CN108226516B - 一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶fads1的方法 - Google Patents

一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶fads1的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108226516B
CN108226516B CN201711240014.0A CN201711240014A CN108226516B CN 108226516 B CN108226516 B CN 108226516B CN 201711240014 A CN201711240014 A CN 201711240014A CN 108226516 B CN108226516 B CN 108226516B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fads1
broiler
fatty acid
specific peptide
acid desaturase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711240014.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108226516A (zh
Inventor
夏冰
孟庆石
高杰
张宏福
唐湘方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Institute of Animal Science of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Science of CAAS filed Critical Institute of Animal Science of CAAS
Priority to CN201711240014.0A priority Critical patent/CN108226516B/zh
Publication of CN108226516A publication Critical patent/CN108226516A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108226516B publication Critical patent/CN108226516B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，先进行肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的提取，再对肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的相对定量；肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的特异性肽段为2条，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明的相对定量方法相对于基于抗体Western Blot法特异性更强，并且免去了制备抗体的繁琐步骤，提高了鸡源FADS1蛋白检测通量和效率。

Description

一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，特别是指一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法。
背景技术
在全球环境变暖和集约化养殖条件下，肉鸡的养殖密度逐渐增加，热应激已成为肉鸡养殖过程中普遍面临的问题。热应激是动物生长过程中常见的一种体外应激，当动物的生长环境温度超过其代谢稳定区上限，通过机体物理调节不能维持热平衡时，导致机体会产生应对环境高温所产生的非特异性应答反应。热应激会造成肉鸡采食量下降、生长速度慢、体增重降低、饲料转化率低。据报道，慢性热应激显著降低肉鸡采食量(-16.4％)、体增重(-32.6％)和提高了料重比(+25.6％)。同时，热应激还影响消化代谢，降低肉品质，严重的会造成肉鸡免疫力下降，导致死亡率升高，给肉鸡生产带了巨大经济损失。据报道，美国每年因热应激造成畜牧生产损失约16.9～23.6亿美元，其中家禽生产损失达1.25～1.65亿美元，肉鸡损失约5200万美元。相比美国，我国也是肉鸡养殖大国，生产与消费均位居世界第二，但行业集团化、产业化程度不足，养殖环境控制能力弱，热应激对我国肉鸡生产造成的损失更为严重。
当动物处于热应激条件下时，细胞膜内多不饱和脂肪酸发生氧化，产生过量的脂质过氧化物，并降低了动物体内脂肪的正常氧化分解，使过量的脂肪转化为甘油三酯。脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase，FADS)是一种膜结合去饱和酶，主要参与催化多不饱和脂肪酸的合成，它控制着多不饱和脂肪酸的不饱和程度。FADS1能够催化n-3和n-6系列的多不饱和脂肪酸的合成，是体内重要的一种脂肪酸去饱和酶，FADS1的表达含量能够反映动物机体内不饱和脂肪酸的动态变化，会随着热应激水平的变化而变化，可以作为反应热应激水平的重要生理指标。现在判断FADS1在体内相对含量的分析方法主要是在mRNA水平、蛋白质水平进行比较，通过提取组织体内RNA后反转成cDNA，根据FADS1基因设计特异性引物对cDNA模板进行扩增，使用荧光实时定量PCR技术对模板中FADS1转录水平进行比较分析。由于基因转录后，还需经历剪切和拼接等转录后调控才能表达成蛋白，因此基因在转录水平上表达量并不能真实反应其基因产物蛋白的表达量。目前，在蛋白水平上分析FADS1最能反应出该蛋白在组织、细胞和体液中的表达含量，通常会采用酶联免疫法、Western Blot、组织原位杂交等方法，然而以上蛋白水平检测方法都需要高质量的抗体特异识别FADS1蛋白。由于现在市场上的制备抗体的抗原蛋白多数源于人、小鼠和大鼠等模式生物，针对鸡源FADS1的抗体在市场上还未有出现，导致现在还没有能在蛋白水平上定量分析肉鸡FADS1表达量的方法。若想建立在蛋白水平定量分析肉鸡FADS1的方法，需要制备可特异识别肉鸡FADS1的抗体。制备FADS1单克隆抗体可以提高抗体的特异性，减少非特异结合和交叉反应，但是单克隆控体周期长、费用高；若制备HSPA5多克隆抗体可以减少费用，但是非特异性的交叉反应较为严重，成功率很低。
