CN114166983B - 一种分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其杂质的分析方法 - Google Patents

一种分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其杂质的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其杂质的分析方法，属于分析化学领域，本发明以五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂，以水‑高氯酸为流动相A，以乙腈‑甲醇为流动相B，对磷酸奥司他韦中间体进行梯度洗脱的分析方法，通过本发明方法能实现磷酸奥司他韦中间体及其特定杂质的有效分离与检测，检测灵敏度高、检测结果准确、可靠的特点，为分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其特定杂质的质量研究提供了可靠参考方法。

Description

一种分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其杂质的分析方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其特定杂质的分析方法。
背景技术
磷酸奥司他韦是神经氨酸酶抑制剂，可以竞争性的与流感病毒神经氨酸酶的活动位点结合，通过干扰病毒从被感染的宿主细胞中释放，从而减少甲型和乙型流感的传播，被广泛用于甲型和乙型流感的预防和治疗。
(1S，5R，6S)-5-(戊基-3-基氧基)-7-氧杂双环[4.1.0]庚-3-烯-3-羧酸乙酯是合成磷酸奥司他韦的重要中间体，其分子式为：C14H22O4，分子量为：254.33；结构式如下所示：
Figure BDA0003383246760000011
杂质0103为磷酸奥司他韦中间体原料产物，分子式为C14H22O5，分子量为270.33，结构式如下所示：
Figure BDA0003383246760000012
杂质0104为磷酸奥司他韦中间体原料产物，分子式为C15H24O7S，分子量为348.41，结构式如下所示：
Figure BDA0003383246760000021
杂质0105为磷酸奥司他韦中间体原料产物，分子式为C15H26O7S，分子量为350.43，结构式如下所示：
Figure BDA0003383246760000022
杂质0109为磷酸奥司他韦中间体工艺杂质，分子式为C13H20O4，分子量为240.30，结构式如下所示：
Figure BDA0003383246760000023
杂质0111为磷酸奥司他韦中间体非对映异构体杂质，分子式为C14H22O4，分子量为254.33，结构式如下所示：
Figure BDA0003383246760000031
杂质0112为磷酸奥司他韦中间体非对映异构体杂质，与杂质0111为对映异构体结构，在液相普通色谱条件下出峰重合，分子式为C14H22O4，分子量为254.33，结构式如下所示：
Figure BDA0003383246760000032
杂质0114为磷酸奥司他韦中间体工艺杂质，与磷酸奥司他韦中间体化学性质相似，在普通液相色谱条件下与磷酸奥司他韦中间体出峰分离度较差，分子式为C14H22O4，分子量为254.33，结构式如下所示：
Figure BDA0003383246760000033
杂质0114现有技术中未见对上述中间体及杂质进行分离的检测方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种能够有效分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其特定杂质的分析方法，该方法检测灵敏度高，采用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以水-高氯酸为流动相A，以乙腈-甲醇为流动相B，采用梯度洗脱，对磷酸奥司他韦中间体及其特定杂质进行分离与检测，具体包括以下步骤：
a、制备系统测试液：取磷酸奥司他韦中间体及各杂质适量，用溶剂(乙腈-水(30∶70))溶解并稀释，得到磷酸奥司他韦中间体浓度为0.5mg/ml～2mg/ml，优选为1.0mg/ml，各杂质均为2μg/ml的系统测试液(杂质限度不得过0.2％，2μg/ml按照供试品浓度1mg/ml计算得到)；
b、采用反相高效液相色谱进行检测，具体检测条件如下：
柱温为20～50℃，色谱柱固定相：用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂，以水-高氯酸为流动相A，以乙腈-甲醇为流动相B，采用梯度洗脱。
所述流动相A中水与高氯酸的体积比为100∶0.11～100∶0.09，所述流动相B中乙腈与甲醇的体积比为78∶22～82∶18。
进一步的，步骤b中，色谱柱的规格：内径为4.0～5.0mm长度为100～250mm，填料粒径为2～5μm。
优选的，步骤b中，色谱柱的规格：内径4.6mm，长度150mm，填料粒径为5μm。
进一步的，步骤b中，色谱柱以五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂，优选PhenomenexKinetex PFP
Figure BDA0003383246760000042
进一步的，步骤b中，所述水-高氯酸的体积比为100∶0.1，所述乙腈与甲醇的体积比为80∶20。
进一步的，步骤b中，检测波长为205～210nm，优选207nm。
进一步的，步骤b中，进样量为1～100μl，优选10μl。
进一步的，步骤b中，流速为1.0～1.5ml/min，优选1.0ml/min。
进一步的，步骤b中，柱温为20～50℃，优选25℃。
从0min～65min时间内，流动相A占流动相的体积比为80％～50％，流动相B占流动相的体积比为20％～50％。
