CN113640419A - 唑来膦酸注射液的质控方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种唑来膦酸注射液的质控方法，属于药物检测领域。具体而言，本发明公开了一种高效液相色谱检测唑来膦酸中咪唑乙酸的方法。应用本发明提供的检测方法，能够更灵敏地检测唑来膦酸注射液中咪唑乙酸的浓度，其专属性好，能够更好地控制唑来膦酸注射液的产品质量。

Description

唑来膦酸注射液的质控方法
技术领域
本发明属于药物检测领域，涉及一种唑来膦酸注射液的质量控制的方法，具体而言，涉及一种高效液相色谱检测唑来膦酸中杂质的方法。
背景技术
唑来膦酸为诺华公司开发的第三代双膦酸盐药物，是一种具有较强抑制骨吸收和潜在的促进骨形成作用的二膦酸盐类药物，主要用于治疗恶性肿瘤引起的骨转移、骨质疏松症、高钙血症等。该药于2000年10月在加拿大首次上市，2001年在欧盟获批，后相继在美国、日本等获批上市，目前已在中国上市。
唑来膦酸作为一类新型的双膦酸类药物，其中含两个膦酸基团，化合物极性极强，在十八烷基硅烷键合硅胶柱上几乎无保留，无法与杂质分离，水溶性脂溶性均较差，紫外吸收仅在210nm波长附近存在末端吸收。
咪唑-1-乙酸是唑来膦酸合成过程中的中间体，同时也是唑来膦酸水解的主要产物，极易引入到产品中。根据ICH指导原则，咪唑-1-乙酸限度为0.2％，由于唑来膦酸注射用溶液浓度较低，且该杂质紫外吸收较弱，也无荧光淬灭，紫外检测该杂质存在一定缺陷。参考唑来膦酸注射液的进口药品注册标准(标准号：JX20170216)，完全重现咪唑-1-乙酸的测定方法，发现2.5～4min处存在空白辅料峰与咪唑-1-乙酸无法完全分离的情况。使用不同类型的色谱柱、改变离子对试剂类型/浓度、筛选有机相种类、调整流动相pH、柱温、流速等，均未得到理想的色谱条件。现在尚无分离效果好，专属性强，灵敏度高的检测方法。
其他方法例如阴离子交换高效液相色谱法和反相离子对高效液相色谱法也可以对咪唑-1-乙酸进行检测。阴离子交换高效液相色谱法中，为了唑来膦酸以单一电离形式保留，需要采用强碱或强酸流动相，固定相选用昂贵的耐酸碱阴离子交换柱；反相离子对高效液相色谱法中，常规离子对试剂增强化合物保留效果不显著，分离杂质有限。
因此，为改善上述情况，本申请提供了一种灵敏度更高、专属性更强的高效液相色谱-质谱联用唑来膦酸杂质检测方法。
发明内容
本申请提供了一种高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其包括：
(1)取唑来膦酸注射液为供试品，唑来膦酸为对照品A，咪唑-1-乙酸为对照品B；
(2)用稀释剂对供试品、对照品A和对照品B进行稀释，稀释剂为8-12:92-88:0.4-0.6(v/v)的乙腈-水-甲酸的混合溶液；
(3)采用如下色谱条件分别对稀释后的供试品、对照品溶液进行检测：
固定相：酰胺基硅烷键合硅胶填充的正相色谱柱；
流动相：A相：0.4-0.6％(v/v％)的甲酸水溶液；B相：0.4-0.6％(v/v％)的甲酸乙腈溶液；
流速：0.3-0.5ml/min；
柱温：35-45℃；
进样器温度：5-15℃。
在一些实施方案中，步骤(3)中对稀释后的供试品、对照品溶液进行检测时，按照线性梯度洗脱：
Figure BDA0003209771950000021
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其包括：
(1)取唑来膦酸注射液为供试品，唑来膦酸为对照品A，咪唑-1-乙酸为对照品B；
(2)用稀释剂对供试品、对照品A和对照品B进行稀释，稀释剂为10:90:0.5(v/v)的乙腈-水-甲酸的混合溶液；
(3)采用如下色谱条件分别对稀释后的供试品、对照品溶液进行检测：
固定相：酰胺基硅烷键合硅胶填充的正相色谱柱；
流动相：A相：0.5％(v/v％)的甲酸水溶液；B相：0.5％(v/v％)的甲酸乙腈溶液；
流速：0.4ml/min；
柱温：35-45℃；
进样器温度：5-15℃。
在一些实施方案中，所述色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1mm×100mm，1.7μm)。
在一些实施方案中，所述方法的柱温为38-42℃；在一些实施方案中，所述方法的柱温为40℃。
在一些实施方案中，进样器温度为8-12℃；在一些实施方案中，进样器温度为10℃。
在一些实施方案中,稀释后的对照品A浓度为0.1μg/mL-1mg/mL。
在一些实施方案中，对照品B浓度为0.1ng/mL-0.2μg/mL；在一些实施方案中，对照品B浓度为0.12ng/mL-0.1μg/mL。
在一些实施方案中，供试品浓度为2μg/mL-8μg/mL。在一些实施方案中，供试品浓度为4μg/mL-6μg/mL。
在一些实施方案中，步骤(3)中进样量为1-5μl。
在一些实施方案中，步骤(3)中进样量为1μl。
在一些实施方案中，步骤(3)中对稀释后的供试品、对照品溶液进行检测时，按照线性梯度洗脱：
Figure BDA0003209771950000022
