MXPA04009584A

MXPA04009584A - Metodo para discriminacion de metaplasias de lesiones neoplasicas o preneoplasicas.

Info

Publication number: MXPA04009584A
Application number: MXPA04009584A
Authority: MX
Inventors: Martin Peter
Original assignee: Mtm Lab Ag
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2003-04-08
Publication date: 2005-01-11
Also published as: US8043819B2; EP1493032B1; US7422859B2; US20190177804A1; DE60318415D1; US10246751B2; EP1369694A1; DE60318415T2; ES2360342T3; EP1821102B1; DE60335922D1; US8815520B2; US20050255468A1; JP4809408B2; JP4290118B2; WO2004005927A1; JP2005523039A; AU2003274105A1; ATE382863T1; US10822660B2

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para discriminar metaplasias que sobreexpresan p16INK4a de lesiones neoplasicas o preneoplasicas que sobrepasan p16INK4a, mediante la determinacion del nivel de productos genicos codificados por PVH de alto riesgo, tales como e.g., moleculas E2 o E7 de PVH en muestras biologicas, en el transcurso de procedimientos de prueba citologicos. De esta manera, el metodo hace posible la reduccion de resultados falsos positivos en la deteccion, basada en p16INK4a, de lesiones anogenitales en procedimientos de prueba citologicos.

Description

METODO PARA DISCRIMINACION DE METAPLASIAS DE LESIONES NEOPLASICAS O PRENEOPLASICAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para discriminar metaplasias que sobreexpresan pl6IN 4a de lesiones neoplásicas o preneoplásicas que sobreexpresan pl6IN 4a, mediante la determinación del nivel de productos génicos codificados por PVH (Papilomavirus humano) de alto riesgo, tales como e.g. , moléculas E2 o E7 de PVH en muestras biológicas, en el transcurso de procedimientos de prueba citológicos. De esta manera, el método hace posible la reducción de resultados falsos positivos en la detección, basada en pl6INK4a, de lesiones anogenitales en procedimientos de prueba citológicos. La detección de la sobreexpresión de pl6INK4a en muestras biológicas a comprobado ser un marcador útil en la detección en lesiones anogenitales, tales como carcinoma cervicouterino (véase la Solicitud Internacional de Patente O00/1845; Kles et al., Int. Cáncer: 92,276-284 (2001)). El método basado en la tinción inmunoquímica específica de pl6INK4a permite una identificación sensible y específica de células displásicas en secciones tisulares y en muestras citológicas . En exámenes inmunohistoquímicos de tejidos, Ref. 157724 céllulas neoplásicas se pueden teñir con el uso de un procedimiento de tinción mediado por anticuerpos específicos contra pl6INK4a. El diagnostico histológico de lesiones neoplásicas, de esta manera, puede ser respaldado por una tinción basada por un marcador molecular característico de la transformación de células en lesiones anogenitales . El diagnostico, ya sea que las células sean neoplásicas o no, en estos procedimientos no únicamente esta basado en la tinción específica pl6INKa, sino que también se basa en la información histológica. Esto se debe al hecho de que en aproximadamente el 30% de las muestras, as células metaplásicas muestran alguna inmunorreactividad con anticuerpos específicos contra pl6INK4a, y por lo tanto se tiñen en el transcurso del procedimiento. Sin embargo, el patrón de tinción en estas células metaplásicas, difiere del patrón de aquellas que son lesiones neoplásicas. Las células metaplásicas dan origen a un patrón de tinción en parches o focal, mientras que las lesiones neoplásicas dan origen a un patrón de tinción difusa. Además, la intensidad de la tinción de las células metaplásicas es predominantemente menor que aquella de las células neoplásicas. Los métodos comúnmente utilizados en las pruebas de screening para la detección precoz de neoplasias, no emplean pruebas basadas en histología, sino que confían en procedimientos de pruebas citológicos. Especialmente en algunos casos en donde no hay disponible información histológica con referencia a la arquitectura de los tejidos, tal como por ejemplo en exámenes citológicos, la prueba de la sobreexpresión de pl6INK4a, por sí sola puede conducir a resultados falsos positivos. Esto se debe al hecho de que las células metaplásicas que expresan pl6IN 4a, a niveles elevados detectables, no se pueden diferenciar por medio de patrones de tinción histológica. El porcentaje de células que muestran una sobreexpresión de pl6INK4a se incrementa en el transcurso del surgimiento de las displasias. Así pues, en las etapas neoplásicas o preneoplásicas , cuando hay presente sólo una población restringida de células neoplásicas o preneoplásicas en las muestras, la inmunorreactividad de pl6INK4a puede ser débil. Esta débil inmunorreactividad puede ser comparable al nivel de actividad por las células metaplásicas. En etapas posteriores de las displasias, la inmunorreactividad entera de pl6INK4a es más fuerte y por lo tanto las lesiones neoplásicas son fácilmente discernibles de las metaplasias, incluso