CN116794184B

CN116794184B - 一种单一聚合度的聚乙二醇及同系杂质的检测方法

Info

Publication number: CN116794184B
Application number: CN202310760179.XA
Authority: CN
Inventors: 李旭哲; 贺娇; 何平; 赵宣
Original assignee: Tianjin Jenkem Technology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Jenkem Technology Co Ltd
Priority date: 2023-06-26
Filing date: 2023-06-26
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2043-06-26
Also published as: CN116794184A

Abstract

本发明涉及一种单一聚合度的聚乙二醇及同系杂质的检测方法，所述液相色谱法采用以带保护性丁基侧链的十八烷基键合硅胶为固定相的色谱柱，流动相包含水：乙腈的体积比为420～470：30～60的流动相A，水：乙腈的体积比为120～170：320～380的流动相B；所述流动相A和流动相B中还含有甲酸铵和甲酸作为缓冲剂；所述液相色谱法采用电喷雾式检测器。本发明方法能快速分离并定量测定单一聚合度聚乙二醇样品与其同系物杂质，方法准确性高、特异性强、灵敏度高、重复性好，通过高低浓度计算方法，在线性范围内更准确地检测了产品的纯度，从而更好地解决单一聚合度聚乙二醇的纯度检测问题及杂质控制问题。

Description

一种单一聚合度的聚乙二醇及同系杂质的检测方法

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种单一聚合度的聚乙二醇及同系杂质的检测方法。

背景技术

聚乙二醇因为其低毒性，无免疫原性和无抗体性的特点，被广泛的应用在生物医药、化工、材料领域。聚乙二醇可以与特定的药物结合，如当其与小分子活性成分、多肽、蛋白质药物结合时，其能够有效地改善药物的稳定性、水溶性、存在免疫原性、肾清除速率快等问题，有利于药物的快速吸收和迅速起效，降低了药物在细胞外分解造成的毒性，在生物医药行业中具有广泛的应用。

在实际生产过程中，往往会用到单一聚合度的聚乙二醇，其纯度影响着下游产品的质量，因此，单一聚合度的聚乙二醇的纯度的检测十分重要，传统的聚乙二醇检测方法一般采用高效液相色谱——示差折光检测器进行测定，如GB/T 17830-1999《聚乙氧基化非离子表面活性剂中聚乙二醇含量的测定高效液相色谱法》，但是采用示差折光检测器时，样品中的水分会对待测物的结构产生干扰。专利文献CN111579660A中公开了一种测定聚乙二醇4000及其散剂平均分子量及分布系数的检测方法，但是其方法只能分开聚合度相差较大的PEG，不能分来聚合度相差较小的聚乙二醇。专利CN105067727B中公开了采用HPLC检测，聚羧酸减水剂大单体中聚乙二醇含量的方法，采用等度洗脱，外标法定量，但是，其仅仅能够分离聚乙二醇的混合物，不能分离单一聚合度的聚乙二醇。专利文献CN111855878A公开了一种克服质量歧视效应的聚乙二醇测定方法，可以根据待测样品中游离聚乙二醇分子量范围选取对照品，通过标准曲线法或外标法定量。但是，同样没有解决单一聚合度的聚乙二醇难以通过液相色谱分离的问题。专利CN101493446B公开了一种检测样品或制品中游离聚乙二醇含量的方法，采用紫外检测器联合蒸发光检测器，或者二极管阵列检测器联合蒸发光检测器，对比两者信号差异，甄别出游离聚乙二醇信号峰，然而，其方法适用于聚乙二醇修饰样品或聚乙二醇修饰制品中游离聚乙二醇含量的检测，不能适用于具有重复的氧乙烷基(-CH2-CH2-O-)结构单元组成的聚乙二醇的同系物的分离和检测。综上所述，现有技术没有公开能够精准检测单一聚合度的聚乙二醇，也就是说，现有技术鲜有能够将特定聚合度的聚乙二醇与其结构相近的聚乙二醇同系物分离的方法。

因此，亟需开发一种检测单一聚合度的聚乙二醇及同系杂质的方法，来控制单一聚合度的聚乙二醇的质量、纯度等。

发明内容

为了解决上述背景技术的问题，本发明的具体技术方案如下：

本发明第一方面提供一种单一聚合度的聚乙二醇及同系杂质的检测方法，将待测品溶解，采用液相色谱法进行检测；

所述液相色谱法采用以带保护性丁基侧链的十八烷基键合硅胶为固定相的色谱柱；

所述液相色谱法流动相包含流动相A和流动相B，所述流动相A为水-乙腈溶液，其中水：乙腈的体积比为420～470：30～60；

所述流动相B为水-乙腈溶液，其中水：乙腈的体积比为120～170：320～380；

所述流动相A和流动相B中还含有缓冲剂，所述缓冲剂包括甲酸铵和甲酸；

所述液相色谱法采用电喷雾式检测器。

进一步的，所述流动相A各组分体积比为水：乙腈：甲酸铵：甲酸＝420～470：30～60：2～3：0.2～0.7，流动相B各组分体积比为水：乙腈：甲酸铵：甲酸＝120～170：320～380：2～3：0.2～0.7；

所述甲酸铵为甲酸铵溶液，添加的甲酸铵溶液的浓度为0.5～1.5mol/L，包括但不限于0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L、1.1mol/L、1.25mol/L、1.3mol/L、1.4mol/L或1.5mol/L、优选为1mol/L。

在本发明的实施例中，所述流动相A各组分体积比为水：乙腈：甲酸铵：甲酸＝447：50：2.5：0.5；

所述流动相B各组分体积比为水：乙腈：甲酸铵：甲酸＝147：350：2.5：0.5；

所述甲酸铵为甲酸铵溶液，浓度为1mol/L。

进一步的，所述单一聚合度的聚乙二醇的聚合度为30～50，包括但不限于30、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和/或50；

优选的，所述单一聚合度的聚乙二醇的聚合度为34、35、36、37、38和/或39。

在本发明的具体实施例中，所述单一聚合度的聚乙二醇的聚合度为36。

进一步的，所述固定相的温度为25～35℃，包括但不限于25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃；

所述流动相的流速为0.8～1.5mL/min，包括但不限于0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min、1.3mL/min、1.4mL/min或1.5mL/min。

在本发明的具体实施例中，所述固定相的温度为30℃，所述流动相的流速为1mL/min。

进一步的，所述液相色谱法采用梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：

0～10min，流动相A与流动相B体积比为75：25，保持等度洗脱；

10～20min，流动相A与流动相B体积比按线性渐变为0：100；

20～25min，流动相A与流动相B体积比按线性渐变为0：100，保持等度洗脱；

25～25.1min，流动相A与流动相B体积比按线性渐变为75：25；

25.1～35min，流动相A与流动相B体积比为75：25，进行等度洗脱。

进一步的，所述液相色谱法的进样量为2～10μL，具体的，可以为2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL或10μL；

在本发明的具体实施例中，所述进样量为5μL。

进一步的，所述色谱柱的规格为250×4.6mm 5μm，100A。

进一步的，所述溶解采用甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和水中的一种或多种；优选的，所述溶解溶剂为水。

进一步的，采用高低浓度法计算待测品的纯度；

本发明的高低浓度法具体为：杂质％＝杂质峰面积/(1％样品峰面积×100+所有杂质峰面积)×100％；

主峰纯度＝1-所有杂质的％。

本发明可以通过使用带保护性丁基侧链的十八烷基键合硅胶为固定相，通过特定的流动相体系，将单一聚合度的聚乙二醇与其同系物杂质分离。使用电喷雾式检测器，通过色谱峰更好的定量同系物杂质。从而更好的解决单一聚合度的聚乙二醇纯度检测问题及杂质控制问题，在本发明中，聚乙二醇具有强极性，传统方法不易将其与结构相近的杂质分离并定量，尤其是聚乙二醇的同系物，其结构与聚乙二醇十分相似，极性十分相近，普通的色谱方法几乎难以将其分离，现有技术中，公开的是分离聚乙二醇混合物的方法，鲜有分离单一聚合度的聚乙二醇方法，采用本发明的特定的色谱柱配合特定的流动相比例，特定的洗脱程序，以及特定的流速等条件，特定的检测器能够有效分离单一聚合度的聚乙二醇和其同系物杂质。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明方法能快速便捷的分离并定量测定单一聚合度聚乙二醇样品与其同系物杂质，从而有效的控制单一聚合度聚乙二醇的纯度，方法准确性高、特异性强、灵敏度高、重复性好；并且，能够通过高低浓度计算方法，在线性范围内更准确地检测了产品的纯度，从而更好地解决单一聚合度聚乙二醇纯度检测问题及杂质控制问题。

附图说明

图1a所示为EG36样品谱图，方框部分的放大图为图1b所示；

图1b所示为EG36样品谱图；

图2所示为空白溶液图谱；

图3所示为EG36样品LOQ(0.1％)谱图；

图4所示EG36样品线性图；

图5所示为对比例1洗脱条件下的色谱图；

图6a所示为对比例2流动相的色谱图；

图6b所示为对比例2流动相条件下的色谱局部放大图；

图7A所示为对比例3色谱条件下的色谱图；

图7B所示为对比例3的色谱条件下EG36的LOQ(0.25％)色谱图；

图8所示为EG34质谱图，m/z＝1586.9454；

图9所示为EG35质谱图，m/z＝1630.9722；

图10所示为EG36质谱图，m/z＝1675.0012；

图11所示为EG37质谱图，m/z＝1719.0230；

图12所示为EG38质谱图，m/z＝1763.0501；

图13所示为EG39质谱图，m/z＝1807.0723。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

本发明中，术语“固定相”是将在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。

本发明中，术语“流动相”是指色谱过程中携带待测组分向前移动的物质。与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。

本发明中，术语“反相模式”是指是分离大多数常规样品的首选分离模式，是指固定相(如C18，C8，C4等)极性比流动相(如水、乙腈等)极性小的一种液相色谱法。

本发明中，术语“FA”(Formic acid)是指甲酸；

本发明中，术语“CAD检测器”是指电喷雾式检测器；

本发明中，术语“PEG”是指“聚乙二醇”；

本发明中，术语“C₁₈”是指十八烷基键合硅胶为固定相的色谱柱；

本发明中，术语“EG36”是指聚合度为36的聚乙二醇，以此类推，图1b中EG34～39分别为聚合度34～39的聚乙二醇。

本发明中，术语“LOQ”是指定量限；

本发明中，术语“LOQ(0.1％)”是指相对于待测物来说，浓度为0.1％，待测物质的浓度为4mg/ml，其0.1％的浓度为0.004mg/ml，LOQ(0.25％)同理；

本发明中，术语“同系杂质”是指与目标物(待测物中需要检测的单一聚合度的聚乙二醇)的通式相同，但是聚合度不同的聚乙二醇；具体的，目标物与同系杂质相差的结构是“-CH₂-CH₂-O-”，二者通式均为：其中，n为聚乙二醇的聚合度，本申请中EG36指的是上述结构n＝36。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1EG36的HPLC检测

1、仪器方法

仪器：SHIMADZU Essentia LC-16液相色谱仪和Thermo DIONEX Corona Veo CAD检测器

色谱柱：带保护性丁基侧链的十八烷基键合硅胶为固定相，Phenomenex kinetexXB-C18250*4.6mm 5μm，100A，Part#00G-4605-E0

流动相A：水:乙腈：1M甲酸铵：甲酸＝447：50：2.5：0.5；

流动相B：水:乙腈：1M甲酸铵：甲酸＝147：350：2.5：0.5；

1M甲酸铵是指添加的甲酸铵的浓度为1mol/L；

按如下表进行梯度洗脱：

表1洗脱程序

时间	流动相A	流动相B
			0	75	25
10	75	25
			20	0	100
25	0	100
			25.1	75	25
35	75	25

柱温：30℃

流速：1.0mL/min

进样量：5μL

工作站：LC-Solution

2、样品的制备

100％供试品溶液的配制：称取EG36样品(键凯合成PEG，聚合度为36，通式为：其中，n为聚乙二醇的聚合度，EG36即n＝36)40mg至10ml容量瓶中，用水溶解，然后加水定容至刻度，涡旋混匀作为100％供试品溶液。

1％供试品溶液的配制：精密量取1ml供试品溶液至10ml容量瓶中，然后加水定容至刻度，涡旋混匀(10％溶液)。精密量取10％溶液1ml溶液至10ml容量瓶中，然后加水定容至刻度，涡旋混匀，作为1％溶液。

精密量取上述100％供试品溶液、1％供试品溶液5μL注入液相色谱仪，记录35分钟色谱图，按照高低浓度法计算供试品纯度，色谱结果见图1a和图1b。

对比例1洗脱条件的优化

供试品同实施例1

流动相的配制同实施例1

表2对比例1的梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A(体积百分数：％)	流动相B(体积百分数：％)
			0	70	30
10	70	30
			20	0	100
25	0	100
			25.1	70	30
37	70	30

从图5中可以看出，与和图1b相比，EG36～EG39的色谱峰没有分开，无法准确定量单一聚合度的聚乙二醇的纯度，说明本发明实施例1的洗脱条件分离效果好，而其他洗脱条件无法达到好的分离效果。

对比例2流动相的优化

其余条件与实施例1相同，区别仅在于流动相的不同：

流动相A：水:乙腈：甲酸＝449.5：50：0.5；

流动相B：水:乙腈：甲酸＝149.5：350：0.5；

与实施例1的流动相差别是未加入甲酸胺，

结果见图6a和图6b，与图1b相比，图6b的同系物杂质与主峰未完全分离，难以准确定量EG36的纯度。

对比例3流动相和洗脱程序的优化

其余条件与实施例1相同，区别如下；

流动相A：0.1％FA水

流动相B：0.1％FA乙腈

色谱柱：Waters CORTECS C18+4.6mm*150mm；2.7μm

表3对比例3的洗脱程序

时间(min)	流动相A(体积百分数：％)	流动相B(体积百分数：％)
			0	95	5
1	95	5
			3	75	25
13	75	25
			18	50	50
20	0	100
			23	0	100
23.1	95	5
			30	95	5

结果如图7A和图7B所示，图7B所示为对比例3的色谱条件下EG36的LOQ(0.25％)色谱图，本发明EG36样品LOQ(0.1％)谱图如图3所示，通过对比可以知道，实施例1的色谱方法的EG36的保留时间为16.093，S/N＝13.51，对比例3的色谱方法的EG36样品的LOQ(0.25％)，EG36的保留时间为15.129，S/N＝19.34，上述数据说明了，对比例3的灵敏度只能达到0.25％，低于实施例1中的灵敏度0.1％。

实施例2方法验证

采用1％高低浓度自身对照法计算纯度和线性验证。

线性溶液配制：

储备液A(约4mg/mL)：称取EG36约40mg于10mL容量瓶中，用纯水溶解，然后加纯水定容至刻度，涡旋混匀。

储备液B(约0.4mg/mL)：精密量取储备液A，1mL置于10mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，涡旋混匀。

储备液C(约0.04mg/mL)：精密量取储备液B，1mL置于10mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，涡旋混匀。

按如下表4方式配制线性曲线，分别取储备液到置于10mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，涡旋混匀，进样HPLC-CAD(采用实施例1方法)。

表4EG36线性实验

序号	1	2	3	4	5	6	7
								浓度(mg/ml)	0.004	0.008	0.01	0.02	0.04	0.1	0.2
储备液浓度(mg/ml)	0.04	0.04	0.04	0.4	0.4	0.4	4
								储备液体积(ml)	1	2	2.5	0.5	1	2.5	0.5

将上述浓度的EG36标准品采用实施例1所述的仪器方法检测，结果表5和图4所示。

表5线性结果：

图4所示，EG36在0.004～0.2mg/mL(质量浓度为0.1％-5％)范围内，响应关系呈线性，R²为0.9954，满足线性要求。(线性方程为：y＝2612706.90X+17070.45，R²＝0.9954)

图2所示为空白溶液(纯水5μL)采用实施例1所述的仪器方法检测的色谱图，从图中可以看出，本实施例的空白溶液无干扰。

本发明还采用q-TOF方法确认同系物的位置：

q-TOF的色谱条件同实施例1的色谱条件；

q-TOF的质谱条件如表6所示

表6q-TOF的质谱条件

LC-Q-TOF	SCIEXExionLC液相系统；SCIEXTripleTOF6600检测器
		LC液相系统参数	与液相仪器参数一致
离子化模式	ESI源正离子化模式
		扫描范围	100-3000
离子源温度	550℃
		离子喷雾电压	5500v
离子源气体1	55psi
		离子源气体2	55psi
气帘气电压	35psi
		去簇电压	50
碎裂电压	10

其中，EG34～39的质荷比和谱图信息如图8～13所示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种单一聚合度的聚乙二醇及同系杂质的检测方法，其特征在于，将待测品溶解，采用液相色谱法进行检测；

所述液相色谱法的固定相采用带保护性丁基侧链的十八烷基键合硅胶的色谱柱；

所述液相色谱法的流动相包含流动相A和流动相B，所述流动相A为水-乙腈溶液，其中水：乙腈的体积比为420~470：30~60；所述流动相B为水-乙腈溶液，其中水：乙腈的体积比为120~170：320~380；

所述流动相A和流动相B中还含有缓冲剂，所述缓冲剂包括甲酸铵和甲酸；所述液相色谱法采用电喷雾式检测器；

所述流动相A各组分体积比为水：乙腈：甲酸铵：甲酸=420~470：30~60：2~3：0.2~0.7，流动相B各组分体积比为水：乙腈：甲酸铵：甲酸=120~170：320~380：2~3：0.2~0.7；

所述甲酸铵为甲酸铵溶液，添加的甲酸铵溶液的浓度为0.5~1.5mol/L；

所述液相色谱法采用梯度洗脱，所述梯度洗脱程序为：

0~10min，流动相A与流动相B体积比为75：25，保持等度洗脱；

10~20min，流动相A与流动相B体积比按线性渐变为0：100；

20~25min，流动相A与流动相B体积比为0：100，保持等度洗脱；

25~25.1min，流动相A与流动相B体积比按线性渐变为75：25；

25.1~35min，流动相A与流动相B体积比为75：25，进行等度洗脱；

所述单一聚合度的聚乙二醇的聚合度为30~50。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述添加的甲酸铵溶液的浓度为1mol/L。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述固定相的温度为25~35℃，所述流动相的流速为0.8~1.5mL/min。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱法的进样量为2~10μL。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述溶解采用甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和水中的一种或多种。