CN103698418B - 植物中转基因蛋白cp4-epsps的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物中转基因蛋白CP4-EPSPS的定量检测方法，先从植物中提取蛋白，得到蛋白粗提液；将蛋白粗提液进行酶切，采用18O标记3个CP4-EPSPS的特异性肽段作为内标，用UPLC/ESI-QQQ MS检测，在肽段水平上定量CP4-EPSPS；其中所述3个特异性肽段序列为ITGLLEGEDVINTGK、SFMFGGLASGETR和LAGGEDVADLR。本发明的方法具有极高的灵敏度，将同位素稀释法和MRM策略联用可实现对于CP4-EPSPS的绝对定量。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质组学技术的应用，具体地说，涉及一种应用同位素稀释法与多反应监测(MRM)策略联合对植物中转基因蛋白CP4-EPSPS定量检测的方法。
背景技术
CP4-EPSPS基因业已广泛应用于转基因农作物和植物。目前，包含30种不同植株的61%的转基因作物/植物已在全球范围内12个国家内被广泛种植。随着种植转基因作物/植物的数量和品种在许多国家内逐年递增，转基因作物/植物对人类健康和环境的影响越来越受到关注。因此，检测转基因作物/植物中转基因蛋白的定量技术逐渐成为研究热点之一。
近年来，作物/植物中转基因蛋白定量方法学的研究已成为研究热点之一。常规的检测方法包括实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)或者基于DNA和蛋白的免疫学检测方法。实时定量PCR最初是由Applied Biosystems公司于1996年开发的。自此，该方法被广泛应用于转基因DNA的测定。由于DNA相对而言较为脆弱，在加热、存在核酸酶以及低pH值下均可能发生降解，而PCR方法学的可靠性又取决于DNA的完整性，因此该方法存在一定局限性。Western blotting和酶联免疫吸附法(ELISA)也是可供选择的定量方法。这些免疫学方法可以在蛋白水平上定量测定转基因作物或植物中的转基因蛋白，且具有较高灵敏、度通量等优点。然而，这些方法均需要根据不同的目标蛋白而使用不同抗体，这就为方法的广泛应用带来了不小的挑战。且由于在农作物加工成食品的过程中有诸多因素存在，因此上述方法也无法应用于加工食品中转基因蛋白的检测，这使得其应用范围受到了限制。此外，非特异性结合和交叉污染都可能降低基于免疫学的定量准确度。
为了克服上述方法的局限，质谱多反应监测(MRM)方法被引入蛋白定量领域，该方法可以实现对目标蛋白在肽段水平上的定量检测，与直接定量蛋白本身的方法相比具有更高的精密度。随着质谱技术的发展，MRM业已成为检测小分子的常规方法，如：药物代谢、激素、多肽和农残等。MRM是指，在电喷雾离子化后有两个质量选择阶段：选择完整待测物质的母离子，以及该母离子特异性碎裂产生的子离子。MRM方法会对待测物质具产生特异性且灵敏度非常高的响应，因此仅需将该方法与一维色谱分离结合就可以实现对于待测物质的子离子峰进行积分的定量检测。因此，基于质谱的定量方法可以实现对待测物质进行结构特异性分析。而将MRM方法与同位素稀释法联合，可将一个相对定量的检测提升为绝对定量。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种具有极高的灵敏度，可实现对CP4-EPSPS绝对定量的检测方法。
本发明采用的技术方案是：
植物中转基因蛋白CP4-EPSPS的定量检测方法，先从植物中提取蛋白，得到蛋白粗提液；将蛋白粗提液进行酶切，采用18O标记3个CP4-EPSPS的特异性肽段作为内标，用UPLC/ESI-QQQ MS检测，在肽段水平上定量CP4-EPSPS；其中所述3个特异性肽段序列为ITGLLEGEDVINTGK（如SEQ ID NO.1所示）、SFMFGGLASGETR（如SEQ ID NO.2所示）和LAGGEDVADLR（如SEQ ID NO.3所示）。
