CN112666282A - 一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，步骤如下：杂质对照品溶液、试验样品溶液的制备；取杂质对照品溶液、供试样品分别注入高效液相色谱仪进行分析，分析条件如下：设备：高效液相色谱仪，检测器为紫外吸收检测器或DAD检测器；色谱柱：SHIMADZU Shim‑pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm；流动相：流动相A为醋酸‑醋酸钠缓冲液和甲醇；流动相B为醋酸‑醋酸钠缓冲液；柱温：30℃；检测波长：360nm；流动相流速：0.9ml/min～1.1ml/min。本发明的优点：针对葡萄糖酸钙锌口服溶液中的杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及未知杂质有良好的检测效果；灵敏度高；系统稳定，重现性较好；对各种制备工艺下的葡萄糖酸钙锌口服溶液中的苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及未知杂质均能够进行准确测定。
Description
技术领域
本发明涉及一种杂质的检测技术领域，具体涉及一种高效液相色谱测定葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的方法。
背景技术
由于一种药品从合成原料药到制备有关的制剂，再经贮藏、运输、使用，要经历一段较为复杂和漫长的过程，在此期间每一过程都可能产生有关的杂质，如生产中可能带入起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等；在贮藏和运输过程中可能产生降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。药品中的杂质泛指在药品的生产与储运过程中产生的工艺杂质或降解产物等。药品在临床使用中产生的不良反应除了与主成分的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大关系，药品中杂质的控制是药品研发的一个重要方面，也是临床使用安全性的保障。因此，为了保证药物的安全有效，同时也要考虑到生产实际情况，国内外在药物的研究过程中均将杂质检测作为控制药品质量的重要指标。药品杂质检测研究是目前我国药品研发中的薄弱点之一。要全面提升我国药品研发的水平、切实保证公众用药的安全性，必须重视并加强药品中有关杂质的研究。
葡萄糖酸钙锌口服溶液(Calcium and Zine Gluconates Oral Solution)为复方制剂，是矿物质补充剂，用于治疗因缺钙、锌引起的疾病，包括骨质疏松、手足抽搐症、骨发育不全、佝偻病、妊娠妇女和哺乳期妇女、绝经期妇女的钙补充、小儿生长发育迟缓、食欲缺乏、厌食症、复发性口腔溃疡以及痤疮等。由于葡萄糖酸钙锌口服溶液主要用于儿童，由于儿童用药的复杂性和年龄阶段性，必须加强对该药物安全性的监测，所以，对葡萄糖酸钙锌口服溶液中杂质控制尤为重要。
众所周知，药品中的杂质具有个性化的特征，不同的药品具有不同的杂质谱，同一药品用不同的生产工艺也可能具有不同的杂质谱，同一药品用不同的辅料也可能具有与不同的杂质谱。因此，研发一种方法适用于所有工艺路线制备的葡萄糖酸钙锌口服溶液中苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和未知杂质的检测是有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一个测定葡萄糖酸钙锌口服溶液中杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和未知杂质的方法，可以更好的控制葡萄糖酸钙锌口服溶液的质量，更好的对葡萄糖酸钙锌口服溶液中可能存在的杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和未知杂质进行检测。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，包括如下步骤：
步骤一：杂质对照品溶液、供试品溶液的制备；
步骤二：取步骤(1)制得的杂质对照品溶液、待测样品分别注入高效液相色谱仪进行分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质含量，分析条件如下：
(1)设备：高效液相色谱仪，检测器为紫外吸收检测器或DAD检测器；
(2)色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm；
(3)流动相：流动相A为醋酸-醋酸钠缓冲液和甲醇；流动相B为醋酸-醋酸钠缓冲液；
(4)柱温：30℃；
(5)检测波长：360nm；
(6)流动相流速：0.9ml/min～1.1ml/min。
进一步地，
所述流动相运行梯度方式如下：
进一步地，所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH为4.7。
进一步地，所述流动相A中各成分体积比是醋酸-醋酸钠缓冲液：甲醇＝30：70。
进一步地，所述流速是1ml/min。
进一步地，所述杂质对照品溶液的制备：分别取苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和盐酸赖氨酸对照品各10mg到100ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀；取溶液2.5ml到100ml量瓶中，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液5ml与2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2.5ml进行衍生化，加pH7.0磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀作为杂质对照溶液。
进一步地，所述待测样品溶液的配制：精密量取待测葡萄糖酸钙锌口服溶液2.5ml到100ml量瓶中，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液5ml与2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2.5ml进行衍生化，加pH7.0磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀作为试验样品溶液。
本发明的优点包括：
(1)针对葡萄糖酸钙锌口服溶液中的杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及未知杂质有良好的检测效果；在极低的杂质量范围线性关系好，灵敏度高，检测限均可达4.15ng/ml；
(2)系统稳定，重现性较好；
(3)对高效液相色谱仪型号及性能要求不高；
(4)对各种制备工艺下的葡萄糖酸钙锌口服溶液中的杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及未知杂质均能够进行准确测定，适用性广。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为供试品溶液为样品、Welch UItimate AQ-C18,4.6×150mm,3μm为色谱柱的色谱图；
图2为供试品溶液为样品、Agilent ZORBAX Extend-C18,4.6×250mm,5μm为色谱柱的色谱图；
