CN102449479B - 鉴别高度或≥cin2用于人乳头瘤病毒(hpv)与hpv相关癌症的早期及晚期检测、筛检和诊断 - Google Patents

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Abstract

公开了用于诊断人类个体中乳头瘤病毒感染的疾病阶段的方法和试剂盒。该方法包括从所述人类个体中获得样本，所述样本由包含蛋白质的组织样本或包含蛋白质的细胞样本组成；将所述样本和与一或多种HPV重组蛋白专一性结合的一或多种抗体接触；测定所述样本中与所述抗体专一性结合的至少一种蛋白的存在、不存在或量；并基于所述一或多种蛋白质的所述测定的存在、不存在或量，测定所述人类个体中乳头瘤病毒感染的所述疾病阶段。

Description

鉴别高度或≥CIN2用于人乳头瘤病毒(HPV)与HPV相关癌症的早期及晚期检测、筛检和诊断
对相关申请的交叉引用
本申请要求2009年5月07号提交的名称为“有效用于人乳头状瘤病毒(HPV)与HPV相关癌症的早期及晚期检测、筛检及诊断的新型抗体及检测方法”的美国临时专利申请序号61/215,589的权益。
本申请交叉引用美国专利申请序号11/559,366，提交于2006年11月13日，名称为“人乳突病毒(HPV)的检测方法及其应用于子宫颈癌”，美国专利申请序号12/082,740，200年4月14日提交，名称为“检测HPV的蛋白质芯片”，美国专利申请序号61/131,991，2008年6月13日提交，名称为“检测HPV的抗体及实验方法”，以及美国专利申请序号61/192,912，2008年9月22日提交，名称为“有效应用于早期及晚期乳头瘤病毒相关癌症的检测、筛检及诊断的新乳头瘤病毒单克隆抗体”，美国专利申请序号12/456,053，2009年6月10日提交，名称为“新HPV蛋白单克隆抗体”，美国专利申请序号12/456,054，2009年6月10日提交，名称为“原位检测早期及晚期乳头瘤病毒感染”，美国专利申请序号12/456,055，2009年6月10提交，名称为“原位检测早期及晚期乳头瘤病毒感染”，美国专利申请序号12/456,076，2009年6月10提交，名称为“检测早期及晚期乳头瘤病毒感染”，美国专利申请序号61/199,013，2008年11月12日提交，名称为“乳头瘤病毒相关癌症的检测、筛检及诊断”，和美国专利申请序号12/590,747，2009年11月12日提交，名称为“乳头瘤病毒相关癌症的检测、筛检及诊断”。每一上述相关专利申请的内容以它们的整体并入本文。
发明背景
子宫颈癌是在全世界妇女疾病中致死率高达第二位的常见癌症，每年累计约有50万新病例，并造成约25万死亡例。在美国，子宫颈癌的死亡率已大幅下降，这是因为现今成功采用的子宫颈癌筛选方法可检测癌前状态并在演变成癌症之前即被干预和处理。目前子宫颈癌筛选方法的范例系基于帕氏涂片试验(Paptest)，此方法是一种以细胞学为基础的细胞检查，该细胞通过人或机器自子宫颈刮出并于显微镜下检测，以检测代表发育异常细胞生长的变化。此测试明显受限于主观上的判定标准的变异，并且受限于低灵敏度和高假阳性的结果。在子宫颈细胞学的假阴性报告率相差很大，从最低的1.6％至近28％。在美国每年检测出的子宫涂片异常，其中约400万为意义不明的不典型鳞状细胞(ASC-US)，不典型性鳞状上皮细胞无法排除高度上皮发育异常(ASC-H)，低度鳞状上皮内病变(LSIL)，或非典型之腺细胞(AGC)。
基于目前临床治疗的规范，以上所述病例，会以阴道镜组织切片作进一步检测，以测定有临床显著性的高度病变(第二或第三级子宫颈上皮内赘瘤)或在子宫颈切片检测出有子宫颈内组织增生的病例。根据一些报告显示，由细胞学检测出意义不明的不典型鳞状细胞之病例(美国每年高于200万例)，在子宫颈切片检测中仅有5％-17％为第二或第三级子宫颈上皮内赘瘤，而在低度鳞状上皮内病变之病例中(美国每年约160万例)，第二或第三级子宫颈上皮内赘瘤的比例则为25％。此数据显示约300万子宫涂片检测出为意义不明的不典型鳞状细胞或低度鳞状上皮内病变的病例不需要阴道镜组织切片检测。虽然一直以来阴道镜切片检测被视为检测标准，但近来结果分析指出子宫颈切片检测可因取样或误诊而造成33-50％的高度病变病例被遗漏。因而导致细胞学的假阳性结果及切片检测之假阴性结果极难被分辨。因此，目前极需一种检测方法以能分辨高度子宫颈发育异常，来鉴别及分类病患，这些病患可由此干预获得最大利益。
虽然大多数低度子宫颈发育异常(lowgradecervicaldysplasias)会自行萎缩而不演变成子宫颈癌，但发育异常可作为一个迹象，即提高警觉是必要的。CIN1是最常见和最温和形式的子宫颈上皮内瘤，通常在两年内会自行消退。正因如此，LSIL的结果可用简单的“观望和等待”的理念来处理。然而，因有12-16％的机会发展成更严重的发育异常，医生可能需要采取阴道镜组织切片以更积极地追踪结果。如果发育异常增进，则可能需要治疗。因此，需要一种方法来原位检测乳突病毒(HPV)癌蛋白。这特别有助于ASC-US、LSIL或CIN1患者来检测高度发育异常细胞，并鉴别出那些潜在CIN2或上述物质，其可立即受益于治疗，并避免“等待和观望”伴随的焦虑。
特定上皮细胞感染以人乳突病毒(HPV)及由此诱导的上皮细胞增生，在子宫颈癌发生中扮演着重要角色。发现约99％例确诊子宫颈癌伴随HPV感染，且活检证实为鳞状上皮内病变(SIL)或子宫颈上皮内赘瘤(CIN)。HPV感染主要经由性接触传播，尤其在年轻妇女为最高，目前全世界约有2,000万性活跃男女已被感染。约1％的人口有生殖器疣，且4％的妇女有子宫颈癌前病变，如低度鳞状细胞上皮病变(LSIL)、高度鳞状细胞上皮病变(HSIL)或重要性不确定的非典型性鳞状细胞(ASC-US)。
这些病变，优先是在年龄介于35-40岁女性中观察到的，皆伴随发展成侵略性子宫颈癌的高风险。一般认为，持续HPV感染是演变成上皮癌前病变之必备条件。然而，在妇女感染高危险型HPV病毒中，LSIL并非总是演变成HSIL。事实上，多数LSIL人类病患会有缓解现象，尽管某些进展为HSIL。虽然99.7％的子宫颈癌为HPV阳性，但病毒基因组需整合入宿主基因组，以促进必要的基因表达从而发展为HSIL或癌。事实上，每10个有持续HPV感染的妇女中，只有一个发展为高度CIN病变，如子宫颈上皮内赘瘤(CIN)2级和3级(分为CIN2和CIN3)，并且这些上皮病变案例的部分最终可发展为子宫颈癌。
由HPV感染引起的疾病阶段包括早期HPV感染、晚期HPV感染、重要性不确定的非典型性鳞状细胞(ASC-US)、非典型鳞状细胞、不能排除HSIL(ASC-H)、非典型腺细胞(AGC)、低度鳞状上皮细胞病变(LSIL)、高度鳞状上皮细胞病变(HSIL)、子宫颈上皮内赘生CIN1、CIN2、CIN3(分别代表轻度、中度或重度细胞发育异常)、侵入性子宫颈癌、腺癌、或鳞状细胞癌(SCC)。
在过去，子宫颈癌筛检基于经子宫颈涂片而根据传统的细胞学检查，疑似的病例则接着进行阴道镜镜检和组织切片。使用细胞学筛检的方式确实使子宫颈癌的死亡率显著下降。但是，由于测试标准具有主观性，而子宫颈涂片检查的缺点包括获取样本困难、观察者自身和观察者彼此之间对于观察结果的一致性太差、高比率的假阴性(高达20％)和假阳性、需要专业的实验室及高度训练有素的人员，以及对HPV感染者有很大比例无法确诊。目前需要更具再现性的实验方法以改善目前的检查方法，并避免不必要的医疗行为介入和造成受影响妇女的心理困扰。现行子宫颈细胞学筛检方式的灵敏性为30％至87％，而特异度介于86％至100％。
通过核酸方法的HPV感染检测分析虽已被研发，但用以预测疾病风险并不理想，系因其成本高，检测作业程序，以及对场所、设备及高度设训练人员的要求，和对CIN的低阳性预测值。此外，当前的DNA分析方法并不能自HSIL中区分LSIL诊断，也不能自非转化潜在或缓解病毒感染来区分CIN病变。E6/E7mRNA的检测分析显示与HPVDNA检测分析的灵敏度相当，且具有较高的阳性预测值。然而，目前仅有有限的显示原位E6/E7癌蛋白直接检测之的报告。目前需要的是一种低成本、简便、灵敏和特异性检测，其可在临床实验室或医师诊所依常规实践进行并能够检测早期上皮病变、自HSIL区分LSIL、或预测进展至子宫颈癌的风险。
用于生产HPV单克隆抗体的已知方案通常不适合于生产抗-HPV单克隆抗体，并且不能用于免疫组织化学诊断测试以进行普通人群的病理筛检。这是因为以此种方案产生的抗体并不需要与感染的人细胞中自然发生的HPV蛋白进行反应。此外，由先前技术抗体识别的表位并不必需是那些抵抗标准程序——包含取样、固定和储存临床样本——的表位。其他用ELISA(酶联免疫吸附实验)检测人体中HPV相关抗体或病毒蛋白存在的尝试一般导致检测灵敏度极低，因此不能发展成市售可得的诊断试剂。大部分此类ELISA分析法针对单一病毒蛋白或短肽片段，因此不能与人体的抗体有良好反应或强烈并专一地结合。此类分析的特异性和灵敏度是如此之低，以至于即使使用患者确诊有HPV伴随的侵入性子宫颈癌的患者的样本，只有53％患者样本发现对HPV感染呈阳性。由于测试人群来自一般筛检，有或没有低度或癌前病变，该分析法的灵敏度将会太低而无法于临床实践。因此，目前并无成功的ELISA分析法可作为临床样本的诊断工具。
在100种以上的HPV感染中，只有约15种被认为具有发展为CIN或子宫颈癌的高风险。此外，约70％子宫颈癌病例和50％的CIN2和CIN3病例是由于感染高风险HPV类型-16和HPV类型-18。然而，一些进行性子宫颈癌病例与低风险HPV类型感染有关，而感染某些HPV类型并不会进展为子宫颈癌。因此，确定出具有特定癌蛋白表达的HPV感染变得非常重要，而不是仅仅确定出高风险型的HPV感染。因此，极需检测作为子宫颈癌生物标记(biomarker)HPV癌蛋白，以更好地识别发展成HSIL、癌前病变或子宫颈癌的风险。
需要研发适当的分析方法，如HPV免疫分析法，用以检测此种HPV癌蛋白或子宫颈癌的生物标记。于CIN2和CIN3病变中E6/E7癌蛋白的存在可提供证据来显示高风险的进展。然而，可用于原位检测E6/E7致癌蛋白的抗体有限。因此，极需研发抗体及免疫分析法以检测作为子宫颈癌生物标记的HPV癌蛋白，以确定HSIL或≥CIN2(CIN2及以上)，或其癌前病变，以用于筛选侵入性子宫颈癌和/或恶性转形为子宫颈癌及其它HPV相关癌症的风险。
发明概述
许多实施方式提供许多免疫分析方法用于利用各式不同的、抗重组HPV蛋白的单克隆抗体和抗细胞蛋白的抗体来原位(insitu)检测HPV蛋白及细胞蛋白。许多实施方式也提供HPV免疫细胞化学(ICC)检测法、HPV免疫组织化学(ICC)检测法，用以检测受HPV感染引起的HPV蛋白及细胞蛋白在子宫颈细胞或子宫颈组织及其他HPV相关癌症——包括但不限于膀胱癌、头颈部癌、肺癌等等——中的存在。
在某些实施方式中，一种筛检人类高度发育异常细胞的方法由各种免疫组织化学检测法进行，以从一种或多种乳头瘤病毒类型原位检测一种或多种乳头瘤病毒蛋白，和从一种或多种乳头瘤病毒类型原位检测受HPV感染所影响的一种或多种细胞蛋白，这些蛋白存在于载玻片上的生物样本中，此生物样本含有组织，包括但不限于子宫颈癌、膀胱癌、肺癌、头颈部癌等等。
在某些实施方式中，一种筛检人类高度发育异常细胞的方法由免疫细胞化学检测法进行，以从一种或多种乳头瘤病毒类型原位检测一种或多种乳头瘤病毒蛋白，和从一种或多种乳头瘤病毒类型原位检测受HPV感染所影响的一种或多种细胞蛋白，这些蛋白存在于载玻片上的生物样本中，此生物样本含有人类细胞薄层，利用一种或多种抗体对此人类细胞薄层进行染色。
在某些实施方式中，提供了HPVE6E7检测法。
在某些实施方式中，HPVE6E7检测法与帕氏涂片试验(Papsmeartest)同时使用。
在某些实施方式中，可对抗一种或多种纯化的重组乳头状瘤病毒蛋白产生一种或多种抗体，其中至少有一种抗体能够辨识乳头状瘤病毒癌蛋白。在某些实施方式中，一种或多种抗体将被标上试剂(agent)，而从人类受试者的生物样本中取得的一种或多种人类细胞会制备成液体基溶液，以便一种或多种抗体与存在于生物样品的一种或多种人类细胞中的一种或多种乳头状瘤病毒类型的一种或多种乳头状瘤病毒蛋白的结合，能够由与标记的一种或多种抗体反应的试剂的存在而被检测到。在一些实施方式中，这些试剂包括比色试剂、荧光发色团、以及其他在流式细胞仪分析方法中用于随后分离及鉴别一种或多种人类细胞的试剂。
在某些实施方式中，提供了进行免疫组织化学检测法的试剂盒(kit)。此试剂盒可包括前抗体(pre-antibody)阻断液、后抗体(post-antibody)阻断液、作为一抗的抗HPV抗体、与HRP或生物素共轭结合的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白、或作为二抗的其他剂、以及含有用作待被检测的二抗底物的合适试剂的溶液。
在某些实施方式中，提供了进行免疫组织化学检测法的试剂盒(kit)。此试剂盒可包括前抗体阻断液、后抗体阻断液、作为一抗的抗HPV抗体、与HRP或生物素共轭结合的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白、或作为二抗的其他试剂、以及含有用作待被检测的二抗底物的合适试剂的溶液。
一个实施方式提供了在HPV感染的人类受试者当中测定乳头状瘤病毒感染的疾病阶段的方法，此方法包括：从本文所述的受试者取得样本，本文所述的样本由包括蛋白的组织样本及包括蛋白的细胞样本组成；将此样本与专一性结合一种或多种重组HPV蛋白的一种或多种抗体接触(contacting)，此多种重组HPV蛋白选自重组乳头状瘤病毒E6基因产物、重组乳头状瘤病毒E7基因产物、重组乳头状瘤病毒L1基因产物、重组乳头状瘤病毒截短型L1基因产物以及重组乳头状瘤病毒L2基因产物，其中所述的接触发生在有助于多种抗体作专一性结合的条件之下；测定所述样本中第一种一或多种蛋白质的存在、不存在或含量，所述第一种一或多种蛋白质与所述第一种一或多种抗体的一或多种专一性结合，这至少部分地基于所述第一种一或多种抗体的一或多种与所述接触样本的专一性结合的测量；以及测定所述人类个体中所述乳头瘤病毒感染的疾病阶段，这基于所述样本中所述第一种一或多种蛋白质的所述存在、不存在或含量的测定。
在一实施方式中，此第一种一或多种蛋白包括选自乳头瘤病毒E6基因产物、乳头瘤病毒E7基因产物、乳头瘤病毒L1基因产物、乳头瘤病毒截短型L1基因产物和乳头瘤病毒L2基因产物的一种或多种蛋白。
在一实施方式中，此第一种一或多种蛋白包括选自乳头瘤病毒E6基因产物和乳头瘤病毒E7基因产物的一种或多种蛋白。