所述提取蛋白时优选采用pH7.6的Tris-HCl作为提取溶剂。
所述酶切时优选采用胰蛋白酶酶切，酶切反应时间为24h。其中蛋白:胰蛋白酶=50:1(w/w)。
其中18O标记的过程优选为：将特异性肽段样品溶于用H2 18O配制的50mM KH2PO4缓冲液中，随后加入分别用H2 18O溶解的胰蛋白酶，其中蛋白:胰蛋白酶=50:1(w/w)，在37℃浴中标记20h。
本发明的方法具有极高的灵敏度，可实现对于CP4-EPSPS的绝对定量。在本发明中，本发明采用烟叶被用作模式植物，因烟叶作为模式植物已广泛应用于农业领域的转基因作物/植物研究。本文建立的绝对定量方法，可以推广至在其它作物或植物中对于转基因蛋白含量的测定。
本发明中的3个特异性肽段是采用ExPasy blast算法确定的，于是可采用质谱法将定量CP4-EPSPS在肽段水平上进行，这一方法缓解了上述各方法的瓶颈。此外，本发明采用18O标记与MRM方法相结合的方法，实现了相对定量到绝地定量的转变。所有与分析相关的条件(蛋白提取、胰酶消化、标记以及质谱参数的设定)均经过优化，经考察对于高中低不同浓度的上述3个特异性肽段，本方法的日内、日间精密度、准确度、回收率以及线性范围等均令人满意。最终，本发明将建立的方法应用于30例烟叶中转基因蛋白CP4-EPSPS的定量分析，验证了方法的灵敏度与准确度。这一新方法可以将CP4-EPSPS蛋白的绝对定量推广至其它植物或农作物中。
本发明以MRM方法结合18O标记技术为测量手段，建立了转基因蛋白CP4-EPSPS在肽段水平的绝对定量方法。经验证该方法灵敏度高；特异性好；线性范围广；准确度、精密度、回收率以及稳定性均令人满意。有望解决目前市场上采用免疫学手段定量转基因蛋白CP4-EPSPS的多种试剂盒，由于厂商采用不同的工艺表达以及方法确定参考物质的量值，无法溯源到上一级计量标准，造成测定结果不准确和缺乏可比性的问题。本方法的建立和采用，将有望在将来降低生物安全隐患，并减少由此产生的一系列法律、贸易等经济、社会问题。
附图说明
图1为转基因烟草(A)和非转基因空白对照烟草(B)；
图2为3个特异性肽段的LC色谱和MS质谱图；
图3为CP4-EPSPS特异性肽段的碎裂电压(A)和碰撞能量(B)的分析优化；
图4为提取自烟叶的多肽混合物的LC-MS/MS分析：A):CP4-EPSPS来源的多肽(ITGLLEGEDVINTGK)子离子(m/z=932.4和1061.5)的MS/MS质谱；B):CP4-EPSPS来源的多肽(SFMFGGLASGETR)子离子(m/z=847.2和946)的MS/MS质谱；C):CP4-EPSPS来源的多肽(LAGGEDVADLR)子离子(m/z=688.3,931.4和1002.7)的MS/MS质谱；
图5为胰蛋白酶消化条件的考察；
图6为酸性缓冲液对多肽标记效率的影响；
图7为3个特异性肽段的6个子离子的校正曲线。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
下面结合附图对本发明做进一步描述。
1材料与方法
1.1试剂(表1)
表1试剂列表
| 试剂名称 | 规格 | 生产公司 |
| 合成肽段ITGLLEGEDVINTGK | 95.52% | 北京赛百盛基因技术有限公司 |
| 合成肽段SFMFGGLASGETR | 97.27% | 北京赛百盛基因技术有限公司 |
| 合成肽段LAGGEDVADLR | 98.76% | 北京赛百盛基因技术有限公司 |
| 尿素 | 电泳级 | Sigma-Aldrich.Inc. |
