CN104931637A - 一种生物样本中peg含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明为一种生物样本中PEG含量的测定方法，采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，首先制备标准曲线，然后将待测样本测定结果通过标准曲线计算出待测样本中PEG浓度；本发明中质谱条件基于三重串联质谱技术，质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来定量PEG。本发明针对生物样本中PEG分子量的不唯一性，建立一种操作简便易行，结果准确可靠，灵敏度高，重现性好的PEG定量测定方法。

Description

一种生物样本中PEG含量的测定方法

技术领域

   本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种生物样本中PEG含量的测定方法。一种基于高效液相色谱-飞行时间质谱（LC-Q-Q-TOF）联用技术测定样本中不同聚合度PEG含量的方法。

背景技术

聚乙二醇（PEG）是一种pH中性，无毒，且具有独特理化性质和良好生物相容性的亲水高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数可以体内注射的合成聚合物之一。当PEG偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物或纳米颗粒外壳上时，可以降低药物制剂的免疫清除以及肾脏的快速消除，延长药物的体内循环时间，减小药物的毒性。作为新型的药用辅料，PEG的质量控制以及在体内的吸收、分布与排泄过程对于PEG化药物的设计与评价具有十分重要的意义。

目前对于PEG的分析常采用放射性标记法、比色法、Western Blot和高效液相色谱法（HPLC），但这些方法均存在明显的不足。例如，放射性标记法用于标记PEG时成本太高，且目前尚未建立成熟的方法学检验标记效率，也没有对比试验说明标记后的PEG在体内的动力学行为是否发生了变化；比色法和Western Blot法都不能得到精确的定量结果，且后者是通过测定与PEG结合的抗体量来间接对PEG进行定量。鉴于抗体的选择性差，可能和样本中存在的内源性干扰物质结合，故不适合血浆或组织等复杂生物样本中PEG的定量分析；HPLC法采用折射率检测器，分析时间长，且定量下限仅为50 mg/mL，不足以分析生物体内痕量的PEG水平。

近年来，迅速发展的液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）凭借其在定量分析方面的出色表现，为药物的药代动力学研究提供了良好的解决方案。LC-MS/MS定量的流程是：色谱分离、离子化、质荷比（m/z）扫描、选择特定m/z进行定量。在众多扫描方式中，三重四级杆质量分析器的多重反应监测模式（MRM）选择性好，灵敏度高，已经成为LC-MS/MS分析中最常用的定量方式。这种模式的定量思路是：离子化、第一个四级杆（Q1）：选择一个特定的离子作为母离子，并只允许这一种离子通过、第二个四级杆（Q2）：母离子被碰撞能量打成碎片、第三个四级杆（Q3）：从产生的碎片中选择一个响应高且稳定的碎片作为子离子、测定选择的母子离子对的含量。所以这种模式必须在知道待测化合物母离子和子离子的准确m/z的前提下才能进行。

而PEG是由一系列以乙二醇为基本单元组成的高分子混合物，其分子量不是唯一的值，而是以某个聚合度的分子量平均值为中心呈正态分布，如： PEG 4000其实是以分子量4000的PEG分子为中心呈正态分布的多种分子量PEG分子的混合物；PEG600、PEG 6000、PEG 10000也是如此，均为多种分子量PEG分子的混合物；因此这给以待测化合物目标分子量为基础的LC-MS/MS定量分析带来了极大的挑战。

对于PEG的质谱定量分析，通常采用电喷雾离子源（ESI），在ESI条件下，PEG的离子化效率高，其长链易于带电，但是其所带电荷量不同，这使得本身聚合度就不相同的PEG具有更多不同的m/z，所以PEG碎片的m/z更加不确定，难以用传统的MRM扫描模式对PEG进行LC-MS/MS定量分析。为此，人们也在尝试着一些方法来解决这一难题。如有学者尝试利用离子源内能量将不同聚合度PEG初步打碎成较大片段，并通过Q1选择其中一个响应较高的片段作为母离子，再继续按照MRM模式用产生的碎片进行定量分析。该方法虽然能部分实现PEG的LC-MS/MS定量分析，但是离子源内产生的能量较低，比串联质谱碰撞室（Q2）内的碰撞能量至少低2个数量级，所以只能部分裂解PEG，且裂解位置不固定，裂解效率不稳定，可以产生若干种不同m/z的碎片，无论选择哪个碎片作为母离子进行定量，都不得不忽略大部分其他m/z的碎片，其定量结果灵敏度、准确性较低，线性差。另有学者对聚合度较低的PEG 400进行定量分析，针对其中丰度较高的9种不同分子量的PEG，对每个PEG都利用MRM模式测定含量之后，再将它们的含量相加得到PEG 400的总体含量。但是在定量前必须先测定每种聚合度的PEG占总量的比例才可完成定量，而且对每种成分都要单独制作标准曲线，操作步骤相应增加，造成定量准确性降低。以上两种方法均采用MRM模式，仍需要利用Q1选择母离子，没有从根本上解决问题，还存在一些不足。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对生物样本中PEG分子量的不唯一性，建立一种操作简便易行，结果准确可靠，灵敏度高，重现性好的PEG定量测定方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

一种生物样本中PEG含量的测定方法，采用液相色谱-飞行时间质谱（LC-Q-Q-TOF）进行测定，测定步骤包括：

A. 建立PEG测定的标准曲线；

B.使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中PEG浓度；

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来定量PEG。

进一步的，所述特征碎片离子m/z为133.083~133.086。

进一步的， 测定PEG 400~1000，所述质谱操作部分解簇电压为80 V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为25 eV。

进一步的， 测定PEG 1000~2000，所述质谱操作部分解簇电压为100 V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为25 eV。

进一步的， 测定PEG 2000~20000，所述质谱操作部分解簇电压为100 V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为30 eV。

进一步的，测定方法中使用的内标物质为辛伐他汀。

进一步的，步骤A和步骤B中所述质谱条件为：正离子方式检测；离子喷射电压：5500 V；温度：500°C；气帘气体（CUR）氮气压力15 psi；气体1氮气压力（GS1）60 psi、气体2氮气压力（GS2）50 psi；PEG扫描方式为TOF-MS模式，扫描的m/z范围为88.0~178.0。

进一步的，步骤A和步骤B中所述色谱条件为：流动相为甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占0.1%的乙腈，梯度洗脱，柱温40°C；流速：400 mL/min。

进一步的，所述步骤A具体操作程序为：

1）制备内标溶液和不同浓度的PEG标准溶液。

2）于抗吸附管中加入内标溶液、PEG标准溶液及预冷的乙腈涡流混匀，离心后取上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）取不同浓度的PEG标准溶液重复程序2）操作，记录色谱图，PEG浓度为横坐标，PEG色谱峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

进一步的，所述步骤B具体操作程序：

1）于抗吸附管中加入内标溶液、待测样本溶液及预冷的乙腈涡流混匀，离心后取上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

2）将程序1）中获取的待测样本PEG峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线，求得PEG浓度。

本发明测定方法的原理是：通过改变液相色谱流动相比例，将不同分子量范围的PEG从色谱柱上洗脱后进入质谱检测。采用TOF-MS模式，无需在Q1中选择母离子，所有PEG都直接进入碰撞室（Q2）内，通过碰撞诱导解离（CID）的方式，利用Q2内的较大能量高效地将PEG全部打碎，然后利用飞行时间质量分析器（TOF）选择不同聚合度PEG共同产生的的响应最高且稳定的特征质谱裂解碎片（理论上精确m/z为133.08592，3个乙二醇重复单元）进行定量，进而建立一种操作简便、结果准确可靠，灵敏度高，重现性好的用于分析不同分子量PEG的LC-Q-Q-TOF定量方法。

本发明的有益效果为：

1、本发明可解决母离子未知情况下的不同分子量PEG的定量难题。传统的质量分析器由于软、硬件设计上的问题，难以得到背景干扰低且灵敏度高的全质荷比裂解数据。本发明中使用的串联四级杆飞行时间质量分析器（Q-Q-TOF）通过碰撞室内碰撞诱导解离（CID）的方式，利用较大能量将进入碰撞室内的质荷比不确定、不唯一的PEG全部打碎，进而对不同分子量的PEG均产生的丰度高且稳定的特征质谱裂解碎片（理论上精确m/z为133.08592，3个乙二醇重复单元）进行定量。

2、本发明利用高效液相色谱将PEG与杂质在色谱柱上初步分离，并可起到富集作用，然后将色谱洗脱液进行Q-Q-TOF分析。Q-Q-TOF是一种新型的高分辨率质量分析设备，其质量分辨率高达2.0 ppm，突破了单位质量分辨率分析器的限制，提高了对待测碎片的专属辨识能力，可将样本测定过程中的基质干扰降至最低水平，提高不同分子量PEG定量的灵敏度与准确性。

3、本发明除提取质量范围为133.083~133.086离子的色谱图进行定量以外，还提取质量范围为89.058~89.062以及177.110~177.114两个范围的离子色谱图作为监测离子。这三种离子均为PEG在碰撞室中裂解产生的丰度高且稳定的PEG特征碎片，其中用于定量分析的碎片响应信号最强且稳定性最好。当这三种离子的色谱峰型和保留时间均相同时，可以确定所得到的色谱峰来自待分析物，使定量的专属性、准确性更强。

4、本发明所述的PEG定量方法操作简便易行、分析时间短、线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、可靠，不仅可以对复杂生物样本中不同聚合度的PEG进行定量，也可应用于PEG键合药物中PEG的含量测定，应用范围广。

附图说明

图1是空白血浆样本色谱图。

图2是内标色谱图。

图3是PEG 600、PEG 4000、PEG 6000、PEG 10000标准工作曲线最低定量下限色谱图。

图4是实施例1得到的PEG 4000血浆样本色谱图。

图5是实施例1得到的大鼠尾静脉注射PEG 4000后血浆药-时曲线。

具体实施方式

实施例1

一种生物样本中PEG含量的测定方法，采用液相色谱-飞行时间质谱（LC-Q-Q-TOF）进行测定，测定步骤包括：

A. 建立PEG测定的标准曲线；

B.使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中PEG浓度；

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中电压不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来定量PEG。

所述特征碎片离子m/z为133.083~133.086（精确m/z为133.08592，3个乙二醇重复单元）。

测定方法中使用的内标物质为辛伐他汀。

步骤A和步骤B中所述质谱条件为：正离子方式检测；离子喷射电压：5500 V；温度：500°C；气帘气体（CUR）氮气压力15 psi；气体1氮气压力（GS1）60 psi、气体2氮气压力（GS2）50 psi；PEG扫描方式为TOF-MS模式，扫描的m/z范围为88.0~178.0。根据待测为中PEG聚合度不同，解簇电压（DP）和碰撞电压（CE）的设定值如下。

步骤A和步骤B中所述色谱条件为：流动相为甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占0.1%的乙腈，梯度洗脱，柱温40°C；流速：400 mL/min。

所述步骤A具体操作程序为：

1）制备内标溶液和梯度稀释的不同浓度的PEG标准溶液。

2）于抗吸附管中加入20 μL内标溶液、100 μL PEG标准溶液及300 μL在-20℃中预冷的乙腈后涡流混匀，15000 rpm离心5 min取30 μL上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）取不同浓度的PEG标准溶液重复程序2）操作，记录色谱图，PEG浓度为横坐标，PEG色谱峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

所述步骤B具体操作程序：

1）于抗吸附管中加入20 μL内标溶液、100 μL待测样本溶液及300 μL在-20℃中预冷的乙腈后涡流混匀，15000 rpm离心5 min取30 μL上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

2）将程序1）中获取的待测样本PEG峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线，求得PEG浓度。

实施例 2

在实施例1的基础上，具体选择测定血浆中 PEG 4000 进行定量。

测定之前的准备工作为：

大鼠血浆样本的采集

①选取体重为200 g±10 g雄性大鼠1只，自由饮食；

②称取PEG 4000并用生理盐水稀释至1.0 mg/mL；

③给药过程如下：尾静脉注射给药，给药剂量为1.0 mg/mL的PEG 4000生理盐水溶液0.6 mL/只。大鼠分别于给药前（0 h）和给药后0.083 h、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h，经大鼠眼眶取血0.5 mL，将全血置于预冷的肝素化EP管中，4°C离心（13300 rpm，5 min），分离并将全部血浆移置另一EP管中，置于-20°C冰箱中保存待测。

大鼠血浆样本中PEG 4000含量的测定

采用液相色谱-飞行时间质谱（LC-Q-Q-TOF）进行测定，测定步骤包括：

A. PEG测定标准曲线的制备，

具体操作程序为：

1）制备内标溶液和梯度稀释的不同浓度的PEG标准溶液。

①用去离子水将PEG 4000标准品溶解，并稀释至1.0 mg/mL，得到PEG 4000储备液；

②利用与待测样本相同的基质溶液将PEG 4000储备液分别稀释至50，100，300，1000，3000，10000 ng/mL；

③用甲醇将辛伐他汀标准品溶解，并稀释至1.0 mg/mL，得到辛伐他汀储备液，利用甲醇:水=50:50（v/v）的溶液将辛伐他汀储备液稀释至100 ng/mL，用作内标溶液；

2）于2 mL抗吸附管中加入20 μL内标溶液、100 μL PEG标准溶液及300 μL在-20℃中预冷的乙腈后涡流混匀，15000 rpm离心5 min取30 μL上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）取不同浓度的PEG标准溶液重复程序2）操作，记录色谱图，PEG浓度为横坐标，PEG色谱峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

B.使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中PEG浓度，

步骤B具体操作程序：

1）于2 mL抗吸附管中加入20 μL内标溶液、100 μL待测样本溶液及300 μL在-20℃中预冷的乙腈后涡流混匀，15000 rpm离心5 min取30 μL上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

2）将程序1）中获取的待测样本PEG峰面积与内标峰面积比值代入标准曲线，求得PEG浓度。

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来定量PEG。

色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱系统，包括二元输液泵，脱气机，自动进样器，美国Agilent公司；岛津UFLC SIL-20A XR柱温箱，日本岛津公司；色谱柱：XBridge^TM BEH300 C18柱，2.1×50 mm I.D.，3.5 μm粒径，300A孔径（Waters）；流动相：甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占0.1%的乙腈，梯度洗脱，具体程序见表2；柱温40°C；流速400 mL/min；

其中A是甲酸体积百分数占0.1%的水，B是甲酸体积百分数占0.1%的乙腈。

质谱条件：Triple TOF 5600型质谱仪，配有电喷雾离子化源以及Analyst TF 1.6.1数据处理软件（美国AB SCIEX公司）；正离子方式检测；离子喷射电压：5500 V；温度：500°C；气帘气体（CUR）氮气压力15 psi；气体1氮气压力（GS1）60 psi、气体2氮气压力（GS2）50 psi；PEG扫描方式为TOF-MS模式，扫描的m/z范围为88.0~178.0，解簇电压（DP）100 V，碰撞电压（CE）30 eV；辛伐他汀扫描方式为Product ion模式，母离子的m/z为419.2，子离子扫描范围为198.5~199.5；

数据处理：

利用Analyst TF 1.6.1软件记录色谱图，并使用Multiquant 2.0.2软件提取m/z范围为133.083~133.086（理论上精确m/z为133.08592，3个乙二醇重复单元）离子的色谱图进行定量，同时提取质量范围为89.058~89.062（理论上精确m/z为89.05971，2个乙二醇重复单元）以及177.110~177.114（理论上精确m/z为177.11214，4个乙二醇重复单元）两个范围的离子色谱图作为监测离子。以A步骤中获取的PEG浓度为横坐标，PEG色谱峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准工作曲线。将B步骤中获取的待测样本PEG峰面积与内标峰面积比值代入标准工作曲线，求得PEG浓度。空白血浆样本色谱图如图1所示，内标色谱图如图2所示，含PEG 4000的样本色谱图如图4所示，大鼠尾静脉注射PEG 4000后的血药浓度见表3；

质量控制样本制备

①利用去离子水将PEG 4000标准品溶解至1.0 mg/mL，得到PEG 4000储备液；

②利用大鼠血浆将PEG储备液分别稀释至100，1000，8000 ng/mL；

③每浓度取至少三个样本，按照标准曲线制备方法处理样本，并根据标准曲线，得出PEG浓度，计算质量控制样本准确度，具体见表5，考察方法的准确性。

本发明所述的不同聚合度PEG定量方法操作简便易行、分析时间短、线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、可靠，不仅可以对复杂生物样本中不同聚合度的PEG进行定量，也可应用于PEG键合药物中PEG的含量测定，应用范围广。

实施例 3

血浆样本中PEG 10000含量的测定，除下述参数与实施例2不同外，其他操作和参数与实施例2相同。

  测定之前的准备工作中给大鼠注射的为PEG 10000生理盐水溶液，制作标准溶液时选取的标准品为PEG 10000。测定参数中：质谱条件中解簇电压为100 V，碰撞电压为30 eV；色谱洗脱程序见表6。标准曲线和准确度见表7、8。

实施例 3

血浆样本中PEG 600含量的测定，除下述参数与实施例2不同外，其他操作和参数与实施例2相同。

  测定之前的准备工作中给大鼠注射的为PEG 600生理盐水溶液，制作标准溶液时选取的标准品为PEG 600。测定参数中：质谱条件中解簇电压为80 V，碰撞电压为25 eV；色谱洗脱程序见表9。标准曲线和准确度见表10、11。

Claims (10)

1.一种生物样本中PEG含量的测定方法，其特征在于：采用液相色谱-飞行时间质谱进行测定，测定步骤包括：

A.建立 PEG测定的标准曲线；

B.使用液相色谱-飞行时间质谱测定待测样品，通过步骤A所得标准曲线计算出待测样本中PEG浓度；

步骤A和步骤B的色谱条件和质谱条件相同，其中质谱条件基于三重串联质谱技术，步骤A和步骤B质谱部分的设定为：第一个质量分析器Q1中不选择母离子，带电粒子全部通过后进入第二个质量分析器Q2；在第二个质量分析器Q2中设置碰撞能量，将带电粒子打碎成碎片离子；在第三个质量分析器飞行时间质量分析器选取稳定的特征碎片离子，来定量PEG。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述特征碎片离子m/z为133.083~133.086。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于： 测定PEG 400~1000，所述质谱操作部分解簇电压为80 V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为25 eV。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于： 测定PEG 1000~2000，所述质谱操作部分解簇电压为100 V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为25 eV。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于： 测定PEG 2000~20000，所述质谱操作部分解簇电压为100 V，第二个质量分析器Q2中PEG的碰撞电压为30 eV。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：测定方法中使用的内标物质为辛伐他汀。

7.根据权利要求1~6中任意一项所述的测定方法，其特征在于：步骤A和步骤B中所述质谱条件为：正离子方式检测；离子喷射电压：5500 V；温度：500°C；气帘气体（CUR）氮气压力15 psi；气体1氮气压力（GS1）60 psi、气体2氮气压力（GS2）50 psi；PEG扫描方式为TOF-MS模式，扫描的m/z范围为88.0~178.0。

8.根据权利要求1~6中任意一项所述的测定方法，其特征在于：步骤A和步骤B中所述色谱条件为：流动相为甲酸体积百分数占0.1%的水和甲酸体积百分数占0.1%的乙腈，梯度洗脱，柱温40°C；流速：400 mL/min。

9.根据权利要求1~6中任意一项所述的测定方法，其特征在于：所述步骤A具体操作程序为：

1）制备内标溶液和不同浓度的PEG标准溶液；

2）于抗吸附管中加入内标溶液、PEG标准溶液及预冷的乙腈后涡流混匀，离心后上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

3）取不同浓度的PEG标准溶液重复程序2）操作，记录色谱图，PEG浓度为横坐标，PEG色谱峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，用加权W=1/x²最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为标准曲线。

10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于：所述步骤B具体操作程序为：

1）于抗吸附管中加入内标溶液、待测样本溶液及预冷的乙腈涡流混匀，离心后取上清液进样到高效液相色谱-飞行时间质谱中分析；

2）将程序1）中获取的待测样本PEG峰面积与内标峰面积比值代入标准工作曲线，求得PEG浓度。