在一个实施方式中，该方法进一步地包括本文所述样本与第二一种或多种抗体接触；测定所述第二种一或多种蛋白质在所述样本中的存在、不存在或含量，所述第二种一或多种蛋白质选自p16INK4a、pRB、p53、E2F、E2F活化细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖型激酶、CDK4、CDK6、Ki-67(MIB-1)、MYC蛋白、细胞周期蛋白-A、细胞周期蛋白-B、细胞周期蛋白-E、端粒酶-TERC、MCM2、TOP2A、热休克蛋白40(HSP40)、热休克蛋白60(HSP60)热休克蛋白70(HSP70)、CA9/MN、层黏蛋白5、brn-3a、CDKN2、拓朴异构酶2A、微体维持蛋白-2、微体维持蛋白-4、微体维持蛋白-5、存活蛋白、VEGF、p27(kip1)和p21(waf)，这基于所述第二多种抗体的一或多种与所述接触样本的专一性结合的测量；以及筛选乳头瘤病毒感染的所述人类个体进一步基于所述第二种一或多种蛋白质存在、不存在或的含量测定。
在一实施方式中，一种或多种蛋白包括p16INK4a。
在一实施方式中，样本是原位的。
在实施方式中，样本包括组织样本，所述的测定包括免疫组织化学检测法。
在一实施方式中，样本包括细胞样本，所述的测定包括免疫细胞化学检测法。
在一实施方式中，所述的测定所述疾病阶段包括测定定HSIL的存在与否。
在一实施方式中，所述的测定所述疾病阶段包括测定晚期HPV感染的存在或不存在。
在一实施方式中，所述的测定所述疾病阶段包括测定高度发育异常的存在或不存在。
在一实施方式中，疾病阶段是≥CIN2或＜CIN2。
在一实施方式中，疾病阶段是≥CIN2是CIN2/3。
在一实施方式中，疾病阶段是HSIL。
在一实施方式中，疾病阶段是晚期HPV感染。
在一实施方式中，疾病阶段是高度发育异常。
在一实施方式中，重组HPV蛋白通过包含以下步骤的程序而制备：提供编码融合蛋白的重组构建物，所述融合蛋白包含所述乳头瘤病毒基因产物和选自HIS标记、GST标记和MBP标记的亲和性标记；在宿主细胞中表达所述重组构建物；在所述亲和性树脂与亲和性标记专一性结合条件下，用亲和性树脂温育由所述宿主细胞制备的提取物；以及自所述亲和性树脂中洗脱出所述的重组HPV蛋白，其中宿主细胞中所述重组构建物的表达导致某种水平的蛋白质表达，以便所述洗脱产生含有浓度从1mg/L至10mg/L的所述重组HPV蛋白的组合物，其中所述重组HPV蛋白在组合物中以经SDSPAGE测定纯度至少为90％存在，其中所述重组HPV蛋白在组合物中以经尺寸排阻色谱法测定为基本可溶的单体形式而存在。
在一实施方式中，乳头瘤病毒包括选自HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-54、HPV-55、HPV-56、HPV-58、HPV-59和HPV-66所的一种或多种病毒。
在一实施方式中，乳头瘤病毒包括选自HPV-16和HPV-18的一种或多种病毒。
在一实施方式中，重组乳头瘤病毒HPVE6基因产物是重组HPV-16E6基因产物或重组HPB-18E6基因产物。
在一实施方式中，重组乳头瘤病毒HPVE7基因产物是指重组HPV-16E7基因产物或是重组HPB-18E7基因产物。
在一实施方式中，细胞样本包括正常细胞、ASC-US细胞、ASC-H细胞、LSIL细胞、HSIL细胞、ADC细胞或SCC细胞。
在一实施方式中，组织样本是良性的、CIN1、CIN2、CIN3、SCC或ADC。
在一实施方式中，此方法进一步包括从人类受试者取得的第二样本，此样本包括细胞样本及；对所述样本进行细胞学帕氏涂片检查。
在一实施方式中，此方法进一步由所述人类个体获得第二样本，所述样本包含核酸；以及对所述样本进行人乳突病毒的核酸杂交试验。
附图的简要说明
以这样的方式说明，可详细了解上述本发明的特点，对本发明的更具体的说明，简要总结于此，可以参照实施方式，其中的一些在附图中说明。必须注明的是，附图说明的一些实施方式只是典型实施方式，因此不被视为其范围的限制，可为有意承认其他等同有效的实施方式。
图1A显示，以确诊为CIN2的临床样本，在液体基溶液中使用抗HPVE7小鼠单克隆抗体进行免疫细胞化学(ICC)染色的结果。图1B显示，以另一个确诊为CIN2的临床另一样本，在液体基溶液中使用抗HPVE6小鼠单克隆抗体进行免疫细胞化学(ICC)染色的结果。
图2显示，以确诊为CIN3的临床样本，在液体基溶液中使用抗HPVE6小鼠单克隆抗体进行免疫细胞化学(ICC)染色的结果。
图3A-3D为具代表性的图像，来自以另一个确诊为CIN3的临床样本，在另一个液体基溶液中，利用图2所示相同的抗HPVE6小鼠单克隆抗体进行免疫细胞化学(ICC)染色的结果。
图4A显示，用图3A-3D中所示的相同CIN3样本使用抗HPVE7小鼠单克隆抗体进行免疫细胞化学(ICC)染色的结果。图4B显示另张图像，为使用相同的抗HPVE7小鼠单克隆抗体进行的图4A所示相同的免疫细胞化学(ICC)染色的结果。
图5显示，以图3A-3D中所示的相同CIN3样本，使用抗HPVp16小鼠单克隆抗体进行免疫细胞化学(ICC)染色的结果。
图6A显示于液体基溶液中被诊断为鳞状细胞癌(SCC)的临床样本ICC染色结果，使用抗-HPVE6小鼠单克隆抗体。图6B显示与图6A相同的SCC样本的ICC染色结果，使用抗-HPVE7小鼠单克隆抗体。图6C显示与图6A相同的SCC样本的ICC染色结果，使用抗-p16小鼠单克隆抗体。
图7A显示于液体基溶液中被诊断为正常的临床样本ICC染色结果，使用抗-HPVE6小鼠单克隆抗体。图7B显示与图7A所示相同的临床样本的ICC染色结果，使用抗-HPVE7小鼠单克隆抗体。
图8A-8B：使用抗-E6抗体对子宫颈癌组织和其邻近正常组织的IHC图像。图8C-8D：使用抗-E7抗体对子宫颈癌和其邻近正常组织之IHC图像。
图9A-9C：子宫颈癌样本抗-E6抗体的IHC图像：阳性10×(左)、阳性20×(中)、阴性20×(右)。图9D-9F：子宫颈癌样本抗-E7抗体的IHC图像：阳性10×(左)、阳性20×(中)、阳性40×(右)。图9G-9I：子宫颈癌样本p16INK4a抗体的IHC图像：阳性10×(左)、阳性20×(中)、阴性20×(右)。
详述描述
各种实施方式，提供各式免疫试验和抗作为生物标记的HPV致癌蛋白的单克隆抗体，以便高危险和低危险HPV病毒型感染引起的发育异常细胞的可被一或多种抗体检测到。各种实施方式提供HPV免疫组织化学(IHC)试验和HPV免疫细胞化学(ICC)试验，检测HPV致癌蛋白的存在，用以原位辨识组织或子宫颈细胞中来自高度或癌前病变的高度发育异常细胞。各种实施方式也提供方法，使用组合的HPV病毒标记和细胞标记进行IHC或ICC试验，以相对于使用单一HPV病毒标记或单一细胞标记进行的IHC或ICC试验，获得较高之灵敏性，原位检测高度发育异常细胞。
在一些实施方式中，筛选人体中乳头瘤病毒感染的方法，在含有人类细胞薄层的玻片上进行免疫细胞化学试验，以原位检测玻片上的生物性样本中存在的来自一或多种乳头瘤病毒型的一或多种乳头瘤病毒蛋白。该薄层为子宫颈细胞的单层。
为了对人类细胞薄层进行染色，使用一或多种针对一或多种纯化的重组乳头瘤病毒蛋白产生的抗体，，或针对一或多种受HPV感染影响的细胞蛋白产生的抗体，至少一种抗体能够辨识乳头瘤病毒致癌蛋白。乳头瘤病毒致癌蛋白包括但不限于HPV-16E6蛋白、HPV-16E7蛋白、HPV-18E6蛋白、HPV-18E7蛋白，以及其组合。细胞标记物包括但不限于p16INK4a、pRB、p53、E2F、E2F活化细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖型激酶、CDK4、CDK6、Ki-67(MIB-1)、MYC蛋白、细胞周期蛋白-A、细胞周期蛋白-B、细胞周期蛋白-E、端粒酶-TERC、MCM2、TOP2A、热休克蛋白40(HSP40)、热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白70(HSP70)、CA9/MN、层黏蛋白5、brn-3a、CDKN2、拓朴异构酶2A、微体维持蛋白-2、微体维持蛋白-4、微体维持蛋白-5、存活蛋白、VEGF、p27(kip1)和p21(waf)。
在某些实施方式中，一或多种免疫组织化学试验在一含有临床组织样本切片的玻片上进行以染色人类细胞，使用一或多种针对一或多种纯化的重组乳头瘤病毒蛋白产生的一或多种抗体，可，或针对一或多种受HPV感染所影响的细胞蛋白产生的一或多种抗体，至少一种抗体能够辨识乳头瘤病毒致癌蛋白，用以原位检测玻片上临床组织样本切片中存在的来自一或多种乳头瘤病毒型的一或多种蛋白质。乳头瘤病毒致癌蛋白包括但不限于HPV-16E6蛋白、HPV-16E7蛋白、HPV-18E6蛋白、HPV-18E7蛋白以及其结合。细胞标记物包括但不限于p16INK4a、pRB、p53、E2F、E2F活化细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖型激酶、CDK4、CDK6、Ki-67(MIB-1)、MYC蛋白、细胞周期蛋白-A、细胞周期蛋白-B、细胞周期蛋白-E、端粒酶-TERC、MCM2、TOP2A、热休克蛋白40(HSP40)、热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白70(HSP70)、CA9/MN、层黏蛋白5、brn-3a、CDKN2、拓朴异构酶2A、微体维持蛋白-2、微体维持蛋白-4、微体维持蛋白-5、存活蛋白、VEGF、p27(kip1)和p21(waf)。
在某些实施方式中，对临床样本也进行细胞学帕帕尼科拉乌氏(帕氏)涂片试验，将其细胞学帕帕尼科拉乌氏涂片试验结果与一或多种免疫组织化学试验进行比较。对临床样本也进行核酸杂交试验，以检测来自人体临床样本的乳头瘤病毒基因组的存在。
各种实施方式一般涉及多种方法、检测试验、试剂盒、多克隆和单克隆抗体、多肽、重组蛋白和核酸，有用于检测HPV感染，包含一般性HPV感染和不同HPV基因型的感染、高风险HPVs和低风险HPVs。提供各种新颖的单克隆抗HPV蛋白抗体，可用作为生物标记，和作为用于检测HPV病毒蛋白、HPV致癌蛋白、子宫颈癌早期筛选和诊断疾病等级≥CIN2的有用工具。本文描述的工具也可应用于HPV感染的早期临床筛检，以及子宫颈癌和其他HPV相关癌症的一般性诊断。
在某些实施方式中，一或多种纯化的重组乳头瘤病毒蛋白包括乳头瘤病毒E6蛋白、乳头瘤病毒E7蛋白、乳头瘤病毒L1蛋白以及其组合。重组乳头瘤蛋白包括但不限于HPV-16E6重组蛋白、HPV-16E7重组蛋白、HPV-18E6重组蛋白、HPV-18E7重组蛋白、HPV-16L1重组蛋白、HPV-18L1重组蛋白以及其组合。
一些实施方式提供各种抗HPV病毒蛋白的单克隆抗体，以便受高危险和低危险HPV病毒型的感染可通过单一单克隆抗体被检测到。一些实施方式还提供HPV非-病毒型专一性单克隆抗体，用以检测一或多种HPV病毒型。该一或多种乳头瘤病毒类型包括高危险HPV型、低危险HPV型、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-59和HPV-68、HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-53、HPV-54、HPV-55和HPV-56以及其组合。
一些实施方式中所使用的各种术语的定义：
NILM：恶性上皮内病变阴性。当没有瘤形成的细胞证据时使用NILM；这可能包括组织和/或其他非肿瘤性的发现，如反应性/修复性的改变。
ASC-US：重要性不明的非典型鳞状细胞。细胞通常为中间型大小或表面的鳞状细胞并具有核变化，这是一种征兆但不诊断为LSIL或SIL，除非另指明。
ASC-H：无法排除HSIL的非典型鳞状细胞。细胞通常为化生细胞的大小，可能单独出现或形成团簇，它们是一种征兆但不诊断为HSIL。
LSIL：低度鳞状内皮细胞病变，包含：HPV细胞病变效应/中度发育异常/CIN1。
HSIL：高度鳞状细胞上皮内病变，包含：中度发育异常/CIN2和严重发育异常/CIS/CIN3，以及有可疑侵袭性特征的HSIL。
鳞状细胞癌(SCC)：子宫颈的癌症，局部侵袭入邻近组织、血管、淋巴管和淋巴结。在其晚期阶段，可能难以治疗或可能是致命的。根据阶段或侵袭性程度，子宫颈侵袭性癌症可以利用局部切除术、子宫切除术、放射性子宫切除术、放射疗法和化学疗法加以治疗。
腺癌：虽然多数的子宫颈癌来自组成外部皮肤的鳞状细胞，仍有一偶发性的癌症来自黏膜产生性细胞，其位于内子宫颈道延伸至子宫处。此腺质型被称之为“腺癌”，有别于“鳞状细胞癌”。腺癌难以被检测。不同于鳞状细胞癌，当腺癌前趋物存在时，难以在帕氏涂片中被辨认出。与腺癌不一致，鳞状细胞发育异常缓慢发展成子宫颈鳞状细胞癌。
在美国，多数的帕氏涂片结果是正常的，然而，每年约有4-5百万的异常帕氏涂片检查结果被发现。多数异常的结果是轻微的异常(ASC-US，典型地，帕氏检查结果的2-5％)或LSIL(占结果的约2％)，表示遭受HPV感染。虽然大多数的低级子宫颈发育异常会自动消退且从未导致子宫颈癌，但发育异常可作为需要提高警觉的征兆。CIN1是最为普遍且最为良性的子宫颈上皮内赘瘤，且通常在两年内会自动消失。正因为如此，LSIL结果可利用简单的“观察与等待”理念加以管理。然而，因为有12-16％的机率会发展成更严重的发育异常，医师可能希望通过利用组织切片进行阴道镜检查来更积极的追踪结果。若发育异常恶化，治疗可能是必要的。因此，提供HPVE6E7ICC试验与帕氏涂片试验来原位检测HPV致癌蛋白是有效的，尤其有助于ASC-US或LSIL或CIN1病患检测高度发育异常细胞，以及识别潜在的CIN2或可受益于医疗介入的上述那些，并避免“等待和观察”所产生的焦虑感。
高度鳞状上皮内细胞病变或HSIL或HGSIL表示中度或严重的子宫颈上皮内赘瘤或原位肿瘤。通常以帕氏涂片试验来进行诊断。在某些病例中，若无适当追踪，这些病变会导致侵袭性子宫颈癌。HGSIL并不意味着癌症的存在。所有具HGSIL结果的妇女中，2％或更少在当时具有侵袭性子宫颈癌，然而，在未治疗下，约有20％会发展成具有侵袭性的子宫颈癌。为了解决此问题，HGSIL通常利用组织切片对样本进行立即的阴道镜检查，或移除发育异常的组织。该组织送至病理学测试以进行组织学分类，这比帕氏涂片结果更具有测定性。HGSIL通常与CIN2或CIN3的组织学分类相关。因此，提供HPVE6E7IHC试验配合HE(苏木紫-伊红染色法)，或HPVE6E7IHC试验配合帕氏涂片试验以原位检测HPVE6E7致癌蛋白是有帮助的，尤其有助于识别CIN2/CIN3病患。
在某些实施方式中，一或多种抗体与一或多种来自于生物性样本中的一或多种乳头瘤病毒型的蛋白质的结合以显微镜进行检测，检测与标记的一或多种抗体反应的试剂的存在，该试剂包含比色试剂、荧光显色试剂以及其组合。生物性样本包括子宫颈细胞、子宫颈组织、子宫颈刮拭、体液、血清、血液、肿瘤、细胞培养物、组织切片，以及其组合。生物性样本可获得自帕氏涂片试验结果异常的转诊人群，或子宫颈癌常规筛检的普通群体。
说明性的实施例1。
某些实施方式针对免疫学试验，包含检测脱落的子宫颈细胞中的HPV蛋白和细胞蛋白。作为例子，ICC试验的结果显示，使用小鼠单克隆抗-HPVE6或HPVE7抗体，可原位检测固定于玻片上单一细胞中的HPVE6和HPVE7蛋白。HPVE6或HPVE7致癌蛋白的原位存在，可被检测自不同液体溶液中不同阶段的子宫颈刮拭样本。相同的子宫颈刮拭样本也进行标准子宫颈染色，用以比较ICC染色结果与帕氏涂片结果。
例如，HPVE6蛋白可分别在子宫颈刮拭正常、ASC-US、ASC-H、CIN1、CIN2/3样本中被检测到，且具有增加的阳性率。样本依帕氏涂片被诊断为HSIL(CIN2/3)约有92％的阳性率，仅有15％的样本依帕氏涂片被诊断为正常者，使用相同的抗-HPVE6抗体通过ICC试验呈阳性染色。对于ASC-US或ASC-H样本，藉由使用于LSIL、HSIL样本中相同的抗-HPVE6抗体，约有33％-38％的这些样本呈阳性染色，表示这些ASC-US或ASC-H样本中，致癌基因蛋白的表达可能为潜在的≥CIN2(CIN2及其以上)，且须要对进一步的癌症进展进行追踪。依帕氏涂片被诊断为ASC-US，且ICC染色(使用抗-HPVE6抗体)阴性的样本，可能发展成恶病变之风险较低。如数据所示，ICC染色方法使用某些实施方式描述的抗-HPVE6抗体，对≥CIN2提供了ICC试验灵敏性93％、精确度74％。对相同样本使用抗-HPVE7抗体，也发现相似的ICC结果。这些数据显示，某些实施方式所描述的E6或E7抗体和E6E7ICC试验，可作为有用的生物标记来检测HPV致癌蛋白，用于1)作为已分类的子宫颈异常病患的辅助试验，以及2)自普通群体常规子宫颈测试筛选子宫颈癌的联合试验。
在某些实施方式中，提供用来进行免疫细胞学试验的试剂盒。该试剂盒可包含前-抗体阻断溶液、后-抗体阻断溶液、抗-HPV抗体作为一级抗体、结合有HRP或生物素的抗-小鼠或抗-兔免疫球蛋白、作为二级抗体的其他试剂，以及含有作为待检测二级抗体的底物的适当试剂的溶液。
在某些实施方式中，临床样本的核酸杂交试验可检测来自人体的临床样本中乳头瘤病毒基因组的存在。该核酸杂交试验包括聚合酶连锁反应、核酸杂交试验、DNA芯片试验、放射性核酸杂交试验和检测试验，以及非-放射性核酸杂交和检测试验。
此外，帕氏涂片正常样本也使用抗-HPV抗体进行HPVE6或E7ICC测试，并发现染色呈阴性(44个样本中有44个)。这些数据表示，某些实施方式描述的ICC染色试验非常专一。与相同样本的HPVDNA测试结果进行比较，16％(37个样本中有7个)的帕氏涂片正常样本在HPVDNA测试中呈阳性。本研究使用的高度HPVDNA测试为HC2，是FDA认可的HPVDNA测试。对于那些HPVDNA阳性但为帕氏涂片正常且HPVICC阴性之样本，可能为HPVDNA试验的假阳性，或为HPVDNA阳性但无可检测到的HPV致癌基因蛋白表达。因此，相较于HPVDNA测试，本专利描述的HPVICC试验对于子宫颈癌的筛选提供了较好的临床相关性。
说明性的实施例2。
某些实施方式涉及免疫试验，包含检测子宫颈癌中的HPV致癌蛋白和细胞蛋白。HPVE6和E7致癌基因蛋白表达于子宫颈癌的肿瘤细胞中，藉由使用专一性抗-E6和抗-E7抗体进行IHC试验，在大多数的样本中可被检测到。这些结果巩固了病原学和HPV致癌蛋白分子机制在多数的子宫颈癌病例中的角色。研究结果进一步显示，丧失调节的病毒E6和E7致癌蛋白，各别使得p53和pRB蛋白产生功能性的失活，导致p16INK4a过度表达。
如数据所示，使用抗-E6抗体进行HPVIHC试验，灵敏性约为92.1％(203个子宫颈癌组织中有187个)，精确度为100％(3个正常子宫颈组织中0个阳性)。在16个IHC阴性样本中，15个样本使用抗-p16抗体IHC呈阳性。结合E6和p16IHC试验，提供了99.5％的试验灵敏性(203个E6或p16IHC阳性样本中有202个)。
使用抗-p16抗体的HPVIHC试验灵敏性约为91.3％(208个样本中有190个)。在18个IHCp16阴性样本中，17个样本使用抗-E6抗体进行IHC呈阳性。结合p16和E6IHC试验，提供了99.5％的试验灵敏性(203个p16或E6IHC阳性样本中有202个)。
使用抗-E7抗体的HPVIHC试验灵敏性为约76.2％(202个样本中有154个)。在48个IHCE7阴性样本中，28个样本使用E6和p16皆呈阳性，5个样本为E6阳性和p16阴性，14个样本为E6阴性和p16阳性，仅有一个样本在E6和E7和p16中都呈阴性。结合E6、E7和p16IHC试验，提供了99.5％的试验灵敏性(202个E6、E7或p16IHC阳性样本中有201个)。
子宫颈癌样本中所显示的HPVE6/E7致癌蛋白和p16细胞蛋白表达量之差异，可能是个体病例的癌症发展涉及了多种不同路径。数据显示，为了可检测到99.5％(接近100％)的子宫颈癌，多重生物标记(也即，结合E6和p16IHC试验)是必要的。
HPV致癌蛋白和细胞蛋白在癌症形成上都扮演了重要角色，作为生物标记用以诊断HPV相关性癌症。更多的不同HPV相关性癌症生物标记的研究，将有助于提供个人化的医疗。
因此，某些实施方式提供单克隆抗体，其能够辨识来自两种不同HPV病毒型——HPV16和HPV18——的E6蛋白上的表位，都可通过用纯化的HPV16E6重组蛋白和纯化的HPV18E6重组蛋白筛选抗体产生性杂交合瘤细胞。某些实施方式提供单克隆抗体，其能够辨识HPV16E7和HPV18E7蛋白上的一般性表位。作为一例子，该单克隆抗体被用来测试各种等级上皮细胞病变(CIN2，CIN3，LSIL，HSIL，ASC-U)和不同子宫颈癌、鳞状细胞癌(SCC，一种常见的癌症)以及腺癌(ADC，一种腺体癌症)的各种生物性样本、细胞系和/或临床样本。
在某些实施方式中，用以筛选人体中乳头瘤病毒的感染方法包括：获得来自人体的临床样本；和利用多种HPV重组蛋白以及对HPV致癌蛋白具有专一性的实验室生产抗体，对获自人体的临床样本执行一或多项免疫学试验，以检测和筛选人类对象HPV蛋白和HPV抗体存在中的HPV感染的存在。在某些实施方式中，人类对象中的HPV蛋白使用针对HPV重组蛋白产生的抗体进行检测，包括但不限于各种抗各种HPV早期和晚期蛋白的多克隆和单克隆抗体。
示范性E6或E7早期致癌基因的克隆在本申请中被描述。包含HPV-16E6、E7或L1基因的氨基酸密码区的DNA片段通过聚合酶链式反应(PCR)而获得。将该DNA片段亚克隆到组氨酸标记物表达载体上，以产生用来表达E6和E7重组蛋白的质粒DNA。含有组氨酸标记物(例如His6、His8等)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合、麦芽糖结合蛋白(MBP)以及其他的其他种类的表达载体也可被使用。此外，该DNA片段可被亚克隆到其他表达系统，例如杆状病毒(bacilobirus)、酵母菌等，以表达来自不同HPV病毒型和病毒株的E6或E7重组蛋白。例如，由杆状病毒中表达的HPV16所获得的L1重组蛋白被获得并命名为HPV-16-L1-baculo。
以IPTG诱导E6或E7重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。在37℃下诱导蛋白质表达两小时后，以供货商(分别为Amersham和NewEnglandBiolabs)所建议的标准步骤来获得E6或E7重组蛋白，并将其纯化使最后浓度为约1mg/L。发现较长的诱导时间和再次流过蛋白质纯化柱产生较高的蛋白质产量，产生高浓度纯化的重组蛋白，产量为约2-10mg/L。以PAGE分析估计GST-E6或HisE6蛋白质的纯度＞90％。重组E6或E7融合蛋白被用来检测临床样本中E6或E7抗体的表达，也被用作为多克隆抗血清和单克隆抗体产生的免疫原。
克隆和进行免疫试验的基本技术可于“Antibodies：ALaboratoryManual”，HarlowandLane，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.1989；“MolecularCloning”，ALaboratoryManual，eds.Sambrook，FritschandManiatis，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，以及本领域已知的其他书本和手册文章中找到。相关的免疫试验、组织和/或子宫颈细胞之免疫组织化学、以及/或免疫细胞学试验与流式细胞技术与下列专利有交互相关性：美国专利申请序号11/559,366，2006年11月13日提交，名称为“乳头瘤病毒检测方法与其在子宫颈癌之应用”；美国专利申请序号12/082,740，2008年4月14日提交，名称为“HPV检测之蛋白质芯片”；美国专利申请序号61/131,991，2008年9月22日提交，名称为“新型抗HPV单克隆抗体，有效用于HPV相关性子宫颈癌之早期晚期检测、筛选和诊断”；美国专利申请序号12/456,053，2009年6月10日提交，名称为“新型抗HPV蛋白单克隆抗体”；美国专利申请序号12/456,054，2009年6月10日提交，名称为“HPV感染之早期和晚期活体内检测”；美国专利申请序号12/456,055，2009年6月10日提交，名称为“HPV感染之早期和晚期活体内检测”；美国专利申请序号12/456,076，2009年6月10日提交，名称为“HPV感染之早期和晚期检测”；美国专利申请序号61/199,013，2008年11月12日提交，名称为“HPV相关癌症之检测、筛选和诊断”；以及美国专利申请序号12/590,747，2009年11月12日提交，名称为“HPV相关癌症之检测、筛选和诊断”。以上交互相关之专利申请内容在此以参照方式将其全体加以合并整合。
各项实施方式也提供了各种方法、检测试验、试剂盒、单克隆和多克隆抗体、多肽、重组蛋白和核酸，可用于检测一般HPV感染以及不同HPV基因型、高危险HPVs和低危险HPVs的感染。此外，检测HPV蛋白表达之试验方法或样本之形式不受限制，并可用于子宫颈组织、子宫颈细胞、子宫颈刮拭、血清、体液等。有用的筛检或诊断试验可为IHC、ICC、流式细胞技术、结合到珠的抗体、快筛、蛋白质芯片、点墨法、沟槽，以及传统ELISA试验。HPV蛋白可藉由某些实施方式描述之抗体进行检测，该蛋白存在于上皮组织，这在病理学家分级后以IHC染色被证实。
检测HPVDNAs、基因组、早期病毒蛋白、晚期病毒蛋白、原致癌蛋白和/或来自HPV基因型的衣壳蛋白，依据“Antibodies：ALaboratoryManual”，HarlowandLane，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.1989；“MolecularCloning”，ALaboratoryManual，eds.Sambrook，FritschandManiatis，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989以及其他书本和手册，可藉由各种体外和体内方法以及检测试验被进行，对于HPV感染的一般性临床筛选非常有效。
以免疫学试验检测HPV抗体和/或原致癌蛋白，可用于HPV感染的早期临床筛检和子宫颈癌的一般诊断。对于变化阶段的HPV蛋白和宿主蛋白的比较性检测可以在相同或不同的试验方法中来加以执行。也可应用于检测子宫颈的HPV相关性癌症，HPV感染、癌变前和癌变HPV相关上皮细胞病灶诱发上皮发育异常相关之病例，以及具发展中HPV相关性子宫颈癌和腺癌风险之病例。本申请所述方法可独立使用，或作为传统细胞学帕氏涂片测试或组织学测式的附属筛选工具，且所得的结果可与后续患者管理相比较。
更多详细的实施例。
人乳头瘤病毒(HPV)感染被认为在子宫颈发育异常和癌症中扮演重要的病理角色。FDA许可的HPVDAN试验有两种，都无法检测诸如病毒基因组转录或翻译的下游事件。虽这些试验可检测HPVDNA的存在，它们却无法分辨可自愈HPV感染的真正癌前阶段。因此，在临床上，有必要从临床显著疾病中区分出自愈型感染的HPV感染个体。此外，临床上也迫切需要对分子诊断辅助物加以辨认，以证实子宫颈细胞学试验的专一性，用于检测高度发育异常和癌症，并且降低子宫颈细胞学试验假阴性结果的风险。HPVE6和E7致癌基因的作用，在了解何种HPV的机制有助于癌症的发展上，有很大程度的影响力。这些致癌基因使得在关键细胞周期检查点调控的肿瘤阻抑基因失活。HPVE6和E7分别与p53和视网膜母细胞瘤(RB)交互作用并将其降解，释放转录因子E2F以诱发细胞凋亡的肿瘤阻抑基因。E7具有多重作用，也刺激细胞周期基因，阻断细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，并且诱发非整倍体的产生，导致肿瘤发生。在癌前病变中，E6和E7蛋白的表达远高于其在良性组织中，且HPVE6和E7致癌蛋白表达量的增加显示由HPV感染发展成癌前病变。治疗剂被发现可有效阻断E7的功能。因此，作为高度CIN2/3的专一性生物标记，检测E7致癌蛋白的能力是关键的发展，使从业人员能够1)从癌前病变的病灶中鉴别HPV感染，2)在子宫颈组织中辨别高度结构不良细胞和肿瘤细胞，3)避免良性HPV感染的妇女不必要的阴道镜检查和生物检体采样。E6和E7致癌蛋白向来难以进行分离。我们发展出高度专一性抗HPVE6或E7致癌蛋白的专用抗体。除了子宫颈癌之外，由下生殖道(肛门、外阴、阴道和阴茎)以及某些口腔、头部、颈部和皮肤癌的肿瘤组织中，已可检测出HPVDNA的存在。我们已发展出的E6和E7生物标记预期在多重族群和器官部位中可有效检测与HPV感染相关的癌症/癌前病变。技术上的挑战即为，在子宫颈细胞学样本中，由于型态上正常与微量不正常的细胞相互混和，使得HPV相关致癌蛋白在一般情况下的存在量很低。
HPVE6E7致癌基因是子宫颈癌发病的关键因子，在发育异常细胞和恶性细胞中过度表达。E6和E7基因都具有刺激增生的活性。这些基因和其各自的蛋白质在恶性变形中扮演了重要角色。尽管其联合的功能导致转化活性的增加，它们各自携有自身的致癌基因路径，可独立使人类细胞无限增殖(永生)。因此每一个E6和E7致癌蛋白在子宫颈癌中都应被视为关键标记物。E6或E7致癌蛋白作为多功能蛋白质，对肿瘤发生必需的多种重要的细胞路径进行去调节作用。致癌的HPV类型中E6和E7致癌蛋白的过度表达，在子宫颈癌中已被认为是非常特异的标记物。因此，组织中E6和E7致癌蛋白的检测，比检测高危险HPVs或其他内源性细胞周期标记物，成为辨识真正癌前病变更直接和具有专一性的测试。然而，目前没人成功发展出抗-E6或抗-E7抗体，以作为临床诊断上合适的生物标记。
目前的HPVDNA测试可检测高危险型HPV的感染，旦无法辨别良性HPV感染与高度癌前病变。其他发展中的生物标记试验，诸如p16和proExC，可检测对HPV感染无专一性的内源性细胞标记物。检测致癌基因转录体的HPVE6E7mRNA测试显示出比Pap和HC2试验增加的专一性，但该试验程序需要昂贵和复杂精密的仪器。此外，mRNA试验由于其丰度极低，以及RNA与生俱来的降解倾向，在例行的临床诊断上可能不适用。原位杂交(ISH)可检测组织中的HPVDNA或E7mRNA，但在临床实验室中不被广泛接受。由于IHC较ISH健全，且致癌蛋白是致癌基因实质上的终产物——其直接作用并加以阻断参与细胞凋亡和不正常细胞增生的RB肿瘤阻抑蛋白，HPVE6E7致癌蛋白较E6E7mRNA测试为更好的生物标记。然而，HPVE6E7的IHC试验在体外诊断尚不可用。迄今，可用的抗-HPVE6或E7抗体有限。我们所生产的抗-HPVE6或E7抗体可抗非变性的HPVE6或E7重组蛋白。利用我们已研发出的专一性抗-E7抗体，目标在于发展健全的IHC诊断试验平台，用于直接检测HPVE6或E7蛋白质，作为辨识高度CIN2/3的关键因子。我们希冀此平台可扩展成为一健全的HPVE7免疫试验方法，便可在细胞学样本上由良性HPV感染中辨识癌前病变，藉此判定在筛选进行时，何种医疗介入较为有效。
详细实施例1。
某些实施方式涉及抗HPV蛋白质的单克隆抗体。在临床样本中，产生对HPV蛋白检测具有专一性的抗体，其第一重要的步骤便是获得大量原始构型的纯化HPV重组蛋白以作为免疫原。蛋白质纯化过程中不期望的聚集、蛋白质不稳定性、表达程度低，以及纯化蛋白免疫应答低，使得E6和E7被认为非常难以分离和纯化。我们已经克服了技术上的障碍，制造出非变性且可溶性的HPVE6和E7重组蛋白。为证实我们所发展出的纯化方法可纯化出与原始形态非常近似的构型并与抗-HPV抗体结合，我们使用含有人类HPV抗体的HPV感染子宫颈样本(PCR结果为高危险型HPV阳性)以对纯化的HPV重组蛋白进行测试。使用该纯化E6和E7重组蛋白来检测HPV感染的研究确认这些蛋白质会与受HPV感染经人体免疫反应而产生的抗-HPV抗体结合。这些结果显示，该纯化HPV重组蛋白适合作为免疫原以增加抗血清，并在活体中产生可辨识天然HPV病毒蛋白的抗体。我们已使用非变性的、可溶性的E6和E7重组蛋白进行抗原刺激，因此已经产生高专一性的抗HPVE6和E7致癌蛋白的专用抗体。
初步研究结果支持，可藉由不同的应用：ELISA、蛋白质印迹和子宫颈癌组织的免疫组织化学技术(IHC)，使用我们的新型抗-E6和抗-E7抗体。临床样本的确认结果显示，我们的抗-E7单克隆抗体可作为辨认子宫颈组织中高度发育异常的生物标记，且在临床诊断上有进一步开发研究的潜能。
HPV重组蛋白可以是任何一种HPV病毒蛋白、早期基因和/或晚期基因的HPV蛋白，包含但不限于E2、E6、E7、L1、L2，且可来自各种不同HPV病毒型。一些实施方式提供了重组蛋白，例如含有HPV致癌蛋白的部份序列或全长序列的重组杂合蛋白。例如，由于蛋白质纯化过程中不期望的聚集、蛋白质不稳定、表达水平低以及纯化蛋白免疫应答度低，使得E6、E7和/或L1的全长多肽序列被认为非常难以获得和纯化。例如，许多早期E6致癌蛋白含有许多半胱氨酸，因此使得正确的E6致癌蛋白拓扑学需要适当的形成许多双硫键。此外，某些免疫学试验使用早期E6和E7蛋白的小肽，导致试验的专一性和敏感性极低，也因此不适合作为商品化的诊断工具。
产生HPV重组蛋白作为免疫原以产生抗血清，并筛选来自杂交瘤细胞系的单克隆抗体。克隆和产生各种不同重组蛋白包括由HPV16E6和HPV18E6g基因、HPV16E7和HPV18E7基因、HPV16L1和HPV18L1基因编码的基因。为了产生具有许多期望构型的最(或相似)原始形式的重组蛋白，由可溶性部分中纯化大肠杆菌所表达的HPVE6、E7或L1重组蛋白，然后加以浓缩，以PBS透析，作为免疫原。经由标准步骤进行小鼠的免疫以及融合，以筛选出与我们ELISA筛选标准相符的克隆。每一杂交瘤细胞系在组织培养中成长，且注射至小鼠体内以生产腹水。收集腹水，同型化，由蛋白质G柱进行纯化，以进行HPV免疫试验。
生殖道感染已辨识出超过40种的HPV病毒型，15种是来自子宫颈癌的高危险型，其中HPV16型占约50％，HPV18型则占了子宫颈癌病例的20-25％。然而，由于许多HPV感染——包括HPV16和HPV18——是可自愈的，检测组织中的HPVE6和E7致癌蛋白可作为辨识任何HPV病毒型的高度发育异常细胞的最直接且健全的试验。我们的目标是获得HPVE7专一性单克隆抗体，该抗体具有与癌症发展相关的最高危险HPV病毒型反应的能力。我们由HPV16和18型(占子宫颈癌病例约75％)中筛选出具有HPV重组蛋白的杂交瘤克隆，以测定出能够由大部分或所有的高危险HPV病毒型中检测出相关蛋白质的克隆。此外，我们筛选具有不相关HPV蛋白的杂交瘤克隆，以消除与HPV结构蛋白非特异性结合的那些克隆。用于杂交瘤筛选的纯化人乳头瘤病毒重组蛋白包含旦不限于HPV16E6蛋白、HPV16E7蛋白、HPV16L1蛋白、HPV18E6蛋白和HPV18E7蛋白。将我们的IHC结果与来自试验组织的HPV基因定型分析进行比较，我们的抗-E7抗体可辨认大部分的一般高危险型，包含但不限于HPV16和HPV18，且同时也可辨认其他分别与HPV16(即，31、33、35、52、58型)和18(即，45型)病毒型密切关联的高危险型。
某些实施方式涉及解决了发展CIN2/3的E7抗体所面临的三项挑战。第一，临床样本中的HPV蛋白质含量极低，使得难以加以分离。第二，许多HPV病毒型各自具有其独特的E7密码序列。第三，目前仍无法成功的由HPV感染的培养细胞系中大量产生和纯化出HPV蛋白质作为免疫原以产生抗体。针对合成小肽或变性的重组蛋白所产生的已知抗-HPV抗体在受感染的人类细胞中，并不必然会与天然产生的HPV病毒蛋白产生反应，故一般不适用于临床诊断。另一项技术挑战是经福尔马林固定和石蜡膜包埋处理后在自然感染的人类组织中发生的蛋白质构型改变，使得难以用来检测临床相关样本。这些因素解释了一项事实，由变性的重组蛋白或和合成肽所产生的现有抗体对于IHC无法作用。此外，已知某些使用E7蛋白质小肽的免疫学试验方法产生极低的试验专一性和灵敏性。因此，目前尚无可用的天然形式的E6或E7蛋白质可纯化作为免疫原，以产生能够在体外诊断中检测临床样本中存在的病毒蛋白的抗-HPV抗体。
详细的实施例2-免疫细胞化学分析(ICC)
某些实施方式涉及免疫试验，包含检测脱落的子宫颈细胞的HPV蛋白和细胞蛋白。样本制备：将收集自液体溶液中的子宫颈刮拭细胞分成两部分，一部分进行细胞学帕氏染色，另一部分则使用某些实施方式中所描述的HPV抗体进行免疫细胞化学染色。在帕氏涂片的结果中，将帕氏染色样本分为0-17等级。等级(1)到(3)视为正常，等级(4)及以上则为异常。帕氏涂片检查报告的解读有时会引发争议。基于Bethesda2001系统，帕氏涂片阴性可能包括了阴性上皮内病变或恶性肿瘤，而帕氏涂片异常可能包含发育异常和病变发展的不同阶段的鳞状细胞。例如，LSIL：低度鳞状细胞上皮内病变、HSIL：高度鳞状细胞上皮病变、CIN1：子宫颈上皮内赘瘤第一级，轻度细胞异常、CIN2：子宫颈上皮内赘瘤第二级，病灶更具侵略性、CIN3：子宫颈上皮内赘瘤第三级，具侵略性的发育异常。侵袭性癌症可包含鳞状上皮细胞癌(SCC)、腺癌，以及其他癌症。非典型的异常细胞包括非典型鳞状上皮细胞(ASC-US)和非典型腺细胞(AGUS)，在帕氏涂片中，不寻常或非典型的细胞可能微不足道并使其重要性被忽略。针对鉴定出的异常细胞，HPV免疫细胞化学染色可提供额外的HPV感染状况和/或HPV致癌蛋白表达的信息。因此，相较于帕氏染色，HPV免疫细胞化学染色试验用于辨认帕氏LSIL或HSIL样本中的高度发育异常，和/或非典型异常细胞如ASC-US或AGUS非常有效。
使用ICC方法作为免疫学试验例子，收集来自子宫颈刮拭的细胞，离心、清洗后，依此处所描述之ICC步骤进行免疫染色。依据标准生产流程以液体溶液收集子宫颈刮拭。然后以细胞离心机或ThinPrep技术将子宫颈细胞处理成单层薄膜。将玻片上的单层细胞固定，依HPV免疫细胞化学试验步骤通过抗-HPV抗体染色。于显微镜下可看见被染色的细胞。
在某些实施方式中，提供进行ICC试验的试剂盒。该试剂盒包含前-抗体阻断溶液、后-抗体阻断溶液、抗-HPV抗体作为初级抗体、结合有HRP或生物素的抗-小鼠或抗-兔子免疫球蛋白、其他作为次级抗体的试剂，和含有作为待被检测次级抗体的底物的适当试的溶液。
抗-HPV抗体也可直接标记上HRP或生物素，或使用适当的试剂作为底物可被检测的其他试剂。前-抗体阻断溶液可包含某些蛋白质、BSA、血清或其他试剂，用来阻断初级抗体与细胞产生非特异性结合。后-抗体阻断溶液可包含与前-抗体阻断溶液相似的溶液，其以较少量的阻断蛋白质或血清与初级抗体一起进行温育。含有HPV抗体的溶液可以是浓缩或稀释的形式，作为预备使用的试剂。含有次级抗体的溶液可以是浓缩或稀释的形式，作为预备使用的试剂。含有作为底物的适当试剂的溶液可以包括DAB(3，3’-二氨基联苯胺)作为一种或两种成分，或AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)底物作为一种或两种成分，或其他底物。
来自子宫颈刮拭的人类细胞经过处理和固定在玻片形成单层或薄膜后，进行免疫细胞化学(ICC)试验，用前-抗体阻断溶液阻断玻片一段时间，再与HPV抗体一起温育。该玻片然后以PBS或H2O或其他溶液清洗3到5次，除去任何未结合的HPV抗体。然后将玻片与二级抗体如抗-小鼠IgGHRP进行温育，接着清洗和结合适当的底物进行检测。作为底物的例子，在过氧化酶和过氧化氢存在下将DAB氧化，导致棕色、酒精不溶性沉淀物在酶活性位置沉淀。沉淀物的颜可色由浅金黄棕色到深金黄棕色，这取决于酶的存在量。在显微镜下可见的金黄棕色沉淀，表示HPV抗体与细胞内存在的HPV蛋白质产生专一性结合。该试验分析可于室温或较高温下进性，以加快结合反应。该HPVICC试验可以手动进行或通过ICC自动仪进行操作，因此对于HPV感染与子宫颈刮拭中位于原位上皮细胞的HPV致癌蛋白，提供了强而有力的筛选与检测工具。
为了证实HPVICC试验能够识别不同疾病阶段的发育异常，来自轻度、中度、严重或侵袭性的肿瘤形成的样本都进行测试。这些样本包含但不限于，例如CIN1、CIN2、CIN3、LSIL、HSIL或ASC-US。为了证明本申请所描述的ICC试验能够用于对于不同阶段各式液体溶液中的各种样本来源进行染色，也制备溶于不同液体溶液中的不同阶段的样本，以在某些实施方式中进行ICC试验。
中度发育异常表示子宫颈的皮肤适度的成长，比其应有速度还快，且已发展超过了轻微阶段。子宫颈组织切片显示，不成熟的基底细胞生长途中通过皮肤表面，无明显的成熟。中度发育异常是相当重要的，因为存在更大的风险且挑战将会提升，若不经治疗，将发展成为非侵袭性的子宫颈癌。基于此原因，中度发育异常被称为“高度”病变或HGSIL。另一针对此状况的同义字为“CIN2”(子宫颈上皮内赘瘤，第二级)。帕氏涂片中度发育异常通常显示进一步的子宫颈阴道镜研究是必要的。若证实为中度发育异常，通常便进行治疗。治疗可包括冷冻治疗、LEEP或激光。治疗之后，常常获得频繁的帕氏涂片检查作为后续追踪，以确保是否复发(约10％机率)，复发则被及时诊断并作进一步的治疗。
为证实HPVICC试验能够检测HSIL，图1A显示子宫颈刮拭细胞经帕氏染色被诊断为CIN2，将其制备于另一液体溶液中，使用抗-E7单克隆抗体进行阳性ICC染色。如图1A所示，该CIN2、HSIL异常细胞处于相互连接的形式，经细胞核与细胞质的阳性染色，具有高N/C(核/质)比值(以黑色箭头显示)。这些结果显示，在ICC试验中，通过使用小鼠单克隆抗-HPVE7抗体，可原位检测不同来源的液体溶液中的中间肿瘤阶段的异常细胞之HPVE7蛋白存在。
图1B显示另一制备于另一液体溶液中的子宫颈刮拭细胞的CIN2样本，使用抗-E6单克隆抗体进行ICC阳性染色。如图1B所示，该CIN2、HSIL异常细胞处于相互连接的形式，经细胞核与细胞质的阳性染色，具有高N/C(核/质)比值(以黑色箭头显示)。这些结果显示，使用本发明描述的ICC试验方法中的小鼠单克隆抗-HPVE6抗体，可原位检测不同来源液体溶液中的异常细胞中间肿瘤阶段存在的HPVE6蛋白。
若异常细胞通过基底膜而侵入至下层组织，则被认为是癌症。对于严重的发育异常，虽不被认为是癌症但将之视为癌前问题，因为发育异常中的异常细胞没有通过基底膜而侵入。因此，顾名思义，它们并非癌症。原位癌指的是异常细胞扩增至全层的皮肤。这些细胞单独看起来就像癌细胞。原位癌被许多有关当局认为在临床上等同于严重的发育异常或CIN3，且应加以及时和仔细评估。治疗可包括藉由冷冻消除异常细胞(冷冻治疗)、蒸发(激光)，或以通电的金属线圈(LEEP)将其刮除。在某些情况下，针对子宫颈锥组织切片的形式，须要更多广泛的手术方法来解决问题。
为证实本发明描述的ICC试验方法可用于液体溶液中的严重子宫颈内皮瘤细胞，制备溶于不同液体溶液中的CIN3子宫颈刮拭样本，以进行某些实施方式所描述的ICC试验。图2显示子宫颈刮拭细胞(经帕氏染色诊断为CIN3)可使用抗-E6单克隆抗体进行ICC阳性染色。图3A-3D显示，使用相同的抗-E6小鼠单克隆抗体对另一CIN3样本ICC染色的结果。如图3A-3D所示，该CIN3、HSIL异常细胞处于相互连接的形式，经细胞核与细胞质的阳性染色，具有高N/C(核/质)比值(以黑色箭头显示)。这些结果显示，藉由本发明描述的ICC试验方法，使用小鼠单克隆抗-HPVE6抗体，可原位检测不同来源液体溶液中的异常细胞癌变中间阶段的HPVE6蛋白存在。这些结果也显示，在ICC试验中，使用小鼠单克隆抗-E6抗体，可原位检测液体溶液CIN3异常细胞中HPVE6蛋白的存在。
图4A和4B显示两幅代表性ICC染色图像，将与，使用图3A-3D所示相同CIN3样本的抗-HPVE7小鼠单克隆抗体。图像显示，该CIN3、HSIL异常细胞处于相互连接的形式，经细胞核与细胞质的阳性染色，具有高N/C(核/质)比值(以黑色箭头显示)。这些结果显示，在ICC试验中，利用小鼠单克隆抗-HPVE7抗体，可原位检测不同来源液体溶液中的异常细胞中间肿瘤阶段的HPVE7蛋白存在。这些结果显示，藉由本发明描述的ICC试验方法，使用小鼠单克隆抗-HPVE7抗体，可原位检测液体溶液CIN3异常细胞中HPVE7蛋白之存在。
为了确认p16在晚期肿瘤中也过度表达，将与图3和图4相同的CIN3样本，使用抗-p16小鼠单克隆抗体进行ICC染色。图5显示来自相同的ICN3样本利用抗-p16小鼠单克隆抗体进行ICC染色的结果。如图所示，该CIN3、HSIL异常细胞处于相互连接的形式，经细胞核与细胞质的阳性染色，具有高N/C(核/质)比值(以黑色箭头显示)。这些结果显示，在中期至晚期肿瘤阶段的异常细胞中，可原位检测到p16蛋白的存在。图2-5表示的所有这些结果显示，藉由ICC试验，使用本发明所描述的小鼠单克隆抗体，可原位检测到来自液体溶液中CIN3异常细胞的HPVE6、HPVE7和p16蛋白的存在。
子宫颈癌是最常见的影响生殖器官的癌症形式。它局部侵袭至邻近组织、血管、淋巴管和淋巴结。在其晚期阶段，则难以治疗甚至可能是致命的。在发展成为子宫颈癌之前，通常有一段可逆的癌前变化，称为发育异常。虽然大多数子宫颈癌源自构成外部皮肤的鳞状细胞，仍有偶发的癌症是由生成黏液的细胞所产生，其位于进入子宫的内子宫颈腔道上。此种腺型被称为“腺癌(ADC)”而非“鳞状细胞癌(SCC)”。不同于鳞状细胞癌，当腺癌的前体存在时，难以经由帕氏涂片被辨认出来，因此使得腺癌难以被检测出来。子宫颈鳞状细胞异常增生成为鳞状细胞癌的发展缓慢，且不像在腺癌中一致。因此，子宫颈腺癌比鳞状细胞癌经常在更晚期的阶段被检测到。治疗方式则与更常见的鳞状细胞癌相似。然而，由于其通常在较晚期的阶段才被发现，往往需要更积极的治疗。因此，使用某些实施方式描述的HPVICC试验，对液体溶液中的腺癌细胞进行早期筛选，以检测HPV致癌蛋白的存在变得极为重要。
作为另一例子说明本发明所描述的ICC试验可应用于检测液体溶液中的子宫颈癌细胞，将子宫颈刮拭样本的不同肿瘤制备于不同的液体溶液中，以进行某些实施方式所描述的ICC试验。作为例子，图6A显示，最常见的子宫颈癌类型之一，SCC(经帕氏染色诊断为鳞状细胞癌)，可使用抗-E6单克隆抗体被ICC阳性染色。图6B显示使用抗-HPVE7小鼠单克隆抗体，对图6A所示的相同SCC样本进行ICC染色的结果。为了确认在晚期肿瘤中p26也过量表达，使用抗-p16小鼠单克隆抗体，对图6A和6B中相同的SCC样本进行ICC染色。图6C显示使用抗-p16小鼠单克隆抗体，对图6A和6B所示的相同SCC样本进行ICC染色的结果。如图6A-C所示，HSILSCC细胞处于相互连接的形式，经细胞核与细胞质的阳性染色，具有高N/C(核/质)比值(以黑色箭头显示)。这些结果显示，藉由本发明描述的ICC试验方法，使用小鼠单克隆抗体，可原位检测液体溶液中不同类型子宫颈癌细胞的异常细胞中HPVE6、HPVE7和p16蛋白的存在。
为表示本发明所描述的ICC染色的结果来自于HPV抗体和子宫颈刮拭细胞原位存在的HPV蛋白的专一性结合，同时还获得来自液体溶液中的正常子宫颈细胞进行ICC试验测试。图7A显示，经帕氏染色诊断为正常子宫颈刮拭细胞，将其制备于液体溶液中，使用抗-E6单克隆抗体以ICC阴性染色。相同的样本也使用如图7B所示的抗-HPVE7单克隆抗体进行ICC染色。使用小鼠单克隆抗-HPVE6或抗-HPVE7抗体的ICC试验显示阴性染色结果，因此表示HPVE6蛋白和HPVE7蛋白都未在正常的子宫颈刮拭细胞中原位存在。因此，该结果显示，某些实施方式所描述的ICC试验，是使用本发明所描述的HPV专一性抗体来检测HPV蛋白质的专一性染色方法。
虽然有许多因素，包括免疫系统受损，会导致中度发育异常的发展，但HPV感染可能为其中最重要的因素。中度发育异常的发生，并非永久性的特征。它会消退或发展，使其在妇女子宫颈(和帕氏涂片)上一度存在又消失。这结果来自于这一事实，即HPV病毒是这些潜伏在子宫颈皮肤细胞内的改变的先决条件。一般针对女性施行的免疫系统检查，在免疫系统失调的时候，HPV能够再活化细胞机械装置导致更快速的生长。针对发展出显示为中度发育异常的的单一帕氏涂片检查的妇女，大致有三项如下方法可采用：1)六个月内重复帕氏涂片检查。帕氏涂片不正常者大部分会转变成自愈性的HPV感染，由其是青春期的女性。重复的帕氏涂片检查而无其他治疗，使得许多子宫颈感染得以有时间痊愈，避免了其他更多广泛的介入治疗。另一方面，重复的帕氏涂片检查方法主要缺点在于，大多数的妇女无论如何最终需要进行阴道镜检查，他们已遭受了超乎意料的不同程度的焦虑，但仍无法解决其健康问题。2)立即阴道镜检查。许多妇女在历经简单的检查发现异常后，往往感到焦虑且未立即加以进行调查。这种方法的主要缺点是，即使妇女帕氏涂片呈假阳性，将会经历适度昂贵的评估过程。3)观察并治疗(确诊性切除术治疗)。代替阴道镜评估和直接的组织切片，继之以某些形式的治疗数天或数周后，某些医师更喜欢以阴道镜来评估子宫颈，且对于那些适合进行LEEP手术者，同时立即进行LEEP治疗。然而，对多数的患者而言，这是过度的治疗。
关于ASC(非典型鳞状细胞)的报道，是一种细胞学家用来描述不完全正常的帕氏涂片的方法。然而，他们无法肯定是何种异常或其重要性为何。ASC帕氏涂片可分为两型：ASC-US(非典型)和ASC-H(不能排除高度SIL)。诊断为ASC的妇女中，少数拥有子宫颈高度病变。ASC-US的妇女中，介于5％和17％会存在高度SIL(CIN2或CIN3)。ASC-H的妇女中，介于24％和94％有高度SIL。因此，ASC帕氏涂片发展成HSIL的可能性不容忽视。任何ASC帕氏涂片妇女中，非侵袭性子宫颈癌症的风险约为0.1％至0.2％。
HPVE6或E7免疫细胞化学(ICC)试验不仅检测HPV感染，也可原位检测HPV致癌蛋白。因此，与标准HPVDNA测试或帕氏涂片试验相比较，ICC试验结合各式专一的和一般的抗-HPV抗体，可作为原位检测HPV强而有力的工具。
表1显示使用小鼠抗-HPVE6单克隆抗体，对液体溶液中不同的子宫颈刮拭样本HPVE6ICC试验的结果。共有85个取自临床转诊病患的样本收集至ThinPrep。表1的结果显示，使用小鼠单克隆抗-HPVE6抗体，可藉由免疫细胞化学(ICC)试验，对固定于玻片上的单一细胞原位检测到HPVE6蛋白。HPVE6蛋白质的原位存在，可从各种液体溶液中不同阶段的子宫颈刮拭样本中检测出。相同的子宫颈刮拭样本也进行标准帕氏染色，以将ICC染色结果结果与帕氏涂片结果进行比较。如表1所示，HPVE6蛋白分别存在于子宫颈刮拭正常、ASC-US、ASC-H、LSIL和HSIL样本中，且阳性率增加。
帕氏涂片HSIL或CIN2/3样本有约100％的阳性率，而仅14％的样本被诊断为帕氏染色正常者，使用相同的抗-HPVE6抗体经ICC试验呈阳性染色结果。对于ASC样本，约33％的ASC-US和约50％的ASC-H，使用表1所示用于LSIL、HSIL样本相同的抗-HPVE6抗体，得阳性染色结果，这表示这些ASC-US或ASC-H样本中致癌蛋白的表达接着产生进一步的病情恶化。对于帕氏涂片ASC-US和HPVE6ICC染色阴性的样本，其发展成为恶化病变的风险较低。这些结果显示，本发明描述的HPVE6ICC试验，对于提供HPV感染的额外信息用于做出疾病管理决策非常有效。
表1.使用小鼠抗-HPVE6单克隆抗体对液体溶液中的各种子宫颈刮拭样本进行的ICC染色。
表2显示表1中ICC染色结果的概述。如数据显示，该ICC染色方法使用某些实施方式描述的抗-HPVE6抗体，得到ICC试验≥CIN2灵敏性为95％，精确度为66％。这些数据显示，此试验含有50％的PPV(阳性预测值)和98％的NPV(阴性预测值)，可有效用于帕氏涂片异常的分类病患或普通群体常规性帕氏染色的宫颈癌筛选，检测HPV蛋白质。
表2.使用小鼠单克隆抗-HPVE6抗体，对液体溶液中CIN2子宫颈刮拭样本ICC染色结果的概述。
作为另一HPVICC试验例子，表3和表4显示使用抗-HPVE7抗体的ICC染色结果。如数据所示，HPV抗-E7给出与HPV抗-E6所示相当的ICC结果。表3显示，HPVE7蛋白分别存在于子宫颈刮拭正常、ASC-US、ASC-H、LSIL和HSIL样本中，且阳性率增加。帕氏涂片样本确诊为HSIL者，有约94％的阳性率，仅11％的样本被诊断为帕氏涂片正常者，使用相同的抗-HPVE7抗体经ICC试验呈阳性染色结果。对于ASC-US或ASC-H样本，使用与如表3所示用于CIN1、CIN2/3样本相同的抗-HPVE7抗体，有约40％的这些样本得阳性染色结果，这表示这些ASC-US或ASC-H样本中的致癌蛋白的表达接着产生进一步的癌症恶化。对于帕氏涂片确诊为ASC-US和ICC染色(抗-HPVE7)呈阴性的样本，其发展成为恶化病变的风险较低。
表3.使用小鼠单克隆抗-HPVE7抗体，对液体溶液中各式子宫颈刮拭样本的ICC染色结果。
表4显示表3中ICC染色结果的概述。如数据显示，使用某些实施方式描述的抗-HPVE7抗体的该ICC染色方法，对HSIL+得到ICC试验灵敏性为91％，专一性为67％。这些数据显示，此试验含有51％的PPV阳性预测值和95％的NPV阴性预测值，可有效用于帕氏涂片异常的分类病患或普通群体常规帕氏染色的子宫颈癌筛选，以检测HPV蛋白质。
表4.使用小鼠单克隆抗-HPVE7抗体，对液体溶液中子宫颈刮拭≥CIN2样本的ICC染色结果。
帕氏HSIL阳性 帕氏HSIL阴性
E7 ICC阳性 20 21 51％ PPV
E7 ICC阴性 2 42 95％ NPV
灵敏性 91％
专一性 67％
作为另一例子，帕氏细胞学样本的所有200+病例由临床转诊患者获得，并收集至液态Prep溶液中。结合帕氏测试和HPVDNA测试及相关组织学结果，用于分析HPVE6E7致癌蛋白和细胞蛋白的表达。共177个ICC结果的病例用帕氏试验、HPVDNA试验和组织学的结果进行分析，对液体溶液中不同阶段的子宫颈刮拭样本，ICC使用抗-E6、抗-E7和抗-p16抗体。作为例子，表5显示帕氏试验、HPVDNA试验和使用E6、E7或p16抗体进行ICC试验的结果的相关性。
表5.ICC染色结果概述，显示具有不同异常阶段的帕氏涂片样本的48个病例与HPVDNA试验和使用抗-HPV抗体、抗-p16抗体的ICC试验进行比较。
由表5的数据显示，使用抗-HPV抗体进行ICC染色，相较于单独使用抗-p16进行ICC，对HPVDNA试验阳性率有更佳的相关性。结果显示，HPVICC可用于早期检测原位HPV蛋白质。针对假阳性样本，例如，帕氏检测正常的HPV阳性样本，ICC可进一步确认HPV致癌蛋白的表达。针对假阴性样本，例如，帕氏检测正常的HPV阴性样本，ICC试验却为阳性样本，其需要作进一步确认是否有任何的病变进展。然而，大部分为HPVDNA阳性样本的ASC-US或CIN病例，使用抗-E6抗体进行HPVICC试验呈现阳性。与p16ICC相较，HPVICC与帕氏涂片异常有更好的相关性。
表6，利用帕氏试验作为黄金标准，HPVDNA试验和E7ICC试验比较。
为了分析HPVDNA和HPVE6E7致癌蛋白表达的相关性，作为例子，表6进一步表示了HPVE7ICC的阳性率，与表5所示48个病例的帕氏测试结果中不同分类的HPVDNA结果进行比较。如表6所示，HPVDNA测试显示阳性率对帕氏NML、ASC-US、LSIL和HSIL分别为57％、83％、100％和83％，相对于E7ICC试验，阳性率则为21％、51％、25％和84％。这些数据显示，临床转诊病患的HPVDNA试验具有高的阳性率，表示在分类的帕氏异常病患中，HPVDNA试验并不有效。如数据所示，83％的ASC-US为HPVDNA阳性，因此仅有17％的ASC-US/HPV阴性病患可免于不必要的阴道镜检查。然而，100％的LSIL为HPVDNA阳性，表示对于分类的LSIL病患，并不建议使用HPVDNA检测。然而，仅50％的ASC-US和25％的LSIL呈E7阳性。这表示E7ICC试验对分类的帕氏异常ASC-US和LSIL病患是较好的检测方法，可大大避免不必要的阴道镜检查或过度检测。对于HSIL族群，HPVDNA试验和E7ICC试验都有83％的阳性率。对于HSIL/HPVDNA阴性，由于在E7ICC试验中呈阳性，HPVDNA试验则可能呈假阴性。对于HSIL/HPVDNA阳性，但E7ICC阴性，需要更进一步确认是否为真的HSIL及组织学CIN2等级以上。
进一步分析表6、表7和表8的HPVDNA试验与E7ICC试验的灵敏性与专一性，以帕氏HSIL作为切点(cutoff)，分别显示E7ICC试验和HPVDNA试验的结果。
表7.利用帕氏试验作为黄金标准，比较E7ICC和HPVDNA试验(来自表6中的总共48个病例)
帕氏HSIL阳性 帕氏HSIL阴性
E7 ICC阳性 5 11 31％ PPV
E7 ICC阴性 1 31 97％ NPV
灵敏性 83％
专一性 74％
表8.以HSIL作为切点，比较HPVDNA试验与帕氏试验的概述(来自表6中的总共48个病例)
帕氏HSIL阳性 帕氏HSIL阴性
HPV阳性 5 29 15％ PPV
HPV阴性 1 13 93％ NPV
灵敏性 83％
专一性 31％
如表8数据所示，HPVDNA方法提供了对≥CIN2灵敏性为83％，专一性为31％，PPV为15％，NPV为93％。与表7相比较，对相同的病患使用抗-HPVE7单克隆抗体进行相同的ICC研究，这两种方法有相同的试验灵敏性(83％)。然而，使用抗-E7抗体进行的ICC试验表现了较高的精确度(74％对31％)，较好的PPV(31％对15％)，以及较好的NPV(97％对93％)。因此，这些结果显示，相较于HPVDNA方法，HPVE7ICC试验可作为较好的方法来检测HPV蛋白，用于从普通群体常规帕氏涂片染色来筛选子宫颈癌。因此，HPVE6E7作为较好的生物标记用于辨认高度发育异常，并对可从医疗介入获利的病患提供有效的疾病管理。
为了进一步分析HPVE7ICC数据与组织学结果，作为另一例子，表9和表10显示了以组织学作为黄金标准的HPVE7ICC染色结果。表9显示，HPVE7蛋白在子宫颈刮拭正常、CIN1、CIN2/3样本中存在，且阳性率随之增加。帕氏涂片诊断为CIN2/3的样本具有约94％的阳性率，而23％的样本经诊断组织学结果为NIL(正常)者，使用相同抗-HPVE7抗体ICC染色结果呈阳性。对于CIN1样本，有约40％的这些样本以相同的抗-HPVE7呈阳性染色，表示致癌蛋白在这些CIN1样本中的表达，且接着发展成进一步的癌症进展。组织学NIL/CIN1和ICC染色(抗-HPVE7)阴性样本，可能发展成为进行性病变的风险性较低。
表9.使用小鼠抗-HPVE7单克隆抗体的ICC染色结果与组织学的比较。由收集至LiquidPrep中的临床转诊病患样本获得共105个病例。
组织学 NIL CIN1 CIN2 CIN3
HPV E7 ICC阳性 14 6 11 15
HPV E7 ICC阴性 48 9 1 1
总病例数 62 15 12 16
阳性率 23％ 40％ 92％ 94％
表10表是来自表9的ICC染色结果的概述。如数据所示，ICC染色方法使用某些实施方式所描述的抗-HPVE7抗体，提供了对于≥CIN2样本ICC试验93％的灵敏性和74％的专一性。这些数据显示，此试验PPV为57％，NPV为97％，可有效用于检测HPV蛋白质，用于从普通群体常规帕氏涂片染色来筛选子宫颈癌。
表10。使用小鼠单克隆抗-HPVE7抗体，对液体溶液中子宫颈刮拭样本进行ICC染色的结果概述。
CIN≥2 CIN≤1
HPV E7 ICC阳性 26 20 57％ PPV
HPV E7 ICC阴性 2 57 97％ NPV
灵敏性 93％
专一性 74％
为了测试某些实施方式所描述的ICC试验是否适于检测早期的子宫颈癌筛选，使用帕氏涂片正常样本将HPVICC试验与HPVDNA试验进行比较。如表11所示，所有受测试的帕氏涂片正常样本(44个样本中的44个)，使用抗-HPV抗体呈阴性染色。这些数据显示，某些实施方式所描述的ICC染色试验是非常专一的。对相同的样本进行HPVDNA试验的结果比较，16％(44个样本中有7个)的帕氏涂片正常样本在HPVDNA试验呈阳性。本研究使用的高度HPVDNA试验为HC2，是FDA批准的唯一HPVDNA试验。对于其中7个HPVDNA阳性但帕氏涂片正常以及HPVICC阴性的样本，可能为HPVDNA试验的假阳性，或事实上HPV感染可检测到DNA，但却无HPV致癌蛋白质的表达。这些数据显示，本发明描述的HPVICC试验相较于HPVDNA试验，提供较好的阳性预测值。因此，该HPVICC试验对于子宫颈癌的诊断提供较好的临床相关性。
表11.帕氏正常样本中利用各种抗-HPV抗体的ICC染色与HPVDNA测试(HC2)的比较，以帕氏试验作为黄金标准。来自一般群体筛选的共44个正常帕氏涂片的病例。样本收集于LiquidPrep溶液中。
帕氏涂片正常 HPV ICC阳性 HPV ICC阴性
