CN108037199B - 一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白hspa5的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，先进行肉鸡热休克蛋白HSPA5的提取，再对肉鸡热休克蛋白HSPA5进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡热休克蛋白HSPA5的相对定量；所述肉鸡热休克蛋白HSPA5的特异性肽段为3条，3条特异性肽段的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明的相对定量方法相对于基于抗体Western Blot法特异性更强，并且免去了制备抗体的繁琐步骤，提高了鸡源HSPA5蛋白检测通量和效率。

Description

一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，特别是指一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法。
背景技术
在全球环境变暖和集约化养殖条件下，肉鸡的养殖密度逐渐变大，热应激已成为肉鸡养殖过程中普遍面临的问题。热应激是动物生长过程中常见的一种体外应激，当动物的生长环境温度超过其代谢稳定区上限，通过机体物理调节不能维持热平衡时，导致机体会产生应对环境高温所产生的非特异性应答反应。热应激会造成肉鸡采食量下降、生长速度慢、体增重降低、饲料转化率低。据报道，慢性热应激显著降低肉鸡采食量(-16.4％)、体增重(-32.6％)和提高了料重比(+25.6％)。同时，热应激还影响消化代谢，降低肉品质，严重的会造成肉鸡免疫力下降，导致死亡率升高，给肉鸡生产带了巨大经济损失。据报道，美国每年因热应激造成畜牧生产损失约16.9-23.6亿美元，其中家禽生产损失达1.25-1.65亿美元，肉鸡损失约5200万美元。相比美国，我国也是肉鸡养殖大国，生产与消费均位居世界第二，但行业集团化、产业化程度不足，养殖环境控制能力弱，热应激对我国肉鸡生产造成的损失更为严重。
在热应激条件下，动物会产生一组热休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)，这一现象称热休克应答。HSPs是一组分子量不等的酸性蛋白(等电点5.10～ 6.15)，目前按相对分子量以及同源程度可分为HSP90、HSP70、小分子HSP 和泛素4个家族。HSP70家族是一类最保守和最重要的热应激蛋白家族，包括分子量为68、72、73、75、78KD等多种蛋白，它们具有相同的等电点和相似的胰蛋白酶肽谱。HSPA5是肉鸡体内非常重要的一类热休克蛋白，其在肉鸡体内表达含量的变化随着热应激水平的变化而变化，是反应热应激水平的重要生理指标。现在判断HSPA5在体内相对含量的分析方法主要是在mRNA水平、蛋白质水平进行比较，通过提取组织体内RNA后反转成cDNA，根据HSPA5 基因设计特异性引物对cDNA模板进行扩增，使用荧光实时定量PCR技术对模板中HSPA5转录水平进行比较分析。由于基因转录后，还需经历剪切和拼接等转录后调控才能表达成蛋白，因此基因在转录水平上表达量并不能真实反应其基因产物蛋白的表达量。目前，在蛋白水平上分析HSPA5最能反应出该蛋白在组织、细胞和体液中的表达含量，通常会采用酶联免疫法、Western Blot、组织原位杂交等方法，然而以上蛋白水平检测方法都需要高质量的抗体特异识别HSPA5蛋白。由于现在市场上的制备抗体的抗原蛋白多数来源于人、小鼠和大鼠等模式生物，针对鸡源HSPA5的抗体在市场上还未有出现，导致现在还没有能在蛋白水平上定量分析肉鸡HSPA5表达量的方法。若想建立在蛋白水平定量分析肉鸡HSPA5的方法，需要制备可特异识别肉鸡HSPA5的抗体。制备HSPA5单克隆抗体可以提高抗体的特异性，减少非特异结合和交叉反应，但是单克隆控体周期长、费用高；若制备HSPA5多克隆抗体可以减少费用，但是非特异性的交叉反应较为严重，成功率很低。
根据定量HSPA5蛋白的表达需求，综合考虑现有的分析方法，本发明使用多重离子检测的方法建立一种基于质谱技术的HSPA5蛋白定量方法，该方法不需要制备抗体，根据HSPA5特异性肽段序列设计子母离子对和碰撞能量，实现在蛋白质水平上对HSPA5蛋白进行相对定量分析，大大提高了检测灵敏度、准确性和检测通量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白 HSPA5的方法。本发明主要是为了实现相对定量分析肉鸡体内HSPA5蛋白在不同组织内表达含量变化，使用质谱技术建立了一种无需抗体的高通量检测方法。本发明主要利用质谱可以分析不同肽段质量，并能在可控条件性对复杂样本中的特定肽段进行碎裂，并再次分析特定多肽产生的碎裂小肽的质量，根据以上原理通过优化碰撞能量寻找到特异子母离子对，使用特异子母离子对实现对肉鸡热休克蛋白HSPA5的相对定量分析。
