CN111337482A - 一种快速检测聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速检测聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度的方法,包括如下步骤:1)对待测样品进行预处理,方法如下:取待测样品溶液,去除溶液中干扰两相法检测游离聚乙二醇的蛋白组分和小分子杂质组分;2)采用两相法,测算步骤1)处理后的样品溶液中的游离聚乙二醇质量;3)根据步骤2)的游离聚乙二醇质量推算出待测样品的聚乙二醇修饰度。本发明还提供上述方法在检测样品溶液中聚乙二醇含量、聚乙二醇残留量或聚乙二醇修饰度方面的应用。本发明具有如下技术效果:通过实现待测样品中其他物质与游离PEG的分离,去除待测样品中非游离PEG组分,使得这些物质不干扰两相法检测游离PEG含量,从而更加精确且快速地检测PEG修饰度。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域,具体涉及聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度的检测方法。
背景技术
聚乙二醇(PEG)是一种线性、直链或带有支链的大分子聚合物,具有极低的毒性和微弱的免疫原性,易溶于水和有机溶剂。用它来共价修饰蛋白质,可以提高蛋白稳定性,延长其体内半衰期并降低免疫原性。聚乙二醇已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究,蛋白质聚乙二醇化技术已经成为蛋白药物长效化、改善其体内药代动力学性质最有效的方法之一。
蛋白质上可以发生PEG修饰的位点较多,当蛋白质上修饰位点与个数发生变化时,蛋白质的等电点、活性等理化性质会发生相应的变化。因此,聚乙二醇修饰蛋白的PEG平均修饰度是此类药物质量控制的重点。
目前,PEG修饰度的检测方法主要有:三硝基苯磺酸(TNBS)法、荧光胺法和质谱法。TNBS法和荧光胺法原理是通过发光或显色物质结合游离氨基,通过游离氨基数来反推蛋白的聚乙二醇结合数。这三种方法分别存在如下不足:
1.质谱法结果准确,优于本方法,但成本过高,不适于作为日常检测方法。
2.TNBS法为经典方法,方法较为简单经济,但测得结果波动较大且适用场景有限。有下列问题:1)关键试剂三硝基苯磺酸受管制,无法购买;2)实验总耗时4小时以上;3)使用场景受限制,如受多种小分子干扰、不能检测中间体等。
3.荧光胺法基本可以作为TNBS法的替代,但有下列问题:(1)需要荧光酶标仪或荧光分光光度计,成本较高;(2)使用场景受限制,如受多种小分子干扰、不能检测中间体等。
另外,也有人采用两相法进行PEG修饰度的检测,主要有以下几种:
Nag等人在Anal.Biochem.,1996,237:224-231中首先提出使用氯仿、水构建两相体系,并使用硫氰酸铁作为显色物质的两相法。多年以来两相法没有本质上的变化,均为以水和有机溶剂组成互不相溶的两相体系,利用PEG既溶于水也溶于有机溶剂的性质,通过与PEG形成有颜色的络合物在有机相中的浓度检测PEG含量。改进和进一步研究一般产生在样品前处理上。Nag也仅仅止步于单纯的PEG的检测,其文章中检测PEG修饰蛋白修饰度时仍然使用的TNBS法。
高蓉等人在分析实验室,2003,22(4):44-45中报道了“两相体系分光光度法测定聚乙二醇化蛋白质混合物中游离聚乙二醇”,文章基本上是对Nag文章的重复。只是将PEG与BSA及其他有机大分子进行简单混合后检测。而这些大分子不带有PEG或类似基团,其在两相体系中的行为不能简单与PEG修饰的蛋白类比。
Li Shukuan等人在Anal.Biochem.,2003,313:335-337中提到使用强碱使PEG从修饰后蛋白上脱落。但一般认为PEG修饰后,蛋白稳定性增强,更能对抗极端pH环境。且发明人实践过程中发现,对于多点修饰蛋白,强碱几乎不可能使PEG从蛋白上脱落。
张鹏等人在化学通报,2008(10):777-781中报道了“两相体系检测聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子的修饰度”,文章中虽然想到了酶解蛋白以减小PEG修饰的蛋白进入有机相的阻力。但其使用的胰蛋白酶专一性较强,水解的是赖氨酸或精氨酸的羧基端,无法对PEG与蛋白间形成的酰胺键起作用。于是其酶解产物是PEG连接一个较长的多肽。达不到其宣称的“PEG已经基本被水解下来”的效果。另外,发明人在实践中发现,多肽进入有机相后会在其中形成悬浮颗粒,影响检测。
中国专利CN101493446B提供了一种检测样品或制品中游离聚乙二醇含量的方法,其存在如下不足:1)成本高:该方法需要液相系统及特定的非常用的检测器以及相应的配套设备,硬件成本高。2)适应性一般,针对不同的PEG修饰蛋白,该方法不一定适用,需要在其基础上调整流动相比例、流速等参数。
综上,现有技术存在多种技术问题,不能精确且快速检测聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度。