本发明提供了一种高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法。采用本发明检测色谱条件，能够更灵敏地检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的含量，其专属性好，能够更好地控制唑来膦酸注射液的产品质量。
通过以上技术方案，本发明可以有效实现唑来膦酸中咪唑-1-乙酸的检测，分离度良好，有很好的重现性，解决了唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸杂质化合物不保留、分离效果差、专属性弱、灵敏度低的问题。
本技术方案能够改善紫外检测时2.5-4.0分钟处空白辅料峰与唑来膦酸无法分离的情况，本申请采用LC-MS法对唑来膦酸进行控制，检测限浓度可以达到供试品浓度的0.0025％，专属性更强、灵敏度更高。
所述唑来膦酸注射液处方为：唑来膦酸(按照无水唑来膦酸计)5mg，甘露醇4950mg，枸橼酸钠30mg，注射用水加至100mL。
所述供试品为在温度25℃±2℃，相对湿度60％±5％的条件下放置21个月的唑来膦酸注射液。所述空白辅料为：甘露醇，枸橼酸钠。
本申请中，提供的咪唑-1-乙酸的检测方法，具有的优势包括：
1.专属性强：溶剂对咪唑-1-乙酸的测定无干扰；杂质咪唑-1-乙酸与唑来膦酸之间能达到良好分离；
2.检测限低，在一些实施方案中可达到0.0025％；
3.准确度高，咪唑-1-乙酸的回收率在80.0％～115.0％范围内，在具体的实施方案中，回收率达到100.62～114.90％；在一些实施方案中，回收率RSD≤5％；
4.进样精密度高，重复性好。
附图说明
图1对照例1空白溶剂、空白辅料、对照品溶液和供试品谱图
图2对照例1唑来膦酸注射液-咪唑-1-乙酸谱图
具体实施方式:
实施例1采集离子确证:
色谱条件：
仪器：Waters UPLC H-Class高效液相色谱仪；
检测器：Waters QDa检测器；
流动相：A相：0.5％(v/v％)的甲酸水溶液；B相：0.5％(v/v％)的甲酸乙腈溶液；
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1mm×100mm，1.7μm)；
柱温：40℃；流速：0.4ml/min；进样器温度：10℃；进样量：1μl；
质谱参数：ESI+；SIR模式；采集时间：0～9分钟；采集离子：126.9；毛细管电压：0.8KV；孔电压：15V。
按下表进行线性梯度洗脱：
Figure BDA0003209771950000031
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
测定：取咪唑-1-乙酸对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含咪唑-1-乙酸1μg的溶液注入高效液相色谱-质谱联用仪，采用MS Scan 50-600模式扫描，测得咪唑-1-乙酸分子离子峰[M+H]+m/z为126.93，因而将采集离子定为126.9。
实施例2专属性测试:
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
供试品溶液：精密移取唑来膦酸注射液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
唑来膦酸对照品溶液：取唑来膦酸对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加入适量溶剂超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为唑来膦酸对照品溶液。
咪唑-1-乙酸对照品溶液：精密称取咪唑-1-乙酸对照品约5mg，置200ml量瓶中，加溶剂振荡溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置250ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液；精密量取1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
混合溶液：精密移取供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密量取咪唑-1-乙酸对照品溶液贮备液1ml置同一10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。
测定：采取实施例1的色谱条件，分别取溶剂、供试品溶液、唑来膦酸对照品溶液、咪唑-1-乙酸对照品溶液与混合溶液各1μl，分别注入高效液相色谱-质谱联用仪，记录液相与质谱图。
专属性测定结果见下表。溶剂对咪唑-1-乙酸的测定无干扰；唑来膦酸与咪唑-1-乙酸之间能够达到良好分离。
表1咪唑-1-乙酸专属性测试结果
Figure BDA0003209771950000041
实施例3定量限与检测限测试:
定量限