| 二硫苏糖醇(DTT) | 试剂级 | Sigma-Aldrich.Inc. |
| 碘乙酰胺(IAA) | 试剂级 | Sigma-Aldrich.Inc. |
| 碳酸氢铵 | ≥99.0% | Sigma-Aldrich.Inc. |
| 胰蛋白酶 | 测序级 | Promega.Inc. |
| 甲酸 | 色谱纯 | Sigma-Aldrich.Inc. |
| H2 18O | >97% | 中国同位素公司 |
| KH2PO4 | 分析纯 | 北京北化精细化学品责任有限公司 |
| K2HPO4·12H2O | 分析纯 | 北京北化精细化学品责任有限公司 |
| Na2CO3 | 分析纯 | 北京北化精细化学品责任有限公司 |
| NaCl | 分析纯 | 北京北化精细化学品责任有限公司 |
| Tris·HCl | 分析纯 | 北京拜尔迪生物公司 |
| 乙腈 | 色谱纯 | Fisher Scientific.Inc. |
| 三蒸水 | 18.2 MΩ | Millipore.Inc. |
| 考马斯亮蓝 | G-250,R-250 | Aeresco.Inc |
1.2仪器与软件(表2,3)
表2主要仪器列表
| 仪器名称 | 生产厂家 | 型号 |
| 高效液相色谱系统 | Agilent Technologies,USA | 1100 |
| 离子阱质谱仪(ESI源) | Agilent Technologies,USA | Trap-MSD |
| 超高效液相色谱系统 | Agilent Technologies,USA | 1290 |
| 三重串联四极杆质谱 | Agilent Technologies,USA | 6210 |
| 迷你离心机 | Thermo Electron CorpoRation,USA | Mini-8K |
| 酶标仪 | Thermo Electron CorpoRation,USA | MMLTISKAN ASCENT |
| -80℃超低温冰箱 | Thermo Electron CorpoRation,USA | Forma-86C |
| 电子天平 | OHAUS Corp.USA | AR2140 |
| 台式高速冷冻离心机 | Heraeus Sepatech.Inc.,Germany | Biofuge 22R |
| 低温超速离心机 | Hitachi,Japan | CP100MX |
| 电子pH计 | HANNA,Italy | pH 211 |
| 低速离心机 | 北京医用离心机场 | LD5-2A |
| 真空冷冻干燥机 | 北京德天佑科技发展有限公司 | FD-1C |
| 超净工作台 | 北京莱尔净化设备有限公司 | |
| 旋涡混合器 | 北京金北德工贸有限公司 | MVS-1 |
| 电热恒温水槽 | 上海精宏实验设备有限公司 | DK-8A |
| 超声波清洗机 | 宁波新芝生物科技股份有限公司 | SB5200D |
| 冰箱(4℃、-20℃) | 青岛海尔股份有限公司 | BCD-206YH |
表3主要仪器列表
| 软件名称 | 软件开发公司 |
| Mass Hunter | Agilent Technologies,USA |
| MASCOT 2.1 | Matrix Science,USA |
2实验方法
2.1样品制备
转基因烟草和非转基因空白对照烟草由中国农业科学院提供(图1)。将碎裂后的烟叶放入2mL EP管中称重，继而向EP管中直接加入蛋白提取液(Tris-HCl,pH7.6)充分研磨，再将样品管密封好进行超声提取30min。将蛋白粗提液离心处理10min后取上清(1,000×g)，再将上清液进行高速离心处理30min(17,000×g)后，取100μL上清液冻干备用。采用考马斯亮蓝法(Bradford Assay)测定烟叶中提取蛋白的浓度。