根据定量FADS1蛋白的表达需求，综合考虑现有的分析方法，本发明使用多重离子检测的方法建立一种基于质谱技术的FADS1蛋白定量方法，该方法不需要制备抗体，根据FADS1特异性肽段序列设计子母离子对和碰撞能量，实现在蛋白质水平上对FADS1蛋白进行相对定量分析，大大提高了检测灵敏度、准确性和检测通量。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法。本发明主要是为了实现相对定量分析肉鸡体内FADS1蛋白在不同组织内表达含量变化，使用质谱技术建立了一种无需抗体的高通量检测方法。本发明主要利用质谱可以分析不同肽段质量，并能在可控条件性对复杂样本中的特定肽段进行碎裂，并再次分析特定多肽产生的碎裂小肽的质量，根据以上原理通过优化碰撞能量寻找到特异子母离子对，使用特异子母离子对实现对FADS1的相对定量分析。
基于上述目的，本发明提供的一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，先进行肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的提取，再对肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的相对定量。
在本发明中的一些实施例中，所述肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的特异性肽段为2条，2条特异性肽段的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
其中，SEQ ID NO:1：Asp-Ser-Gly-Glu-Leu-Trp-Leu-Asp-Ala-Tyr-Leu-His-Lys；
SEQ ID NO:2：Trp-Leu-Val-Ile-Asp-Arg。
在本发明中的一些实施例中，SEQ ID NO:1所示的特异性肽段的母离子为773.9m/z，子离子为1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z，子离子所对应的碰撞电压为35～40V；SEQ IDNO:2所示的特异性肽段的母离子为401.2m/z，子离子为403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z，子离子所对应的碰撞电压为20～25V。
在本发明中的一些实施例中，SEQ ID NO:1所示的特异性肽段的信号强度为子离子1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z的信号强度总和，SEQ ID NO:2所示的特异性肽段的信号强度为子离子403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z的信号强度总和，肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的信号强度为SEQ ID NO:1所示的特异性肽段和SEQ ID NO:2所示的特异性肽段这两条特异性肽段的信号强度总和。
在本发明中的一些实施例中，先采用液质联用仪中的高效液相色谱对2条特异性肽段进行分离，然后进入质谱进行检测；其中，分离2条特异性肽段的条件为：色谱柱为C18填料的毛细管色谱柱，流速设置在200～500nL/min，流动相A为：水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为：乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，在分离2条特异性肽段时采用梯度洗脱，流动相起始梯度为95％流动相A+5％的流动相B，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A。
在本发明中的一些实施例中，肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的提取步骤为：使用蛋白质提取缓冲液提取不同处理下肉鸡组织中的肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1，并对提取到的总蛋白质定量；
酶切肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1获得特异性肽段步骤为：取不同处理样品的总蛋白质，先打开二硫键再封闭蛋白质内部巯基，然后依次加入胞内蛋白酶和胰蛋白酶进行酶切，终止酶切反应后，得到特异性肽段。
在本发明中的一些实施例中，在肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的提取步骤中，所述蛋白质提取缓冲液的成分为：50～100mM Tris-HCl，0.1～0.5M NaCl，10～20mM二硫苏糖醇，0.5～2wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 7.2～8.0；使用蛋白质提取缓冲液在90～100℃下水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1 15～30min。
在本发明中的一些实施例中，在酶切产生特异性肽段步骤中，先使用二硫苏糖醇打开二硫键，再通过乙酰胺封闭蛋白质内部巯基，添加甲酸或三氟乙酸终止酶切反应。
在本发明中的一些实施例中，在酶切产生特异性肽段步骤中，依次加入胞内蛋白酶和胰蛋白酶进行酶切的具体步骤为：先按照胞内蛋白酶和总蛋白的质量比为1:100～200的比例加入胞内蛋白酶，酶切总蛋白4～6小时后，再按照胰蛋白酶和总蛋白的质量比为1:30～60的比例加入胰蛋白酶，酶切12～16小时。
在本发明中，一种相对定量分析FADS1蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)FADS1蛋白提取
使用蛋白质提取缓冲液(50～100mM Tris-HCl，0.1～0.5M NaCl，10～20mM二硫苏糖醇(DTT)，0.5～2％十二烷基麦芽糖苷(DDM)，pH 7.2～8.0)在90～100℃水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的FADS1蛋白15～30min，并对提取到的总蛋白质进行定量；