en un formato de prueba citológica. Esto podría conducir a casos en donde la presencia de células metaplásicas que expresan pl6INK a, se pudiera confundir con la presencia de células neoplásicas y, por lo tanto, producir un resultado falso positivo. Especialmente en pruebas de screening, en donde la detección de etapas tempranas de neoplasias, es deseable, esta condición es muy desagradable. Esto es especialmente real, ya que el diagnostico basado en pl6INK4a a comprobado ser una herramienta valiosa en exámenes histológicos y la aplicación en procedimientos de screening basados en citología podría ser capaz de mejorar estos procedimientos establecidos . Para reducir los resultados falsos positivos en formatos de pruebas citológicos y de este modo mejorar la fidelidad del diagnóstico mediado por pl6INK a de lesiones anogenitales, es deseable un método para discriminar las metaplasias de las lesiones neoplásicas y displásicas. El problema en la técnica se refiere especialmente a las etapas tempranas de las neoplasias, en donde el porcentaje de células que muestran una sobreexpresión de pl6INK4a todavía está a un nivel que podría confundirse con los niveles normalmente presentes de las células metaplásicas en proliferación que sobreexpresan pl6INK4a. Así pues, los medios útiles para resolver el presente problema, tienen que incluir parámetros que caractericen a las etapas tempranas de las neoplasias del tracto anogenital. Cualquier característica de las displasias y/o neoplasias que surja durante el progreso de la tumorogénesis, constituye entonces una herramienta de diagnóstico de displasias de alto grado y es limitada en las etapas tempranas de la tumorogénesis y no es adecuada para el método de conformidad con la presente invención. Un método para la discriminación de metaplasias de lesiones neoplásicas y preneoplásicas se proporciona en las modalidades reivindicadas de la presente invención. Para respaldar la discriminación de metaplasias de lesiones neoplásicas en procedimientos de prueba basados en la sobreexpresión de pl6INK a, sería deseable un marcador molecular que se exprese en células y tejidos neoplásicos y/o preneoplásicos y que no se exprese en células metaplásicas . iLa molécula E2 de PVH se expresa especialmente en lesiones CIN de grado bajo y la expresión disminuye cuando el grado de CIN se incrementa (Steveson et al., J. Gen. Virol., 81, 1825-32 (2000)) . En gran parte de los carcinomas invasivos no se detecta la expresión de la proteína E2. Esto puede deberse al hecho de que algunas partes del gen E2 se pierden durante la integración del ADN de PVH. Así pues, en las infecciones persistentes por PVH que tienen ADN de PVH integrado, se podría detectar una baja expresión de E2 o ninguna expresión. Debido a estos hechos, la proteína E2 prueba ser un marcador de las etapas tempranas de las lesiones asociadas con infecciones por PVH de alto riesgo. En contraste el pl6IN a es un marcador que se sobreexpresa incluso en etapas tempranas de lesiones anogeni ales , cuyo nivel de expresión se incrementa en el transcurso del progreso de las lesiones displásicas. El hecho de que la proteína E2 sea especialmente expresada en las etapas tempranas de las neoplasias, la hace particularmente útil para métodos de detección precoz. El alto nivel de expresión de la proteína E2 en las etapas tempranas de la infección por PVH, permite identificar células infectadas antes de que haya un número abundante de copias del virus en las células probadas. Los productos de los genes Ll y L2 también son útiles para el método de conformidad con la presente invención, debido a su alto nivel de expresión predominantemente en las etapas tempranas de la infección viral, antes de que la integración haya ocurrido. La expresión de estos productos génicos también se reduce en la infección persistente por PVH. Los inventores ahora encontraron que las células que expresan productos génicos de PVH de alto riesgo, tales como la proteína E2 de PVH, pueden servir para discriminar lesiones neoplásicas o displásicas tempranas detectables por tinción inmunoquímica específica de pi6INK4a de las metaplasias, las cuales también pueden comprender células inmunorreactivas con pl6INK a en el transcurso de los procedimientos de pruebas citológicas. Las células que expresan otros productos génicos codificados por PVH que son detectables a un nivel de expresión similar al ARNm o polipéptido en las etapas neoplásicas o preneoplásicas , también podrían servir para la discriminación de lesiones neoplásicas y/o preneoplásicas de metaplasias que sobreexpresan pl6INK4a de conformidad con la presente invención. Ejemplos de tales productos génicos codificados por PVH incluyen las proteínas E6, E7, Ll o L2 de PVH, o ARNm del mismo. La presente invención se refiere a un método para la discriminación de lesiones neoplásicas, preneoplásicas y/o displásicas de metaplasias que comprenden células que sobreexpresan pl6INK4a, en