将冻干后的肽段样品溶于含8M尿素的10mM DTT(二硫苏糖醇)溶液进行变性，于37℃水浴孵育4h。再加入50mM IAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应1h。再加入溶于NH4HCO3(pH8.3)缓冲液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶=50:1(w/w)，于37℃水浴孵育16h。完成酶切后，残余的胰蛋白酶需经灭活处理，将样品在沸水中煮10min，再加入5%的甲酸(v/v)。在LC-ESI/QQQ MS进行分析之前，样品需经过高速离心处理(17,000×g,15min)，以确保无不溶物进到分析系统里。
2.218O标记制备内标肽段
采用18O标记3个CP4-EPSPS特异性肽段(IK,ITGLLEGEDVINTGK;SR,SFMFGGLASGETR;以及LR,LAGGEDVADLR)作为内标物。特异性肽段的选择基于HPLC/ESI-Trap MS/MS的实验结果以及经BLAST算法的验证。肽段的18O标记根据优化后的条件进行，首先将肽段样品溶于用H2 18O配制的50mM KH2PO4缓冲液中，随后加入分别用H2 18O溶解的胰蛋白酶(蛋白:胰蛋白酶=50:1,w/w)，在37℃水浴中标记20h。标记完成后，残余的胰蛋白酶需经灭活处理，将样品在沸水中煮10min，再加入5%的甲酸(v/v)。在LC/ESI-QQQ MS进行分析之前，样品需经过高速离心处理(17,000×g,15min)，以确保无不溶物进到分析系统里。
2.3LC-MS分析
为了考察目标蛋白CP4-EPSPS特异性肽段在MS/MS碎裂后，其子离子的质谱响应情况，本发明首先采用HPLC/ESI-Trap MS进行预分析。表达、提纯的转基因蛋白CP4-EPSPS由中国农业科学院提供。
在HPLC/ESI-Ion Trap分析中，液相色谱条件：色谱柱为Grace5μm C18柱(2.1mm×150mm)；流速0.2mL/min；进样体积10μL；所用流动相为：A相为含0.1%甲酸的水溶液；B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件为：3%B,0→8min;3-40%B,8→35min;40-95%B,35→40min;95%B,40→43min以及95-3%B from43→45min;Post run为10min。ESI-TOF MS条件为：以氮气作为干燥气和雾化气(干燥气流速10L/min；干燥气温度为350℃。雾化器压力为35psi)；采用正离子模式；毛细管电压为-3.5kV；毛细管出口电压160V；锥孔电压60V；MS扫描范围为m/z300-1800。HPLC/ESI-Ion Trap分析可以帮助本发明考察多个CP4-EPSPS特异性肽段择优而选。该检测平行3次实验。
方法的建立以及随后的实际样品检测采用UPLC/ESI-QQQ MS。色谱条件为：色谱柱为Zorbax Extend-C18柱(50mm×2.1mm,1.8μm;Agilent Technologies,USA)；流速0.15mL/min；进样体积1μL；所用流动相为：A相为含0.1%甲酸的水溶液；B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件为：5%B,0–5.0min;5→20%B,5.1–7.0min;20→30%B,7.1–20.0min;30→5%B,20.1–25.0min;5%B,25.1–30.0min。质谱条件：电喷雾离子源；以氮气作为干燥气和雾化气(干燥气流速7L/min；干燥气温度为300℃。雾化器压力为35psi)；采用正离子模式；毛细管电压为-3.5kV。
