CN1643378A - 一种区别组织化生与癌变或癌前病变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种区别过度表达p16INK4a的组织化生与过度表达p16INK4a的癌变或癌前病变的方法,该方法是在细胞学检测操作中,通过确定生物样本中高危险亚型HPV编码的基因产物如HPVE2和HPVE7分子的水平来区别组织化生与癌变或癌前病变。因而该方法能减少在基于p16INK4a的细胞学检测操作中的肛门和生殖器病变探查的假阳性结果。
Description
技术领域
本发明涉及一种区别过度表达p16INK4a的组织化生与过度表达p16INK4a的癌变或癌前病变的方法,该方法是在细胞学检测操作中,通过确定生物样本中高危的人乳头癌病毒(HPV)编码的基因产物如HPVE2或E7分子的水平进行。因而该方法能减少以p16INK4a为基础的细胞学检测操作中的肛门和生殖器病变探查的假阳性结果。
背景技术
在生物样本中过度表达的p16INK4a已在探查肛门和生殖器病变如子宫颈癌的过程中被证明是一个有用的标记(见WO00/01845;Klaes et al.,Int.J.Cancer:92,276-284(2001))。这种基于p16INK4a特异性免疫化学染色的方法可以在组织切片和细胞学样本中灵敏地、特异性地识别异常细胞。
在对组织进行免疫组织化学检测中,用p16INK4a特异性抗体为介质的染色操作能将肿瘤细胞染色。因此,以肛门和生殖器病变中细胞转化的分子标记特征为基础的染色反应能够支持癌病变的组织学诊断。在这些操作中,诊断是否是肿瘤细胞,并不仅仅只依靠p16INK4a的特异性染色,还要依靠组织学信息。
这是因为在大约30%的样本中,组织化生细胞显示出一定程度的与p16INK4a特异性抗体的免疫反应性,因此,在操作过程中组织化生细胞也会被染色。但是由组织化生细胞产生的染色图案不同于癌病变细胞产生的图案。组织化生细胞产生斑驳或集中的染色图案,而癌病变细胞产生扩散的染色图案。此外,组织化生细胞的染色强度远弱于癌病变细胞的染色强度。
但癌变早期发现的筛查试验,其普通方法不使用以组织学为基础的检测,而更依赖于细胞学检测操作。特别在一些情况下,当没有关于组织结构方面的组织学信息可利用时,诸如在细胞学检测中,单独检测过度表达的p16INK4a可能会导致假阳性结果。原因是组织化生细胞表达的p16INK4a可能处于一个可检测的较高水平,组织学的染色图案不能将其区别开来。
在出现发育异常的过程中显示出过度表达p16INK4a的细胞百分比逐渐增加。因此,在癌变或癌变前的阶段,样本中只存在有限数量的癌变或癌变前细胞,p16INK4a的免疫反应性可能是很微弱的。这样微弱的免疫反应性可能和组织化生细胞引起的免疫反应性的水平大致一样。在发育异常的稍后阶段,p16INK4a的总免疫反应性增强了,因此,即使在细胞学检测程序中,也能很容易的将癌病变与组织化生区别开来。这可能导致这样的情况,表达p16INK4a的组织化生细胞的存在可能会与癌变细胞的存在相混淆,从而产生假阳性结果。
特别在进行有价值的癌变早期发现的筛查试验中,这种情况令人相当不愉快。这是特别真实的,当这种基于p16INK4a的诊断被证明是有价值的组织学检测时,将其运用于以细胞学为基础的筛查程序,能够提高目前已有的检测过程。
为了减少细胞学检测操作中出现的假阳性结果,从而更进一步地提高以p16INK4a为介质的肛门和生殖器病变诊断方法的精确度,一种能区别组织化生与癌及异常病变的方法是令人期待的。该领域的这个问题在癌变的早期阶段特别明显,当显示出过度表达p16INK4a现象的细胞的百分比保持在某一水平时,可能与组织化生细胞的扩散增生所引起的正常的p16INK4a过度表达的水平相混淆。解决当前问题的有效方法就是加入能够表示肛门和生殖道早期癌变特征的参数。任何在肿瘤发生过程中出现的,已证实作为高度发育异常的诊断试剂盒的发育异常或/和癌变的特征并不适合按照本发明得到的方法,这样的特征应仅限于肿瘤发生早期出现的特征。