muestras biológicas en un procedimiento de prueba citológica, basándose en la detección de la presencia o ausencia de células que expresan productos génicos de PVH de alto riesgo en dichas muestras biológicas. Los productos génicos de PVH útiles para el método descrito en la presente, son productos génicos altamente expresados, especialmente en las etapas tempranas de las lesiones neoplásicas y preneoplásicas. En una modalidad de la presente invención, la proteína E2 o el ARNm de PVH pueden servir como marcadores para la discriminación de metaplasias de lesiones neoplásicas y preneoplásicas tempranas en las muestras. Además, las proteínas E6 , E7, Ll o L2 de PVH y/o el ARNm del mismo, también pueden ser adecuadas para efectuar la discriminación de conformidad con la presente invención. La discriminación utilizada en el contexto de la presente invención, deberá comprender una comprobac ón de si la muestra se va a clasificar de una u otra manera. En una modalidad preferida de la presente invención, la discriminación se refiere a la comprobación de un tejido o componentes del mismo si son neoplásicos o metaplásicos . Así pues, la discriminación tal como se utiliza en la presente invención, es un juicio a cerca de las propiedades de crecimiento de la célula en una muestra. La discriminación de conformidad con la presente invención, se basa en la presencia o ausencia de células que expresen productos génicos de PVH de alto riesgo y en la presencia o ausencia de células que sobreexpresen pl6INK4a en dicha muestra. Las células que expresan los productos génicos de PVH de alto riesgo, tales como E2 , no necesitan ser las mismas células que las que sobreexpresan pl6INK4a, aunque la expresión de ambas moléculas marcadoras puede ocurrir en las mismas células. Así pues, la presencia de células que expresan productos del gen E2 en una muestra, simultáneamente con la presencia de células que sobreexpresan pl6INK4a (células diferentes o iguales que expresan concomitantemente ambos marcadores) de conformidad con la presente invención, sirve para discriminar lesiones neoplásicas o preneoplásicas de metaplasias . Los productos génicos codificados por PVH tal como se utilizan en el contexto de la presente invención, deberán ser cualesquier ARNm transcrito de un gen del genoma de PVH o cualquier polipéptido traducido proveniente de dicho ARNm. Los productos génicos de PVH adecuados para el método de conformidad con la presente invención, son productos génicos codificados por los genes E6, E7, Ll y L2. En una modalidad especialmente preferida de la presente invención, el producto génico de PVH es codificado por el gen E2 de PVH. PVH en la presente significa Papilomavirus Humano. El PVH tal como se utiliza en la presente, deberá comprender cualquier subtipo de alto riesgo de PVH. En una modalidad preferida de la presente invención, el subtipo de PVH es un subtipo relacionado con el cáncer, tal como e.g., PVH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58. En una modalidad especialmente preferida, los subtipos de PVH alto riesgo son PVH 16, 18, 39 o PVH 45. La subtipificación del PVH deberá comprender cualquier método adecuado para determinar el subtipo particular de PVH presente en una muestra biológica. El método para la detección del nivel de productos génicos del PVH de conformidad con la presente invención, es cualquier método que sea adecuado para detectar cantidades muy pequeñas de moléculas biológicas específicas, en muestras biológicas. La reacción y detección con la presente invención, es una detección ya sea a nivel de ácidos nucleicos, o bien a nivel de polipéptidos .

Los productos génicos de PVH se pueden detectar con el uso de reactivos que reconocen específicamente estas moléculas. La reacción de detección de los productos génicos de PVH puede comprender una o más reacciones con agentes detectores, ya sea que reconocen las moléculas marcadoras iniciales, o bien que reconocen moléculas utilizadas para reconocer otras moléculas. La reacción de detección además puede comprender una reacción de reporte que indique la presencia o ausencia y/o el nivel de los productos génicos de PVH. La reacción de reporte puede ser, por ejemplo, una reacción que produce un compuesto colorido, una reacción de biolumuniscencia , una reacción de fluorescencia, generalmente una reacción que emite radiación, etc. En una modalidad preferida, diferentes marcadores moleculares pueden ser reconocidos por agentes que producen diferentes señales de reporte, de tal modo que las señales que se refieren a los marcadores moleculares puedan ser distinguidas. En una modalidad preferida de la presente invención, la detección de la expresión de productos génicos de PVH de alto riesgo se lleva a cabo de manera simultanea a la detección de la sobreexpresión de pl6INK4a. En este caso, en la reacción de reporte se pueden emplear, por ejemplo, diferentes marcas fluorescentes para las diferentes moléculas detectadas.