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
定量限溶液：取咪唑-1-乙酸对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含咪唑-1-乙酸0.41ng的溶液，作为定量限溶液。
测定：采取实施例1的色谱条件，取定量限溶液1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，连续进样6针，记录质谱图。
检测结果
定量限试验测定结果见下表。定量限溶液连续进样6针，咪唑-1-乙酸的信噪比(S/N)在16.25～17.39之间，峰面积RSD(n＝6)为6.58％。
表2咪唑-1-乙酸定量限试验结果
Figure BDA0003209771950000051
检测限
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
咪唑-1-乙酸对照品溶液：取咪唑-1-乙酸对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含咪唑-1-乙酸0.12ng的溶液，作为检测限溶液。
测定：采取实施例1的色谱条件，取检测限溶液1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，连续进样3针，记录质谱图。
检测结果
检测限试验测定结果见下表。检测限溶液连续进样3针，咪唑-1-乙酸的信噪比(S/N)在4.34～5.07之间。
表3咪唑-1-乙酸检测限试验结果
Figure BDA0003209771950000052
实施例4线性与范围测试:
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
咪唑-1-乙酸对照品贮备液：精密称取咪唑-1-乙酸对照品约5mg，置200ml量瓶中，加溶剂振荡溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置250ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液。线性溶液：取咪唑-1-乙酸对照品贮备液0.5ml、0.6ml、1.0ml、1.0ml、1.2ml和1.5ml，分别置100ml、20ml、20ml、10ml、10ml和10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液①、②、③、④、⑤和⑥。
测定：采取实施例1的色谱条件，精密量取线性溶液①～⑥各1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，每份溶液进样2针，记录质谱图。
检测结果
结果如下表，以峰面积(A)为纵坐标，以进样量(pg)为横坐标，进行线性回归方程。咪唑-1-乙酸在进样量0.49pg～14.58pg范围内与峰面积呈良好线性关系，相关系数r为0.9998，线性方程y轴截距是限度响应值的0.73％。同时以峰面积(A)为纵坐标，以进样量(pg)为横坐标，绘制咪唑-1-乙酸的线性与范围图。
表4咪唑-1-乙酸线性和范围试验结果
Figure BDA0003209771950000061
实施例5准确度测试:
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
浓度点设置：以限度浓度(对照品浓度/供试品浓度＝0.2％)为100％，按照30％、100％、120％三个浓度点对咪唑-1-乙酸准确度进行验证。
咪唑-1-乙酸对照品贮备液：精密称取咪唑-1-乙酸对照品约5mg，置200ml量瓶中，加溶剂振荡溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置250ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液。
咪唑-1-乙酸对照品溶液：精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为咪唑-1-乙酸对照品溶液。
供试品溶液：精密移取唑来膦酸注射液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行配制3份。
准确度溶液：精密移取供试品溶液2ml，置20ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液0.6ml，置同一20ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度溶液30％浓度点，平行配制3份；精密移取供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1.0ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度溶液100％浓度点，平行配制3份；精密移取供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1.2ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为准确度溶液120％浓度点，平行配制3份。