根据本发明要求的具体实施方案提供了一种区别组织化生与癌变和癌前病变的方法。
为了帮助在基于p16INK4a过度表达的试验操作中区别组织化生和癌病变,需要一个标记分子,该分子在癌变和/或癌变前的组织和细胞中表达,而在组织化生细胞中不表达。
HPV的E2分子在低程度的子宫颈癌前病变(CIN)中是被特别表达的,并且其表达随着CIN程度的增加而减少(Stevenson et al.,J.Gen.Virol.,81,1825-32(2000))。在大部分侵润性肿瘤中检测不到E2蛋白质分子的表达。这可能是因为在HPV的DNA整合到寄主基因组过程中,部分E2基因会丢失。因此,对于持续的HPV感染,因HPV的DNA已经被整合,就只能检测到很少或检测不到E2分子的表达。
由于这些事实,E2蛋白被证实是高危HPV感染引起早期病变的一个标记。与之相反,p16INK4a是一个即使在肛门和生殖道病变的早期阶段也会过度表达的标记,且表达的程度随着发育异常的病变程度而增加。事实上,E2分子在癌变早期的特殊表达使它特别适用于癌变的早期诊断方法。在受试细胞中的病毒大量拷贝前,E2蛋白质分子在HPV感染早期的高表达就使它能识别发现已被感染的细胞。
基因产物L1和L2也能用于依照本发明的方法,这是由于在病毒感染的早期,基因整合发生之前,它们也有突出的高表达水平。这些基因产物的表达也随着HPV的持续感染而减少。
发明人现在已发现,细胞表达高危险亚型HPV的基因产物如HPV的E2分子适合于区分通过p16INK4a特异性免疫化学染色探测到的早期癌变或发育异常病变与组织化生,即使这样的组织化生也含有细胞学检测操作中与p16INK4a发生免疫反应的细胞。
按照本发明,细胞表达的其它HPV编码的mRNA或多肽基因产物,只要在癌变期或癌变前期的表达水平是可检测到的,也可以用于区分癌变或/和癌前病变与组织化生在过度表达p16INK4a上的不同。这样的HPV编码的基因产物的例子包括HPV E6、E7、L1、L2的蛋白质或mRNA。
发明内容
本发明涉及一种在对生物样本进行细胞学检测操作时区别癌变、癌变前和/或发育异常病变与包含过度表达p16INK4a细胞的组织化生的方法,该方法的基础是确定所述样本中是否有表达高危险亚型HPV基因产物的细胞存在。用于这个方法的HPV基因产物在此是指这样一些基因产物,它们特别是在癌变早期阶段和癌前病变中能高表达。在本发明的一个实施方案中,HPV的E2蛋白质或mRNA就可以作为区别样本中的组织化生与早期癌变及癌前病变的标记。此外,按照在此公开的本发明,HPV的E6、E7、L1或L2蛋白质分子和/或mRNA分子也已证明适用于进行这种区别。
用在本发明上下文中的区别方法包括样本是否被一种或另外一种方法分类的评估。在本发明一个优选的实施方案中,区别方法是属于评价一个组织或成分是癌变或是组织化生。因此,用在此处的区别方法是对样本中细胞生长特性的判断。
按照本发明得到的区别方法,其基础是确定在所述的样本中是否有表达高危HPV基因产物的细胞存在和是否有过度表达p16INK4a的细胞存在。表达高危HPV基因产物如E2的细胞不必与过度表达p16INK4a的细胞相同,尽管这两种标记分子的表达可以发生在相同的细胞内。
因此,按照本发明,样本中是否同时存在表达E2基因产物的细胞和过度表达p16INK4a的细胞(其它细胞或共同表达两种标记的相同细胞)就可以用来区别癌变或癌前病变与组织化生。