本发明已经解决了上述技术问题,提供了一种精确且快速检测聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度的方法。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术存在的上述技术问题,提供一种精确且快速检测聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度的方法。
发明人经过长期研究实践,发现几乎不可能使得PEG从修饰后的蛋白上脱落,尤其是多位点修饰的蛋白。因此放弃了使用酶切等方式处理样品的思路,改为检测溶液中的游离PEG。另外,针对样品中的杂质,串联使用了硫酸铵沉淀和分子排阻离心分别去除蛋白和小分子杂质,使得处理后的液体中只存在游离PEG;针对随着纯化步骤的增加,溶液中游离PEG大幅度减少的问题,对原液样品使用了低截留分子量的超滤离心代替分子排阻离心,使得样品中的游离PEG浓度增加到了定量限以上。
正是基于上述与现有技术完全不同的技术思路,发明人提供了一种新的技术解决方案,并解决了现有技术存在的技术问题。
本发明的技术方案如下:
一种快速检测聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度的方法,包括如下步骤:
1)对待测样品进行预处理,方法如下:取待测样品溶液,去除溶液中干扰两相法检测游离聚乙二醇的蛋白组分和小分子杂质组分;
2)采用两相法,测算步骤1)处理后的样品溶液中的游离聚乙二醇质量;
3)根据步骤2)的游离聚乙二醇质量推算出待测样品的聚乙二醇修饰度。
所述的步骤1)中,采用硫酸铵沉淀法去除蛋白组分。
所述的步骤1)中,所述的步骤1)中,采用离心法去除小分子杂质组分。
优选地,
所述的步骤1)中,所述的步骤1)中,采用超滤离心法或分子排阻离心法去除小分子杂质组分。
所述的步骤1)中,所述的步骤1)中,串联使用硫酸铵沉淀和分子排阻离心分别去除蛋白和小分子杂质组分。
所述的步骤1)中,所述的步骤1)中,串联使用硫酸铵沉淀和超滤离心分别去除蛋白和小分子杂质组分。
所述的步骤2)中,测算处理后的样品中的游离聚乙二醇质量的方法如下:首先将步骤1)处理后的待测样品和聚乙二醇对照品梯度溶液分别加入到硫氰酸铁-氯仿两相体系中;测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值;以对照品吸光度值对各点对照品溶液中的聚乙二醇质量拟合标准曲线,并得到曲线参数;将处理后的样品的吸光度值代入标准曲线,计算出其中游离聚乙二醇的质量。
所述的步骤3)中,根据步骤2)的游离聚乙二醇质量推算出聚乙二醇修饰度的计算公式如下:
本发明的方法,包括如下步骤:
1)对样品进行预处理,去除溶液中干扰两相法检测游离聚乙二醇的蛋白组分和小分子杂质组分,具体操作如下:取样品溶液,加入硫酸铵,搅拌,使蛋白沉淀;取上清液进行离心,去除小分子杂质,收集液体备用;
2)聚乙二醇对照品溶液的制备:精密称取分子量与样品所用相同的聚乙二醇,加水溶解,系列稀释后定容,制成一系列含量固定的聚乙二醇对照品溶液,放置备用;
3)反应:分别取上述对照品溶液和预处理后的样品溶液,加入到硫氰酸铁-氯仿两相体系中,混匀后静置,待两相分层后取出氯仿相溶液;
4)数据测定与计算:测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值;以对照品吸光度值对对照品溶液中的聚乙二醇质量拟合标准曲线;将样品吸光度值代入标准曲线,计算出其中游离聚乙二醇的质量,再计算出聚乙二醇修饰蛋白中间体中的游离聚乙二醇质量;
5)聚乙二醇修饰度计算:根据以上结果计算聚乙二醇修饰度,计算公式如下:
采用本发明的方法在检测样品溶液中聚乙二醇含量、聚乙二醇残留量或聚乙二醇修饰度方面的应用。
测定检测样品溶液中聚乙二醇残留量的方法,包括如下步骤:
1)对待测样品进行预处理,方法如下:取待测样品溶液,去除溶液中干扰两相法检测游离聚乙二醇的蛋白组分和小分子杂质组分;
2)采用两相法,测算步骤1)处理后的样品溶液中的游离聚乙二醇质量;
3)根据步骤2)的游离聚乙二醇质量推算出待测样品的聚乙二醇残留量;
聚乙二醇残留量即为待测样品溶液中的游离PEG含量,计算公式如下:
本发明中,
“聚乙二醇修饰蛋白中间体”是指以已知质量的蛋白和已知投料量的聚乙二醇为原料,进行修饰反应一段时间,然后终止反应后获得的溶液。将其经本技术领域内熟知的纯化方法纯化即可得到聚乙二醇修饰蛋白原液。
“蛋白组分”是指溶液中的未修饰蛋白与聚乙二醇修饰蛋白。
“小分子杂质组分”是指溶液中除聚乙二醇与蛋白外的组分,如聚乙二醇的活化基团,无机盐等。
本发明工作原理如下:利用当在含有硫氰酸铁的水溶液中加入PEG时,PEG中的聚醚类结构会与硫氰酸铁定量形成络合物的原理。并利用PEG的两亲性,在剧烈震荡后,PEG会在水相与氯仿相中重新分配,于是部分硫氰酸铁被PEG携带进入氯仿相,使氯仿相呈现一定程度的颜色。另外,本发明独创性地加入了去除样品中非游离PEG组分的步骤,使得这些物质不干扰两相法检测游离PEG含量。
