CN111855878A - 一种克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及产品质量控制技术，具体公开了一种克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法及应用，利用电喷雾检测器对聚乙二醇进行定量分析，所述聚乙二醇为单一分子量或为不同分子量的聚乙二醇混合物。本发明首次发现了利用电喷雾检测器检测聚乙二醇能够克服现有检测方法中对检测物的质量歧视效应，使待测样品不再受到游离聚乙二醇分子量分布不同的影响而导致检测结果的不准确或检测方法缺乏科学性，开创性地提供了上述克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法。本发明所述方法具有安全、简便、快速、灵敏的优势，弥补了现有聚乙二醇测定方法的不足之处。

Description

一种克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法及应用

技术领域

本发明涉及产品质量控制技术领域，尤其涉及一种克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法及应用。

背景技术

聚乙二醇(PEG)，由环氧乙烷与水，或由乙二醇经分步反应合成制得，合成较大的聚合物时，常用低分子量的聚乙二醇作为引发剂，其分子式为H(OCH₂CH₂)nOH，是平均分离量为200～8000以上的高聚物。其物理化学性质随着平均分子量的不同有较大差异，从无色无臭粘稠液体至蜡状固体，毒性也随分子量的增加而减少，有相关文献报道人体对低分子量PEG产生不良反应。PEG作为一种常用的药用辅料，已被收录在《中国药典》、《欧洲药典》和《美国药典》等。

聚乙二醇在药品领域被广泛应用，其用途主要为：(1)药物溶剂。PEG可以提高药物的溶解性、流动性，使制剂主成分与辅料充分混合。此外，大分子PEG也可以作为增稠剂，延长药物停留时间从而增加药效。(2)润滑剂、粘合剂。最具有代表性的是在生产片剂过程中，PEG作为润滑剂、粘合剂提高了主成分在体内的溶解性，最终有助于增加生物利用度。(3)药物载体。PEG可作为亲水性基质，可制成软膏剂、栓剂等多种剂型；此外，PEG可作为囊材、骨架剂成为药物载体。(4)稳定剂。在一些生物制品中，PEG常作为一种稳定剂来增强药物的稳定性，例如抑制rhKGF(重组人角化细胞生长因子)、稳定BSA和溶菌酶等。(5)修饰材料。在生化药如多肽、酶等，或者生物制品如重组蛋白等药物的研制过程中，PEG常作为修饰基团，对药物主体结构进行修饰，从而改变或提高药物的生物活性，改善药物药效及药代动力学特征。

PEG作为常用的药用辅料，其质量控制尤为重要。目前常用的测定方法有：(1)液相色谱-蒸发光检测器法测定制剂中的游离PEG(专利，专利号：CN101493446A)；(2)比色法(《中国生物制品规程》残留聚乙二醇含量测定/《中国药典》2015年版四部通则3202聚乙二醇残留量测定法)(3)紫外分光光度法(人凝血因子Ⅷ制品中聚乙二醇残留量测定方法的验证，中国输血杂志，2016，2(1)：52-55)；(4)重量法(《中国药典》2015年版二部壬苯醇醚项下游离PEG的测定：80页/美国药典USP42nonoxinol9项下聚乙二醇检查项：3160-3161页)。

然而，目前常用的PEG测定方法至少存在以下缺陷：(1)由于PEG/游离PEG为具有一定分子量范围(分子量大小不同，非单一分子量)的混合物，很难找到相应的试剂或对照品通过外标法或标准曲线法来对其进行定量，在专属性方面缺乏科学性；(2)比色法或者紫外分光光度法在测定PEG时也存在不足，PEG没有显色基团，在紫外光下无吸收或吸收较弱，因此在测定时要对待测物进行衍生化(增加显色基团)，实验干扰因素较大，特别是在基质复杂的情况下，测定结果存在较大误差。(3)重量法专属性较差，且操作过程繁琐，需用到多种有毒试剂对供试品进行多步萃取，过程中待测物易损失，测定误差较大，结果不准确。

因此，急需开发一种针对具有一定分子量范围的聚乙二醇混合物进行科学测定的方法，进而开发一种能够对样品中游离聚乙二醇含量进行准确定量的方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法，利用电喷雾检测器对聚乙二醇进行定量分析。