测定：采取实施例1的色谱条件，精密量取上述溶液1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图。按照下式计算回收率：
回收率(％)＝(X1-X2)/M×100％
式中：X1为供试品中咪唑-1-乙酸测得量(μg)；
X2为供试品中咪唑-1-乙酸原有量(μg)；
M为咪唑-1-乙酸加入量(μg)。
检测结果
准确度试验结果见下表。咪唑-1-乙酸在各浓度点的回收率均在100.62％～114.90％之间，回收率RSD(n＝9)为4.90％。
表5咪唑-1-乙酸准确度试验结果
Figure BDA0003209771950000071
实施例6进样精密度测试:
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
咪唑-1-乙酸对照品溶液：精密称取咪唑-1-乙酸对照品约5mg，置200ml量瓶中，加溶剂振荡溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置250ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液；精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为咪唑-1-乙酸对照品溶液。
测定：采取实施例1的色谱条件，取咪唑-1-乙酸对照品溶液1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，连续进样6针，记录质谱图。
检测结果
进样精密度试验测定结果见下表。对照品溶液连续进样6针，咪唑-1-乙酸的峰面积RSD(n＝6)为2.93％，保留时间RSD(n＝6)为0.56％。
表6咪唑-1-乙酸进样精密度试验结果
Figure BDA0003209771950000072
Figure BDA0003209771950000081
实施例7重复性测试:
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
咪唑-1-乙酸对照品贮备液：精密称取咪唑-1-乙酸对照品约5mg，置200ml量瓶中，加溶剂振荡溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置250ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液。
咪唑-1-乙酸对照品溶液：精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为咪唑-1-乙酸对照品溶液。
供试品溶液：精密移取唑来膦酸注射液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行配制3份。
重复性溶液：精密移取供试品溶液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1.0ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为重复性溶液，平行配制6份。
测定：采取实施例1的色谱条件，精密量取上述溶液1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图。按照下式计算回收率：
回收率(％)＝(X1-X2)/M×100％
式中：X1为供试品中咪唑-1-乙酸测得量(μg)；
X2为供试品中咪唑-1-乙酸原有量(μg)；
M为咪唑-1-乙酸加入量(μg)。
检测结果
重复性试验结果见下表。6份混合溶液中咪唑-1-乙酸的回收率在100.73％～104.94％范围内，含量RSD(n＝6)为1.52％。
表7咪唑-1-乙酸重复性试验结果
Figure BDA0003209771950000082
实施例8待测溶液稳定性试验
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
咪唑-1-乙酸对照品贮备液：精密称取咪唑-1-乙酸对照品约5mg，置200ml量瓶中，加溶剂振荡溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置250ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液。
咪唑-1-乙酸对照品溶液：精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为咪唑-1-乙酸对照品溶液。
待测溶液：精密移取唑来膦酸注射液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂适量使溶解，精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1.0ml，置同一10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液。