本发明具有如下技术效果:通过实现待测样品中其他物质与游离PEG的分离,去除待测样品中非游离PEG组分,使得这些物质不干扰两相法检测游离PEG含量,从而更加精确且快速地检测PEG修饰度。
具体实施方式
实施例中涉及的原料说明如下:
尿酸氧化酶蛋白,为本领域技术人员已知的任何重组尿酸氧化酶,具体可参考中国专利CN103173471A制备。
分子量为10kDa的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯,购自北京键凯科技股份有限公司。
聚乙二醇修饰尿酸氧化酶,由上述尿酸氧化酶蛋白与单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯缀合而成,可通过本领域技术人员已知的任何缀合反应进行。
实施例1检测聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度
1、制备聚乙二醇修饰尿酸氧化酶中间体
修饰方式:将纯化好的尿酸氧化酶蛋白样品超滤浓缩至2mg/mL,同时将样品体系更换为20mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。取出10mL,将分子量为10kDa的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯按质量比7:1加入到样品中,室温搅拌修饰2小时后加入甘氨酸至终浓度为10mM终止反应。即得聚乙二醇修饰尿酸氧化酶中间体。
2、溶液配制:
硫氰酸铁溶液的配制:称取1.62g六水合三氯化铁,3.04g硫氰酸铵,溶于100mL蒸馏水。
聚乙二醇对照品溶液的配制:称取分子量为10kDa的单甲氧基聚乙二醇100mg,溶于10mL蒸馏水,再用蒸馏水分别稀释,制得聚乙二醇终浓度分别为1mg/mL、1.5mg/mL、1.75mg/mL、2mg/mL和2.5mg/mL的聚乙二醇对照品溶液。
3、操作步骤:
1)待测样品处理:取上述中间体1mL,用蒸馏水稀释6倍,在缓慢搅拌的添加下逐步加入3.5g硫酸铵粉末。继续搅拌10min后将溶液转移至离心管,10000rpm离心10min,取3mL上清加入两支截留分子量为7kDa的5mL分子排阻离心管中,1500rpm离心2min后取出滤出液合并,作为待测样品。
2)反应:在六支5mL离心管中分别加入1mL硫氰酸铁溶液和1mL氯仿。再分别加入100μL上述待测样品和聚乙二醇对照品后迅速在漩涡混匀器上混合1分钟。将各离心管置于离心机中,3000r/min离心3min,取出下层氯仿相。另取蒸馏水同法操作作为空白对照。
3)数据测定与计算:用空白对照调零,在分光光度计上测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光值;以对照品吸光值对对照品溶液中的聚乙二醇质量拟合标准曲线;将待测样品吸光值代入标准曲线,计算出其中游离聚乙二醇的含量,再计算出聚乙二醇修饰蛋白中间体中的游离聚乙二醇总量。
4)检测结果:
标准曲线测得结果如表1,拟合得到的标准曲线方程为y=0.0049x+0.1012。
表1标准曲线
待测样品吸光值与计算得到的反应体系中的PEG质量如表2。另已知中间体中含蛋白20mg,分子量为34.2kDa;PEG投料量为140mg,分子量为10kDa。蛋白理论修饰位点为24个。按照公式计算可知聚乙二醇修饰尿酸氧化酶中间体的聚乙二醇平均修饰度为28.750%。
表2样品检测结果
实施例2检测样品中的游离聚乙二醇残留
实施例2中的样品为由实施例1制备的聚乙二醇修饰尿酸氧化酶中间体经本技术领域内熟知的纯化方法纯化过的聚乙二醇修饰尿酸氧化酶原液。
1、溶液配制:
聚乙二醇对照品溶液的配制:称取分子量为10kDa的单甲氧基聚乙二醇100mg,溶于10mL蒸馏水,再用蒸馏水分别稀释,制得聚乙二醇终浓度分别为0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL和1.2mg/mL的聚乙二醇对照品溶液。
2、操作步骤:
1)待测样品处理:取上述原液样品5mL,在缓慢搅拌的添加下逐步加入2.92g硫酸铵粉末。继续搅拌10min后将溶液转移至离心管,10000rpm离心10min,取800μL上清加入两支截留分子量为3kDa的0.5mL超滤离心管中,8000rpm离心30min使得离心管内液剩余总量为160μL,合并内液作为待测样品。
2)反应:在六支5mL离心管中分别加入1mL硫氰酸铁溶液和1mL氯仿。再分别加入100μL上述待测样品和聚乙二醇对照品后迅速在漩涡混匀器上混合1分钟。将各离心管置于离心机中,3000r/min离心3min,取出下层氯仿相。另取蒸馏水同法操作作为空白对照。
3)数据测定与计算:用空白对照调零,在分光光度计上测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光值;以对照品吸光值对对照品溶液中的聚乙二醇质量拟合标准曲线;将待测样品吸光值代入标准曲线,计算出其中游离聚乙二醇的含量。
4)检测结果:
标准曲线测得结果如表3,拟合得到的标准曲线方程为y=0.0040x+0.2004。