用在本发明文本中的HPV编码的基因产物应当是任何由HPV基因组的一个基因转录的mRNA或任何这样的mRNA翻译的多肽。按照本发明的方法,适合的HPV编码的基因产物是由E6、E7、L1和L2基因编码的。本发明一个特别优选的HPV基因产物是由HPV的E2基因编码的。
在此,HPV是指人乳头状瘤病毒。用在此处的HPV应包含任何高危险HPV亚型。本发明优选的HPV亚型是与癌相关的HPV亚型,如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56和58。特别优选的HPV高危险亚型是HPV16、18、39或HPV45。鉴别HPV亚型的方法包含任何适合于确定存在于生物样本中的特定HPV亚型的方法。
根据本发明,检测HPV编码的基因产物的水平的方法包含任何适用于在生物样本中检测非常微量的特定生物分子的方法。按照本发明的检测反应可以用于检测核酸或者多肽的水平。
HPV基因产物可以用特异性识别这些分子的试剂来检测。检测HPV基因产物的反应可以包括一个或更多的与检测试剂发生的反应,这些检测试剂或者识别初始的标记分子或者识别用来识别其它分子的前体分子。
检测反应更进一步地包括一个报告反应,以指示HPV基因产物存在与否,和/或存在水平。报告反应可以如一个产生一种有色的化合物的反应,一个生物体发光反应,荧光反应,普通的辐射发射反应等等。
在一个优选的实施方案中,不同的标记分子采用产生不同的报告信号的试剂来识别,因此能辨别出信号所指示的标记分子。在本发明的一个优选实施方案中,在检测p16INK4a的过度表达的同时也检测出高危HPV基因产物表达。在这种情况下,报告反应可以使用例如不同的荧光标记来区分不同的待检测分子。
按照本发明,适用的检测反应可以是印迹技术,如西方印迹,南方印迹,北方印迹。印迹技术是本领域普通技术人员已知的技术,可以操作如电转印迹,半干印迹,真空印迹或点印迹。扩增反应也可用在检测如核酸分子这样的检测反应中。
在本发明一个优选的实施方案中,检测HPV基因产物水平的方法是检测样本中各自基因产物的mRNA或它的片段的水平。检测核酸分子的方法是本领域熟练技术人员所熟知的。核酸分子的检测过程就像进行一个结合反应,将待测分子结合到互补的核酸探针上,或能特异性结合到核酸上的蛋白质或任何其它能特异性识别和结合到所说的核酸分子的整体。
在检测染色反应过程中这个方法能在体外进行,也能直接在原位进行。按照本发明的方法,在样本中检测HPV的mRNA的另一个方法是核酸的扩增反应,该反应以定量的方式如聚合酶链式反应(PCR)进行。本发明的一个优选实施方案中,是实时反转录PCR,可以用来量化肿瘤样本中的HPV基因产物的mRNA的水平。
在本发明另一个优选的实施方案中,检测HPV基因产物水平是通过确定蛋白质的表达水平来进行的。以蛋白质水平来确定HPV基因产物例如进行这样一个反应,该反应中包含了能特异性结合待检测的特定HPV的多肽的试剂。
这些结合剂能用在许多不同的检测技术中,如西方印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫沉淀法。常用的基于检测的多肽结合剂能在例如免疫组织化学染色反应中的体外或直接在原位上进行结合反应。按照本发明,可以使用任何能在生物样本中确定特定多肽数量的其它方法。
本发明上下文中所用的结合试剂无论是用于检测HPV的多肽或是p16INK4a的多肽水平都可包括抗体、抗原结合片段、双功能混和抗体、包含最小抗原结合抗原决定簇的肽聚模拟物等。
一个抗体或抗原结合剂如果在可测的水平上与在此所公开的蛋白质反应,而且与其它蛋白质不发生明显的反应,这就是具有所述的反应特异性。按照本发明,抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。当用在此处时,术语抗体或单克隆抗体意味着包括完整的分子及抗体片段。此外,本发明的抗体包括嵌合、单链和人源性抗体。