测定：采取实施例1的色谱条件，取稳定性溶液，放置控温10℃进样室中，于0h、2h、4h、6h、8h、10h和12h后进样，记录质谱图，按外标法计算溶液中咪唑-1-乙酸的含量。
检测结果
重复性试验结果见下表。待测溶液10℃放置12小时，咪唑-1-乙酸的含量变化RSD(n＝6)为1.71％。溶液在12小时内稳定。
表8咪唑-1-乙酸待测溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003209771950000091
实施例9样品测定
溶剂：乙腈-水-甲酸10:90:0.5(v/v)。
咪唑-1-乙酸对照品贮备液：精密称取咪唑-1-乙酸对照品约5mg，置200ml量瓶中，加溶剂振荡溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置250ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液。
咪唑-1-乙酸对照品溶液：精密量取咪唑-1-乙酸对照品贮备液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为咪唑-1-乙酸对照品溶液。
供试品溶液：精密移取唑来膦酸注射液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(平行配制两份，分别进样1针)。
测定：采取实施例1的色谱条件，取溶剂、对照品溶液和供试品溶液各1μl注入高效液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图，按外标法以峰面积计算。
检测结果
样品测定试验结果见下表。
表9样品测定结果
Figure BDA0003209771950000092
实施例10对照例1
参考唑来膦酸注射液的进口药品注册标准(标准号：JX20170216)，对唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸进行测定。色谱条件：
色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18,4.6mm x 200mm,5μm及保护柱Thermo BDSHYPERSIL C18,4.6mm x 10mm,5μm或效能相当的色谱柱；
检测器：紫外检测器；
流动相：磷酸氢二钠混合溶液-乙腈-乙二胺四乙酸二钠溶液(体积比900:100:2)(用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.9)；其中磷酸氢二钠混合溶液为取无水磷酸氢二钠5.7g，四己基硫酸氢铵4.5g，加水900ml溶解，摇匀即得；乙二胺四乙酸二钠溶液为取乙二胺四乙酸二钠0.365g，置100ml量瓶中，加2mol/L氢氧化钠溶液5ml溶解，用水稀释至刻度，摇匀即得。
波长：215nm；
柱温：30℃；
流速：1.2ml/min；
进样量：500μl；
对照品溶液：取唑来膦酸对照品适量，精密称定，用水稀释制成每1ml中含唑来膦酸0.1μg的溶液作为对照品溶液；
空白溶液：水；
空白辅料：甘露醇4950mg，枸橼酸钠30mg，注射用水加至100mL，作为空白辅料；
供试品溶液：唑来膦酸注射液(唑来膦酸(按照无水唑来膦酸计)5mg，甘露醇4950mg，枸橼酸钠30mg，注射用水加至100mL。)
测定：取空白溶剂、空白辅料、对照品溶液和供试品溶液各500μl进样，记录质谱图，按外标法以峰面积计算。
检测结果
空白辅料峰干扰咪唑-1-乙酸的测定(图1、2)。
实施例11在对照例1的基础上，更换不同类型的色谱柱、改变离子对试剂类型/浓度、筛选有机相种类、调整流动相pH、柱温、流速等，均未得到理想的色谱条件，包括：空白辅料峰干扰杂质咪唑-1-乙酸的测定、杂质咪唑-1-乙酸的保留较弱等。以下实施例中，色谱条件若未特殊说明，即与对照例1中的一致：
对照例2
色谱条件：
色谱柱：Aters Xbridge BEH HILIC(4.6mm x 250mm,5μm)；
检测器：紫外检测器；
流动相A：体积比0.1％的甲酸水溶液；
流动相B：乙腈；
梯度洗脱：
Figure BDA0003209771950000101
波长：215nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：500μl；
测定：取空白溶剂、空白辅料、对照品溶液和供试品溶液各500μl进样，记录质谱图，按外标法以峰面积计算。
检测结果
咪唑-1-乙酸、唑来膦酸在该体系保留弱。
对照例3
色谱条件：
色谱柱：Agilent ZOBAX SAX(4.6mm x 250mm,5μm)
流动相：磷酸氢二钠缓冲液(磷酸pH值为7.0)-乙腈(体积比90:10)；其中磷酸氢二钠混合溶液为取无水磷酸氢二钠5.7g，加水1000ml溶解，摇匀即得，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0；
波长：215nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：500μl；
测定：取空白溶剂、空白辅料、对照品溶液和供试品溶液各500μl进样，记录质谱图，按外标法以峰面积计算。
检测结果
空白辅料峰干扰咪唑-1-乙酸的测定。
对照例4
色谱条件：
色谱柱：AtlantisTM premier BEH C18 AX(4.6mm x 250mm,5μm)
流动相：磷酸氢二钠缓冲液(磷酸pH值为7.9)-乙腈(体积比90:10)；其中磷酸氢二钠混合溶液为取无水磷酸氢二钠5.7g，加水1000ml溶解，摇匀即得，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0；
波长：215nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：500μl；
测定：取空白溶剂、空白辅料、对照品溶液和供试品溶液各500μl进样，记录质谱图，按外标法以峰面积计算。
检测结果
咪唑-1-乙酸保留弱，唑来膦酸和溶剂峰干扰咪唑-1-乙酸的测定。
对照例5
色谱条件：
色谱柱：Agilent ZOBAX SAX(4.6mm x 250mm,5μm)
流动相：磷酸二氢钠缓冲液(磷酸pH值:3.0)-乙腈(体积比95:5)；其中磷酸二氢钠混合溶液为取无水磷酸二氢钠4.8g，加水1000ml溶解，摇匀即得，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0；
波长：215nm；
柱温：30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：500μl；
测定：取空白溶剂、空白辅料、对照品溶液和供试品溶液各500μl进样，记录质谱图，按外标法以峰面积计算。
检测结果
咪唑-1-乙酸保留弱。

Claims (9)

1.一种高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其包括：
(1)取唑来膦酸注射液为供试品，唑来膦酸为对照品A，咪唑-1-乙酸为杂质对照品B；
(2)用稀释剂对供试品、对照品A和对照品B进行稀释，稀释剂为乙腈-水-甲酸8-12:92-88:0.4-0.6(v/v)的混合溶液；
(3)采用如下色谱条件分别对稀释后的供试品、对照品溶液进行检测：
固定相：酰胺基硅烷键合硅胶填充的正相色谱柱；
流动相：A相：0.4-0.6％(v/v％)的甲酸水溶液；B相：0.4-0.6％(v/v％)的甲酸乙腈溶液；
按下表进行线性梯度洗脱：
Figure FDA0003209771940000011
流速：0.3-0.5ml/min；
柱温：35-45℃；
进样量：1-5μl；
进样器温度：5-15℃℃。
2.如权利要求1所述的高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其特征在于：所述固定相为Waters ACQUITY UPLC BEH Amide柱；色谱柱规格为内径2.1mm，长度100mm，填料粒径1.7μm。
3.如权利要求1或2所述的高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其特征在于：所述稀释剂为10:90:0.5(v/v)的乙腈-水-甲酸的混合溶液。
4.如权利要求1-3任一项所述的高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其特征在于：所述流动相A相为0.5％(v/v％)的甲酸水溶液；B相为0.5％(v/v％)的甲酸乙腈溶液。
5.如权利要求1-4任一项所述的高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其特征在于：所述流速为0.4ml/min。
6.如权利要求1-5任一项所述的高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其特征在于：所述柱温为40℃。
7.如权利要求1-6任一项所述的高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其特征在于：所述进样器温度为10℃。
8.如权利要求1-7任一项所述的高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其特征在于：所述进样量：1-5μl。
9.如权利要求1-8任一项所述的高效液相色谱-质谱联用检测唑来膦酸注射液中咪唑-1-乙酸的方法，其特征在于：所述稀释后的对照品A浓度为0.1μg/mL-1mg/mL；对照品B浓度为0.12ng/mL-0.1μg/mL；供试品浓度为4μg/mL-6μg/mL。
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