(2)酶切产生代表的特异性肽段
精确称取相同质量的不同处理样品的总蛋白，通过乙酰胺封闭蛋白质内部的巯基后，使用按照1：100～200(胞内蛋白酶Lys-C：总蛋白，质量比)的比例，酶切总蛋白4～6小时后，再按照1：30～60(胰蛋白酶：总蛋白，质量比)的比例加入胰蛋白酶12～16小时，添加1～5wt％的甲酸或者三氟乙酸终止酶切反应，并在40～50℃条件下旋转挥干样品中的缓冲液，得到特异性肽段；
通过以上操作获得序列为DSGELWLDAYLHK(SEQ ID NO:1所示)和WLVIDR(SEQ IDNO:2所示)的两条特异肽段；
(3)FADS1特异性肽段的分离
使用液质联用仪对特异性肽段序列进行分离和信号采集，其中，分离特异性肽段的色谱柱为C18填料的毛细管色谱柱，流速设置在200～500nL/min，流动相A为水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，在分离特异性肽段时采用梯度洗脱，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A；保证三条特异性肽段依次进入质谱进行分析；
(4)多重离子监测方法分析样品中特异性肽段的信号强度
设置特异性肽段的三个子母离子对分别为：773.9m/z为DSGELWLDAYLHK的母离子，在35～40V碰撞电压下产生的子离子为1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z；401.2m/z为WLVIDR的母离子，在20～25V碰撞电压下产生的子离子为403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z；
在该步骤中，使用773.9m/z产生的1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z信号强度总和代表DSGELWLDAYLHK的信号强度，使用401.2m/z产生的403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z信号强度总和代表WLVIDR的信号强度。使用DSGELWLDAYLHK和WLVIDR两条特异多肽的信号总和代表FADS1蛋白的信号强度。最终，通过比较不同样品中FADS1的信号强度，实现不同样品中FADS1蛋白质的相对定量。
与现有技术相比，本发明相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法具有以下有益效果：
本发明使用液质联用仪，通过多重离子检测方法实现对不同样品中FADS1蛋白质的相对定量，主要是通过胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶两次酶切产生FADS1的DSGELWLDAYLHK和WLVIDR共2条特异多肽，使用液质联用仪一次特异检测DSGELWLDAYLHK和WLVIDR子母离子对实现对FADS1的定量分析。本发明相对于基于抗体Western Blot法特异性更强，并且免去了制备抗体的繁琐步骤，提高了鸡源FADS1蛋白检测通量和效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的DSGELWLDAYLHK的质谱图；
图2为本发明实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的WLVIDR的质谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法
在本实施例中，所述相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法包括以下步骤：
(1)FADS1蛋白提取
分别取0.1g对照组和热处理组肉鸡肝脏组织(热处理组肝脏样品来源于肉鸡在33℃处理24小时的肉鸡，对照组肝脏样品来源于同期肉鸡在25℃处理24小时的肉鸡)，按照1：5(质量比)的比例加入蛋白质提取缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM二硫苏糖醇，1wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 8.0)，在90～100℃水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的FADS1蛋白15～30min，匀浆后通过20000g 4℃离心30min后取上清液，使用BCA方法对上清中的总蛋白进行蛋白定量。
(2)酶切产生代表的特异性肽段
分别取不同组别样品50ug，先使用10mM二硫苏糖醇在50℃还原1h打开二硫键，再用20mM的碘乙酰胺在黑暗条件下封闭巯基反应30min；按照1：200(质量比)的比例加入Lys-C在37℃条件下酶切4h，再按照1：50(质量比)的比例加入胰蛋白酶在37℃条件下酶切12个小时，使用1wt％的甲酸终止反应，并在40℃的条件下挥发掉所有的酶切缓冲液，得到干燥好的特异性肽段。
(3)FADS1特异性肽段的分离
使用50ul的95wt％水+5wt％+0.1wt％甲酸重新溶解干燥好的特异性肽段，使用nanoLC-QTRAQ 6500对重溶的特异性肽段进行多重离子监测定量分析，分析时使用的C18毛细管分析柱规格为：75μm×15cm ChromXP C18-CL 3μm
Figure BDA0001489648190000061
流动相A为水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A；流速为300nl/min，保证三条特异性肽段依次进入质谱进行分析。
(4)多重离子监测方法分析样品中特异性肽段的信号强度
质谱参数设置为：773.9m/z为DSGELWLDAYLHK(SEQ ID NO:1所示)的母离子，在36.7V碰撞电压下产生的子离子为1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z；401.2m/z为WLVIDR(SEQID NO:2所示)的母离子，在23.3V碰撞电压下产生的子离子为403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z。