进一步，所述梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0003383246760000041
有益效果：
(1)本发明采用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱，以水-高氯酸为流动相A，以乙腈-甲醇为流动相B的反相高效液相色谱法分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其特定杂质，能有效分离磷酸奥司他韦中间体中各杂质；而其他色谱条件的HPLC结果显示，磷酸奥司他韦中间体及其特定杂质不能有效分离。
(2)一般磷酸奥司他韦中间体包括的杂质为0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114，本发明的检测方法可能很好的对磷酸奥司他韦中间体的特定杂质进行检测与控制。
(3)本发明对检测过程中反相液相色谱操作参数进行了优化选择，使检测时间短，同时保证检测的特异性、准确度和灵敏度。
附图说明
图1为实施例1中对系统测试液的检测图谱；
图2为实施例2中对系统测试液的检测图谱；
图3为实施例3中对系统测试液的检测图谱；
图4为实施例4中对系统测试液的检测图谱；
图5为实施例5中对系统测试液的检测图谱；
图6～图12为实施例5中对杂质定位溶液的检测图谱；
图13为实施例6中对空白溶液的检测图谱；
图14为实施例6中对系统测试液的检测图谱；
图15为实施例7中对检测限溶液的检测图谱；
图16为实施例7中对定量限溶液的检测图谱；
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，应说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
下述实施例中使用的主要仪器有：高效液相色谱仪(型号：Thermo U3000，生产厂家：Thermo)，电子天平(型号：MSA125P-1CE-DU，生产厂家：赛多利斯)
下述实施例中使用的主要样品与试剂有：磷酸奥司他韦中间体(按照申请号为2006800499352的专利方法制备)、分析纯磷酸氢二钾(国药集团化学试剂有限公司)，色谱纯甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司)，色谱纯乙腈(上海星可高纯溶剂有限公司)，优级纯高氯酸(永华化学股份有限公司)，超纯水(娃哈哈)。
实施例1
制备系统测试液：取磷酸奥司他韦中间体及上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量，用乙腈-水(30∶70)溶解并稀释，得到磷酸奥司他韦中间体浓度为1.0mg/ml，各杂质均为2μg/ml的系统测试液；
制备杂质定位溶液：分别取上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量用溶剂(乙腈-水(30∶70))溶解并稀释，得到各杂质浓度为0.1mg/ml的定位溶液；
采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件：
色谱柱：色谱柱型号：Thermo scientific Hypersil GOLDTM；色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm；
流动相：10mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，乙腈-甲醇(80∶20)为流动相B；
流动相A(％)
采用梯度洗脱；
Figure BDA0003383246760000061
检测波长：207nm；
柱温：20℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
检测结果见附图1，杂质0112为磷酸奥司他韦中间体非对映异构体杂质，与杂质0111为对映异构体结构，在液相普通色谱条件下出峰重合，磷酸奥司他韦中间体与杂质0105及杂质0114的分离度较差。
实施例2
制备系统测试液：取磷酸奥司他韦中间体及上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量，用乙腈-水(30∶70)溶解并稀释，得到磷酸奥司他韦中间体浓度为1.0mg/ml，各杂质均为2μg/ml的系统测试液；
制备杂质定位溶液：分别取上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量用溶剂(乙腈-水(30∶70))溶解并稀释，得到各杂质浓度为0.1mg/ml的定位溶液；
采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件：
色谱柱：色谱柱型号：YMC Pack-Pro C18；色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格：内径为3.0mm，长度为250mm，填料粒径为3μm；
流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；
采用梯度洗脱；
Figure BDA0003383246760000071
检测波长：207nm；
柱温：20℃；
流速：0.7ml/min；
进样量：10μl；
检测结果见附图2，杂质0105磷酸奥司他韦中间体分离度为2.3，分离度良好；杂质0114与磷酸奥司他韦中间体未分开，分离度较差，0111与0112出峰重合。
实施例3
制备系统测试液：取磷酸奥司他韦中间体及上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量，用乙腈-水(30∶70)溶解并稀释，得到磷酸奥司他韦中间体浓度为1.0mg/ml，各杂质均为2μg/ml的系统测试液；
制备杂质定位溶液：分别取上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量用溶剂(乙腈-水(30∶70))溶解并稀释，得到各杂质浓度为0.1mg/ml的定位溶液；
采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件：
色谱柱：色谱柱型号：Phenomenex Kinetex PFP
Figure BDA0003383246760000082
色谱柱填料：五氟苯基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm；
流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B；
采用梯度洗脱；
Figure BDA0003383246760000081
检测波长：207nm；
柱温：20℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：10μl；
检测结果见附图3，杂质0114与磷酸奥司他韦中间体分离度为2.2，但是峰形较差；杂质0111、0112与杂质0105出峰重合。
实施例4
制备系统测试液：取磷酸奥司他韦中间体及上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量，用乙腈-水(30∶70)溶解并稀释，得到磷酸奥司他韦中间体浓度为1.0mg/ml，各杂质均为2μg/ml的系统测试液；
制备杂质定位溶液：分别取上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量用溶剂(乙腈-水(30∶70))溶解并稀释，得到各杂质浓度为0.1mg/ml的定位溶液；
采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件：
色谱柱：色谱柱型号：Phenomenex Kinetex PFP
Figure BDA0003383246760000092
色谱柱填料：五氟苯基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm；
流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，乙腈-甲醇(90∶10)为流动相B；
采用梯度洗脱；
Figure BDA0003383246760000091
检测波长：207nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：20μl；
检测结果见附图4，杂质0114与磷酸奥司他韦中间体分离度为0.96，分离度较差；杂质0111、0112与杂质0105出峰重合。
实施例5
制备系统测试液：取磷酸奥司他韦中间体(按照申请号为2006800499352的专利方法制备)及上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量，用乙腈-水(30∶70)溶解并稀释，得到磷酸奥司他韦中间体浓度为1.0mg/ml，各杂质均为2μg/ml的系统测试液；
制备杂质定位溶液：分别取上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量用溶剂(乙腈-水(30∶70))溶解并稀释，得到各杂质浓度为0.1mg/ml的定位溶液；
采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件：
色谱柱：色谱柱型号：Phenomenex Kinetex PFP
Figure BDA0003383246760000102
色谱柱填料：五氟苯基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm；
流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，乙腈-甲醇(80∶20)为流动相B；
采用梯度洗脱；
Figure BDA0003383246760000101
检测波长：207nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：10μl；
检测结果见附图5～附图12，磷酸奥司他韦中间体及各杂质峰之间分离度均大于1.5，分离度良好；空白基线平滑，主峰以及各杂质峰的响应均能满足要求。
实施例6(专属性试验)
制备系统测试液：取磷酸奥司他韦中间体及上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量，用乙腈-水(30∶70)溶解并稀释，得到磷酸奥司他韦中间体浓度为1.0mg/ml，各杂质均为2μg/ml的系统测试液；
制备杂质定位溶液：分别取上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量用溶剂(乙腈-水(30∶70))溶解并稀释，得到各杂质浓度为0.1mg/ml的定位溶液；
采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件：
色谱柱：色谱柱型号：Phenomenex Kinetex PFP
Figure BDA0003383246760000113
色谱柱填料：五氟苯基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm；
流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，乙腈-甲醇(80∶20)为流动相B；
采用梯度洗脱；
Figure BDA0003383246760000111
检测波长：207nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：10μl；
检测结果见附图13～附图14，检测结果见下表1
表1
Figure BDA0003383246760000112
Figure BDA0003383246760000121
从上述结果可知：空白溶剂对样品测定无干扰；系统测试液中各杂质峰之间最小分离度为5.0，均大于1.5，该方法的专属性良好。