2.4数据处理
采用Data Analysis3.3采集Ion Trap MS/MS数据。参数设置为：S/N阈值5；响应阈值1,000；最大峰数1,000；保留时间窗口0.5min。MS/MS数据用MASCOT2.1检索Swissprot蛋白数据库，鉴定肽段的蛋白归属。允许的漏切位点为0；MS质量数误差为2Da；MS/MS质量数误差为0.8Da；固定修饰为Carbamidomethyl(C)；可变修饰为Oxidation(M)。
3结果
烟叶中转基因蛋白CP4-EPSPS的绝对定量有三个主要步骤：1)将目标蛋白从烟叶中提取出来；2)将所提取的蛋白混合物进行胰蛋白酶酶切；3)UPLC/ESI-QQQ MS定量CP4-EPSPS特异性肽段的含量，并以此间接计算出蛋白含量。
在第一步中，最重要的是选择蛋白提取液。需考察多个蛋白提取液，以选择单位体积提取蛋白质量最大的为佳，且所得的蛋白粗提液中必须含有目标蛋白。在第二步中，需要对酶解效率进行考察。较高的酶解效率以及酶解效率的稳定性是本发明作为一个绝对定量方法学的研究基础。第三步是本发明的核心步骤，由于本发明采用定量目标蛋白特异性肽段的方法去间接定量蛋白，所以需要根据HPLC/ESI-Ion Trap MS的实验以及BLAST算法的运行结果选择合适的肽段并合成得到标准物，并经过18O标记后添加于待测样品中。于是，为了定量的准确性，有必要对18O标记条件进行优化。
此外，为了获得三重四级杆质量分析器对于不同待测物质的最佳分析条件，在MS/MS分析之前，需要将仪器的碎裂电压、碰撞能量根据不同肽段各自的情况进行优化。最后在完成蛋白提取、酶解、标记以及仪器参数设置等各项优化条件下定量所肽段标物，绘制标准曲线。在对方法的回收率、准确度以及稳定性做进一步的验证后，方可进行实际样品的测定。
3.1典型色谱和质谱数据
采用LC/ESI-QQQ MS分析合成肽段，其典型的色谱和各肽段子离子的质谱数据如图2所示。
通过获得图2，本发明确信此方法可以有效测定烟叶中转基因蛋白CP4-EPSPS。图2A所示为三个合成所得特异性肽段(LR,IK和SR)的色谱图，色谱条件可以有效的在短时间内实现三个峰的分离。图2B所示为实际样品的色谱图，先提取烟叶中的蛋白，再将蛋白混合液进行酶解，洗脱梯度与图2A所示相同。对比肽段标物与来自实际烟叶样品的两张色谱图(图2A和B)可以发现，三个肽段的保留时间略有差异，这可能因为在实际样品中，混合蛋白经酶切得到的是十分复杂的肽段混合物，而在LC分析时，难免会有肽段之间的相互作用，而使得保留时间略有偏移。图2C、D和E分别为每个肽段子离子的MS/MS图，与预期相吻合。
3.2特异性肽段的选择
表4列出了九个植物范围内的CP4-EPSPS的特异性肽段。用来定量目标蛋白的肽段需满足以下条件：1)通过BLAST验证同源性，确保所选择的肽段是目标蛋白CP4-EPSPS的特异性肽段，这保证了在从烟叶提取的蛋白混合液中，所选择的肽段的氨基酸序列仅来自于蛋白CP4-EPSPS；2)在肽段的选择上，应避免选择过长的肽段。因为长肽段在合成上有一定困难，且其色谱行为也具有一定不确定性。同时，过短的肽段也应尽量避免。根据本发明的经验，10个氨基酸左右的肽段为首选；3)应保证所选肽段的氨基酸序列中不带有侧链不稳定的氨基酸，如半胱氨酸的侧链巯基，在空气中极易被氧化。因而含有半胱氨酸的肽段不适宜作为标准物；4)肽段应在初始流动相中应具有良好的溶解性，因而应选择含亲水性氨基酸较多的肽段；5)肽段目离子须在质谱检测时具有较高的响应值，子离子应具有良好的信噪比；6)应尽量选择y离子，因为在18O标记后，y离子具有4Da的质量改变，而b离子在标记后并无这一变化。
表4经BLAST算法验证CP4-EPSPS的特异性肽段
