１つのプローブが、ハイリスクのＨＰＶ遺伝子産物と特異的にハイブリダイズする核酸である、方法。
16. インサイチュハイブリダイゼーション反応を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 核酸増幅反応を含む、請求項１５に記載の方法。
18. 請求項１７に記載の方法であって、ここで、前記核酸増幅反応が、ＰＣＲまたはＬＣＲである、方法。
19. 請求項１〜１８のいずれかに記載の方法であって、ここで、核酸プローブおよびポリペプチドプローブを使用する検出反応が、同時に実行される、方法。
20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記ハイリスクのＨＰＶ遺伝子産物が、癌関連ＨＰＶサブタイプのＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６および５８の遺伝子産物である、方法。
21. 請求項１〜２０のいずれかに記載の方法であって、ここで、少なくとも１つの単細胞において、少なくとも１つのハイリスクＨＰＶ遺伝子産物の発現と同時であるｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現が測定される、方法。
22. 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法を実行するためのキットであって、該キットは、診断キットまたは研究キットであって、以下：
    ａ．生物学的サンプルにおける、ｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}の過剰発現の存在または非存在を検出するためのプローブ、
    ｂ．生物学的サンプルにおける、１つ以上のＨＰＶ遺伝子産物の発現の存在または非存在を検出するための１つ以上のプローブであって、少なくとも１つのＨＰＶ遺伝子産物が、ＨＰＶ Ｅ７遺伝子によってコードされるものである、プローブ、
    を含む、キット。
23. 請求項２２に記載のキットであって、さらに、
    ａ．ポジティブコントロール反応を実行するためのｐ１６^{ＩＮＫ４ａ}サンプル
    ｂ．ポジティブコントロール反応を実行するためのＨＰＶ遺伝子産物の１つ以上のサンプル
    を含む、キット。

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