在该步骤中，使用773.9m/z产生的1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z信号强度总和代表DSGELWLDAYLHK的信号强度，使用401.2m/z产生的403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z信号强度总和代表WLVIDR的信号强度。使用DSGELWLDAYLHK和WLVIDR两条特异多肽的信号总和代表FADS1蛋白的信号强度，通过比较对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的信号强度，实现对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的相对定量。
实施例2一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法
在本实施例中，所述相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法包括以下步骤：
(1)FADS1蛋白提取
分别取0.1g对照组和热处理组肉鸡肝脏组织(热处理组肝脏样品来源于肉鸡在33℃处理18小时的肉鸡，对照组肝脏样品来源于同期肉鸡在25℃处理18小时的肉鸡)，按照1：5(质量比)的比例加入蛋白质提取缓冲液(100mM Tris-HCl，0.1M NaCl，20mM二硫苏糖醇，2wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 7.2)，在90～100℃水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的FADS1蛋白15～30min，匀浆后通过20000g 4℃离心30min后取上清液，使用BCA方法对上清中的总蛋白进行蛋白定量。
(2)酶切产生代表的特异性肽段
分别取不同组别样品50ug，先使用10mM二硫苏糖醇在50℃还原1h打开二硫键，再用20mM的碘乙酰胺在黑暗条件下封闭巯基反应30min；按照1：100(质量比)的比例加入Lys-C在37℃条件下酶切6h，再按照1：30(质量比)的比例加入胰蛋白酶在37℃条件下酶切16个小时，使用1wt％的三氟乙酸终止反应，并在50℃的条件下挥发掉所有的酶切缓冲液，得到干燥好的特异性肽段。
(3)FADS1特异性肽段的分离
使用50ul的95wt％水+5wt％+0.1wt％甲酸重新溶解干燥好的特异性肽段，使用nanoLC-QTRAQ 6500对重溶的特异性肽段进行多重离子监测定量分析，分析时使用的C18毛细管分析柱规格为：75μm×15cm ChromXP C18-CL 3μm
Figure BDA0001489648190000081
流动相A为水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A；流速为500nl/min，保证三条特异性肽段依次进入质谱进行分析。
(4)多重离子监测方法分析样品中特异性肽段的信号强度
质谱参数设置为：773.9m/z为DSGELWLDAYLHK(SEQ ID NO:1所示)的母离子，在38.2V碰撞电压下产生的子离子为1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z；401.2m/z为WLVIDR(SEQID NO:2所示)的母离子，在21.1V碰撞电压下产生的子离子为403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z。
在该步骤中，使用773.9m/z产生的1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z信号强度总和代表DSGELWLDAYLHK的信号强度，使用401.2m/z产生的403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z信号强度总和代表WLVIDR的信号强度。使用DSGELWLDAYLHK和WLVIDR两条特异多肽的信号总和代表FADS1蛋白的信号强度，通过比较对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的信号强度，实现对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的相对定量。
实施例3一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法
在本实施例中，所述相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法包括以下步骤：
(1)FADS1蛋白提取
分别取0.1g对照组和热处理组肉鸡肝脏组织(热处理组肝脏样品来源于肉鸡在33℃处理30小时的肉鸡，对照组肝脏样品来源于同期肉鸡在25℃处理30小时的肉鸡)，按照1：5(质量比)的比例加入蛋白质提取缓冲液(80mM Tris-HCl，0.3M NaCl，15mM二硫苏糖醇，1wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 7.5)，在90～100℃水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的FADS1蛋白15～30min，匀浆后通过20000g 4℃离心30min后取上清液，使用BCA方法对上清中的总蛋白进行蛋白定量。
(2)酶切产生代表的特异性肽段
分别取不同组别样品50ug，先使用10mM二硫苏糖醇在50℃还原1h打开二硫键，再用20mM的碘乙酰胺在黑暗条件下封闭巯基反应30min；按照1：150(质量比)的比例加入Lys-C在37℃条件下酶切5h，再按照1：60(质量比)的比例加入胰蛋白酶在37℃条件下酶切14个小时，使用5wt％的三氟乙酸终止反应，并在45℃的条件下挥发掉所有的酶切缓冲液，得到干燥好的特异性肽段。
(3)FADS1特异性肽段的分离
使用50ul的95wt％水+5wt％+0.1wt％甲酸重新溶解干燥好的特异性肽段，使用nanoLC-QTRAQ 6500对重溶的特异性肽段进行多重离子监测定量分析，分析时使用的C18毛细管分析柱规格为：75μm×15cm ChromXP C18-CL 3μm
Figure BDA0001489648190000091