| 编号 | 分子量 | 位置 | 氨基酸个数 | 肽段序列 |
| 1 | 1707.988 | 367-382 | 16 | LNGVDCDEGETSLVVR |
| 2 | 1557.8250 | 47-61 | 15 | ITGLLEGEDVINTGK |
| 3 | 1358.6289 | 34-46 | 13 | SFMFGGLASGETR |
| 4 | 1115618 | 295-305 | 11 | LAGGEDVADLR |
| 5 | 947.5076 | 161-168 | 8 | TPTPITYR |
| 6 | 929.5004 | 169-177 | 9 | VPMASAQVK |
| 7 | 871.5127 | 358-366 | 9 | LSAVANGLK |
| 8 | 871.4399 | 313-320 | 8 | GVTVPEDR |
| 9 | 833840 | 62-69 | 9 | AMQAMGAR |
基于上述原则，本发明舍去了LNGVDCDEGETSLVVR、TPTPITYR和GVTVPEDR这三条肽段，因为它们的序列过长或者过短。本发明对肽段VPMASAQVK、LSAVANGLK和AMQAMGAR也所有担忧，因为这些序列中含有多个亲脂性氨基酸，这可能会使得肽段在初始流动相中的溶解度不佳，造成定量的不准确性。
最终，本发明选择了ITGLLEGEDVINTGK、SFMFGGLASGETR和LAGGEDVADLR这作为可能的标准物订购了合成肽段。这些肽段实际在质谱检测中的表现，以及在初始流动相中的溶解情况还有待下一步实验验证。图4A、B和C分别显示了这三条特异性肽段的MS/MS质谱图，子离子m/z=932.4和1061.5；872和946；688.3、931.4和1002.7分别来自母离子m/z=780.4、680.5和558.5，绝大多数子离子都具有较好的响应值，这为定量分析奠定了很好的基础。在MRM分析中，肽段母离子m/z=680.5的子离子m/z=946不能实现稳定检测，因而本发明最终选择其余6个子离子通过MRM方法进行定量分析，碎裂电压和碰撞能量的优化见图3，优化后总结于表5。为了节约实验时间，优化质谱质量分析器参数的过程采用直接进样，不经过液相系统。
表5质量分析器参数优化
| 肽段名称 | 肽段序列 | 电荷数 | Q1(m/z) | Q3(m/z) | 碎裂电压(V) | 碰撞能量(eV) |
| IK | ITGLLEGEDVINTGK | 2 | 780.4 | 932.4 | 145 | 28 |
| 2 | 1061.5 | 145 | 26 | |||
| IK-Label | ITGLLEGEDVINTGK* | 2 | 782.4 | 934 | 145 | 28 |
| 2 | 1065.5 | 145 | 26 | |||
| SR | SFMFGGLASGETR | 2 | 680.5 | 872 | 155 | 20 |
| SR-Label | SFMFGGLASGETR* | 2 | 682.5 | 878.2 | 155 | 20 |
| LR | LAGGEDVADLR | 2 | 558.5 | 931.5 | 145 | 20 |
| 2 | 1002.3 | 145 | 18 | |||
| 2 | 688.5 | 145 | 20 | |||
| LR-Label | LAGGEDVADLR* | 2 | 560.5 | 935.5 | 145 | 20 |
| 2 | 1006.3 | 145 | 18 | |||
| 2 | 672.5 | 145 | 20 |
*代表标记上两个18O原子；atoms are incorporated;Q1离子具有+2Da的质荷比改变,Q3离子具有+4Da的质荷比改变.