所述聚乙二醇可为平均分子量在200～8000或8000以上的乙二醇高聚物。

本发明首次发现了利用电喷雾检测器检测具有不同分子量的聚乙二醇的混合物，能够克服现有检测方法中对检测物的质量歧视效应，使待测样品不再受到游离聚乙二醇具有不同分子量的影响而导致检测结果的不准确或检测方法缺乏科学性，开创性地提供了上述克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法，同时开拓了电喷雾检测器的应用方向，克服了现有技术对电喷雾检测器应用的局限性，为具有相关检测需要的行业提供了科学依据和技术支持，解决了聚乙二醇检测技术中的痛点难点，促进了行业技术的进步与发展，具有良好的社会效益。

所述方法灵敏度高，检测限可低至0.3μg/mL；重复性高，仪器精密度与方法精密度RSD均小于2％；准确性高，对不同样品进行回收率测定，平均回收率达99.0％～105.0％。

第二方面，本发明提供了上述聚乙二醇测定方法在检测样品中游离聚乙二醇含量方面的应用，所述样品包括但不限于药品、食品、保健品或日化用品，样品中游离的聚乙二醇来自于原料或在所述样品的合成过程中生成。

所述应用具体可体现为一种测定样品中游离聚乙二醇含量的方法。

第三方面，本发明提供一种测定样品中游离聚乙二醇含量的方法，包括如下步骤：

(1)利用PEG标准品配制浓度范围为1～5mg/mL的一系列PEG标准曲线溶液；

利用反相液相色谱结合电喷雾检测器进行色谱检测，并以PEG浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(2)对含有游离聚乙二醇的待测样品进行稀释，得到待测样品溶液；

采用与步骤(1)相同的色谱条件对待测样品溶液进行检测，利用标准曲线法或外标法对待测样品中的游离聚乙二醇进行定量。

根据本领域技术常识，稀释对照品和待测样品时所用的溶剂应当相同。

进一步地，所述待测样品中游离聚乙二醇的分子量范围可为200～40000，步骤(1)中所使用的PEG标准品的分子量在步骤(2)中待测样品含有的游离聚乙二醇的分子量范围内，优选与待测样品含有的游离聚乙二醇的分子量相当。

作为优选，步骤(1)所使用的PEG标准品的分子量为300～8000。典型但非限制性地可选为300、400、600、800、1000、2000、4000、6000、8000。

进一步地，所述方法采用的色谱条件为：C18色谱柱，柱温30～40℃；检测器为电喷雾检测器，蒸发管温度35℃、50℃或70℃，雾化气体为氮气，气流压力为60psi。

经试验验证，当蒸发管温度为50℃时，可使检测具有更高的灵敏度。

可选地，在进行色谱检测时，进样量为20μL。

需要说明的是，本领域技术人员可根据待测样品的不同，采用本领域常规技术手段调整流动相的组成及流动相的比例，以使聚乙二醇达到更好的分离效果，本发明对流动相的组成及比例不作限定，仅在具体实施方式中给出示例性说明。

进一步地，流动相的流速可为0.5～1.5mL/min，典型但非限制性地可选为1mL/min。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种能够克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法，可以根据待测样品中游离聚乙二醇分子量范围选取对照品，通过标准曲线法或外标法定量。且分子量在300至8000之间的PEG系列标准曲线基本重合，5条标准曲线的斜率、截距和残差在统计学上无明显差异，说明本发明所述方法在测定样品中游离聚乙二醇时无质量歧视，背景及主成分对待测物无干扰，专属性强，准确性高。

本发明所述方法具有安全、简便、快速、灵敏的优势，弥补了现有聚乙二醇测定方法的不足之处。除了药品以外，该方法亦可作为食品、化妆品和保健品等制品中游离聚乙二醇的测定方法，该方法的建立为其他制剂中游离PEG的控制提供了一定的参考，同时也为国家标准的制定提供了方法依据。