按照本发明,结合剂可以单独或联合使用。联合使用结合剂有可能获得更高的灵敏度。优选的抗体是指由本质上不同的抗原特异性的单克隆抗体混和组成,以及独特的单克隆抗体制剂。
单克隆抗体由包含了本发明使用各种在本领域普通技术人员所熟知的技术产生的多肽片段的抗原制成;如见Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。在这样的一种技术中,首先将一种含有抗原多肽或合成部分的免疫原注入各种哺乳动物中(如,小鼠、大鼠、兔子、绵羊或山羊)中。在这一步,本发明的多肽可以无需修饰就用作免疫原。或者,特别对相当短的多肽,如果多肽连接一个载体蛋白,如牛血清白蛋白或匙孔嘁血蓝蛋白,可引起更好的免疫反应。将免疫原注入动物宿主后,最好根据预定安排进行一次或多次的强化免疫,然后对动物定期采血。从该抗血清中,利用耦合到适当固体支持物上的多肽进行亲和层析,从而纯化获得对多肽特异性的多克隆抗体。
按照本发明,用于检测p16INK4a的过度表达是否存在的方法与上文提到的检测HPV基因产物的方法相同。
按照本发明,HPV基因产物的检测可与p16INK4a是否存在过度表达的检测同时进行。按照本发明,文中的同时应当是指字面上的相同时刻或在相同的检测操作中,由此单个的检测步骤是临时连续的。
按照本发明的方法,样本包括任何含有肛门和生殖器来源的细胞的样品。这些样本可以包括如分泌物、切片、体液,和细胞样本。
本发明的一个具体实施方案是包括子宫颈细胞组成的。本发明的一个优选样本是由经典子宫颈涂片制备的宫颈细胞样本。本发明的更优选样本是制备为单层或薄层制品的细胞学样本。样本的制备可以包括:如从一个病人获得组织、体液或细胞样本。按照本发明,样本制备包括更进一步地对样本进行制备的几个步骤,如组织标本的制备、将待测细胞涂或敷到显微镜载波片上,组织微阵列的制备,分离多肽或核酸,制备固相或玻珠固定的肽或核酸,以及待测分子共价耦合或非共价耦合的膜或载波片。
按照本发明的方法适用的癌病变包括任何肛门和生殖器病变,其特征是p16INK4a过度表达,更进一步的是显示有HPV基因产物的表达。本发明的优选肛门和生殖器病变是子宫颈病变。
按照本发明的方法,本发明的另一方面是用于该方法的试验试剂盒。试剂盒可以如诊断试剂盒或研究试剂盒。
按照本发明的试剂盒至少包括一种适合于检测HPV基因产物的试剂和一种适合于检测p16INK4a是否存在过度表达的试剂。
因此,按照本发明的试剂盒可以包括:
a)用于检测HPV基因产物的试剂
b)用于检测p16INK4a是否过度表达的试剂
c)通常用于进行检测反应的试剂和缓冲液,如缓冲液、检测标记、载体物质和其它
d)一个用于进行阳性对照反应的p16INK4a样本
e)一个用于进行阳性对照反应的HPV基因产物样本
检测HPV基因产物和/或p16INK4a的试剂包括任何可以结合到HPV基因产物和/或p16INK4a的分子。这样的试剂包括蛋白质、多肽、核酸、肽核酸、糖蛋白、蛋白多糖、多聚糖或脂类。
用于进行阳性对照的HPV基因产物和/或p16INK4a的样本可以包括例如:如溶液或盐类等适用形式的核酸,适用形式的肽、组织切片样本或阳性细胞。
在本发明的一个优选实施方案中,按多肽水平对HPV基因产物和/或p16INK4a进行检测。在该实施方案中,结合剂可以是如HPV基因产物和/或p16INK4a的特异性抗体或含它的片段。
在另一个试验试剂盒的实施方案中,按核酸水平对HPV基因产物和/或p16INK4a进行检测。在该实施方案中,用于检测的试剂可以所述的HPV基因产物和/或p16INK4a核酸的如核酸探针或反相互补引物。
由于癌变或癌变前肛门和生殖器病变是通过评估p16INK4a的过度表达来识别的,而同时组织化生细胞在细胞学检测操作中也能检测到p16INK4a的表达,因此本发明提供了一种区别癌变或癌变前肛门和生殖器病变与组织化生的方法。该方法是基于对高危HPV基因产物表达的检测。已经证实,高危HPV基因产物在癌变早期或癌变前有高水平的表达,正适合于该区别方法。这是由于这样的事实,在生物样本中癌变早期过度表达p16INK4a的细胞的百分比表现了p16INK4a分子的水平,但是有这样的可能性,这个水平是来源于组织化生细胞而不是癌变细胞。因此为了解决这个问题,当基于p16INK4a过度表达的细胞学诊断方法需要更进一步的信息来识别组织化生细胞时,尤其是在癌变早期,本发明提供了一种方法来区别癌变和组织化生细胞。
此外,本发明还提供了一套试剂盒以完成本发明的方法。
附图说明
图1组织化生细胞与p16INK4a特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例1;细胞明显与p16INK4a的抗体发生了反应
图2组织化生细胞与HPV的E2特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例1;显示细胞没有与直接针对HPV的E2蛋白的多克隆抗体发生免疫反应
图3组织化生细胞与HPV的L1特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例1;显示细胞没有与直接针对HPV的L1蛋白的多克隆抗体发生免疫反应
图4发育异常细胞与p16INK4a特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例1;细胞明显与p16INK4a的抗体发生了反应
图5发育异常细胞与HPV的E2特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例1;清楚地显示了细胞与直接针对HPV的E2蛋白的多克隆抗体发生了免疫反应
图6发育异常细胞与HPV的L1特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例1;清楚地显示了细胞与直接针对HPV的L1蛋白的多克隆抗体发生免疫反应
图7组织化生细胞与p16INK4a特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例3;细胞明显与p16INK4a的抗体发生了反应
图8组织化生细胞与HPV的E7特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例3;显示细胞没有与直接针对HPV的E7蛋白的单克隆抗体发生了免疫反应
图9发育异常细胞与p16INK4a特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例3;细胞明显与p16INK4a的抗体发生了反应
图10发育异常细胞与HPV的E7特异性抗体的免疫化学染色;试验细节见实施例3;清楚地显示了细胞与直接针对HPV的E7蛋白的抗体发生了免疫反应
图11发育异常细胞与HPV的E7特异性抗体和p16INK4a特异性抗体的双重免疫化学染色;试验细节见实施例3;细胞明显与HPV的E7和p16INK4a蛋白的抗体都发生了反应;
下面给出的例子仅仅是为了阐述在此公开的发明,而不是希望限制本发明的范围。
实施例1:子宫颈样本中HPV的E2、L1和p16INK4a表达的免疫化学检测
用p16INK4a的特异性抗体和HPV中E2蛋白的多克隆抗体对子宫颈涂片进行免疫细胞化学染色。