图3为供试品溶液为样品、Agilent ZORBAX SB-C18,4.6×150mm,5μm为色谱柱的色谱图；
图4为供试品溶液为样品、Agilent InfinityLabporshell 120EC-C18,4.6×100mm,2.7μm为色谱柱的色谱图；
图5为供试品溶液为样品、Welch UItimate AQ-C18,4.6×250mm,5μm为色谱柱的色谱图；
图6为供试品溶液为样品、SHIMADZU Shim-pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm为色谱柱、流动相A：流动相B初始比例为35：65的色谱图；
图7为供试品溶液为样品、流动相中醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.5的色谱图；
图8为供试品溶液为样品、流动相中醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.7的色谱图；
图9为供试品溶液为样品、流动相A：流动相B初始比例为60：40的色谱图；
图1～图9中，①为苏氨酸色谱峰，②为苯丙氨酸色谱峰，③为亮氨酸色谱峰，④为赖氨酸色谱峰。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
发明人在开发葡萄糖酸钙锌口服溶液的过程中，重点研究了葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相色谱分析方法。在研究过程中发现，三种已知杂质中苏氨酸的容量因子k较小，苯丙氨酸和亮氨酸的容量因子k较大，在同一色谱条件下进行检测，需要采用梯度洗脱条件。根据研究分析结果，发明人将杂质苏氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸按本发明技术方案进行检测。
如无特殊说明，下文的杂质对照品溶液的制备、供试品溶液的配制均按如下方法。
杂质对照品溶液的制备：分别取苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和盐酸赖氨酸对照品各10mg到100ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀；取溶液2.5ml到100ml量瓶中，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液5ml与2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2.5ml进行衍生化，加磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释至刻度，摇匀作为杂质对照溶液。
供试品溶液的配制：分别取苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和盐酸赖氨酸对照品各10mg到100ml量瓶中，加葡萄糖酸钙锌口服溶液稀释至刻度，摇匀；再取该溶液2.5ml到100ml量瓶中，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液5ml与2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2.5ml进行衍生化，加磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液。
(一)检测条件的选择
1.色谱柱的选择
分别采用表2中样品以及6种色谱柱，按下面色谱条件进行试验：
(1)设备：高效液相色谱仪，检测器为紫外吸收检测器或DAD检测器；
(2)色谱柱：分别采用表2中6种色谱柱；
(3)流动相：流动相A为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)∶甲醇＝30：70(v/v)；流动相B为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)；
(4)柱温：30℃；
(5)检测波长：360nm；
(6)流动相流速：1.0ml/min；
(7)进样量：10μl。
所述流动相A为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)∶甲醇＝30：70(v/v)，流动相B为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)。其运行梯度方式见下表1：
表1梯度洗脱表
测定法：取供试品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，并记录色谱图。
实验结果见表2。
表2色谱柱的选择
结论：由表2及图1-6可知，使用色谱柱SHIMADZU Shim-pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm进行葡萄糖酸钙锌口服溶液中杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸及未知杂质检测分离效果最好。
2.醋酸-醋酸钠缓冲液pH值的选择
对葡萄糖酸钙锌口服溶液中的杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸及未知杂质的液相条件中醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值进行了摸索，分别采用表3中不同pH值的醋酸-醋酸钠缓冲液，按下面色谱条件进行试验：
(1)色谱柱采用SHIMADZU Shim-pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm；
(2)流动相：流动相A和流动相B中使用的醋酸-醋酸钠缓冲液分别采用表3的不同pH值的醋酸-醋酸钠缓冲液；
(3)其余色谱条件，包括流动相A和流动相B运行梯度方式均同“1.色谱柱的选择”；
测定法：取供试品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，并记录色谱图。
实验结果见表3。
表3醋酸-醋酸钠缓冲液pH值的选择
结论：由图8和图7及表3可知，未知杂质在醋酸-醋酸钠缓冲液的pH值为4.7时分离效果最好。
3.流动相洗脱程序的优化
对苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸及未知杂质在的液相条件进行了摸索，按下面色谱条件进行试验：
(1)色谱柱采用SHIMADZU Shim-pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm；
(2)梯度洗脱时，流动相A和流动相B开始进行洗脱的15min内的初始比例分别采用下表4所示的比例；
(3)其余色谱条件，包括流动相A和流动相B开始洗脱15min以后的运行梯度方式均同“1.色谱柱的选择”；
测定法：取供试品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，并记录色谱图。
实验结果见表4。
表4流动相初始比例选择
结论：由图9和图6及表4可知，苏氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸杂质与未知杂质峰在流动相A：流动相B＝35：65(v/v)时分离效果最好，保留时间适中。
4.流速的选择
发明人在研究的过程中，还对流速进行了分析研究，按照下面色谱条件：