附图说明

图1为实验例1中针对不同分子量的PEG标准品绘制的标准曲线图。

图2为实验例1中分子量300～8000的PEG对照品的色谱叠加图。

图3为对比例1中采用电喷雾检测器和紫外分光光度法检测壬苯醇醚样品和壬苯醇醚栓样品的信号差异。

图4为对比例1中采用电喷雾检测器和紫外分光光度法检测空白对照样品的信号差异。

图5为对比例1中采用电喷雾检测器和紫外分光光度法检测PEG400溶液的信号差异。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例旨在说明利用本发明所述聚乙二醇测定方法并采用标准曲线法对聚乙二醇进行定量。

试验样品：壬苯醇醚，购自药大制药有限公司，涉及6批次，批号分别为161003、191101、190804、191001、190801、190905。

根据壬苯醇醚合成工艺，壬苯醇醚中的游离聚乙二醇是分子量约为400的混合物，因此，选择标准品PEG400(购自SIGMA公司)作为对照品。

流动相：甲醇-水(80：20)体系。

测定方法具体如下：

(1)取PEG400对照品，精密称定，加流动相溶解并稀释成每1mL含1mg、2mg、3mg、4mg、5mg的溶液，作为标准曲线溶液；

按照下述色谱条件对标准曲线溶液进行检测分析，并记录色谱图，利用ThermoChameleon 7工作站进行数据处理；

色谱条件：采用C18色谱柱，流动相为甲醇-水(80：20)体系，流速1.0mL/min，柱温35℃；检测器为CAD，蒸发管温度50℃，雾化气体为氮气，气流压力约为60psi，进样量均为20μL；

以标准曲线溶液的聚乙二醇浓度为横坐标，以色谱图中聚乙二醇的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程；

(2)取壬苯醇醚样品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释，得到壬苯醇醚浓度约为1mg/mL的样品溶液；

按照上述色谱条件对样品溶液进行检测分析，将样品溶液中聚乙二醇在色谱图中的峰面积代入上述线性回归方程，根据稀释比例计算得到6个批次壬苯醇醚样品中游离聚乙二醇的含量，如下表所示。

表1壬苯醇醚中游离聚乙二醇含量结果

批号	含量(％)	批号	含量(％)
				161003	0.51	191001	1.33
191101	0.53	190801	0.95
				190804	0.43	190905	0.47

实施例2

本实施例旨在说明利用本发明所述聚乙二醇测定方法并采用外标法对聚乙二醇进行定量。

试验样品：壬苯醇醚栓，分别购自药大制药有限公司、黑龙江成功药业有限公司，涉及24批次，批号详见下表。

根据壬苯醇醚合成工艺，壬苯醇醚中的游离聚乙二醇是分子量约为400的混合物，因此，选择标准品PEG400(购自SIGMA公司)作为对照品。

流动相：甲醇-水(80：20)体系。

测定方法具体如下：

(1)取PEG400对照品，精密称定，加流动相溶解并稀释成每1mL含1mg、2mg、3mg、4mg、5mg的溶液，作为标准曲线溶液；

按照下述色谱条件对标准曲线溶液进行检测分析，并记录色谱图，利用ThermoChameleon 7工作站进行数据处理；

色谱条件：采用C18色谱柱，流动相为甲醇-水(80：20)体系，流速1.0mL/min，柱温35℃；检测器为CAD，蒸发管温度50℃，雾化气体为氮气，气流压力约为60psi，进样量均为20μL；

以标准曲线溶液的聚乙二醇浓度为横坐标，以色谱图中聚乙二醇的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(2)取同一批次的壬苯醇醚样品10粒，剪碎，精密称定，加甲醇适量，置50℃水浴中使溶化，得到壬苯醇醚浓度约为1mg/mL的样品溶液；

(3)取PEG400对照品，精密称定，加甲醇溶解并稀释成约为3mg/mL的溶液，作为对照品溶液；

按照上述色谱条件对样品溶液和对照品溶液进行检测分析，分别得到色谱峰面积，按外标法计算，根据稀释比例计算得到24个批次壬苯醇醚栓样品中游离聚乙二醇的含量，如下表所示。

表2壬苯醇醚栓中游离聚乙二醇含量结果

实验例1

本实验例旨在说明本发明所述方法可以克服聚乙二醇测定中的质量歧视效应(目前用于定量分析的检测器大多为质量型检测器)。

实验试剂：标准品PEG200、标准品PEG300、标准品PEG400、标准品PEG600、标准品PEG800、标准品PEG1000、标准品PEG2000、标准品PEG3000、标准品PEG4000、标准品PEG6000、标准品PEG8000、标准品PEG12000、标准品PEG20000、标准品PEG40000；均购自SIGMA公司；

实验方法：

(1)针对不同标准品，分别配制浓度为1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的标准曲线溶液；

(2)按照下述色谱条件对标准曲线溶液进行检测分析，并记录色谱图，利用ThermoChameleon 7工作站进行数据处理；

色谱条件：采用C18色谱柱，流动相为甲醇-水(80：20)体系，流速1.0mL/min，柱温35℃；检测器为CAD，蒸发管温度50℃，雾化气体为氮气，气流压力约为60psi，进样量均为20μL；

以标准曲线溶液的聚乙二醇浓度为横坐标，以色谱图中聚乙二醇的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程。

不同标准品对应的标准曲线见图1，从图中可以看出，分子量300～8000的PEG标准品的标准曲线基本重合，具有相对一致的斜率和截距。

图2为分子量300～8000的PEG对照品的色谱叠加图，由图可以看出，分子量300～8000的PEG对照品的色谱图无论从出峰时间还是从峰面积来看都趋于一致，也印证了标准曲线中分子量300～8000的PEG标准品的标准曲线基本重合的事实。

分子量300～8000的PEG标准品的标准曲线参数如表3所示。

表3 PEG300～8000标准品的标准曲线参数

由此可以说明，PEG分子量在300～8000之间时，其单位浓度或单位质量的PEG在CAD检测器上具有相同的响应值，即PEG分子量的大小对CAD检测器响应无影响，这种现象对目前分析领域中常用的质量型检测器来说是一种新的发现，这种屏蔽了质量歧视效应的发现为具有一定分量范围的PEG混合物定量分析提供了理论依据，本发明就是利用这种克服质量歧视效应的方法快速、安全、准确的对游离PEG进行定量分析。

因此，在实际应用中，可利用分子量在300～8000之内的PEG标准品，进行样品中游离聚乙二醇的定量分析。

对于标准品PEG200、标准品PEG12000、标准品PEG20000、标准品PEG40000绘制的标准曲线，虽然没有体现出克服质量歧视效应的现象，但通过实验可知，上述四种分子量范围的PEG在该实验条件下均能得到很好的线性，当待测样品中的PEG分子量同为相应分子量时，也可利用该方法对其进行定量分析。

实验例2

本实验例旨在说明本发明所述方法的灵敏度，精密度，重复性和准确性等。

实验方法具体如下：

1、标准曲线及线性关系

取PEG400(购自SIGMA公司)对照品，精密称定，加流动相(甲醇-水(80:20)体系)溶解并稀释成每1mL含1mg、2mg、3mg、4mg、5mg的溶液，作为标准曲线溶液，按照下述色谱条件进行分析，并记录色谱图，利用Thermo Chameleon 7工作站进行数据处理。

色谱条件：C18色谱柱，流动相为甲醇-水(80：20)体系，流速1.0mL/min，柱温35℃；检测器为CAD，蒸发管温度50℃，雾化气体为氮气，气流压力约为60psi，进样量均为20μL。

以PEG峰面积Y对PEG浓度X(mg/mL)作回归处理，得回归方程及相关系数：

Y＝0.1435X+0.0233，相关系数r＝0.9993。

结果表明PEG浓度为1.05mg/mL～5.25mg/mL范围内线性关系良好。

2、灵敏度试验

取PEG400对照品溶液，逐步稀释，按上述色谱条件测定，PEG的检测限为0.3μg/mL，定量限为0.5μg/mL，具有较高的灵敏度。

3、精密度试验

按上述色谱条件，以实施例1所述样品作为供试品，将供试品溶液分别连续进样6次，计算峰面积RSD％，计算结果小于2％，说明检测器精密度良好。

4、重复性试验

以实施例1所述样品作为供试品，平行配制供试品溶液6份，按上述方法测定，计算样品中游离PEG含量RSD％，计算结果小于2％，说明方法重复性良好。

5、准确性试验

以实施例1的壬苯醇醚样品溶液和实施例2中的壬苯醇醚栓样品溶液作为供试品溶液，精密量取，分别适量的加入PEG400对照品溶液，配制成低、中、高三个浓度水平的加标供试品溶液，按本发明所述方法进行测定，每个浓度水平测定3份供试品，计算回收率，分别为100.6％和104.2％。说明本发明方法准确性高。

对比例1

本对比例旨在对比本发明所述方法与紫外分光光度法(人凝血因子Ⅷ制品中聚乙二醇残留量测定方法的验证，中国输血杂志，2016，,2(1)：52-55)的区别。

1、应用本发明所述方法和紫外分光光度法对实施例1和实施例2的待测样品进行测定，通过图3可以看出，由于PEG没有显色基团，在紫外光下无吸收或吸收较弱，因此紫外分光光度法难以实现对样品中游离聚乙二醇的检测和定量。而本发明所述方法采用CAD作为检测器，色谱中PEG特征峰清晰，基质干扰小。

2、以流动相作为空白对照，应用本发明所述方法和紫外分光光度法对空白对照进行测定，通过图4可以看出，本方法以流动相为稀释剂，对PEG的测定无干扰。

3、应用本发明所述方法和紫外分光光度法对浓度为5μg/mL的PEG400溶液进行测定，通过图3、图5可以看出，采用本发明方法得到的色谱图中，PEG色谱峰具有较好的峰型，与主成分壬苯醇醚能够很好的分离，且PEG峰前后无杂峰干扰；各分子量PEG出峰时间基本一致(相对保留时间RSD<2％)。

综合以上实验对比可以说明，现有技术中的紫外分光光度法并不能对样品中游离聚乙二醇进行检测与定量。相比之下，本发明所述方法具有更加灵敏，受基质干扰更小的特点和优势。

对比例2

本对比例旨在对比本发明所述方法与《中国药典》中重量法的区别。

对实施例1中的6批次壬苯醇醚样品，分别采用本发明所述方法和重量法(《中国药典》2015年版二部壬苯醇醚项下游离PEG的测定：80页)对所述样品进行游离聚乙二醇含量的测定，并委托药大制药有限公司按照《中国药典》重量法对相同样品进行重复检测，检测结果如表4所示。

表4不同方法检测样品中游离PEG的含量

由表4统计的检测结果可知，药典中的重量法的可重复性较差，具有较大的不确定性，存在较大误差，测定结果较本发明方法结果偏小，采用该方法对待测样品进行检测的准确性也较低。

而本发明所述方法在上述实验例1中所表现出的良好重复性和准确性，说明了本发明所述方法相比现有药典方法更为准确。

以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法，其特征在于，利用电喷雾检测器对聚乙二醇进行定量分析。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇测定方法，其特征在于，所述聚乙二醇为单一分子量或为不同分子量的聚乙二醇混合物。

3.权利要求1或2所述的聚乙二醇测定方法在检测样品中游离聚乙二醇含量方面的应用，其特征在于，所述样品包括但不限于药品、食品、保健品或日化用品，样品中游离的聚乙二醇来自于原料或在所述样品的合成过程中生成。

4.一种测定样品中游离聚乙二醇含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用PEG标准品配制浓度范围为1～5mg/mL的一系列PEG标准曲线溶液；

利用反相液相色谱结合电喷雾检测器进行色谱检测，并以PEG浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(2)对含有游离聚乙二醇的待测样品进行稀释，得到待测样品溶液；

采用与步骤(1)相同的色谱条件对待测样品溶液进行检测，利用标准曲线法或外标法对待测样品中的游离聚乙二醇进行定量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待测样品中游离聚乙二醇的分子量范围可为200～40000，步骤(1)中所使用的PEG标准品的分子量在步骤(2)中待测样品含有的游离聚乙二醇的分子量范围内，优选与待测样品含有的游离聚乙二醇的分子量相当。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所使用的PEG标准品的分子量为300～8000。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱条件为：C18色谱柱，柱温30～40℃；检测器为电喷雾检测器，蒸发管温度35℃、50℃或70℃，雾化气体为氮气，气流压力约为60psi。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行色谱检测时，进样量优选为20μL。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，流动相的流速可为0.5～1.5mL/min。

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