3.3蛋白提取液的考察
为了选择提取效率最高的蛋白提取液，本发明考察了九种不同的缓冲溶液对烟叶蛋白的提取，其中包括不同种类的缓冲溶液，也包含溶质相同但pH值不同的缓冲溶液。各缓冲液的蛋白提取效率(所提取的蛋白质量/烟叶质量×100%)总结与表6。
表6蛋白提取液提取效率的考察
| 编号 | 提取液 | 被提取蛋白的比例(%) |
| 1 | 50mM Tris-HCl,pH7.6 | 0.937 |
| 2 | 50mM Tris-HCl,pH6.8 | 0.856 |
| 3 | 50mM NH4HCO3 | 0.820 |
| 4 | 100mM PBS,pH7.0 | 0.681 |
| 5 | 100mM PBS,pH6.0 | 0.651 |
| 6 | 100mM PBS,pH5.0 | 0.634 |
| 7 | 100mM KH2PO4 | 0.576 |
| 8 | H2O | 0.583 |
| 9 | Na2CO3+NaCl+H2O | 0.612 |
从表6的结果中不难发现，最佳的蛋白提取液为Tris-HCl(pH7.6)。被提取的蛋白粗提液经过酶解进样至LC-MS进行检测，可以非常清晰的观察到目标肽段子离子的质谱峰。因此，本发明认为Tris-HCl(pH7.6)为适宜的蛋白提取液，将用作后续实际烟叶样品的蛋白提取。
3.4胰蛋白酶消化条件的考察及优化
绝对定量策略上不直接在蛋白水平上进行定量，而是定量肽段水平代替对蛋白水平的测定。因此，完全酶解对定量目标蛋白的准确性非常重要。不同的胰蛋白酶与蛋白的比例以及酶解时间的考察如图5所示。
在图5A中，横坐标是不同的胰酶与蛋白的质量比；纵坐标表示不同胰酶与蛋白的质量比下采用LC-MRM方法测得的酶解效率，与胰酶:蛋白=1:50(w/w)时的酶解效率之比。从图中可以看出，随着胰酶用量的增加，酶解效率逐渐增大，但当胰酶与蛋白的质量比大于1:50后，酶解效率则不再有明显的变化。因此，最佳胰酶与蛋白的质量比为1:50。
在图5B中，横坐标是为酶解时间；纵坐标表示不同酶解时间下采用LC-MRM方法测得的酶解效率与酶解20h时的酶解效率之比。从图中可以看出，酶解20h后，酶解效率形成了一个平台。最终为了保证样品充分酶解，本发明选择24h作为酶解反应的最佳时间。
3.518O标记条件的考察及优化
与第2、3章对于18O标记条件的考察相似，在本实验中最终的尿素浓度需要降至1M以下。酸化液的pH值是影响标记效率的另一重要因素，本发明考察了pH值0-7.0的50mMKH2PO4–K2HPO4缓冲液对标记效率的影响，实验结果如图6所示，从图中可以看出，最佳的酸化液为50mM KH2PO4(pH0)。
此外，考虑到标记后的标物在一定储藏条件下，可能会有回标的现象发生。因此有必要对回标情况进行考察。表7总结了在4℃and-80℃条件下储存7天和10天后的样品标记效率。
最初完成标记反应时，3条肽段(IK,SR和LR)的标记效率分别为100.00%,990%and100.00%。不同条件下储存后的标记效率如表7所示，基本上可以确定将标记后标物在4℃储存7天是可以接受的，但是如果标记后的标物需要被存放更长时间，则需要在-80℃存放。
表7标记后的标物肽段在不同条件下储藏后的标记效率
范围和最低定量限的考察
在本发明中，所有用来绘制标准曲线的QC样品中均加有肽段混合物作为基质。基质物质是从非转基因烟叶中提取的总蛋白酶切后得到肽段混合物。非转基因烟叶不含有转基因蛋白CP4-EPSPS，因此也不会含有CP4-EPSPS来源的特异性肽段。加入基质的目的在于使得绘制标准曲线的数据更加接近实际样品的情况。
3条特异性肽段IK(ITGLLEGEDVINTGK)、SR(SFMFGGLASGETR)以及LR(LAGGEDVADLR)的6个子离子用于绘制标准曲线用以定量研究。每条肽段都制备了12个不同浓度的标准溶液；内标肽段(标记后的3条特异性肽段)需配制成接近实际烟叶中样品的浓度。实验所得的线性方程和相关系数总结于表8中，3条特异性肽段(SR,IK,and LR)的最低定量限分别为5、3和4fmol。3条特异性肽段的标准曲线线性范围分别为5-500、5-500和10-1000fmol，相关系数r2为0.9992～0.9998，如图7所示，该组数据显示出良好的线性关系。