基于上述目的，本发明提供的一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5 的方法，先进行肉鸡热休克蛋白HSPA5的提取，再对肉鸡热休克蛋白HSPA5 进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡热休克蛋白HSPA5的相对定量。
在本发明的一些实施例中，所述肉鸡热休克蛋白HSPA5的特异性肽段为3条，3条特异性肽段的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3所示；
其中，SEQ ID NO:1：Glu-Leu-Glu-Glu-Val-Val-Gln-Pro-Ile-Val-Ser-Lys；
SEQ ID NO:2：Ile-Ile-Asn-Glu-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ile-Ala-Tyr-Gly-Leu -Asp-Lys；
SEQ ID NO:3：Val-Glu-Ile-Ile-Ala-Asn-Asp-Gln-Gly-Asn-Arg。
在本发明的一些实施例中，SEQ ID NO:1所示的特异性肽段的母离子为 685.4m/z，子离子为671.4m/z、770.5m/z、869.5m/z，子离子所对应的碰撞电压为30～35V；SEQ IDNO:2所示的特异性肽段的母离子为830.5m/z，子离子为666.3m/z，850.5m/z，921.5m/z，子离子所对应的碰撞电压为35～ 40V；SEQ ID NO:3所示的特异性肽段的母离子为614.8m/z，子离子为 703.3m/z，774.3m/z，887.4m/z，子离子所对应的碰撞电压为30～35V。
在本发明的一些实施例中，SEQ ID NO:1所示的特异性肽段的信号强度为子离子671.4m/z、770.5m/z、869.5m/z的信号强度总和，SEQ ID NO:2 所示的特异性肽段的信号强度为子离子666.3m/z，850.5m/z，921.5m/z的信号强度总和，SEQ ID NO:3所示的特异性肽段的信号强度为子离子 703.3m/z，774.3m/z，887.4m/z的信号强度总和，肉鸡热休克蛋白HSPA5 的信号强度为SEQ ID NO:1所示的特异性肽段、SEQ ID NO:2所示的特异性肽段和SEQ ID NO:3所示的特异性肽段这三条特异性肽段的信号强度总和。
在本发明的一些实施例中，先采用液质联用仪中的高效液相色谱对3条特异性肽段进行分离，然后进入质谱进行检测；其中，分离3条特异性肽段的条件为：色谱柱为C18填料的毛细管色谱柱，流速设置在200～500nL/min，流动相A为：水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为：乙腈+0.1wt％甲酸 +5wt％DMSO，在分离3条特异性肽段时采用梯度洗脱，流行相梯度为：0～1 min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A； 70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～ 81min，95％A；81～90min，95％A。
在本发明的一些实施例中，肉鸡热休克蛋白HSPA5的提取步骤为：使用蛋白质提取缓冲液提取不同处理下肉鸡组织中的肉鸡热休克蛋白HSPA5，并对提取到的总蛋白定量；
酶切肉鸡热休克蛋白HSPA5获得特异性肽段步骤为：取不同处理样品的总蛋白，先打开二硫键再封闭蛋白质内部巯基，然后依次加入胞内蛋白酶和胰蛋白酶进行酶切，终止酶切反应后，得到特异性肽段。
在本发明的一些实施例中，在肉鸡热休克蛋白HSPA5的提取步骤中，所述蛋白质提取缓冲液的成分为：50～100mM Tris-HCl，0.1～0.5M NaCl，10～ 20mM二硫苏糖醇，0.5～2wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 7.2～8.0；使用蛋白质提取缓冲液在90～100℃下水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的肉鸡热休克蛋白HSPA5 15～30min。
在本发明的一些实施例中，在酶切产生特异性肽段步骤中，先使用二硫苏糖醇打开二硫键，再通过乙酰胺封闭蛋白质内部巯基，添加甲酸或三氟乙酸终止酶切反应。
在本发明的一些实施例中，在酶切产生特异性肽段步骤中，依次加入胞内蛋白酶和胰蛋白酶进行酶切的具体步骤为：先按照胞内蛋白酶和总蛋白的质量比为1:100～200的比例加入胞内蛋白酶，酶切总蛋白4～6小时后，再按照胰蛋白酶和总蛋白的质量比为1:30～60的比例加入胰蛋白酶，酶切12～16小时。
在本发明中，一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，包括以下步骤：
(1)HSPA5蛋白提取
使用蛋白质提取缓冲液(50～100mM Tris-HCl，0.1～0.5M NaCl，10～ 20mM二硫苏糖醇(DTT)，0.5～2％十二烷基麦芽糖苷(DDM)，pH 7.2～8.0) 在90～100℃水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的HSPA5蛋白15～30min，并对提取到的总蛋白质进行定量；
(2)酶切产生代表的特异性肽段
精确称取相同质量的不同处理样品的总蛋白，通过乙酰胺封闭蛋白质内部的巯基后，使用按照1：100～200(胞内蛋白酶Lys-C：总蛋白；质量比)的比例，酶切总蛋白4～6小时后，再按照1：30～60(胰蛋白酶：总蛋白；质量比)的比例加入胰蛋白酶12～16小时，添加1～5wt％的甲酸或者三氟乙酸终止酶切反应，并在40～50℃条件下旋转挥干样品中的缓冲液，得到特异性肽段；
通过以上操作获得序列为ELEEVVQPIVSK(SEQ ID NO:1所示)， IINEPTAAAIAYGLDK(SEQ ID NO:2所示)，和VEIIANDQGNR(SEQ ID NO:3所示)的三条特异肽段；
(3)HSPA5特异性肽段的分离
使用液质联用仪对特异性肽段序列进行分离和信号采集，其中，分离特异性肽段的色谱柱为C18填料的毛细管色谱柱，流速设置在200～500nL/min，流动相A为水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为乙腈+0.1wt％甲酸 +5wt％DMSO，在分离特异性肽段时采用梯度洗脱，流行相梯度为：0～1min， 95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～ 75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min， 95％A；81～90min，95％A；保证三条特异性肽段依次进入质谱进行分析；
(4)多重离子监测方法分析样品中特异性肽段的信号强度
设置特异性肽段的三个子母离子对分别为：m/z 685.4为ELEEVVQPIVSK 的母离子，在30～35V碰撞电压下产生的子离子为m/z 671.4，m/z 770.5，m/z 869.5；m/z 830.5为IINEPTAAAIAYGLDK的母离子，在35～40V碰撞电压下产生的子离子为m/z 666.3，m/z850.5，m/z 921.5；m/z 614.8为 VEIIANDQGNR的母离子，在30～35V碰撞电压下产生的子离子为m/z 703.3， m/z 774.3，m/z 887.4；
在该步骤中使用m/z 685.4产生的m/z 671.4，m/z 770.5，m/z 869.5信号强度总和代表ELEEVVQPIVSK的信号强度，使用m/z 830.5产生的m/z 666.3， m/z 850.5，m/z921.5信号强度总和代表IINEPTAAAIAYGLDK的信号强度，使用m/z 614.8产生的m/z 703.3，m/z 774.3，m/z 887.4信号强度总和代表 VEIIANDQGNR的信号强度。使用ELEEVVQPIVSK，IINEPTAAAIAYGLDK 和VEIIANDQGNR三条特异多肽的信号总和代表HSPA5蛋白的信号强度。最终，通过比较不同样品中HSPA5的信号强度，实现不同样品中HSPA5蛋白的相对定量。
与现有技术相比，本发明相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法具有以下有益效果：
本发明使用液质联用仪，通过多重离子检测方法实现对不同样品中 HSPA5蛋白质的相对定量，主要是通过胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶两次酶切产生HSPA5的ELEEVVQPIVSK，IINEPTAAAIAYGLDK和 VEIIANDQGNR共3条特异性肽段，使用液质联用仪一次特异检测 ELEEVVQPIVSK，IINEPTAAAIAYGLDK和VEIIANDQGNR子母离子对实现对HSPA5的定量分析。本发明的相对定量方法相对于基于抗体 Western Blot法特异性更强，并且免去了制备抗体的繁琐步骤，提高了鸡源 HSPA5蛋白检测通量和效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的ELEEVVQPIVSK 的质谱图；
图2为本发明实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的 IINEPTAAAIAYGLDK的质谱图；
图3为本发明实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的VEIIANDQGNR的质谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1 一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法
在本实施例中，所述相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法包括以下步骤：
(1)HSPA5蛋白提取
分别取0.1g对照组和热处理组肉鸡肝脏组织(热处理组肝脏样品来源于肉鸡在33℃处理24小时的肉鸡，对照组肝脏样品来源于同期肉鸡在25℃处理 24小时的肉鸡)，按照1：5(质量比)的比例加入蛋白质提取缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM二硫苏糖醇，1％十二烷基麦芽糖苷，pH 8.0)，在90～100℃水浴中提取肉鸡组织中的HSPA5蛋白15～30min，匀浆后通过 20000g 4℃离心30min后取上清液，使用BCA方法对上清中的总蛋白进行蛋白定量。
(2)酶切产生代表的特异性肽段
分别取不同组别样品50ug，先使用10mM二硫苏糖醇在50℃还原1h打开二硫键，再用20mM的碘乙酰胺在黑暗条件下封闭巯基反应30min；按照1：200(质量比)的比例加入Lys-C在37℃条件下酶切4h，再按照1：50(质量比)的比例加入胰蛋白酶在37℃条件下酶切12个小时，使用1wt％的甲酸终止反应，并在40℃的条件下挥发掉所有的酶切缓冲液，得到干燥好的特异性肽段。
(3)HSPA5特异性肽段的分离
使用50ul的95wt％水+5wt％+0.1wt％甲酸重新溶解干燥好的特异性肽段，使用nanoLC-QTRAQ 6500对重溶的特异性肽段进行多重离子监测定量分析，分析时使用的C18毛细管分析柱规格为：75μm×15cm ChromXP C18-CL 3μm
Figure BDA0001489303850000071
流动相A为水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A；流速为300nl/min，保证三条特异性肽段依次进入质谱进行分析。
(4)多重离子监测方法分析样品中特异性肽段的信号强度
质谱参数设置为：m/z 685.4为ELEEVVQPIVSK(SEQ ID NO:1所示) 的母离子，在33.5V碰撞电压下产生的子离子为m/z 671.4，m/z 770.5，m/z 869.5；m/z 830.5为IINEPTAAAIAYGLDK(SEQ ID NO:2所示)的母离子，在38.8V碰撞电压下产生的子离子为m/z666.3，m/z 850.5，m/z 921.5；m/z 614.8 为VEIIANDQGNR(SEQ ID NO:3所示)的母离子，在31V碰撞电压下产生的子离子为m/z 703.3，m/z 774.3，m/z 887.4。
在该步骤中，使用m/z 685.4产生的m/z 671.4，m/z 770.5，m/z 869.5信号强度总和代表ELEEVVQPIVSK的信号强度，使用m/z 830.5产生的m/z 666.3， m/z 850.5，m/z921.5信号强度总和代表IINEPTAAAIAYGLDK的信号强度，使用m/z 614.8产生的m/z 703.3，m/z 774.3，m/z 887.4信号强度总和代表 VEIIANDQGNR的信号强度。使用ELEEVVQPIVSK，IINEPTAAAIAYGLDK 和VEIIANDQGNR三条特异肽段的信号总和代表HSPA5蛋白的信号强度，通过比较对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中HSPA5的信号强度，实现对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中HSPA5蛋白的相对定量。
实施例2 一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法
在本实施例中，所述相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法包括以下步骤：
(1)HSPA5蛋白提取
分别取0.1g对照组和热处理组肉鸡肝脏组织(热处理组肝脏样品来源于肉鸡在33℃处理18小时的肉鸡，对照组肝脏样品来源于同期肉鸡在25℃处理 18小时的肉鸡)，按照1：5(质量比)的比例加入蛋白质提取缓冲液(100mM Tris-HCl，0.1M NaCl，20mM二硫苏糖醇，2wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 7.2)，在90～100℃水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的HSPA5蛋白15～30min，匀浆后通过20000g 4℃离心30min后取上清液，使用BCA方法对上清中的总蛋白进行蛋白定量。
(2)酶切产生代表的特异性肽段
分别取不同组别样品50ug，先使用10mM二硫苏糖醇在50℃还原1h打开二硫键，再用20mM的碘乙酰胺在黑暗条件下封闭巯基反应30min；按照1： 100(质量比)的比例加入Lys-C在37℃条件下酶切6h，再按照1：30(质量比)的比例加入胰蛋白酶在37℃条件下酶切16个小时，使用1wt％的三氟乙酸终止反应，并在50℃的条件下挥发掉所有的酶切缓冲液，得到干燥好的特异性肽段。
(3)HSPA5特异性肽段的分离
使用50ul的95wt％水+5wt％+0.1wt％甲酸重新溶解干燥好的特异性肽段，使用nanoLC-QTRAQ 6500对重溶的特异性肽段进行多重离子监测定量分析，分析时使用的C18毛细管分析柱规格为：75μm×15cm ChromXP C18-CL 3μm
Figure BDA0001489303850000081
流动相A为水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A；流速为500nl/min，保证三条特异性肽段依次进入质谱进行分析。
(4)多重离子监测方法分析样品中特异性肽段的信号强度
质谱参数设置为：m/z 685.4为ELEEVVQPIVSK(SEQ ID NO:1所示) 的母离子，在31.5V碰撞电压下产生的子离子为m/z 671.4，m/z 770.5，m/z 869.5；m/z 830.5为IINEPTAAAIAYGLDK(SEQ ID NO:2所示)的母离子，在39.8V碰撞电压下产生的子离子为m/z666.3，m/z 850.5，m/z 921.5；m/z 614.8 为VEIIANDQGNR(SEQ ID NO:3所示)的母离子，在35V碰撞电压下产生的子离子为m/z 703.3，m/z 774.3，m/z 887.4。
在该步骤中使用m/z 685.4产生的m/z 671.4，m/z 770.5，m/z 869.5信号强度总和代表ELEEVVQPIVSK的信号强度，使用m/z 830.5产生的m/z 666.3， m/z 850.5，m/z921.5信号强度总和代表IINEPTAAAIAYGLDK的信号强度，使用m/z 614.8产生的m/z 703.3，m/z 774.3，m/z 887.4信号强度总和代表 VEIIANDQGNR的信号强度。使用ELEEVVQPIVSK，IINEPTAAAIAYGLDK 和VEIIANDQGNR三条特异多肽的信号总和代表HSPA5蛋白的信号强度，通过比较对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中HSPA5的信号强度，实现对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中HSPA5蛋白的相对定量。
实施例3 一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法
在本实施例中，所述相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法包括以下步骤：
(1)HSPA5蛋白提取
分别取0.1g对照组和热处理组肉鸡肝脏组织(热处理组肝脏样品来源于肉鸡在33℃处理30小时的肉鸡，对照组肝脏样品来源于同期肉鸡在25℃处理 30小时的肉鸡)，按照1：5(质量比)的比例加入蛋白质提取缓冲液(80mM Tris-HCl，0.3M NaCl，15mM二硫苏糖醇，1wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 7.5)，在90～100℃水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的HSPA5蛋白15～30min，匀浆后通过20000g 4℃离心30min后取上清液，使用BCA方法对上清中的总蛋白进行蛋白定量。
(2)酶切产生代表的特异性肽段
分别取不同组别样品50ug，先使用10mM二硫苏糖醇在50℃还原1h打开二硫键，再用20mM的碘乙酰胺在黑暗条件下封闭巯基反应30min；按照1： 150(质量比)的比例加入Lys-C在37℃条件下酶切5h，再按照1：60(质量比)的比例加入胰蛋白酶在37℃条件下酶切14个小时，使用5wt％的三氟乙酸终止反应，并在45℃的条件下挥发掉所有的酶切缓冲液，得到干燥好的特异性肽段。
(3)HSPA5特异性肽段的分离
使用50ul的95wt％水+5wt％+0.1wt％甲酸重新溶解干燥好的特异性肽段，使用nanoLC-QTRAQ 6500对重溶的特异性肽段进行多重离子监测定量分析，分析时使用的C18毛细管分析柱规格为：75μm×15cm ChromXP C18-CL 3μm
Figure BDA0001489303850000101
流动相A为水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A； 1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A；流速为300nl/min，保证三条特异性肽段依次进入质谱进行分析。
(4)多重离子监测方法分析样品中特异性肽段的信号强度
质谱参数设置为：m/z 685.4为ELEEVVQPIVSK(SEQ ID NO:1所示) 的母离子，在34.8V碰撞电压下产生的子离子为m/z 671.4，m/z 770.5，m/z 869.5；m/z 830.5为IINEPTAAAIAYGLDK(SEQ ID NO:2所示)的母离子，在35.5V碰撞电压下产生的子离子为m/z666.3，m/z 850.5，m/z 921.5；m/z 614.8 为VEIIANDQGNR(SEQ ID NO:3所示)的母离子，在34V碰撞电压下产生的子离子为m/z 703.3，m/z 774.3，m/z 887.4。
在该步骤中使用m/z 685.4产生的m/z 671.4，m/z 770.5，m/z 869.5信号强度总和代表ELEEVVQPIVSK的信号强度，使用m/z 830.5产生的m/z 666.3， m/z 850.5，m/z921.5信号强度总和代表IINEPTAAAIAYGLDK的信号强度，使用m/z 614.8产生的m/z 703.3，m/z 774.3，m/z 887.4信号强度总和代表 VEIIANDQGNR的信号强度。使用ELEEVVQPIVSK，IINEPTAAAIAYGLDK 和VEIIANDQGNR三条特异多肽的信号总和代表HSPA5蛋白的信号强度，通过比较对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中HSPA5的信号强度，实现对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中HSPA5蛋白的相对定量。
实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的ELEEVVQPIVSK的质谱图如图1 所示，m/z671.4的信号强度为36，m/z 770.5的信号强度为81，m/z 869.5的信号强度为37.5，ELEEVVQPIVSK的信号强度为36+81+37.5＝154.5；实施例 1中热处理组肉鸡肝脏组织中的IINEPTAAAIAYGLDK的质谱图如图2所示， m/z 666.3的信号强度为50，m/z 850.5的信号强度为40，m/z 921.5的信号强度为72，IINEPTAAAIAYGLDK的信号强度为50+40+72＝162，实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的VEIIANDQGNR的质谱图如图3所示，m/z 703.3 的信号强度为15，m/z 774.3的信号强度为43，m/z 887.4的信号强度为31， VEIIANDQGNR的信号强度为15+43+31＝89，即热处理组肉鸡肝脏组织中 HSPA5蛋白的信号强度为154.5+162+89＝405.5。根据相同的方法，计算出对照组肉鸡肝脏组织中HSPA5蛋白的信号强度为298.2，因此，本实施例中热处理组肉鸡肝脏组织中HSPA5蛋白与对照组肉鸡肝脏组织中HSPA5蛋白的比值为405.5/298.2＝1.36。
由上述内容可知，本发明使用液质联用仪，通过多重离子检测方法实现对不同样品中HSPA5蛋白质的相对定量，主要是通过胞内蛋白酶Lys-C 和胰蛋白酶两次酶切产生HSPA5的ELEEVVQPIVSK， IINEPTAAAIAYGLDK和VEIIANDQGNR共3条特异性肽段，使用液质联用仪一次特异检测ELEEVVQPIVSK，IINEPTAAAIAYGLDK和 VEIIANDQGNR子母离子对实现对HSPA5的定量分析。本发明的相对定量方法相对于基于抗体Western Blot法特异性更强，并且免去了制备抗体的繁琐步骤，提高了鸡源HSPA5蛋白检测通量和效率。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法
<130> FI170434
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<400> 1
Glu-Leu-Glu-Glu-Val-Val-Gln-Pro-Ile-Val-Ser-Lys
1 5 12
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<400> 2
Ile-Ile-Asn-Glu-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ile-Ala-Tyr-Gly-Leu-Asp-Lys
1 5 10 16
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<400> 3
Val-Glu-Ile-Ile-Ala-Asn-Asp-Gln-Gly-Asn-Arg
1 5 11

Claims (8)

1.一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，其特征在于，先进行肉鸡热休克蛋白HSPA5的提取，再对肉鸡热休克蛋白HSPA5进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡热休克蛋白HSPA5的相对定量；
酶切肉鸡热休克蛋白HSPA5获得特异性肽段步骤为：取不同处理样品的总蛋白，先打开二硫键再封闭蛋白质内部巯基，然后依次加入胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶进行酶切，终止酶切反应后，得到特异性肽段；