高度HPV DNA阳性 0 7
高度HPV DNA阴性 0 37
详细实施例3-免疫组织化学试验(IHC)
某些实施方式涉及筛选人类个体乳头瘤病毒感染的方法，包括提供含有一种或多种来自人类个体临床组织样本的组织细胞的薄片，将该薄片铺于玻片上，对含有临床组织样本薄片的玻片进行一或多项免疫组织化学试验，使用针对一种或多种纯化的重组乳头瘤病毒蛋白产生的一种或多种抗体，对人类细胞薄层进行染色，其中所述至少有一种抗体能够辨识乳头瘤病毒的早期蛋白，并原位检测来自玻片上临床组织样本薄片中存在的一种或多种乳头瘤病毒型的一种或多种蛋白质。
样本制备：将石蜡组织块切分为4微米，放置于玻片上于60℃烘烤过夜。脱蜡/水合切片在除膜后进行IHC染色标准步骤。纯化的单克隆抗HPV蛋白抗体经稀释后作为一级抗体。以二级抗体溶液进行染色步骤，以适当的底物试剂对每一切片进行清洗。一旦该切片形成后，将玻片浸于dH2O中，以苏木紫复染，脱水并覆上盖玻片。子宫颈组织含有，例如，LSIL：低度鳞状上皮内细胞病变、HSIL：高度鳞状上皮内细胞病变、CIN1：子宫颈上皮内赘瘤，中度细胞异常、CIN2：子宫颈上皮内赘瘤，病变更具侵略性、CIN3：子宫颈上皮内赘瘤，含有侵略形态的发育异常。侵袭性癌症如鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(ADC)。对于发育异常细胞的辨识，HPVIHC染色可对HPV感染状态和/或HPV致癌蛋白的表达提供额外的信息。因此，HPVIHC染色试验可作非常有效的确认性测试。此外，不同子宫颈发育异常阶段的HPVE6和E7致癌蛋白的过度表达可能表示CIN和/或子宫颈癌发展的进展。
组织一旦经处理和固定后，通过用抗原修复缓冲液煮沸玻片上的组织一段时间来进行免疫组织化学(IHC)试验。然后将玻片冷却至室温，用前-抗体阻断溶液阻断一段时间，再与HPV抗体进行温育。将玻片以PBS或H2O或其他溶液清洗3到5次，以除去任何未结合的HPV抗体。将玻片与二级抗体一起温育，例如，抗-小鼠IgGHRP，继以适当的底物以进行检测。作为例子，在过氧化酶和过氧化氢存在下将DAB氧化，在酶活性位置产生棕色、酒精不溶性沉淀物的沉淀。沉淀物的颜色由浅金黄到深金黄棕色，这取决于酶的存在量。在显微镜下可见的金黄棕色沉淀物，表示HPV抗体与细胞内存在的HPV蛋白质产生专一性结合。该试验分析可于室温或较高温下进性，以加快结合反应。该HPVIHC试验可以手动进行或通过ICC自动仪进行操作，因此提供了在子宫颈组织上皮细胞中检测HPV感染与HPV致癌蛋白原位定位的强有力工具。
一些实施例子涉及IHC试验，包含检测子宫颈组织中的HPVE6、E7和p16蛋白。一例子步骤用来说明免疫组织化学(IHC)染色试验：A)组织阵列制备：由石蜡包埋的组织块切割成组织切片。每一组织微阵列含有22个子宫颈鳞状细胞癌或腺癌样本，以及3个正常上皮细胞作为负控制。收集87个石蜡包埋块核心并切分为4微米的组织切片。每一组织微阵列含有3重复的芯片，总共26个子宫颈鳞状细胞癌或腺癌样本，以及3重复的芯片，总共3个正常样本作为负控制。总共220个病例排列于共9个玻片上。B)免疫组织化学方法：9个组织微阵列共220个子宫颈癌组织的病例，以E6、E7和p16IHC进行测试。产生具有全长HPV病毒型16E6、E7和HPV病毒型18E6、E7的重组蛋白，并纯化以免疫兔子和小鼠，用于某些实施方式所描述的多克隆抗体和单克隆抗体产生。使这类抗体和克隆E6H4至p16INK4a人类蛋白，发展IHC方案以染色组织微阵列。研究包含来自每一肿瘤个体的3个样本。为解释结果，对于E6和E7蛋白，若所给定的样本中至少有10％肿瘤细胞被染色，且强度分为1、2或3等级；则指定为样本具有阳性E6/E7表达。对于p16INK4a，若样本呈现连续细胞染色(也即，扩散染色形态)，指定为“阳性”类别，若样本呈阴性染色反应或呈分隔的细胞或小细胞团块染色(也即，局部染色形态)，则为指定“阴性”类别。C)DNA分型：每一病例的HPVDNA分型通过PCRSPF10-LiPA25进行辨别(ver.1：LaboBiomedicalPdts.，Rijswijk，TheNetherlands制造)，一种检测25种高和低风险HPV病毒型的反杂交技术。该试验在HPV实验室中进行(CatalanInstituteofOncology，Barcelona，Spain)。
作为一例子，图8A-8B显示IHC图像，使用抗-E6抗体于子宫颈癌组织和其相邻的正常组织。图8C-8D显示IHC图像，使用抗-E7抗体于子宫颈癌组织和其相邻的正常组织。结果显示子宫颈癌样本呈阳性染色，邻近正常组织则呈阴性染色。作为另一例子，图9显示不同放大程度的子宫颈癌样本的IHC图像。图9A-C，以抗-E6抗体进行IHC：阳性10x(A)、阳性20x(B)、阴性20x(C)。图9D-F，以抗-E7抗体进行IHC：阳性10x(D)、阳性20x(E)、阳性40x(F)。图9G-I，以p16INK4a抗体进行IHC：阳性10x(G)、阳性20x(H)、阴性20x(I)。
IHC染色的结果由执业病理医师评分以给予0-3等级的强度和肿瘤细胞被染色的百分比。为解释结果，阳性结果被指定为样本中存在E6/E7，至少10％的肿瘤细胞被染色且强度等级为1、2或3。对于p16INK4a，若样本呈现连续细胞染色(也即，扩散染色形态)，指定为“阳性”等级，若样本呈阴性染色反应或呈分隔的细胞或小细胞团块染色(也即，局部染色形态)，则指定为“阴性”等级。分析数据以获得试验的灵敏性和专一性，与PCR和p16IHC染色进行比较。同时分析统计上的显著性。
表12显示使用抗-E6、E7和p16抗体进行IHC试验的灵敏性。结果显示，使用抗-E6抗体HPVIHC试验灵敏性为约92.1％(203个样本中有187个)。使用抗-E7抗体HPVIHC试验灵敏性为约76.2％(202个样本中有154个)。使用抗-p16抗体HPVIHC试验灵敏性为约91.3％(208个样本中有190个)。
表12.使用单一标记的IHC试验结果的概述。
E6、E7和p16蛋白表达的相关性显示于表13-15。在表13中，共203个样本以E6或p16通过IHC试验进行分析。187个IHCE6阳性样本中，170个样本在p16IHC试验呈阳性。16个IHCE6阴性样本中，15个样本在p16IHC试验呈阳性。185个IHCp16阳性样本中，170个样本在E6IHC试验呈阳性。18个IHCp16阴性样本中，17个样本在E6IHC试验呈阳性。仅有一个样本在E6IHC和p16IHC都呈阴性。因此，结合p16和E6IHC试验，可得99.5％试验灵敏性(203个样本中202个呈p16或E6IHC阳性，表5)
表13.E6和p16蛋白表达的IHC试验结果的相关性。
E6阳性 E6阴性 总和
p16阳性 170 15 185
p16阴性 17 1 18
187 16 203
在表14中，共202个样本以E6或E7通过IHC试验进行分析。186个IHCE6阳性样本中，153个样本在E7IHC试验呈阳性。16个IHCE6阴性样本中，1个样本在E7IHC试验呈阳性。154个IHCE7阳性样本中，153个样本在E6IHC试验呈阳性。48个IHCE7阴性样本中，33个样本在E6IHC试验呈阳性。共有15个样本在E6IHC和E7IHC都呈阴性。因此，结合E6和E7IHC试验，可得92.5％试验灵敏性(202个样本中187个呈E6或E7阳性，表5)
表14.E6和E7蛋白表达的IHC试验结果相关性。
E6阳性 E6阴性 总和
E7阳性 153 1 154
E7阴性 33 15 48
186 16 202
在表15中，共202个样本以E7或p16通过IHC试验进行分析。154个IHCE7阳性样本中，142个样本在p16IHC试验呈阳性。48个IHCE7阴性样本中，42个样本在p16IHC试验呈阳性。184个IHCp16阳性样本中，142个样本在E7IHC试验呈阳性。18个IHCp16阴性样本中，12个样本在E7IHC试验呈阳性。共有6个样本在E7IHC和p16IHC都呈阴性。结合E7和p16IHC试验，可得97.0％试验灵敏性(202个样本中196个呈p16或E7IHC阳性，表5)
表15.E7和p16蛋白表达的IHC试验结果的相关性。
E7阳性 E7阴性 总和
p16阳性 142 42 184
p16阴性 12 6 18
154 48 202
在子宫颈癌肿瘤细胞中表达的HPVE6和E7致癌蛋白，以专一的抗-E6和抗-E7抗体进行IHC试验，可在大部份的样本中被检测到。这些结果强化了病原学，以及HPV致癌蛋白的分子机转在多数子宫颈癌病例中起作用。研究结果进一步显示，藉由丧失调节性的病毒E6和E7致癌蛋白的表达，可分别使p53和pRb蛋白的功能失活，造成p16INK4a的过度表达。在此研究中，如表12所示，E6抗体的灵敏性(92％)与p16INK4a抗体的灵敏性(91％)相当。虽然E7抗体的灵敏性相对较低(76％)，试验可再进一步地优化。样本IHC试验的结果显示，于子宫颈癌中HPVE6/E7致癌蛋白和p16细胞蛋白的表达并不一致，这可能在病例个体中，有许多不同路径涉及癌症的发展。因此，HPV致癌蛋白和细胞蛋白在癌症形成上都扮演重要角色，可作为诊断HPV相关性癌症的生物标记。研究不同HPV相关性癌症中的更多的生物标记将有助于提供个人化的医疗介入。
虽p16在现今实验中是被采纳的标记，但不是对于所有的病例试验都是完美的。表13显示，在18个p16IHC阴性样本中，17个样本以抗-E6抗体进行IHC呈阳性。表15显示，在18个p16IHC阴性样本中，12个样本以抗-E7抗体进行IHC呈阳性。因此，如表16所示，使用结合标记p16+E6的IHC试验提供99.5％的试验灵敏性，相较于单独使用p16，灵敏性为91.3％。使用结合标记p16+E7的IHC试验提供97.0％的试验灵敏性，相较于单独使用p16，灵敏性为91.3％。在两案例中，使用组合的标记和细胞蛋白诸如p16以及致癌蛋白诸如E6或E7进行IHC试验，增加了检测子宫颈癌的试验灵敏性。
表16.使用单一或组合标记I的HC试验的灵敏性概述。
IHC试验种类 样本数 阳性样本数 灵敏性
E6 203 187 92.1％
E7 202 154 76.2％
p16 208 190 91.3％
E6+p16 203 202 99.5％
E6+E7 202 187 92.5％
E7+p16 202 196 97.0％
E6+E7+p16 202 201 99.5％
与使用E6或p16相比较，使用单一标记E7的IHC试验提供了相对较低的灵敏性76.2％，如表5所示。使用组合标记的试验可增加灵敏性。由表15和表16综合结果显示，48个E7IHC阴性样本中，有33个样本为E6IHC阳性(表15)；48个E7IHC阴性样本中，有42个样本为p16IHC阳性(表16)。此外，这些样本中有28个都为E6和p16阳性(数据未显示)。剩下的47个E7IHC阴性病例为E6IHC阳性或p16IHC阳性，仅有一个样本是E6、E7或p16IHC阴性。因此，如表16所示，虽然E7IHC的灵敏性相对较低仅为76.2％，当使用组合标记E6+E7时，灵敏性可提升至92.5％；使用E7+p16组合标记时，则可提升至97.0％；此外，若所有三种标记都使用，IHC试验的灵敏性可更进一步提升至99.5％。任一案例中的IHC试验，使用含细胞蛋白如p16或其他致癌蛋白如E6或E7的组合标记，都使试验灵敏性增加。
IHC试验使用单一E6标记，灵敏性为92.1％，如表16所示。使用组合标记的试验显示灵敏性增加。表13显示，在E6IHC阴性的16个样本中，有15个样本使用抗-p16抗体进行IHC试验呈阳性。表3显示，在16个E6IHC阴性样本中，有一个样本使用抗-E7抗体进行IHC试验呈阳性。因此，如表16所示，使用E6+p16组合标记进行IHC试验得到99.5％的试验灵敏性，相较于单独使用E6，灵敏性为92.1％；使用E6+E7组合标记进行IHC试验得到92.5％的试验灵敏性，相较于单独使用E6，灵敏性为92.1％。任一案例中的IHC试验，使用含细胞蛋白如p16或某些其他致癌蛋白如E6或E7的组合标记，都使试验灵敏性增加。
这些数据表明，为了检测99.5％(接近100％)的子宫颈癌，须使用一种以上的生物标记。
表17显示HPVDNA分型方法和E6IHC方法结果的比较。共测试202个样本。在163个样本中，有162个阳性，1个阴性，显示E6IHC和HPVDNA试验方法结果一致(81％，163/202)。92％(162/177)的HPVDNA阳性为E6IHC阳性。87％(162/186)的E6IHC阳性为HPVDNA阳性。186个病例为E6IHC阳性，仅177个病例为HPVDNA分型阳性。在子宫颈组织检查切片中，相较于HPVDNA分型方法灵敏性(87.6％，202个样本中有177个)，E6IHC方法因此提供了较好的试验灵敏性92％(202个样本中有186个)。于16个E6IHC阴性样本中，有15个样本为HPVDNA分型阳性。HPVDNA分型阴性的25个样本中，有24个样本为E6IHC阳性。202个测试样本中，仅剩下1个样本都为E6IHC和HPVDNA分型阴性。因此，当同时结合E6IHC和HPVDNA方法时，试验灵敏性可提升至99.5％(201/202)。该结果显示，对于单一标记，E6IHC是优异的，提供简单、有效和较高的灵敏性(E6IHC92％对HPVDNA87.6％)。结合此两种方法则可进一步增加试验灵敏性至99.5％。
表17.HPVDNA分型和E6IHC方法的比较。
本研究中的所有病例都是经组织学鉴定为子宫颈癌的病例。表18显示177个HPVDNA子宫颈癌病例中的癌症类型分布。84％(149/177)的病例为鳞状细胞癌、11％(20/177)为腺癌、3.4％(6/177)为腺鳞状癌，和1.1％(2/177)为其他癌症类型。E6过度表达(E6+)的样本中，92.6％(138/149)鳞状细胞癌、80％(16/20)腺癌，和100％(6/6)的腺鳞状癌是E6IHC阳性。
表18.E6IHC和HPVDNA受试样本的癌症表征(组织学诊断)。
概述：子宫颈癌肿瘤细胞中表达的HPVE6和E7致癌蛋白可在大部份样本中利用专一性抗-E6和抗-E7抗体藉由IHC试验检测到。这些结果强化了病原学以及HPV致癌蛋白的分子机制在多数子宫颈癌病例中起作用。研究结果进一步显示，藉由丧失调节性的病毒E6和E7致癌蛋白表达可分别使p53和pRb蛋白的功能失活，造成p16INK4a的过度表达。在本研究中，E6抗体的灵敏性(92％)近似于p16INK4a抗体的灵敏性(91％)。然而，结合的E6和p16IHC试验则可进一步提升灵敏性至99.5％。
与子宫颈癌组织的HPVDNA分型方法相比较，E6IHC试验更好，提供较高的灵敏性和简单而广泛的试验。结合的IHC和HPVDNA分型方法，可进一步将试验灵敏性提升至99.5％。对于子宫颈癌样本中HPVE6/E7致癌蛋白和p16细胞蛋白的表达并不一致，可能在病例个体中，有许多不同路径涉及癌症的发展。数据显示，相较于使用单一标记物E6或p16，多重标记物(也即，结合的E6和p16IHC试验)有助于获得较高的子宫颈癌灵敏性。
在高度CIN病变中，E6和E7强烈表达于宿主的基底上皮细胞中，且大大地干扰这些宿主细胞复制能力的细胞周期控制。HPV致癌蛋白的表达干扰了宿主细胞G1-S期的调控。HPVE6和E7蛋白攻击许多细胞交互作用，例如E7使pRB失活，E6则使p53降解。高水平的HPVE7蛋白使pRB失活，并导致E2F-Rb结合受到中断。通常，pRB结合至E2F阻断E2F驱动的细胞周期活化。在复制的细胞中，E2F受RB磷酸化的调节。RB的磷酸化通常由细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK4、CDK6)所介导，其由数种激酶抑制剂(INKs)所控制。
作为Rb/E2F阻抑作用的丧失以及游离E2F的强烈活化的结果，宿主细胞蛋白质p16INK4a被强烈地过度表达。此外，由于p16INK4a介导的Cdk4/6的阻抑作用对pRB宿主蛋白并无下游效应产生，S期的基因便持续地被活化。由于E7依赖的E2F的释放并不由pRB磷酸化所介导，p16INK4a表达的反调节作用对活化的细胞周期的并无影响。在生理学条件下，当细胞遭受基因组压力形势，例如老化组织中端粒长度的大幅缩短，p16INK4a便会表达。同时，HPVE6介导p53的降解，使得细胞凋亡终止。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂p16INK4a的过度表达是丧失调节的HPV致癌基因表达的直接结果。
此外，宿主细胞蛋白对增生是重要的，且宿主细胞基因组的复制可能因HPV感染而过度表达。这些宿主细胞蛋白包含旦不限于ki67(MIB-1)、MYC细胞致癌基因、细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白A、B、E等)、CDKN2A/p16INK4a、端粒酶(例如TERC)、复制复合蛋白(例如MCM5、CDC6、拓朴异构酶IIα(TOP2A)、MCM2、微染色体维持蛋白2、4和5等)。
因此，检测HPV蛋白，例如E6、E7、L1等或其HPV感染的免疫反应的免疫试验，可藉由高通量ELISA筛选试验、快速免疫学筛选试验和其他多重蛋白质芯片试验方法等及其组合等加以进行。本发明实施方式提供各种HPV蛋白的单克隆和多克隆抗体，可使用于一种或多种试验中，包括发展出的抗体、抗原或免疫复合试验，以检测早期基因(例如E6和E7)和晚期基因(例如L1)编码的HPV病毒蛋白。此外，发展出的抗体、抗原或E6、E7、L1蛋白的免疫复合试验及其抗体为一种形式，例如，微孔板形式，可适用于单步骤的免疫层析试验，用于直接测量HPV感染所诱发的E6、E7、L1蛋白或抗体。本发明所提供的一项或多项免疫试验目标在于提供用户友好型程序以简单仪器或无需额外仪器在短时间内执行。将多种免疫学试验的结果与伴随细胞学和组织学人类对象数据的核酸杂交试验以及人口学信息相互比较，用于验证HPV感染和/或子宫颈癌诊断的相关性和正确性。
发育异常细胞的早期诊断对子宫颈癌的成功预防和治疗是重要的。预防子宫颈癌的策略需要改善HPV试验/筛选以涵盖大范围的全球族群，并密切追踪这些具有过去或现在HPV感染和/或癌前病变的对象。重要的是，目前已知妇女在发展成侵袭性癌症的前，须遭受12-15年的HPV感染。因此，重要的是能够测定本文所述的高度发育异常或癌前细胞的HPV相关性生物标记以在早期阶段的癌前筛选妇女，并找出潜在的高度CIN，这将有益于医疗介入和预防子宫颈癌发展，而非在诊断为晚期时依赖化学治疗或放射来治疗癌症的恶性肿瘤。

Claims (20)

1.专一性结合至一种或多种重组HPV蛋白的抗体在制备用以评价人类个体中乳头瘤病毒感染的疾病进展风险的试剂盒中的应用，测定包括：
由所述人类个体获得样本，所述样本包括含有蛋白质的组织样本，或含有蛋白质的细胞样本；
将所述样本与专一性结合至一种或多种重组HPV蛋白的第一一种或多种抗体进行接触，所述多种HPV重组蛋白选自重组乳头瘤病毒E6基因产物、重组乳头瘤病毒E7基因产物，所述接触在促进所述多种抗体的专一性结合的条件下进行；
测定所述样本中第一一种或多种蛋白质的存在、不存在或含量，所述第一一种或多种蛋白质与所述第一一种或多种抗体的一种或多种专一性结合，这至少部分地基于所述第一一种或多种抗体的一种或多种与所述接触样本的专一性结合的测量结果；以及
评价疾病进展的风险；
其中所述一种或多种蛋白质的所述不存在指示较小的疾病进展风险，并且所述一种或多种蛋白质的所述存在指示高的疾病进展风险。
2.权利要求1所述的应用，所述第一一种或多种蛋白质含有一种或多种蛋白质，其选自乳头瘤病毒E6基因产物、和乳头瘤病毒E7基因产物。
3.权利要求1所述的应用，所述测定进一步包括：
将所述样本与第二一种或多种抗体接触；
测定所述所述样本中第二一种或多种蛋白质的存在、不存在或含量，所述第二一种或多种蛋白质选自p16INK4a、pRB、p53、E2F、E2F活化的细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4、CDK6、Ki-67、MYC蛋白、细胞周期蛋白-A、细胞周期蛋白-B、细胞周期蛋白-E、端粒酶-TERC、MCM2、TOP2A、热休克蛋白40、热休克蛋白60、热休克蛋白70、CA9/MN、层黏蛋白5、bm-3a、CDKN2、拓朴异构酶2A、微体维持蛋白-2、微体维持蛋白-4、微体维持蛋白-5、存活蛋白、VEGF、p27和p21，这基于所述第二多种抗体的一种或多种与所述接触样本的专一性结合的测量结果；以及
筛选乳头瘤病毒感染的所述人类个体进一步基于所述第二一种或多种蛋白质存在、不存在或含量的测定。
4.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述样本为原位样本、组织样本、或细胞样本，以及所述测定包括免疫组织化学试验、免疫细胞化学分析和流式细胞仪分析方法。
5.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述测定所述疾病阶段包括测定HSIL的存在与否、晚期HPV感染的存在与否、高度发育异常的存在与否。
6.权利要求4所述的应用，其中所述测定所述疾病阶段包括测定HSIL的存在与否、晚期HPV感染的存在与否、高度发育异常的存在与否。
7.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述测定所述疾病阶段包括测定疾病阶段≥CIN2的存在与否。
8.权利要求4所述的应用，其中所述测定所述疾病阶段包括测定疾病阶段≥CIN2的存在与否。
9.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述疾病阶段为≥CIN2或＜CIN2；或所述疾病阶段为HSIL或晚期HPV感染或高度发育异常。
10.权利要求4所述的应用，其中所述疾病阶段为≥CIN2或＜CIN2；或所述疾病阶段为HSIL或晚期HPV感染或高度发育异常。
11.权利要求9所述的应用，其中所述≥CIN2为CIN2/3。
12.权利要求1所述的应用，其中所述乳头瘤病毒包括一种或多种病毒，其选自HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-54、HPV-55、HPV-56、HPV-58、HPV-59和HPV-66。
13.权利要求1所述的应用，其中所述重组乳头瘤病毒E6基因产物是重组HPV-16E6基因产物或重组HPV-18E6基因产物。
14.权利要求1所述的应用，其中所述重组乳头瘤病毒E7基因产物是重组HPV-16E7基因产物或重组HPV-18E7基因产物。
15.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述细胞样本包括正常细胞、ASC-US细胞、ASC-H细胞、LSIL细胞、HSIL细胞、ADC细胞、AGC细胞或SCC细胞。
16.权利要求4所述的应用，其中所述细胞样本包括正常细胞、ASC-US细胞、ASC-H细胞、LSIL细胞、HSIL细胞、ADC细胞、AGC细胞或SCC细胞。
17.权利要求1-3任一项所述的应用，其中所述组织样本为良性、CIN1、CIN2、CIN3、SCC、AGC或ADC。
18.权利要求4所述的应用，其中所述组织样本为良性、CIN1、CIN2、CIN3、SCC、AGC或ADC。
19.权利要求1所述的应用，所述测定进一步包括：
由所述人类个体获得第二样本，所述样本包含细胞样本；以及
对所述样本进行细胞学帕氏涂片试验；或
由所述人类个体获得第二样本，所述样本包含核酸；以及
对所述样本进行人乳突病毒的核酸杂交试验。
20.一种包含专一性结合至一种或多种重组HPV蛋白的抗体的试剂盒，包含：
进行权利要求1-14任一项所述的应用的试剂；以及
执行所述应用的说明书。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8916342B2 (en) * 2006-11-13 2014-12-23 Oncohealth Corp. Identification of high grade or ≧ CIN2 for early stages and late stages detection, screening, and diagnosis of human papillomavirus (HPV) and HPV-associated cancers
US20100003704A1 (en) 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
US8968995B2 (en) 2008-11-12 2015-03-03 Oncohealth Corp. Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
EP2521914A4 (en) 2010-01-08 2013-07-10 Oncohealth Corp CELL-BASED HPV IMMUNOTESTS HAVE A HIGH PERFORMANCE FOR DIAGNOSIS AND SCANNING OF HPV ASSOCIATED CANCER
MX351251B (es) * 2011-09-09 2017-10-06 Amgen Inc Uso del estado del virus del papiloma humano en establecer el uso de un agente que enlaza el receptor del factor de crecimiento anti-epidermal en el tratamiento de cáncer.
CN105247077A (zh) * 2013-03-28 2016-01-13 领先细胞医疗诊断有限公司 通过原位杂交区分瞬时高危型hpv感染和持续高危型hpv感染
JP6607444B2 (ja) * 2014-02-04 2019-11-20 公立大学法人横浜市立大学 子宮頸がんの前がん病変の進行を予測するための方法
US20170074881A1 (en) * 2014-05-07 2017-03-16 Vincenzo MACCALLINI Method for detecting carcinogenesis in the uterine cervix
CN104020291B (zh) * 2014-06-26 2016-03-30 南京大学 一种基于酶联免疫分析的hpv核酸检测试剂盒及其应用
CN105131113B (zh) * 2015-08-26 2019-09-06 艾托金生物医药（苏州）有限公司 用于宫颈癌检测和分级的单隆抗体及其应用
WO2018157069A1 (en) * 2017-02-25 2018-08-30 Leonardi Anthony Treatment of chronic hpv infection with the pan cdk inhibitor dinaciclib
US20200390425A1 (en) * 2017-11-28 2020-12-17 V-Veil-Up Pharma Ltd. Self sampling universal kit, methods and use
CN108037199B (zh) * 2017-11-30 2020-09-18 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白hspa5的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591574A (en) * 1988-05-13 1997-01-07 Institut Pasteur Probes, diagnostic method and immunization method based on papillomavirus types HPV 49 and HPV 50
US6709832B1 (en) * 1998-07-01 2004-03-23 Magnus Von Knebel Doeberitz Method of early diagnosis of carcinomas
CN1675550A (zh) * 2002-08-01 2005-09-28 Mtm实验室公司 基于溶液的检测方法
CN1836166A (zh) * 2003-08-25 2006-09-20 Mtm实验室公司 在溶解的体样本中检测肿瘤疾病的方法

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3633999A (en) 1970-07-27 1972-01-11 Richard G Buckles Removing speckle patterns from objects illuminated with a laser
US4511220A (en) 1982-12-23 1985-04-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Laser target speckle eliminator
US4619508A (en) 1984-04-28 1986-10-28 Nippon Kogaku K. K. Illumination optical arrangement
US5876922A (en) 1985-07-31 1999-03-02 Institute Pasteur Papillomavirus probe and a process for in vitro diagnosis of papillomavirus infections
DE3686304T2 (de) 1985-04-04 1993-02-11 Univ Georgetown Typenspezifische papillomavirus-dns-sequenzen und peptide.