实施例7(灵敏度试验)
定量限与溶液的制备：分别取磷酸奥司他韦中间体以及上述杂质0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量，按信噪比≥10∶1，配制成定量限溶液；按信噪比≥3∶1，配制成定量限溶液。
采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件：
色谱柱：色谱柱型号：Phenomenex Kinetex PFP
Figure BDA0003383246760000124
色谱柱填料：五氟苯基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm；
流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，乙腈-甲醇(80∶20)为流动相B；
采用梯度洗脱；
Figure BDA0003383246760000122
检测波长：207nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：10μl；
检测结果见附图15～附图16，检测结果见下表2～表3
表2检测限结果
Figure BDA0003383246760000123
Figure BDA0003383246760000131
表3定量限结果
Figure BDA0003383246760000132
从上述结果可知：各杂质的检测限浓度均低于供试品溶度的0.03％，各杂质的检测限浓度均低于供试品溶度的0.05％以下，表明该方法的检测灵敏度良好，能够满足磷酸奥司他韦中间体中各杂质的检测。
实施例8(准确度试验)
准确度溶液的制备：取磷酸奥司他韦中间体及0103、0104、0105、0109、0111、0112、0114适量，用乙腈-水(30∶70)溶解并稀释，得到磷酸奥司他韦中间体浓度为1.0mg/ml，各杂质均为2μg/ml的准确度溶液；
采用反相高效液相色谱进行检测，检测条件：
色谱柱：色谱柱型号：Phenomenex Kinetex PFP
Figure BDA0003383246760000134
色谱柱填料：五氟苯基硅烷键合硅胶；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm；
流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，乙腈-甲醇(80∶20)为流动相B；
采用梯度洗脱；
Figure BDA0003383246760000133
Figure BDA0003383246760000141
检测波长：207nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样量：10μl；
检测结果见下表4
表4准确度结果
名称 回收率范围(％) 平均回收率(％) RSD(％)，n＝9
0103 105.5～112.2 107.8 2.0
0109 103.1～113.0 108.2 3.1
0114 97.6～109.0 103.4 3.7
0111 102.0～112.8 108.0 3.4
0105 104.0～118.5 111.5 4.7
0104 103.5～118.9 109.0 4.3
从上述结果可知：各杂质回收率均在80％～120％之间，RSD(n＝9)值均小于10.0％，该方法的准确度良好。
照中国药典2020年版四部通则9101分析方法验证指导原则，对该方法的专属性、灵敏度以及准确度进行了详细的考察，验证结果均满足预定的可接受标准，保证了检测方法的特异性、准确度和灵敏度，证明该方法适用于分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其特定杂质。

Claims (6)

1.一种分离与检测磷酸奥司他韦中间体及其杂质的分析方法，其特征在于：用五氟苯基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以水-高氯酸为流动相A，以乙腈-甲醇为流动相B，采用梯度洗脱，对磷酸奥司他韦中间体及其杂质进行分离与检测；
所述的梯度洗脱程序如下
Figure FDA0004173607100000011
所述的磷酸奥司他韦中间体及其杂质结构为：
Figure FDA0004173607100000012
所述流动相A中水与高氯酸的体积比为100:0.11～100:0.09，所述流动相B中乙腈与甲醇的体积比为78:22～82:18；色谱柱柱温为25～50℃、进样量为1～100μl、检测波长为205～210nm、流速为1.0～1.5ml/ml。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述水与高氯酸的体积比为100:0.1，所述乙腈与甲醇的体积比为80:20；色谱柱柱温为25℃、进样量为10μl、检测波长为207nm、流速为1.0ml/ml。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，磷酸奥司他韦中间体配置成浓度为0.5mg/ml～2mg/ml，杂质配置成浓度为1μg/ml～4μg/ml。
4.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于，色谱柱为Phenomenex KinetexPFP
Figure FDA0004173607100000021
5.根据权利要求1或2所述的分析方法，其特征在于，色谱柱的规格为内径3.0～5.0mm，长度为100～250mm，填料粒径为2～5μm。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其特征在于，色谱柱的规格为内径4.6mm，长度为150mm，填料粒径为5μm。
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