所述肉鸡热休克蛋白HSPA5的特异性肽段为3条，3条特异性肽段的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
其中，SEQ ID NO:1：Glu-Leu-Glu-Glu-Val-Val-Gln-Pro-Ile-Val-Ser-Lys；
SEQ ID NO:2：Ile-Ile-Asn-Glu-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ile-Ala-Tyr-Gly-Leu-Asp-Lys；
SEQ ID NO:3：Val-Glu-Ile-Ile-Ala-Asn-Asp-Gln-Gly-Asn-Arg。
2.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，其特征在于，SEQID NO:1所示的特异性肽段的母离子为685.4m/z，子离子为671.4m/z、770.5m/z、869.5m/z，子离子所对应的碰撞电压为30～35V；SEQ ID NO:2所示的特异性肽段的母离子为830.5m/z，子离子为666.3m/z，850.5m/z，921.5m/z，子离子所对应的碰撞电压为35～40V；SEQ IDNO:3所示的特异性肽段的母离子为614.8m/z，子离子为703.3m/z，774.3m/z，887.4m/z，子离子所对应的碰撞电压为30～35V。
3.根据权利要求2所述的相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，其特征在于，SEQID NO:1所示的特异性肽段的信号强度为子离子671.4m/z、770.5m/z、869.5m/z的信号强度总和，SEQ ID NO:2所示的特异性肽段的信号强度为子离子666.3m/z，850.5m/z，921.5m/z的信号强度总和，SEQ ID NO:3所示的特异性肽段的信号强度为子离子703.3m/z，774.3m/z，887.4m/z的信号强度总和，肉鸡热休克蛋白HSPA5的信号强度为SEQ ID NO:1所示的特异性肽段、SEQ ID NO:2所示的特异性肽段和SEQ ID NO:3所示的特异性肽段这三条特异性肽段的信号强度总和。
4.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，其特征在于，先采用液质联用仪中的高效液相色谱对3条特异性肽段进行分离，然后进入质谱进行检测；其中，分离3条特异性肽段的条件为：色谱柱为C18填料的毛细管色谱柱，流速设置在200～500nL/min，流动相A为：水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为：乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，在分离3条特异性肽段时采用梯度洗脱，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A。
5.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，其特征在于，肉鸡热休克蛋白HSPA5的提取步骤为：使用蛋白质提取缓冲液提取不同处理下肉鸡组织中的肉鸡热休克蛋白HSPA5，并对提取到的总蛋白定量。
6.根据权利要求5所述的相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，其特征在于，在肉鸡热休克蛋白HSPA5的提取步骤中，所述蛋白质提取缓冲液的成分为：50～100mM Tris-HCl，0.1～0.5M NaCl，10～20mM二硫苏糖醇，0.5～2wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 7.2～8.0；使用蛋白质提取缓冲液在90～100℃下水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的肉鸡热休克蛋白HSPA515～30min。
7.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，其特征在于，在酶切产生特异性肽段步骤中，先使用二硫苏糖醇打开二硫键，再通过乙酰胺封闭蛋白质内部巯基，添加甲酸或三氟乙酸终止酶切反应。
8.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡热休克蛋白HSPA5的方法，其特征在于，在酶切产生特异性肽段步骤中，依次加入胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶进行酶切的具体步骤为：先按照胞内蛋白酶Lys-C和总蛋白的质量比为1:100～200的比例加入胞内蛋白酶Lys-C，酶切总蛋白4～6小时后，再按照胰蛋白酶和总蛋白的质量比为1:30～60的比例加入胰蛋白酶，酶切12～16小时。
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