表3标准曲线2
待测样品吸光值与计算得到的反应体系中的PEG质量如表4。因为待测样品在超滤离心过程中已被浓缩五倍,因此可计算得到样品中游离PEG含量为0.099mg/mL。
表4样品检测结果
Claims (10)
1.一种快速检测聚乙二醇修饰蛋白中间体的修饰度的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)对待测样品进行预处理,方法如下:取待测样品溶液,去除溶液中干扰两相法检测游离聚乙二醇的蛋白组分和小分子杂质组分;
2)采用两相法,测算步骤1)处理后的样品溶液中的游离聚乙二醇质量;
3)根据步骤2)的游离聚乙二醇质量推算出待测样品的聚乙二醇修饰度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤1)中,采用硫酸铵沉淀法去除蛋白组分。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤1)中,所述的步骤1)中,采用离心法去除小分子杂质组分。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的步骤1)中,所述的步骤1)中,采用超滤离心法或分子排阻离心法去除小分子杂质组分。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤1)中,所述的步骤1)中,串联使用硫酸铵沉淀和分子排阻离心分别去除蛋白和小分子杂质组分。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤1)中,所述的步骤1)中,串联使用硫酸铵沉淀和超滤离心分别去除蛋白和小分子杂质组分。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的步骤2)中,测算处理后的样品溶液中的游离聚乙二醇质量的方法如下:首先将步骤1)处理后的待测样品和聚乙二醇对照品梯度溶液分别加入到硫氰酸铁-氯仿两相体系中;测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值;以对照品吸光度值对各点对照品溶液中的聚乙二醇质量拟合标准曲线,并得到曲线参数;将处理后的样品的吸光度值代入标准曲线,计算出其中游离聚乙二醇的质量。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法,包括如下步骤:
1)对样品进行预处理,去除溶液中干扰两相法检测游离聚乙二醇的蛋白组分和小分子杂质组分,具体操作如下:取样品溶液,加入硫酸铵,搅拌,使蛋白沉淀;取上清液进行离心,去除小分子杂质,收集液体备用;
2)聚乙二醇对照品溶液的制备:精密称取分子量与样品所用相同的聚乙二醇,加水溶解,系列稀释后定容,制成一系列含量固定的聚乙二醇对照品溶液,放置备用;
3)反应:分别取上述对照品溶液和预处理后的样品溶液,加入到硫氰酸铁-氯仿两相体系中,混匀后静置,待两相分层后取出氯仿相溶液;
4)数据测定与计算:测定氯仿相溶液在510nm波长处的吸光度值;以对照品吸光度值对对照品溶液中的聚乙二醇质量拟合标准曲线;将样品吸光度值代入标准曲线,计算出其中游离聚乙二醇的质量,再计算出聚乙二醇修饰蛋白中间体中的游离聚乙二醇质量;
5)聚乙二醇修饰度计算:根据以上结果计算聚乙二醇修饰度,计算公式如下:
10.如权利要求1-9任意一项所述的方法在检测样品溶液中聚乙二醇含量、聚乙二醇残留量或聚乙二醇修饰度方面的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: 310000 8th floor, building 9, Hexiang science and technology center, Qiantang new area, Hangzhou, Zhejiang Applicant after: XIUZHENG BIOMEDICINE (HANGZHOU) RESEARCH INSTITUTE Co.,Ltd. Address before: 2 / F, building 4, Huoshui Industrial Park, 95 binwen Road, Binjiang District, Hangzhou City, Zhejiang Province, 310052 Applicant before: XIUZHENG BIOMEDICINE (HANGZHOU) RESEARCH INSTITUTE Co.,Ltd. |
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CB02 | Change of applicant information | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200626 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |