CN112697917B

CN112697917B - 一种苯磷硫胺的检测方法

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Publication number: CN112697917B
Application number: CN202011517010.4A
Authority: CN
Inventors: 郭辉; 高永正; 罗林
Original assignee: Shanghai Rixin Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Rixin Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112697917A

Abstract

本发明公开了一种苯磷硫胺的检测方法，该检测方法包含以下步骤：(1)配制对照品和供试品溶液；(2)检测：采用高效液相色谱法，流动相A为0.01％～1％的酸性缓冲液，流动相B为有机溶剂，洗脱梯度流动相A以体积比计，0分钟：15％→15％，0～12分钟：15％→15％，12～35分钟：15％→37％，35～50分钟：37％→37％，50～60分钟：37％→15％；(3)计算步骤(2)的检测图谱中苯磷硫胺的纯度。该检测方法建立了特有的苯磷硫胺的检测方法，可以准确检测苯磷硫胺的纯度，专属性、灵敏度、准确度及重复性均良好。

Description

一种苯磷硫胺的检测方法

技术领域

本发明涉及一种苯磷硫胺的检测方法，尤其涉及一种可以准确检测苯磷硫胺纯度的检测方法。

背景技术

苯磷硫胺的化学名称为：S-{(Z)-2-[(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基)甲基-甲酰基氨基]-5-膦酰氧基戊-2-烯-3-基}苯甲酸硫代酯；分子式为：C₁₉H₂₃N₄O₆PS；分子量为：466.45；结构式如下所示：

由于苯磷硫胺具有酸碱两性性质，且极性较大，目前对苯磷硫胺质量控制均使用离子对液相体系，在使用离子对试剂后，由于基线难以平衡且具有较多梯度峰，使样品的纯度与真实值相比不一致，存在峰型、基线、鬼峰，杂质无法在LC-MS上进行确证等问题，均不利于质量控制，严重影响苯磷硫胺的质量和服用安全。

发明内容

发明目的：本发明旨在提供一种专属性、灵敏度、准确度及重复性均良好的苯磷硫胺的检测方法。

技术方案：本发明的苯磷硫胺的检测方法，其特征在于，所述检测方法包含以下步骤：

(1)配制对照品和供试品溶液；

(2)检测：采用高效液相色谱法，流动相A为0.01％～1％的酸性缓冲液，流动相B为有机溶剂，洗脱梯度中流动相A以体积比计，0分钟：15％→15％，0～12分钟：15％→15％，12～35分钟：15％→37％，35～50分钟：37％→37％，50～60分钟：37％→15％；

(3)计算步骤(2)的检测图谱中苯磷硫胺的纯度。

本发明采用反反相模式的反相高效液相色谱法进行检测，检测器选用二极管阵列检测器(DAD)，可以有效分离供试品中10个相关物质色谱峰。

进一步地，步骤(1)中所述供试品溶液的浓度为1～2mg/ml。具体配制方法为：称取苯磷硫胺供试品用浓度为50％的乙腈-水溶解并稀释，得到浓度为1～2mg/ml的供试品溶液。

进一步地，步骤(2)中所述流动相A为磷酸水溶液，所述流动相B为乙腈。其中，流动相A优选为0.5％磷酸水溶液。

进一步地，步骤(2)中检测使用酰胺基硅胶键合色谱柱。

进一步地，步骤(2)中检测柱温为20～50℃；更进一步地，检测柱温为30～50℃；其中，检测柱温优选为30℃、40℃或50℃，更优选为40℃。

进一步地，步骤(2)中检测进样量为5～100μl，流速为1～1.5ml/min。其中，进样量优选为20μl，流速优选为1.2ml/min。

进一步地，所述色谱柱柱长为100～250mm，色谱柱填料粒度为3.0～5.0μm，色谱柱直径为3.0～5.0mm。其中，色谱柱优选为Ascentis RP-Amide、Accucore 150-Amide-HILIC、Waters Xbridge amide中的一种，色谱柱直径优选为3.5mm，色谱柱长度优选为250mm，色谱柱填料粒度优选为3.5μm。

进一步地，步骤(3)中所述苯磷硫胺的纯度按照面积归一化法计算。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

(1)建立了特有的苯磷硫胺的检测方法，可以准确、有效地反映苯磷硫胺的质量状况，从而有效控制其后续相关产品的质量；

(2)检测方法操作简便，可以准确检测苯磷硫胺的纯度，检测时间短，专属性(各杂质与主成分之间分离度均不小于1.5)、灵敏度(检测限为0.1μg/ml，定量限为0.3μg/ml)、准确度(线性相关系数r值大于0.999)及重复性(杂质含量波动在±0.01％内)均良好；

(3)检测方法适应性强，可用于苯磷硫胺制备全过程的质量控制，同时也可用于苯磷硫胺及其相关产品的质量控制。

附图说明

图1为本申请系统适用性的HPLC色谱图；

图2为本申请供试品的HPLC色谱图；

其中，图1中各标记色谱峰：1、杂质a，2、杂质b，3、杂质c，4、苯磷硫胺，5、杂质d，6、杂质e，7、杂质f，8、杂质g，9、杂质h，10、杂质i。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。

试剂：

色谱柱：Waters Xbridge amide；色谱柱的规格：内径为3.5mm，长度为250mm，填料粒径为3.5μm；

设备：高效液相色谱仪(Thermo U3000，赛默飞)，电子天平(MS105，梅特勒)。

实施例1：专属性试验

1、供试品溶液配制

(1)各破坏条件下供试品溶液配制

储备液配制：精密称取苯磷硫胺供试品适量，用浓度为50％的乙腈溶解并稀释，制成每1ml约含5mg的溶液，作为样品储备液。

酸破坏：取储备液2ml置于10ml量瓶中，加1mol/L HCl 1ml，65℃水浴加热5分钟，放冷，再加1mol/L NaOH 1ml中和，稀释剂定容，摇匀；空白溶剂同法操作。

碱破坏：取储备液2ml置于10ml量瓶中，加1mol/L NaOH1ml，90℃水浴加热30分钟，放冷，再加1mol/L HCl 1ml中和，稀释剂定容，摇匀；空白溶剂同法操作。

氧化破坏：取储备液2ml置于10ml量瓶中，加6％双氧水1ml，室温放置2小时，稀释剂定容，摇匀；空白溶剂同法操作。

高温破坏：取储备液2ml置于10ml量瓶中，90℃水浴加热2小时，放冷，定容，摇匀。空白溶剂同法操作。

光照破坏：取储备液2ml置于10ml量瓶中，在日光(4500±500Lux)和紫外光(83uv)下照射24小时，稀释剂定容，摇匀；空白溶剂同法操作。

(2)供试品溶液配制

称取苯磷硫胺供试品适量，用浓度为50％的乙腈溶解并稀释，得到浓度为1.5mg/ml的供试品溶液；

制备空白溶剂：50％的乙腈溶液；

制备系统适用性溶液：称取苯磷硫胺供试品及各杂质适量用浓度为50％的乙腈溶解并稀释，得到供试品浓度为1.5mg/ml，其他杂质为15μg/ml的系统测试液；

2、样品检测

各供试品溶液和空白溶液采用反相高效液相色谱进行检测：

色谱柱：色谱柱型号：Waters Xbridge amide；色谱柱的规格：内径为3.5mm，长度为250mm，填料粒径为3.5μm；

流动相：0.5％磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；

采用梯度洗脱；

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	15	85
12	15	85
			35	37	63
50	37	63
			50.1	15	85
60	15	85

柱温：40℃；

流速：1.2ml/min；

进样量：20μl；

参照上述检测色谱条件将各配制溶液注入色谱仪，记录色谱图，结果见表1和图1～图2。

表1专属性考察结果

由表1和图1～图2可见，首先，空白溶液在供试品与对照品溶液中主峰保留时间处无干扰；其次，苯磷硫胺经酸、碱、氧化、高温、光照破坏条件下样品产生的降解杂质与主峰分离度良好，杂质与主成分之间的分离度≥1.5，空白溶剂不干扰检测，综上所述，本申请的检测方法专属性良好，符合质控要求。

实施例2：灵敏度试验

取实施例1制备的系统适用性溶液，逐级稀释至合适倍数，以信噪比≥10∶1时的溶液作为定量限溶液；以信噪比≥3∶1时的溶液作为检测限溶液。

参照实施例1的检测色谱条件，分别精密量取上述溶液各5μl，注入液相色谱仪，定量限溶液连续进样6针，检测限溶液进样1针，记录色谱图，结果见表2。

表2检测限与定量限验证结果

由表2可见，本申请的检测方法检测限灵敏度为0.01％(0.1μg/ml)，定量限灵敏度为0.03％(0.3μg/ml)，说明本申请的检测方法灵敏度良好，符合质控要求。

实施例3：线性试验

取苯磷硫胺对照品溶液用稀释剂稀释制成一系列浓度的对照溶液，参照实施例1的检测色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表3。

表3线性验证结果

由表3可见，在3.11～15.54μg/ml范围内，线性相关系数大于0.999，说明本申请的检测方法具有良好的线性关系，符合质控要求。

实施例4：重复性试验

称取苯磷硫胺供试品用稀释剂溶解并稀释，得到浓度为1.0mg/ml的供试品溶液，平行制备6份供试品溶液；参照实施例1的检测色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算供试品中各杂质和总杂质的含量，结果见表4。

表4重复性验证结果

有表4可见，平行配制的6份溶液，混合溶液中杂质含量在±0.01％以内波动，说明本申请的检测方法重复性良好，符合质控要求。

对比例1

流动相A洗脱梯度比例1：0分钟：13％→13％，0～12分钟：13％→13％，12～35分钟：13％→35％，35～50分钟：35％→35％，50～60分钟：35％→13％。

流动相A洗脱梯度比例2：0分钟：17％→17％，0～12分钟：17％→17％，12～35分钟：17％→39％，35～50分钟：39％→39％，50～60分钟：39％→17％。

与实施例1的区别在于：分别选用以上流动相A洗脱梯度比例进行检测，参照实施例1的检测色谱条件(洗脱梯度除外)，取实施例1制备的系统适用性溶液注入色谱仪，记录色谱图，结果见表5。

表5流动相A洗脱梯度比例验证结果

由表5可见，与对比例的洗脱梯度相比，本申请的洗脱梯度下杂质与主成分之间的分离度≥1.5，均符合质控要求，说明本申请的检测方法中的洗脱梯度是经过优选得到的。

对比例2

流动相1：0.5％三氟乙酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；

流动相2：0.5％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；

与实施例的区别在于：分别选用以上流动相体系进行检测，参照实施例1的检测色谱条件(流动相体系除外)，取实施例1制备的供试品溶液注入色谱仪，记录色谱图，结果见表6。

表6流动相体系验证结果

由表6可见，与本申请的检测方法相比，对比例采用乙腈-三氟乙酸、乙腈-甲酸为流动相体系进行检测时，供试品中各杂质分离度不佳、出峰数减少，杂质检出量低于乙腈-磷酸体系，色谱柱柱效降低且峰型对称性降低，说明本申请的检测方法中的流动相体系是经过优选得到的。

Claims

1.一种苯磷硫胺的检测方法，其特征在于，所述检测方法包含以下步骤：

(1)配制对照品和供试品溶液；

(2)检测：采用高效液相色谱法，检测使用酰胺基硅胶键合色谱柱，流动相A为0.01％～1％的酸性缓冲液，流动相B为有机溶剂，洗脱梯度中流动相A以体积比计，0分钟：15％→15％，0～12分钟：15％→15％，12～35分钟：15％→37％，35～50分钟：37％→37％，50～60分钟：37％→15％；

(3)计算步骤(2)的检测图谱中苯磷硫胺的纯度；

步骤(2)中所述流动相A为磷酸水溶液，所述流动相B为乙腈。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述供试品溶液的浓度为1～2mg/ml。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中检测柱温为20～50℃。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中检测柱温为30～50℃。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中检测进样量为5～100μl，流速为1～1.5ml/min。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中检测所用色谱柱柱长为100～250mm，色谱柱填料粒度为3.0～5.0μm，色谱柱直径为3.0～5.0mm。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Ascentis RP-Amide、Accucore 150-Amide-HILIC、Waters Xbridge amide中的一种。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述苯磷硫胺的纯度按照面积归一化法计算。