流动相A为水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流行相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A；流速为300nl/min，保证三条特异性肽段依次进入质谱进行分析。
(4)多重离子监测方法分析样品中特异性肽段的信号强度
质谱参数设置为：773.9m/z为DSGELWLDAYLHK(SEQ ID NO:1所示)的母离子，在39.5V碰撞电压下产生的子离子为1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z；401.2m/z为WLVIDR(SEQID NO:2所示)的母离子，在24.6V碰撞电压下产生的子离子为403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z。
在该步骤中，使用773.9m/z产生的1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z信号强度总和代表DSGELWLDAYLHK的信号强度，使用401.2m/z产生的403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z信号强度总和代表WLVIDR的信号强度。使用DSGELWLDAYLHK和WLVIDR两条特异多肽的信号总和代表FADS1蛋白的信号强度，通过比较对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的信号强度，实现对照组和热处理组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的相对定量。
实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的DSGELWLDAYLHK的质谱图如图1所示，m/z1045.5的信号强度为1400，m/z 746.4的信号强度为660，m/z859.5的信号强度为1290，DSGELWLDAYLHK的信号强度为1400+660+1290＝3350；实施例1中热处理组肉鸡肝脏组织中的WLVIDR的质谱图如图2所示，m/z 403.2的信号强度为1390，m/z 615.4的信号强度为3050，m/z 502.3的信号强度为6390，WLVIDR的信号强度为1390+3050+6390＝10830，即热处理组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的信号强度为3350+10830＝14180。根据相同的方法，计算出对照组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的信号强度为26259，因此，本实施例中热处理组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白与对照组肉鸡肝脏组织中FADS1蛋白的比值为14180/26259＝0.54。
由上述内容可知，本发明使用液质联用仪，通过多重离子检测方法实现对不同样品中FADS1蛋白质的相对定量，主要是通过胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶两次酶切产生FADS1的DSGELWLDAYLHK和WLVIDR共2条特异多肽，使用液质联用仪一次特异检测DSGELWLDAYLHK和WLVIDR子母离子对实现对FADS1的定量分析。本发明相对于基于抗体Western Blot法特异性更强，并且免去了制备抗体的繁琐步骤，提高了鸡源FADS1蛋白检测通量和效率。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001489648190000111
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法
<130> FI170436
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<400> 1
Asp-Ser-Gly-Glu-Leu-Trp-Leu-Asp-Ala-Tyr-Leu-His-Lys
1 5 10 13
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<400> 2
Trp-Leu-Val-Ile-Asp-Arg
1 6

Claims (8)

1.一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，其特征在于，先进行肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的提取，再对肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1进行酶切获得特异性肽段，然后使用液质联用仪检测特异性肽段的子母离子对，获得特异性肽段的子离子信号强度总和，根据特异肽段的子离子信号强度总和获得肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的信号强度，通过比较不同处理肉鸡样品中肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的信号强度，从而实现对不同处理肉鸡样品中肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的相对定量；
所述肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的特异性肽段为2条，2条特异性肽段的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
其中，SEQ ID NO:1：Asp-Ser-Gly-Glu-Leu-Trp-Leu-Asp-Ala-Tyr-Leu-His-Lys；
SEQ ID NO:2：Trp-Leu-Val-Ile-Asp-Arg。