US4744615A (en) 1986-01-29 1988-05-17 International Business Machines Corporation Laser beam homogenizer
AU615159B2 (en) 1986-03-21 1991-09-26 F. Hoffmann-La Roche Ltd Determined dna sequences derived from a papillomavirus genome, their uses for in vitro diagnostic purposes and the production of antigenic compositions
US4777239A (en) 1986-07-10 1988-10-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Diagnostic peptides of human papilloma virus
DE3625257A1 (de) 1986-07-23 1988-02-04 Behringwerke Ag Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika
JPH0786647B2 (ja) 1986-12-24 1995-09-20 株式会社ニコン 照明装置
US5307207A (en) 1988-03-16 1994-04-26 Nikon Corporation Illuminating optical apparatus
US5180806A (en) 1988-05-16 1993-01-19 The Scripps Research Institute Polypeptides and compositions of human papillomavirus latent proteins, diagnostic systems and methods
JPH02219591A (ja) 1989-02-21 1990-09-03 Kanebo Ltd 抗ヒトパピローマウイルスモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ並びに該抗体の製造方法
US5045447A (en) 1989-03-15 1991-09-03 Minson Anthony C Method of producing antibodies to HPV
US5109465A (en) 1990-01-16 1992-04-28 Summit Technology, Inc. Beam homogenizer
US5061025A (en) 1990-04-13 1991-10-29 Eastman Kodak Company Hologon scanner with beam shaping stationary diffraction grating
FR2670797A1 (fr) 1990-12-20 1992-06-26 Pasteur Institut Sequences d'adn determinees derivees du genome du papillomavirus hpv39, application de ces sequences au diagnostic in vitro d'infection par ce papillomavirus, et a la production de composition immunogene.
PT523391E (pt) 1991-07-13 2003-08-29 Dade Behring Marburg Gmbh Utilizacao dos peptidos derivados dos genes hpv-16 e6 e e7 para fins de diagnostico
DE4123760C2 (de) 1991-07-18 2000-01-20 Dade Behring Marburg Gmbh Seroreaktive Bereiche auf den HPV 16 Proteinen E1 und E2
US5709860A (en) 1991-07-25 1998-01-20 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
DE69230693T2 (de) 1991-11-14 2000-06-15 Dgi Inc Nicht-radioaktives hybridisations testverfahren und satz
US5224200A (en) 1991-11-27 1993-06-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Energy Coherence delay augmented laser beam homogenizer
US5233460A (en) 1992-01-31 1993-08-03 Regents Of The University Of California Method and means for reducing speckle in coherent laser pulses
US5328785A (en) 1992-02-10 1994-07-12 Litel Instruments High power phase masks for imaging systems
JPH06140704A (ja) 1992-10-26 1994-05-20 Mitsubishi Electric Corp レーザ光照射装置
US5315427A (en) 1992-12-14 1994-05-24 Xerox Corporation Pair of binary diffraction optics for use in overfilled raster output scanning systems
JPH06232069A (ja) 1993-02-04 1994-08-19 Semiconductor Energy Lab Co Ltd 半導体装置の作製方法
US5532348A (en) 1993-07-30 1996-07-02 United States Of America E6 associated protein and methods of use thereof
US5679509A (en) 1993-09-28 1997-10-21 University Of New Mexico Methods and a diagnostic aid for distinguishing a subset of HPV that is associated with an increased risk of developing cervical dysplasia and cervical cancer
US5610733A (en) 1994-02-28 1997-03-11 Digital Optics Corporation Beam-homogenizer
US5453814A (en) 1994-04-13 1995-09-26 Nikon Precision Inc. Illumination source and method for microlithography
AUPM566794A0 (en) 1994-05-17 1994-06-09 University Of Queensland, The Process and product
JPH0837139A (ja) 1994-07-21 1996-02-06 Sony Corp 露光照明装置
CA2202090C (en) 1994-10-07 2012-04-17 Lutz Gissmann Papilloma virus-like particles, fusion proteins as well as processes for their production
US5621529A (en) 1995-04-05 1997-04-15 Intelligent Automation Systems, Inc. Apparatus and method for projecting laser pattern with reduced speckle noise
US5759864A (en) 1995-06-23 1998-06-02 Cedars Sinai Medical Center Methods for reducing background binding in antibody preparations
US5699191A (en) 1996-10-24 1997-12-16 Xerox Corporation Narrow-pitch beam homogenizer
US5754278A (en) 1996-11-27 1998-05-19 Eastman Kodak Company Image transfer illumination system and method
US5888888A (en) 1997-01-29 1999-03-30 Ultratech Stepper, Inc. Method for forming a silicide region on a silicon body
FR2766091A1 (fr) 1997-07-18 1999-01-22 Transgene Sa Composition antitumorale a base de polypeptide immunogene de localisation cellulaire modifiee
CA2298840A1 (en) 1997-08-05 1999-02-18 Stressgen Biotechnologies Corporation Immune responses against hpv antigens elicited by compositions comprising an hpv antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CA2214461A1 (en) 1997-09-02 1999-03-02 Mcgill University Screening method for determining individuals at risk of developing diseases associated with different polymorphic forms of wildtype p53
WO1999029890A2 (en) 1997-12-12 1999-06-17 Digene Corporation Assessment of human papilloma virus-related disease
US6420106B1 (en) 1999-06-09 2002-07-16 Quantovir Ab Method and kit for early cancer prediction
US6713077B1 (en) 1999-07-28 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Control of shoot/foliar feeding pests with pesticide seed treatments
US7001995B1 (en) 1999-08-25 2006-02-21 Merck & Co., Inc. Synthetic human papillomavirus genes
US6890514B2 (en) 2000-01-28 2005-05-10 Musc Foundation For Research Development Methods for determining risk of developing cervical cancer
US6743593B2 (en) 2000-04-05 2004-06-01 Impact Diagnostics, Inc. Immunological methodology for discerning human papillomavirus
AU2001275438A1 (en) 2000-07-06 2002-01-21 Georgetown University Stable (fixed) forms of viral capsid proteins, fusion proteins and uses thereof
US7312041B2 (en) 2001-02-16 2007-12-25 Arbor Vita Corporation Methods of diagnosing cervical cancer
US20040229298A1 (en) 2000-11-11 2004-11-18 Lu Peter S. Methods and compositions for treating cervical cancer
US6329167B1 (en) 2000-12-05 2001-12-11 Bruce K. Patterson Method of testing adequacy of cells in a specimen
DE10063179A1 (de) 2000-12-18 2002-06-20 Bayer Ag Verfahren zur spezifischen Detektion von Tumorzellen und ihren Vorstufen in Gebärmutterhalsabstrichen durch simultane Messung von mindestens zwei verschiedenen molekularen Markern
US20030190602A1 (en) 2001-03-12 2003-10-09 Monogen, Inc. Cell-based detection and differentiation of disease states
US6933123B2 (en) 2001-04-05 2005-08-23 Yao Xiong Hu Peptides from the E2, E6, and E7 proteins of human papilloma viruses 16 and 18 for detecting and/or diagnosing cervical and other human papillomavirus associated cancers
FR2824326B1 (fr) 2001-05-04 2004-03-19 Commissariat Energie Atomique Melange de peptides issus des proteines e6 et/ou e7 de papillomavirus et leurs applications
US20030044870A1 (en) 2001-07-13 2003-03-06 Peter Sehr Generic capture elisa using recombinant fusion proteins for detecting antibodies in biological samples
US20090075377A1 (en) 2001-08-03 2009-03-19 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
US20030143571A1 (en) 2001-08-08 2003-07-31 North Carolina State University Infectious disease microarray
US6884605B2 (en) 2001-08-09 2005-04-26 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Compositions, methods and products comprising human papillomavirus for detecting and treating a cancer
GB2379220A (en) 2001-08-13 2003-03-05 Univ York Antibodies to HPV E2 protein
WO2003080669A2 (en) 2002-03-22 2003-10-02 Amynon Biotech Gmbh Anti-hpv-16 e7 antibodies and their use
EP1369694A1 (en) 2002-04-09 2003-12-10 MTM Laboratories AG Method for discrimination of metaplasias from neoplastic or preneoplastic lesions
CA2777534A1 (en) 2002-12-26 2004-07-15 Meso Scale Technologies, Llc Methods, compositions and kits for biomarker extraction
EP1656561A2 (de) 2003-03-25 2006-05-17 BUCHNER, Erwin Verfahren zur frühdiagnose von carcinomen und testkit zu dessen durchführung
DE60318294T2 (de) 2003-03-31 2008-12-11 Stichting Researchfonds Pathologie Nachweis von invasivem Krebs induziert von HPV und dessen Vorläufer Läsionen mit Invasionspotential
US7361460B2 (en) 2003-04-11 2008-04-22 Digene Corporation Approach to molecular diagnosis of human papillomavirus-related diseases
US20040260157A1 (en) 2003-06-20 2004-12-23 Montes Miguel A. Method for automated screening of cervical/endocervical malignant and premalignant epithelial lesions using flow cytometry with HPV DNA fluorescent in-situ hybridization ( FISH) technology
WO2005008248A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Georgetown University Diagnosis and treatment of cervical cancer
EP1664785A1 (en) * 2003-09-17 2006-06-07 Amynon BioTech GmbH Combination of anti-hpv-16 and 18 antibodies and uses thereof
RU2251699C1 (ru) 2003-09-25 2005-05-10 Киселев Всеволод Иванович Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака
WO2005033333A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-14 Dako Denmark A/S Methods and compositions for the diagnosis of cancer
US20050147621A1 (en) 2003-10-10 2005-07-07 Higgins Darren E. Use of bacterial 5' untranslated regions for nucleic acid expression
WO2005046263A1 (en) 2003-10-30 2005-05-19 Interdigital Technology Corporation Architecture for implementation of radio access bearer manager (rabm) and packet data convergence protocol (pdcp) process
JP5030594B2 (ja) 2003-12-23 2012-09-19 アルボー ビータ コーポレーション Ｈｐｖの発癌性株に対する抗体およびそれらの使用方法
JP2007530045A (ja) 2004-03-23 2007-11-01 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトｏｘ４０ｌ（ｃｄ１３４ｌ）特異性モノクローナル抗体
US7157233B2 (en) 2004-03-24 2007-01-02 Tripath Imaging, Inc. Methods and compositions for the detection of cervical disease
JP4474264B2 (ja) 2004-08-20 2010-06-02 生寶生物科技股▲ふん▼有限公司 子宮頸癌抑制の融合蛋白
US7354719B2 (en) 2004-12-08 2008-04-08 Gen-Probe Incorporated Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses
US7314630B2 (en) 2005-01-07 2008-01-01 Yao-Xiong Hu Compounds and methods of early diagnosis of cervical cancer and genital condyloma with HPV, CHSP60 tumor suppressor H-Ras, K-Ras and PTEN derived peptides modified
CA2596698C (en) 2005-02-01 2017-05-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Papillomavirus l2 n-terminal peptides for the induction of broadly cross-neutralizing antibodies
US7524631B2 (en) 2005-02-02 2009-04-28 Patterson Bruce K HPV E6, E7 mRNA assay and methods of use thereof
US7595380B2 (en) 2005-04-27 2009-09-29 Tripath Imaging, Inc. Monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease
US20060269967A1 (en) 2005-05-27 2006-11-30 Show-Li Chen Novel diagnosis & treatment tools for cancer using the NRIP antibody and RNA interference
US7732166B2 (en) * 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
US7632498B2 (en) 2005-12-19 2009-12-15 Tripath Imaging, Inc. MCM6 and MCM7 monoclonal antibodies and methods for their use in the detection of cervical disease
KR20080106434A (ko) 2006-02-13 2008-12-05 프라운호퍼 유에스에이, 인코포레이티드 Ｈｐｖ 항원, 백신 조성물 및 관련된 방법
US20080038738A1 (en) 2006-05-10 2008-02-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Detecting tumor biomarker in oral cancer
US8916342B2 (en) * 2006-11-13 2014-12-23 Oncohealth Corp. Identification of high grade or ≧ CIN2 for early stages and late stages detection, screening, and diagnosis of human papillomavirus (HPV) and HPV-associated cancers
US20100003704A1 (en) 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
US7838215B2 (en) 2007-09-25 2010-11-23 Canvir, Inc. Advanced cervical cell screening methods
WO2009079192A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Ribo Guo Universal tandem solid-phases based immunoassay
TWI497075B (zh) 2009-06-11 2015-08-21 Oncohealth Corp 早期及晚期人類乳突病毒感染之偵測
EP2521914A4 (en) 2010-01-08 2013-07-10 Oncohealth Corp CELL-BASED HPV IMMUNOTESTS HAVE A HIGH PERFORMANCE FOR DIAGNOSIS AND SCANNING OF HPV ASSOCIATED CANCER

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591574A (en) * 1988-05-13 1997-01-07 Institut Pasteur Probes, diagnostic method and immunization method based on papillomavirus types HPV 49 and HPV 50
US6709832B1 (en) * 1998-07-01 2004-03-23 Magnus Von Knebel Doeberitz Method of early diagnosis of carcinomas
CN1675550A (zh) * 2002-08-01 2005-09-28 Mtm实验室公司 基于溶液的检测方法
CN1836166A (zh) * 2003-08-25 2006-09-20 Mtm实验室公司 在溶解的体样本中检测肿瘤疾病的方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010129821A1 (en) 2010-11-11
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US8916342B2 (en) 2014-12-23
US20120052486A1 (en) 2012-03-01
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CN102449479B (zh) 鉴别高度或≥cin2用于人乳头瘤病毒(hpv)与hpv相关癌症的早期及晚期检测、筛检和诊断
US9568474B2 (en) In situ detection of early stages and late stages HPV infection
JP5819851B2 (ja) Ｈｐｖ関連の癌の治療及びスクリーニングのための細胞に基づいた高処理能力ｈｐｖ免疫アッセイ
US20080200344A1 (en) Protein chips for HPV detection
Awan et al. Comparison of polymerase chain reaction and immunohistochemistry assays for analysing human papillomavirus infection in oral squamous cell carcinoma
Queiroz et al. Comparative study of the expression of cellular cycle proteins in cervical intraepithelial lesions
TWI497075B (zh) 早期及晚期人類乳突病毒感染之偵測
Zheng et al. HPV58 E7 protein expression profile in cervical cancer and CIN with immunohistochemistry
Manoli et al. Low-cost Cervical Cancer Screening Methods in Poor Resource Settings A Review
Al‐Awadhi et al. Evaluation of NMP179 for the detection of squamous intraepithelial neoplasia in ThinPrep cervical slides using a combination of double immunostaining and morphometric methods of analysis
Kravchuk Indices of Immunohistochemical Markers in Women with Genital Viral Infection
Embryol RUXANDRA STĂNCULESCU, ELVIRA BRĂTILĂ, VASILICA BAUŞIC 2), TEODORA VLĂDESCU 3)
Kostopoulou et al. Immunohistochemistry in the Diagnosis of Squamous Intraepithelial Lesions of the Uterine Cervix
MX2013013365A (es) Sistema integrado de alto rendimiento de deteccion de enfermidades ginocologicas.

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