在摇动装置上将喷射固定的涂片在新鲜的50%乙醇(EtOH)中孵育进行再水化。通过彻底地漂洗去除固定操作中所产生的聚乙二醇(PEG)膜。接下来在蒸馏水中漂洗涂片。用10mM枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)进行抗原修复。就此,载玻片在95℃下水浴加热40分钟,室温冷却20分钟,转移到漂洗缓冲液中(PBS(磷酸缓冲盐溶液)/0.1%吐温20),最后用脂质笔(lipid-pencil)环绕。
为了灭活样本的内源性过氧化物酶,样本在室温下用3%的H2O2孵育20分钟,然后用PBS/0.1%吐温20漂洗5分钟。用马血清(Vectastain-试剂盒)(用PBS/0.1%吐温20按1∶50稀释)进行蛋白质封闭。涂片室温下孵育20分钟,然后仔细清洗。接下来封闭非特异性结合的抗生物素蛋白,试剂操作如下:室温下,样本在抗生物素蛋白封闭溶液(现成的/载体)中孵育15分钟,然后用移液管仔细清洗。为了封闭非特异性结合的生物素,涂片室温下在生物素封闭溶液(现成的/载体)中孵育15分钟,然后仔细清洗。
然后样本与p16INK4a特异性第一抗体,或针对HPV的E2蛋白的多克隆抗体,或对高危险亚型HPV(HPV16)的L1蛋白的多克隆抗体一起孵育;样本在室温下孵育60分钟,用PBS/0.1%吐温20清洗5分钟(两次),随后,与生物素酰化的第二抗体(马-抗-小鼠的IgG)(Vectastain-试剂盒/用PBS/0.1%吐温20按1∶200稀释+马血清)室温下共同孵育30分钟,用PBS/0.1%吐温20清洗5分钟(两次);接下来是与AB复合物(抗生物素蛋白-生物素-辣根过氧化物酶)(Vectastain-试剂盒/用PBS/0.1%吐温20按1∶50稀释)室温下孵育30分钟,然后用PBS/0.1%吐温20清洗5分钟(两次)。
使用底物-色原体复合物(H2O2/AEC)进行信号检测,如下:首先,样本与底物-色原体复合物在室温下孵育30分钟,反应在蒸馏水(aqua dest.)中停止。最后,用Mayers苏木精复染,载玻片用甘油明胶封固。
用显微镜检查载玻片,结果表明只有在样本中同时发现细胞与p16INK4a和HPV的E2蛋白都发生了化学免疫反应,这样的样本才能被显微镜识别为癌病变的样本。细胞被p16INK4a特异性反应染色,而没有被HPV的E2蛋白的特异性反应染色,则是由组织化生引起的。对HPV的L1的染色载玻片进行的显微镜观察显示,组织化生细胞不与直接针对HPV的L1蛋白发生免疫反应。相反,含有发育异常细胞的样本含有能够与HPV的L1蛋白和p16INK4a发生免疫反应的细胞。因此,与发育异常的细胞相比,在组织化生中没有细胞能被HPV的L1蛋白的特异性抗体染色。
结果表明,用HPV的E2或L1特异性的试剂可以区别组织化生与发育异常的p16INK4a过度表达。
实施例2:通过原位杂交检测子宫颈样本中表达HPV的E2、HPV的L1或p16INK4a的细胞
用原位染色反应,对子宫颈涂片进行半定量的分析,分析p16INK4a和HPV的E2和L2的mRNA水平。染色反应操作如下:
在摇动装置上将喷射固定的涂片在新鲜的50%乙醇(EtOH)中孵育进行再水化。通过彻底地漂洗去除固定操作产生的PEG膜。接下来在蒸馏水中漂洗涂片。37℃下涂片与蛋白酶K(在PBS中10μg/ml)一起孵育10分钟。然后,将涂片转移到漂洗缓冲液中(PBS/0.1%吐温20),最后用lipid-pencil环绕。
杂交混和剂的制备,将50μl现成的杂交缓冲液(DAKOA/S,Glostrup,Danmark)与大约5-10pmol的探针混和。探针是经荧光标记的、分别与待测的各个分子的mRNA互补的寡核苷酸序列。
杂交混合剂加热到95℃,然后保持在37℃。在沸腾过程后,在42℃下涂片分别与每50μl杂交混合剂一起孵育4个小时。在37℃下样本用超量的清洗液2×SSC清洗15分钟两次,37℃下用1×SSC清洗15分钟一次,然后室温下涂片用2×SSC漂洗两次。接着清洗操作后,室温下组织标本用封闭缓冲液(NEN,Blockingpugger)孵育30分钟。然后,在经1∶100稀释过的反-碱性荧光素磷酸酶(用封闭缓冲液稀释,见上)(DAKOA/S)中孵育1小时。然后室温下用1×PBS/0.1%Triton X-100清洗涂片两次,每次10分钟,接下来在室温下用1×PBS 50mMMgCl2(pH9.2)清洗10分钟。然后,室温下用NBT/BCIP(Sigma)进行染色反应2小时30分钟。染色反应在涂片与1mM EDTA在PBS中进行短暂孵育后停止。最后,涂片用H2Odest浸泡,然后包埋在AquaTex(Merck)中。随后对被染色的组织标本进行镜检分析。
显微镜分析显示,组织化生含有表达p16INK4a的细胞,但不含有表达HPV的L1或E2的mRNA的细胞。在子宫颈的异常发育病变中发现了表达p16INK4a的细胞,此外也发现了表达HPV的L1或E2的mRNA的细胞。
结果表明,按照本发明的方法可以用作区别组织化生和癌病变。
实施例3:免疫细胞化学检测子宫颈样本中HPV的E7和p16INK4a的表达
用p16INK4a的特异性抗体和HPV E7蛋白的特异性单克隆抗体对子宫颈ThinPrep薄层涂片进行免疫细胞化学染色。
在摇动装置上将喷射固定的涂片在新鲜的50%乙醇中孵育进行再水化。通过彻底地漂洗去除固定操作产生的PEG膜。接下来在蒸馏水中漂洗涂片。用10mM枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)进行抗原修复。就此,涂片在95℃-98℃下水浴加热40分钟,室温冷却20分钟,将涂片转移到漂洗缓冲液中(PBS/0.1%吐温20),最后用lipid-pencil环绕。
为了灭活样本的内源性过氧化物酶,室温下,样本用3%的H2O2(Dakocytomation;S2023)孵育5分钟,随后在漂洗缓冲液(Dakocytomation;S3006)中漂洗5分钟。然后将样本与p16INK4a的特异性第一抗体或直接针对高危险亚型(HPV16)的E7蛋白的单克隆抗体一起孵育;室温下孵育样本30分钟,用漂洗缓冲液清洗5分钟,随后室温下与EnVision系统(Dakocytomation;K4001)孵育30分钟,EnVision系统由山羊抗小鼠抗体结合右旋糖苷多聚体及过氧化物酶组成,随后在漂洗缓冲液中清洗5分钟(三次)。
信号检测使用底物-色原体复合物(DAB+,Dakocytomation,K3468)进行,操作如下:首先,样本与底物-色原体复合物在室温下孵育10分钟,反应在蒸馏水中停止。最后,用Mayers苏木精复染,载玻片用Faramount(Dakocytomation,S3025)封固。
用显微镜检查载玻片,结果显示,只有发现样本中细胞同时与p16INK4a和HPV的E7蛋白发生了化学免疫反应,这样的样本才被显微镜识别为癌变损害的样本。细胞被p16INK4a特异性反应染色,而没有被HPV的E7蛋白的特异性反应染色,则是由组织化生引起的。为了验证此结果,用异硫氰酸荧光素标记的HPV E7抗体(如上给定的抗体)结合上面所用的p16INK4a抗体进行双重染色。按照上面给出的适合的两次染色程序进行染色,必要的变化是本领域熟练技术人员所知道的。
在经过双重染色程序的样本中,没有发现双重染色的组织化生细胞,相反,发育异常细胞显示了被p16INK4a和HPV E7蛋白双重染色。
结果表明,用对HPV E7特异性的试剂进行染色可用于区别组织化生和异常发育的p16INK4a过度表达。
Claims (26)
1、一种区别细胞学试验过程中在生物样本中过度表达的p16INK4a的组织化生与过度表达的p16INK4a的癌变或癌前病变的方法,包括
a.测定在所述的生物样本中是否存在过度表达p16INK4a的细胞;
b.测定在所述的生物样本中是否存在至少表达一种高危HPV基因产物的细胞;
c.确定表达高危险亚型HPV基因产物的细胞和过度表达p16INK4a的细胞同时存在或只有过度表达p16INK4a的细胞单独存在;
d.其中表达高危HPV基因产物的细胞和过度表达p16INK4a的细胞同时存在表示是癌变或癌前病变。
2、根据权利要求1所述的方法,其中高危HPV基因产物在癌变和/或癌前病变早期表达较多。
3、根据前面权利要求任一项所述的方法,其中至少一种HPV基因产物是由HPVE7基因编码的。
4、根据权利要求1所述的方法,其中至少一种HPV基因产物是由HPVE2和/或E6基因编码的。
5、根据权利要求1所述的方法,其中至少一种HPV的基因产物是由HPV的L1和/或L2基因编码的。
6、胼胝前面权利要求任一项所述的方法,其中HPV的基因产物是多肽或RNA分子。
7、胼胝前面权利要求任一项所述的方法,其中的癌变或癌前病变是肛门与生殖道病变。
8、根据权利要求7所述的方法,其中的肛门与生殖道病变是子宫颈病变。
9、胼胝前面权利要求任一项所述的方法,其中的生物学样本是包含来源于肛门与生殖器的细胞的样本。
10、根据权利要求9所述的方法,其中的细胞是来源于子宫颈的细胞。
11、根据权利要求10所述的方法,其中的生物学样本是巴氏涂片或子宫颈细胞学标本。
12、胼胝前面权利要求任一项所述的方法,其中对HPV的基因产物和p16INK4a分子的检测使用至少一种待测分子的特异性探针。
13、根据权利要求12所述的方法,其中探针已被可检测的标记过。
14、根据权利要求13所述的方法,其中标记选自:放射性同位素、生物发光化合物、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物或酶。
15、根据权利要求12-14任一项所述的方法,其中的探针是蛋白质和/或核酸。
16、根据权利要求15所述的方法,其中至少有一种探针是针对高危HPV编码的基因产物或p16INK4a分子的抗体。
17、根据权利要求16所述的方法,包含了一个免疫细胞化学染色过程。
18、根据权利要求15所述的方法,其中至少有一种探针是能特异性地与高危HPV基因产物杂交的核酸。
19、根据权利要求18所述的方法,包含一个原位杂交反应。
20、根据权利要求18所述的方法,包含一个核酸扩增反应。
21、根据权利要求20所述的方法,其中的核酸扩增反应是PCR或LCR。
22、胼胝前面权利要求任一项所述的方法,其中使用核酸探针和多肽探针的同时进行检测反应。
23、胼胝前面权利要求任一项所述的方法,其中高危HPV基因产物是与癌症相关的HPV亚型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56和58的基因产物。
24、胼胝前面权利要求任一项所述的方法,其中确定至少一个单细胞过度表达p16INK4a分子的同时还表达至少一种高危HPV基因产物。
25、进行前面权利要求任一项所述的方法的试剂盒,其是诊断试剂盒或研究试剂盒,包括
a.用于检测生物样本中存在或不存在过度表达的p16INK4a的探针;
b.用于检测生物样本中存在或不存在表达一种或一种以上HPV的基因产物的一种或一种以上探针。
26、根据权利要求25的试剂盒,其进一步包括
a.一种用于阳性对照反应的p16INK4a样本
b.一种或一种以上用于进行阳性对照反应的HPV基因产物样本。
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