2.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，其特征在于，SEQ ID NO:1所示的特异性肽段的母离子为773.9m/z，子离子为1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z，子离子所对应的碰撞电压为35～40V；SEQ ID NO:2所示的特异性肽段的母离子为401.2m/z，子离子为403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z，子离子所对应的碰撞电压为20～25V。
3.根据权利要求2所述的相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，其特征在于，SEQ ID NO:1所示的特异性肽段的信号强度为子离子1045.5m/z，746.4m/z，859.5m/z的信号强度总和，SEQ ID NO:2所示的特异性肽段的信号强度为子离子403.2m/z，615.4m/z，502.3m/z的信号强度总和，肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的信号强度为SEQ ID NO:1所示的特异性肽段和SEQ ID NO:2所示的特异性肽段这两条特异性肽段的信号强度总和。
4.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，其特征在于，先采用液质联用仪中的高效液相色谱对2条特异性肽段进行分离，然后进入质谱进行检测；其中，分离2条特异性肽段的条件为：色谱柱为C18填料的毛细管色谱柱，流速设置在200～500nL/min，流动相A为：水+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，流动相B为：乙腈+0.1wt％甲酸+5wt％DMSO，在分离2条特异性肽段时采用梯度洗脱，流动相梯度为：0～1min，95％A；1～1.1min，90％A；1.1～60min，80％A；60～70min，76％A；70～75min，50％A；75～75.5min，20％A；75.5～80.5min，20％A；80.5～81min，95％A；81～90min，95％A。
5.根据权利要求1所述的相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，其特征在于，肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的提取步骤为：使用蛋白质提取缓冲液提取不同处理下肉鸡组织中的肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1，并对提取到的总蛋白质定量；
酶切肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1获得特异性肽段步骤为：取不同处理样品的总蛋白质，先打开二硫键再封闭蛋白质内部巯基，然后依次加入胞内蛋白酶和胰蛋白酶进行酶切，终止酶切反应后，得到特异性肽段。
6.根据权利要求5所述的相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，其特征在于，在肉鸡脂肪酸去饱和酶的提取步骤中，所述蛋白质提取缓冲液的成分为：50～100mMTris-HCl，0.1～0.5M NaCl，10～20mM二硫苏糖醇，0.5～2wt％十二烷基麦芽糖苷，pH 7.2～8.0；使用蛋白质提取缓冲液在90～100℃下水浴中提取不同处理下肉鸡组织中的肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1 15～30min。
7.根据权利要求5所述的相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，其特征在于，在酶切产生特异性肽段步骤中，先使用二硫苏糖醇打开二硫键，再通过乙酰胺封闭蛋白质内部巯基，添加甲酸或三氟乙酸终止酶切反应。
8.根据权利要求5所述的相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶FADS1的方法，其特征在于，在酶切产生特异性肽段步骤中，依次加入胞内蛋白酶和胰蛋白酶进行酶切的具体步骤为：先按照胞内蛋白酶和总蛋白的质量比为1:100～200的比例加入胞内蛋白酶，酶切总蛋白4～6小时后，再按照胰蛋白酶和总蛋白的质量比为1:30～60的比例加入胰蛋白酶，酶切12～16小时。
CN201711240014.0A 2017-11-30 2017-11-30 一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶fads1的方法 Active CN108226516B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711240014.0A CN108226516B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶fads1的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711240014.0A CN108226516B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶fads1的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108226516A CN108226516A (zh) 2018-06-29
CN108226516B true CN108226516B (zh) 2020-05-19

Family

ID=62653809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711240014.0A Active CN108226516B (zh) 2017-11-30 2017-11-30 一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶fads1的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108226516B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115197298B (zh) * 2022-05-26 2023-10-17 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 用于相对定量分析猪细胞色素p450酶cyp2e1的肽段组合物及应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007055116A1 (ja) * 2005-11-08 2007-05-18 Tohoku University 質量分析計を使った膜タンパク質の定量方法