表8线性方程和相关系数
a最低检出限,LOD,SNR=5
b最低定量限,LOQ,SNR=15
3.7回收率和精密度考察
在酶解后的样品中添加已知量的标准物来测定回收率。每个肽段采用高、中、低三个浓度加以测定，结果如表9所示。其中低浓度的标准物其浓度需接近实际样品。
表9回收率的测定(%)
QC样品的峰面积的相对标准偏差(RSD)通常用于衡量定量方法的精密度和准确度。高、中、低三个浓度的QC样品的RSD%总结于表11，每个浓度的测定采用将标准肽段溶液加入到基质中，每个肽段浓度的测定平行3次，达到了生物样品的检测要求。
表10精密度和准确度的考察
4烟叶样品中转基因蛋白CP4-EPSPS的绝对定量
将建好的定量方法应用于转基因烟草和非转基因烟草实际样品的测定。所有的烟叶样品由中国农业科学院提供。共测定了20例转基因烟叶和和10例非转基因烟叶。其中非转基因烟叶中检测不到转基因蛋白CP4-EPSPS；转基因烟叶中检测到每毫克新鲜叶片中含有转基因蛋白CP4-EPSPS的质量为1.6E-06～9E-06μg。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。
Claims (5)
1.烟叶中转基因蛋白CP4-EPSPS的定量检测方法，其特征在于：从烟叶中提取蛋白，得到蛋白粗提液；其过程为：提取蛋白时采用pH7.6的Tris-HCl作为提取溶剂；将碎裂后的烟叶放入2mL EP管中称重，继而向EP管中直接加入pH7.6的Tris-HCl作为蛋白提取溶剂充分研磨，再将样品管密封好进行超声提取30min；将蛋白粗提液以1,000×g进行离心处理10min后取上清，再将上清液以17,000×g进行高速离心处理30min后，取100μL上清液冻干备用；
将蛋白粗提液进行酶切：将冻干后的肽段样品溶于含8M尿素的10mM二硫苏糖醇溶液进行变性，于37℃水浴孵育4h；再加入50mM碘乙酰胺溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应1h；再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶＝50:1(w/w)，于37℃水浴孵育16h；完成酶切后，残余的胰蛋白酶经灭活处理，将样品在沸水中煮10min，再加入5％的甲酸(v/v)；在LC-ESI/QQQ MS进行分析之前，样品经17,000×g高速离心处理15min，以确保无不溶物进到分析系统里；
采用18O标记的3个CP4-EPSPS的特异性肽段作为内标，用UPLC/ESI-QQQ MS检测，在肽段水平上定量CP4-EPSPS；其中所述3个特异性肽段序列为ITGLLEGEDVINTGK、SFMFGGLASGETR和LAGGEDVADLR；
其中，18O标记的过程为：将特异性肽段样品溶于用H2 18O配制的50mM KH2PO4缓冲液中，随后加入分别用H2 18O溶解的胰蛋白酶，其中蛋白:胰蛋白酶＝50:1(w/w)，在37℃水浴中标记20h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：从烟叶中提取蛋白，得到100μL上清液冻干备用，采用考马斯亮蓝法测定烟叶中提取蛋白的浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：特异性肽段的选择基于HPLC/ESI-Trap MS/MS的实验结果以及经BLAST算法的验证；
标记完成后，残余的胰蛋白酶经灭活处理，将样品在沸水中煮10min，再加入5％的甲酸(v/v)；
在LC/ESI-QQQ MS进行分析之前，样品在17,000×g条件下经高速离心处理15min，以确保无不溶物进到分析系统里。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：采用HPLC/ESI-Trap MS进行预分析。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法是绝对定量方法。
Priority Applications (1)
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