Los formatos aplicables para la reacción de detección de conformidad con la presente invención, pueden ser técnicas de inmunotransferencia, tales como la inmunoelectrotransferencia tipo Western, tipo Southern o tipo Northern. Las técnicas de inmuno ransferencia son conocidas por los técnicos en la materia y pueden ser ejecutadas, por ejemplo, como inmunoelectrotransferencia, inmunotransferencia en condiciones semideshidratadas, transferencias al vacío o como "dot-blots" . La reacción de amplificación también puede ser aplicable para la detección de e.g., moléculas de ácido nucleico. En una modalidad preferida de la presente invención, la detección del nivel de los productos génicos de PVH se lleva acabo mediante la detección del correspondiente AR m o fragmentos del mismo presentes en la muestra. Los medios para la detección de moléculas de ácido nucleico son conocidos por los técnicos en la materia. El procedimiento para la detección de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante una reacción de unión de las moléculas por ser detectadas, a sondas de ácido nucleico complementarias, proteínas con especificidad de unión por los ácidos nucleicos o cualquier otra entidad que reconozca y se una específicamente a dichos ácidos nucleicos. Este método se puede realizar in vi tro o directamente in situ por ejemplo en el transcurso de una reacción de tinción. Otra manera de detectar ARNm de PVH en una muestra procesada de conformidad con la presente invención, es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, la cual se puede llevar a cabo de manera cuantitativa, como por ejemplo la reacción en cadena catalizada por polimerasa. En una modalidad preferida de la presente invención, se puede emplear una RPC-TR (reacción en cadena catalizada por polimerasa, con transcriptasa reversa) en tiempo real para cuantificar el nivel de ARNm de PVH en muestras de tumores. En otra modalidad preferida de la presente invención, la detección del nivel de los productos génicos de PVH se lleva a cabo mediante la determinación del nivel de expresión de una proteína. La determinación del producto génico de PVH a nivel proteína, se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante una reacción que comprende un agente de unión específico para la detección de un polipéptido particular de PVH. Los agentes de unión se pueden utilizar en muchas diferentes técnicas de detección, por ejemplo en inmunoelectrotransferencia tipo Western, en ELISA o en inmunoprecipitación. Por lo general, la detección basada en agentes de unión a polipéptidos se puede llevar a cabo tanto in vi tro como directamente in si tu, por ejemplo en el transcurso de una reacción de tinción inmunohistoquímica. Se puede utilizar cualquier otro método para determinar la cantidad de polipeptidos particulares en muestras biológicas, de conformidad con la presente invención. Los agentes de unión utilizados en el contexto de la presente invención, para la detección del nivel de polipéptidos de PVH o polipéptidos de pl6INK4a, pueden comprender anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos, anticuerpos híbridos bifuncionales , peptidomiméticos que contienen epítopos de unión al antígeno mínimos, etc. Un anticuerpo o agente de unión al antígeno se dice que reacciona específicamente, si reacciona a un nivel detectable con una proteína como la descrita en la presente, y no reacciona significativamente con otras proteínas. Los anticuerpos de conformidad con la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales . Tal como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" o "anticuerpo monoclonal", incluye moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpo. Además, los anticuerpos de la presente invención, incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena simple y humanizados. De conformidad con la presente invención, se pueden emplear agentes de unión aislados o en combinación. Mediante la combinación es posible lograr un mayor grado de sensibilidad. El término "anticuerpo", de preferencia, se refiere a anticuerpos que consisten esencialmente de anticuerpos monoclonales mixtos con diferentes especificidades epitópicas, así como distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fragmentos que contienen antígeno del polipéptido de la presente invención, con el uso de cualquiera de la variedad de técnicas conocidas por los técnicos en la materia; véase e.g., Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En una de tales técnicas, un inmunógeno que comprende el polipéptido antigénico o una parte sintética del mismo, se inyecta inicialmente en cualquiera de una amplia variedad de mamíferos (e.g., ratones, ratas, conejos, ovejas y cabras) . En este paso, los polipéptidos de la presente invención, pueden servir como inmunógeno sin modificación. De manera alternativa, particularmente para polipéptidos relativamente cortos, se puede inducir una respuesta inmunitaria superior si el polipéptido se une a una proteína de vehículo, tal como albúmina sérica bovina o hemocianina de lapa. El inmunógeno se inyecta en el animal hospedero, de preferencia de conformidad con un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y los animales se sangran periódicamente. Luego, los anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido se pueden purificar a partir de tales antisueros, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con el uso del polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado. Los métodos para la detección de la presencia o ausencia de una sobreexpresión de pl6INK4a de conformidad con la presente invención, son los mismos métodos que se mencionaron anteriormente para la detección de productos génicos de PVH. Los productos génicos de PVH, de conformidad con la presente invención, pueden ser detectados simultáneamente con la presencia o ausencia de una sobreexpresión de pl6INK4a. En este contexto, la expresión "simultáneamente"' de conformidad con la presente invención significa literalmente al mismo tiempo, o dentro del mismo procedimiento de prueba, en donde las etapas de detección individuales son temporalmente consecutivas. Una muestra de conformidad con el método de la presente invención, puede comprender cualquier muestra que comprenda muestras de origen anogenital . Las muestras pueden comprender, e.g., secreciones, frotis, fluidos corporales y muestras de células. En una modalidad de la presente invención, las muestras comprenden células de origen cervicouterino. En una modalidad preferida de la presente invención, la muestra de células cervicales se puede preparar de conformidad con un Papanicolau clásico. En otra modalidad preferida de la presente invención, la muestra se puede preparar como una monocapa o una preparación en capa fina del espécimen citológico. La preparación de una muestra puede comprender e.g., obtener una muestra de un tejido, un fluido corporal o células de un paciente. De conformidad con la presente invención, la preparación de la muestra también puede comprender varias etapas de preparaciones adicionales de la misma, tales como la preparación de disecciones, dispersión o aplicación de las células por ser examinadas en portaobjetos de microscopio, la preparación de tejidos, el aislamiento de polipéptidos o ácidos nucleicos, la preparación de péptidos o ácidos nucleicos fijos a una fase sólida, o preparación de cuentas, membranas, o portaobjetos a los cuales las moléculas por ser determinadas se unen de manera covalente o no covalente . Las lesiones neoplásicas a las cuales el método de conformidad con la presente invención se puede aplicar, comprenden cualquier lesión anogenital que esté caracterizada por la sobreexpresión de pl6I K4a, la cual además muestre una expresión de productos génicos · de PVH. En una modalidad preferida de la presente invención, la lesión anogenital es una lesión cervicouterina . Otro aspecto de la presente invención, es un kit de prueba para llevar a cabo el método de conformidad con la presente invención. El kit puede ser por ejemplo un kit de diagnostico o un kit de investigación. Un kit de conformidad con la presente invención comprende cuando menos un agente adecuado para detectar productos génicos de PVH y un agente adecuado para detectar la presencia o ausencia de la sobreexpresión de pl6INK4a. Así pues, un kit de conformidad con la presente invención podría comprender: a) reactivos para la detección de productos génicos de PVH b) reactivos para la detección de la sobreexpresión de pl6IN 4a c) reactivos y soluciones reguladoras comúnmente utilizados para llevar a cabo la reacción de detección, tales como soluciones reguladoras, marcadores de detección, sustancias de vehículo y otros. d) una muestra de pl6INK4a para llevar acabo una reacción de control positivo e) una muestra de producto génico de PVH para llevar a cabo una reacción de control positivo. Los reactivos para la detección de los productos génicos de PVH y/o la expresión de pl6INK4 , pueden incluir cualquier agente capaz de unirse a los productos génicos de PVH y/o a la molécula pl6INK4a. Tales reactivos pueden incluir proteínas, polipéptidos , ácidos nucleicos, ácidos nucleicos peptídicos, glucoproteínas, proteoglicanos , polisacáridos o lípidos.

El producto génico de PVH y/o la muestra de pl6INK4a para llevar a cabo una reacción de control positivo, puede comprender por ejemplo ácidos nucleicos en una forma aplicable, tal como una solución o una sal, péptidos en una forma aplicable, muestras de cortes de tejidos o células positivas . En una modalidad preferida de la presente invención, la detección de los productos génicos de PVH y/o pl6INK4a, se lleva a cabo a nivel de polipéptidos . En esta modalidad, los agentes de unión pueden ser, por ejemplo, anticuerpos específicos contra productos génicos de PVH o contra pl6INK a o contra fragmentos de los mismos. En otra modalidad del kit de prueba, la detección de los productos génicos de PVH y/o pl6INK4a, se lleva a cabo a nivel de ácidos nucleicos. En esta modalidad de la presente invención, el reactivo para la detección puede ser, como por ejemplo, una sonda de ácido nucleico o un cebador complementario antiparalelo al producto génico de PVH y/o ácidos nucleicos de pl6INK4a. La presente invención proporciona un método para la discriminación de lesiones anogenitales neoplásicas y preneoplásicas identificables mediante la comprobación de la sobreexpresión de pl6INK4a, de células metaplásicas que expresan de manera detectable pl6INK4a, en el transcurso de pruebas citológicas. El método se basa en la detección de productos génicos de alto riesgo expresados por PVH. Se ha encontrado que los productos génicos de PVH de alto riesgo expresados en altos niveles en las etapas tempranas de neoplasias y preneoplásicas son adecuados para esta discriminación. Esto se debe al hecho de que el porcentaje de células en una muestra biológica en las etapas tempranas de una neoplasia que sobreexpresan pl6INK a, produce un nivel de moléculas pl6INK4a en el cual todavía hay la posibilidad de que dicho nivel fuera producido por células metaplásicas en vez de células neoplásicas. Así pues, el problema por ser resuelto es proporcionar un método para discriminar entre células neoplásicas y metaplásicas, especialmente en las etapas tempranas de neoplasias, en donde los métodos de diagnostico citológico basados en la sobreexpresion de pl6INK4a necesitan una mayor información para la identificación de células metaplásicas. Además, la presente invención proporciona un kit para ejecutar el método de conformidad con la presente invención.

Breve descripción de las figuras Figura 1 Células metaplásicas teñidas por Inmunoquímica con un anticuerpo específico contra pl6INK4a; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; las células claramente reaccionan con los anticuerpos contra pl6INK4a Figura 2 Células metaplásicas teñidas por inmunoquímica con un anticuerpo específica contra E2 de PVH; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; las células no muestran una inmunorreac ividad con los anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína E2 de PVH . Figura 3 Células metaplásicas con tinción inmunoquímica con un anticuerpo específico contra Ll de PVH; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; las células no muestran inmunorreactividad con los anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína Ll de PVH. Figura 4 Células displásicas con tinción inmunoquímica con un anticuerpo específico contra pl61NK4a; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; estas células claramente reaccionan con los anticuerpos contra pl6INK4a. Figura 5 Células displásicas con tinción inmunoquímica con un anticuerpo específico contra E2 de PVH; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; las células muestran una clara inmunorreactividad con los anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína E2 de PVH . Figura 6 Células displásicas con tinción inmunoquímica con un anticuerpo específico contra Ll de PVH; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; las células muestran una clara inmunorreactividad con los anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína Ll de PVH. Figura 7 Células metaplásicas con tinción inmunoquímica con un anticuerpo específico contra pl6INK4a; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 3; las células claramente reaccionan con los anticuerpos contra pl6INK4a. Figura 8 Células metaplásicas con tinción inmunoquímica con un anticuerpo específico contra E7 de PVH; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 3; las células no muestran inmunorreactividad con los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína E7 de PVH. Figura 9 Células displásicas con tinción inmunoquímica con un anticuerpo específico contra pl6IMK4a; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 3; las células claramente reaccionan con los anticuerpos contra pl6INK a. Figura 10 Células displásicas con tinción inmunoquímica con un anticuerpo específico contra E7 de PVH: para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 3; las células claramente reaccionan con los anticuerpos contra la proteína E7 de PVH. Figura 11 Células displásicas con doble tinción inmunoquímica con anticuerpos específicos contra E7 de PVH y anticuerpos específicos contra pl6INK4 ; para los detalles experimentales, véase el Ejemplo 3; las células claramente reaccionan con los anticuerpos tanto dirigidos contra la proteína E7 de PVH como contra pl6INK a Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente con propósitos de ilustración y no tienen la intención de limitar los alcances de la invención aquí descrita.

Ejemplo 1: Detección iiimunoquímica de la expresión de las Proteínas E2, Ll y pl6IN 4a de PVH, en muestras cervicouterinas Frotis cervicouterinos se sometieron a una tinción inmunocitoquímica con el uso de anticuerpos específicos contra pl6INKa y anticuerpos policlonales específicos contra la proteína E2 de PVH. Para rehidratar los frotis fijados por rociado, estos se incubaron en EtOH al 50% recién preparado en un aparato oscilatorio. La película de PEG producida por el procedimiento de fijación, se retiró mediante enjuagues intensivos. Posteriormente, las preparaciones se enjuagaron con agua bidestilada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo con solución reguladora de citratos lOmM (pH 6.0) . Después, los portaobjetos se calentaron en un baño de agua durante 40 minutos a 95°C, se enfriaron hasta la temperatura ambiente durante 20 minutos, se transfirieron a una solución reguladora de lavado (PBS/Tween20 al 0.1%) y finalmente se encerraron con un lápiz marcador. Para la inactivación de la peroxidasa endógena, las muestras se incubaron con H202 al 3% durante 20 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron con PBS/Tween20 al 0.1% durante 5 minutos. El bloqueo de proteínas se llevó a cabo con suero de caballo (Vectastain®-Kit) (diluido 1:50 con PBS/Tween20 al 0.1%). Los frotis se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente y después se enjuagaron cuidadosamente. Después se realizó el bloqueo de moléculas que se unen de manera no específica al reactivo avidina, de la siguiente manera: las muestras se incubaron con solución bloqueadora de avidina (lista para usarse / Vector) durante 15 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron cuidadosamente con una pipeta. Para bloquear las moléculas que se unen de manera no específica al reactivo biotina, los frotis se incubaron con una solución bloqueadora de biotina (lista para usarse / Vector) durante 15 minutos a temperatura ambiente y después se enjuagaron cuidadosamente. Después, sigue la incubación con un anticuerpo primario específico contra pl6INK a o anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína E2 de PVH o anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína Ll de alto riesgo de PVH (PVH16) ; las muestras se incuban durante 60 min a -temperatura ambiente, se lavan con PBS/Tween 20 al 0.1% durante 5 min (2 veces) y después se incuban con un Anticuerpo Secundario biotinado (suero de caballo contra inmunoglobulina de ratón) (Vectastain®-Kit / diluido 1:200 en PBS / Tween 20 al 0.1% + suero de caballo) durante 30 min a temperatura ambiente y se lavan con PBS / Tween 20 al 0.1% durante 5 min (dos veces) . Después se lleva a cabo una incubación con el Complejo AB (Avidina-Biotina-HRP) (Vectastain®-Kit / diluido 1:50 con PBS / Tween 20 al 0.1%) durante 30 min a temperatura ambiente, seguida por lavados con PBS / Tween 20 al 0.1% durante 5 min (2 veces). La detección de la señal se lleva a cabo con el complejo Sustrato-Cromógeno (H202/AEC) , de la siguiente manera: primero las muestras se incuban durante 30 min a temperatura ambiente con el complejo sustrato-cromógeno, la reacción se detiene con agua destilada. Finalmente se lleva a cabo una contratinción con Hematoxilina de Mayers y los portaobjetos se fijan con gliceringelatina . El examen microscópico de los portaobjetos reveló que las células que son inmunorreactivas con pl6INK4a junto con células inmunorreactivas con la proteína E2 de PVH, sólo se pueden encontrar en muestras que microscópicamente se podrían identificar como muestras de lesiones neoplásicas. Las células que se tiñen con la reacción específica contra pl6INK4a, que se originan de metaplasias, no se tiñen con la reacción específica contra la proteína E2 de PVH. La inspección microscópica de los portaobjetos teñidos con Ll de PVH, muestra que las células metaplásicas no son inmunorreactivas con los anticuerpos dirigidos contra la proteína Ll de PVH. Las muestras que contienen células displásicas, en contraste, comprenden células que son inmunorreactivas con la proteína Ll de PVH y aquellas inmunorreactivas con la proteína pl6INK4a. Así pues, en contraste a las displasias, en las metaplasias las células no se pueden teñir con el uso de anticuerpos específicos contra la proteína Ll de PVH.

Los resultados muestran que la tinción con reactivos específicos para las proteínas E2 o Ll de PVH, permiten discriminar las metaplasias que sobreexpresan pl6INK a de las displasias. Ejemplo 2: Detección de células que expresan las proteínas E2 de PVH, 11 de PVH o pl6INK4a, en muestras cervicouterinas por hibridación in situ Los frotis del cuello uterino se pueden analizar de manera semicuantitativa con respecto a la concentración de ARNm perteneciente a pl6INK4 y las proteínas E2 y L2 de PVH, en una reacción de tinción in situ. La reacción de tinción se lleva a cabo de la siguiente manera: para la rehidratación, los frotis fijados por rociado se incuban en EtOH al 50%, en un aparato oscilante. La película de PEG producida por el procedimiento de fijación, se remueve mediante enjuagues intensivos. Después, los frotis se enjuagan con agua bidestilada. Los frotis se incuban con proteinasa (10 µg/mL en PBS) durante 10 min a 37 °C. Después, los portaobjetos se transfieren a una solución reguladora de lavado (PBS / Tween 20 al 0.1%) y finalmente se encierran en círculos con un lápiz marcador. La mezcla de hibridación se prepara mezclando 50 µL de solución reguladora de hibridación lista para usarse (DAKO A/S, Glostrup, Dinamarca) y aproximadamente 5-10 pmol de las sondas. Las sondas son oligonucleótidos marcados con fluoresceína de secuencias complementarias a- los respectivos ARNm. La mezcla de hibridación se calienta a 95°C y después se equilibra a 37°C. Después del procedimiento de ebullición, los frotis se incuban con 50 µ??? de la mezcla de hibridación durante 4 h a 42 °C. Las muestras se lavan con un exceso de solución reguladora de lavado, dos veces en 2xSSC a 37°C durante 15 min y una vez en lxSSC a 37°C durante 15 min. Después, los frotis se enjuagan dos veces a temperatura ambiente con 2xSSC. Luego de este procedimiento de lavado, las disecciones se incuban durante 30 min con solución reguladora de bloqueo ( EN, Blockingpugger) a temperatura ambiente. Posteriormente se incuban durante 1 hora con una dilución 1:100 (en solución reguladora de bloqueo, véase arriba) de suero antifluoresceína-fosfatasa alcalina (DAKO A/S) . Entonces, los frotis se lavan dos veces con lxPBS/Tritón X100 al 0.1% durante 10 min a temperatura ambiente, seguido por un lavado con lxPBS, MgCl2 50 mM (pH 9.2) durante 10 min a temperatura ambiente. Después, la reacción de tinción se lleva a cabo con NBT/BCIP (Sigma) durante 30 min a 2 h a temperatura ambiente. La reacción de tinción se detiene mediante una corta incubación con AEDT 1 mM en PBS . Finalmente, los frotis se sumergen en agua destilada y luego se empapan con Aqua Tex (Merck) . Posteriormente, las disecciones teñidas se pueden analizar microscópicamente.

El análisis microscópico reveló que las metaplasias comprenden células que expresan pl6INK4a, pero no células que expresan ARNm de Ll o E2 de PVH. En las lesiones displásicas cervicouterinas , se pueden encontrar células que expresan pl6INK4a y además células que expresan ARNm de Ll y E2 de PVH. Estos resultados indican que el método de conformidad con la presente invención, se puede utilizar para discriminar metaplasias de lesiones neoplásicas. Ejemplo 3: Detección inmunocitoguímica de la expresión de E7 de PVH y pl6INK a en muestras cervicouterinas Se tiñen inmunocitoquímicamente preparaciones en frotis ThinPrep de células cervicouterinas, con el uso de anticuerpos específicos contra pl6INK4a y anticuerpos monoclonales específicos contra la proteína E7 de PVH. Para la rehidratación, los frotis fijados por rociado se incuban con EtOH al 50% en un aparato oscilante. La película de PEG producida por el procedimiento de fijación, se remueve mediante enjuagues intensivos. Después, los frotis se enjuagan con agua bidestilada. La recuperación del antígeno se lleva a cabo con solución reguladora de citratos 10 mM (pH 6.0). Por eso los portaobjetos se calientan en un baño de agua a 95-98°C durante 40 min, se enfrían hasta la temperatura ambiente durante 20 min, se transfieren a solución reguladora de lavado (Dakocytomation, S3006) y finalmente se encierran en círculos con un lápiz marcador.

Para la inactivación de la peroxidasa endógena, las muestras se incuban con ¾02 al 3% (Dakocytomation; S2023) durante 5 min a temperatura ambiente y después se lavan con solución reguladora de lavado (Dakocytomation, S3006) durante 5 min. Después, se lleva a cabo una incubación con un anticuerpo primario específico contra pl6INK4a o un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína E7 de alto riesgo (PVH16) ; las muestras se incuban durante 30 min a temperatura ambiente, se lavan con solución reguladora de lavado durante 5 min y posteriormente se incuban con el sistema EnVision (Dakocytomation, K4001) , que consiste de suero de cabra contra Inmunoglobulina murina conjugado con un polímero de dextrán y enzimas peroxidasas, durante 30 min a temperatura ambiente y se lava con solución reguladora de lavado durante 5 min (3 veces) . La detección de la señal se lleva a cabo con el complejo sustrato-cromógeno (DAB+, Dakocytomation, K3468) , incubando durante 10 min a temperatura ambiente. La reacción se detiene con agua destilada. Finalmente, se lleva a cabo una contratinción . con Hematoxilina de Mayers y los portaobjetos se fijan con Faramount (Dakocytomation, S3025) . El examen microscópico de los portaobjetos reveló que las células que son inmunorreactivas con pl6INK4a junto con células inmunorreactivas con la proteína E7 de PVH, sólo se pueden encontrar en muestras que microscópicamente se podrían identificar como muestras de lesiones neoplásicas. Las células que se tiñen con la reacción específica contra pl6INK4 , que se originan de metaplasias, no se tiñen con la reacción específica contra la proteína E7 de PVH. Para validar los resultados aquí presentados, se llevó a cabo una doble tinción de especímenes citológicos, con el uso de un anticuerpo contra E7 de PVH marcado con FITC (un anticuerpo como el mencionado anteriormente) en combinación con el anticuerpo contra pl6INKa, tal como se utilizó anteriormente. La tinción se llevó a cabo de la manera anteriormente descrita, adaptada a un procedimiento de doble tinción. Las variaciones necesarias son conocidas para los técnicos en la materia. En los especímenes sometidos a tinción doble, no fue posible encontrar células metaplásicas con tinción doble; en contraste, las células displásicas muestran una tinción doble para pl61NKa y la proteína E7 de PVH. Los resultados muestran que la tinción con reactivos específicos para E7 de PVH, permite discriminar las metaplasias que sobreexpresan pl6INK4a de las displasias. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para discriminar metaplasias que sobreexpresan pi6INK4a de lesiones neoplásicas o preneoplásicas que sobreexpresan pl6INKla, en muestras biológicas, en el transcurso de procedimientos de prueba citológicos, caracterizado porque el método comprende: a) determinar la presencia o ausencia de células que sobreexpresan pi6IHK4a en la muestra biológica; b) determinar la presencia o ausencia de células que expresan cuando menos un producto génico de PVH (Papilomavirus humano) de alto riesgo en la muestra biológica; c) comprobar la presencia simultánea de células que expresan productos génicos de PVH de alto riesgo y células que sobreexpresan pl6INK4a; o la presencia de células que sobreexpresan pi6INK4a solamente; d) la presencia simultánea de células que expresan productos génicos de PVH de alto riesgo y células que sobreexpresan pl6INKa, es indicativa de una lesión neoplásica o preneoplásica . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los productos génicos de PVH de alto riesgo se expresan predominantemente en lesiones tempranas neoplásicas y/o preneoplásicas . 3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque cuando menos uno de los productos génicos de PVH es codificado por el gen E7 de PVH. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando menos uno de los productos génicos de PVH es codificado por los genes E2 y/o E6 de PVH. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cuando menos uno de los productos génicos de PVH es codificado por los genes Ll y/o L2 de PVH. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el producto génico de PVH es un polipéptido o una molécula de ARN. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las lesiones neoplásicas o preneoplásicas son lesiones del tracto anogenital. 8. El método de conformidad co la reivindicación 7, caracterizado porque la lesión del tracto anogenital es una lesión del cuello uterino. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra biológica es una muestra que contiene células de origen anogenital . 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las células son células de origen cervicouterino . 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la muestra biológica es un frotís de Papanicolaou o una preparación citológica del cuello uterino. 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la detección de los productos génicos de PVH y las moléculas pl6INK4a, se lleva a cabo con el uso de cuando menos una sonda específica para las moléculas a detectar. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la sonda tiene una marca detectable. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la marca se selecciona del grupo que consiste de un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente , un compuesto fluorescente, un quelato metálico o una enzima. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque la sonda es una proteína y/o un ácido nucleico. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque cuando menos una sonda es un anticuerpo dirigido contra un producto génico de alto riesgo codificado por PVH o la proteína pl6INK . 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende un procedimiento de tinción inmunocitoquímica . 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque cuando menos una sonda es un ácido nucleico que se hibridiza específicamente con un producto génico de PVH de alto riesgo. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende una reacción de hibridación in si tu. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque comprende una reacción de amplificación de ácido nucleico. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la reacción de amplificación de ácido nucleico es una RCP o RCL. 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque las reacciones de detección que utilizan sondas de ácido nucleico y sondas polipeptídicas, se llevan a cabo simultáneamente. 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque los productos génicos de PVH de alto riesgo, son productos génicos de los subtipos de PVH asociados al cáncer: PVH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 y 58. 2 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se determina la sobreexpresión de pisINKa simultánea a la expresión de cuando menos un producto génico de PVH de alto riesgo, en cuando menos una sola célula. 25. Un kit para llevar a cabo el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque es un kit de diagnóstico o un kit de investigación que comprende: a) sondas para detectar la presencia o ausencia de la sobreexpresión de pi6INK4a en muestras biológicas, b) una o más sondas para detectar la presencia o ausencia de la expresión de uno o más productos génicos de PVH, en muestras biológicas. 26. El kit de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque además comprende: a) una muestra de pi6INK4a para llevar a cabo una reacción de control positivo, b) una o más muestras de productos génicos de PVH, para llevar a cabo reacciones de control positivo.