(1)色谱柱采用SHIMADZU Shim-pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm；
(2)流动相流速在0.9ml/min～1.1ml/min范围内；
(3)其余色谱条件、进样均同“1.色谱柱的选择”；
进行试验，发现流动相流速在0.9ml/min～1.1ml/min范围内，均可实现对苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、盐酸赖氨酸和未知杂质的有效分析。
经过研究对比分析，本发明特别好的流动相组成为：醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)∶甲醇，梯度洗脱程序为表1所示。
5.辅料干扰性实验
发明人还采用本发明技术方案对市场上常用的制备葡萄糖酸钙锌口服溶液的药用辅料按照“4.流速的选择”的色谱条件进行了研究，经研究发现常用的药用辅料对本技术方案没有干扰。
(二)检测方法学研究
以1.0ml/min的流速，其余色谱条件按照“4.流速的选择”，对杂质对照品溶液进行测定，分别以苏氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的峰面积对进样量进行线性回归，所得线性回归方程为：苏氨酸y＝82022x+0.0168、苯丙氨酸y＝61111x-0.0196、亮氨酸y＝75577x-0.1271、盐酸赖氨酸y＝88932x+0.0554；相关系数为苏氨酸0.9994、苯丙氨酸0.9997、亮氨酸1.0000、盐酸赖氨酸0.9993。在该色谱系统下，苏氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸均在12.5ng/ml～1500ng/ml浓度范围内线性关系良好，苏氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸的定量限均为12.5ng/ml，检测限均为4.15ng/ml。
基于上述试验，下面例举3个实施例：
实施例1
色谱条件：
(1)设备：高效液相色谱仪，检测器为紫外吸收检测器或DAD检测器；
(2)色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm；
(3)流动相：流动相A为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)∶甲醇＝30：70(v/v)；流动相B为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)；
(4)柱温：30℃；
(5)检测波长：360nm；
(6)流动相流速：1.0ml/min；
(7)进样量：10μl。
所述流动相A为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)∶甲醇＝30：70(v/v)，流动相B为醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.7)。其运行梯度方式见下表1：
表1梯度洗脱表
测定法：取杂质对照品溶液、供试品溶液分别注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，并记录色谱图。可按外标法以峰面积计算杂质含量。
检测结果表明，杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及未知杂质分离度较好。
实施例2
原料方法均与实施例1相同，不同的是流动相流速为0.9ml/min。
检测结果表明，杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及未知杂质分离度较好。
实施例3
原料方法均与实施例1相同，不同的是流动相流速为1.1ml/min。
检测结果表明，杂质苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及未知杂质分离度较好。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (7)
1.一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，其特征在于：
包括如下步骤：
步骤一：杂质对照品溶液、供试品溶液的制备；
步骤二：取步骤(1)制得的杂质对照品溶液、待测样品分别注入高效液相色谱仪进行分析，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质含量，分析条件如下：
(1)设备：高效液相色谱仪，检测器为紫外吸收检测器或DAD检测器；
(2)色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST,C18,4.6mm×250mm,5μm；
(3)流动相：流动相A为醋酸-醋酸钠缓冲液和甲醇；流动相B为醋酸-醋酸钠缓冲液；
(4)柱温：30℃；
(5)检测波长：360nm；
(6)流动相流速：0.9ml/min～1.1ml/min。
2.根据权利要求1所述的一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，其特征在于：
所述流动相运行梯度方式如下：
3.根据权利要求1或2所述的一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，其特征在于：
所述醋酸-醋酸钠缓冲液的pH为4.7。
4.根据权利要求1所述的一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，其特征在于：
所述流动相A中各成分体积比是醋酸-醋酸钠缓冲液：甲醇＝30：70。
5.根据权利要求1所述的一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，其特征在于：
所述流速是1ml/min。
6.根据权利要求1所述的一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，其特征在于：
所述杂质对照品溶液的制备：分别取苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和盐酸赖氨酸对照品各10mg到100ml量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀；取溶液2.5ml到100ml量瓶中，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液5ml与2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2.5ml进行衍生化，加pH7.0磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀作为杂质对照溶液。
7.根据权利要求1所述的一种葡萄糖酸钙锌口服溶液杂质的高效液相检测方法，其特征在于：
所述待测样品溶液的配制：精密量取待测葡萄糖酸钙锌口服溶液2.5ml到100ml量瓶中，加0.5mol/l碳酸氢钠溶液5ml与2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2.5ml进行衍生化，加pH7.0磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀作为试验样品溶液。
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