AU2010305150A1 (en) * 2009-10-09 2012-04-05 Symphogen A/S Multiplex quantitation of individual recombinant proteins in a mixture by signature peptides and mass spectrometry
CN104345107B (zh) * 2013-07-24 2016-08-17 上海科倍斯生物科技有限公司 一种乳或乳制品中牛乳血清白蛋白定量检测试剂盒
WO2015026909A2 (en) * 2013-08-23 2015-02-26 Nuclea Biotechnologies, Inc. Msia-srm assay for biomarker analysis
CN103698418B (zh) * 2013-11-12 2015-07-08 北京理工大学 植物中转基因蛋白cp4-epsps的定量检测方法
CN107290461B (zh) * 2017-07-14 2020-06-16 浙江工商大学 一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN108226516A (zh) 2018-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106318934A (zh) 胡萝卜β(1,2)木糖转移酶的基因全序列及用于转染双子叶植物的CRISPR/CAS9 的质粒构建
Rajesh et al. Proteomic analysis of bovine omental, subcutaneous and intramuscular preadipocytes during in vitro adipogenic differentiation
Rodrigues et al. A simple, economical and reproducible protein extraction protocol for proteomics studies of soybean roots
CN108226516B (zh) 一种相对定量分析肉鸡脂肪酸去饱和酶fads1的方法
Zhou et al. An eclosion hormone-like gene participates in the molting process of Palaemonid shrimp Exopalaemon carinicauda
Chen et al. Transcriptome-metabolome analysis reveals how sires affect meat quality in hybrid sheep populations
CN108037199B (zh) 一种相对定量分析肉鸡热休克蛋白hspa5的方法
CN108977514A (zh) 用于筛选冬瓜实时荧光定量PCR内参基因EF-1α的引物
CN108169397B (zh) 一种相对定量分析肉鸡谷胱甘肽s转移酶gsta2的方法
Cho et al. Regional differences of proteins expressing in adipose depots isolated from cows, steers and bulls as identified by a proteomic approach
Lanclos et al. Translation of hormone-induced messenger RNA in amphibian oocytes: I. Induction by estrogen of messenger RNA encoded for vitellogenic protein in the liver of the male African clawed toad (Xenopus laevis).
CN111122755B (zh) 从可食用肉中检测非可食用肉的特征多肽及方法
CN115166067B (zh) 用于相对定量分析猪10-甲酰基四氢叶酸脱氢酶aldh1l1的肽段组合物及应用
CN111122756B (zh) 检测可食用肉的特征多肽及方法
Nam et al. Comparative proteome analysis of porcine Longissimus dorsi on the basis of pH24 of post-mortem muscle
CN115197298B (zh) 用于相对定量分析猪细胞色素p450酶cyp2e1的肽段组合物及应用
CN115181733B (zh) 相对定量分析猪铁蛋白重链fth1的肽段组合物及应用
CN110959575B (zh) 一种促进仔代肌肉发育的广东小耳花猪妊娠期饲喂方法
CN110305966B (zh) 一种罗非鱼肝脏dgat2基因表达的调控方法
CN109536519B (zh) 一种在分子水平调控水牛乳腺细胞甘油酸三酯含量的方法
JP7108055B2 (ja) プロテオーム試験のための試料調製
CN109507429A (zh) 基于CRISPR/cas9和过氧化物酶APEX2系统识别分析特异性位点相互作用蛋白的方法
CN109207482A (zh) 青虾gem基因及其编码蛋白和应用
CN110467652B (zh) 用于预测牡蛎捕捞时间的内源性多肽
Lindert et al. Characterization of Metal‐Responsive Transcription Factor (MTF‐1) from the Giant Rodent Capybara Reveals Features in Common with Human as Well as with Small Rodents (Mouse, Rat). Short Communication

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant